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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

Die kotranslationale Insertion in vorgeformte Nanoscheiben ermöglicht es, zellfrei synthetisierte Membranproteine in definierten Lipidumgebungen ohne Kontakt mit Detergenzien zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung wesentlicher Systemkomponenten und die kritischen Parameter zur Verbesserung der Expressionseffizienz und Probenqualität.

Abstract

Zellfreie Expressionssysteme ermöglichen das maßgeschneiderte Design von Reaktionsumgebungen, um die funktionelle Faltung selbst komplexer Proteine wie Membranproteine zu unterstützen. Die experimentellen Verfahren zur co-translationalen Insertion und Faltung von Membranproteinen in vorgeformte und definierte Membranen, die als Nanoscheiben geliefert werden, werden demonstriert. Das Protokoll ist völlig reinigungsmittelfrei und kann innerhalb eines Tages Milligramm gereinigter Proben erzeugen. Die resultierenden Membranprotein-/Nanoscheibenproben können für eine Vielzahl von funktionellen Studien und strukturellen Anwendungen wie Kristallisation, Kernspinresonanz oder Elektronenmikroskopie verwendet werden. Die Herstellung grundlegender Schlüsselkomponenten wie zellfreie Lysate, Nanoscheiben mit entworfenen Membranen, kritische Stammlösungen sowie der Aufbau von zellfreien Zweikompartiment-Expressionsreaktionen wird beschrieben. Da die Faltungsanforderungen von Membranproteinen sehr unterschiedlich sein können, liegt ein Schwerpunkt dieses Protokolls auf der Modulation von Parametern und Reaktionsschritten, die für die Probenqualität wichtig sind, wie kritische basische Reaktionsverbindungen, Membranzusammensetzung von Nanoscheiben, Redox- und Chaperonumgebung oder DNA-Template-Design. Der gesamte Prozess wird mit der Synthese von Proteorhodopsin und einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor demonstriert.

Introduction

Membranproteine (MPs) sind aufgrund ihrer Unlöslichkeit in wässrigen Umgebungen anspruchsvolle Ziele in Proteinproduktionsstudien. Herkömmliche MP-Produktionsplattformen umfassen zellbasierte Systeme wie E. coli, Hefe oder eukaryotische Zellen. Die synthetisierten rekombinanten MPs werden entweder aus Zellmembranen extrahiert oder aus Einschlusskörpern refoldet1. Nach der Detergensolubilisierung können MPs durch etablierte In-vitro-Rekonstitutionsprotokolle in geeignete Membranumgebungen überführt werden. Neben Vesikeln und Liposomen ist die MP-Rekonstitution in planare Membranen in Form von Nanodiscs2 - oderSalipro-3-Partikeln in jüngster Zeit zur Routine geworden. Alle diese Strategien implizieren jedoch einen Waschmittelkontakt mit MPs, der zu Destabilisierung, Dissoziation von Oligomeren und sogar zum Verlust der Proteinstruktur und -aktivität führen kann4. Das Screening auf optimale Reinigungsmittel-Solubilisierungs- und Rekonstitutionsbedingungen kann daher mühsam und zeitaufwendig sein5.

Die Offenheit zellfreier (CF) Systeme ermöglicht es, die Expressionsreaktion direkt mit vorgeformten Membranen mit definierter Lipidzusammensetzung zu versorgen. In diesem lipidbasierten Expressionsmodus (L-CF) haben die synthetisierten MPs die Möglichkeit, co-translational in die bereitgestellten Doppelschichten 6,7 einzufügen (Abbildung 1). Nanoscheiben, die aus einem Membrangerüstprotein (MSP) bestehen, das eine planare Lipiddoppelschichtscheibe8 umgibt, scheinen für diese Strategie 9,10 besonders geeignet zu sein. Nanoscheiben können routinemäßig in vitro mit einer Vielzahl verschiedener Lipide zusammengesetzt werden, sie sind sehr stabil und die Bestände können bis zu 1 mM konzentriert werden. Die MSP-Expression in E. coli und ihre Reinigung ist jedoch notwendig. Als alternative Strategie kann MSP zusammen mit dem Ziel-MP in CF-Reaktionen exprimiert werden, die mit Liposomen11,12,13 versorgt werden. DNA-Templates für MSP und MP werden der Reaktion hinzugefügt und MP / Nanodiscs können sich bei der Expression bilden. Während die MSP-Produktion vermieden wird, erfordert die Co-Expressionsstrategie eine sorgfältige Feinabstimmung der endgültigen DNA-Template-Konzentrationen, und höhere Schwankungen in der Effizienz der Probenproduktion sind zu erwarten.

Das co-translationale Einfügen von MPs in Membranen vorgeformter Nanoscheiben ist ein unphysiologischer und noch weitgehend unbekannter Mechanismus, der unabhängig von Translokationsmaschinen und Signalsequenzen13,14,15,16 ist. Hauptdeterminanten der Insertionseffizienz sind die Art des Membranproteins sowie die Lipidzusammensetzung der bereitgestellten Membran, wobei häufig negativ geladene Lipidebevorzugt werden 15,17. Da die Nanoscheibenmembranen relativ begrenzt sind, wird bei MP-Insertion18 eine beträchtliche Menge an Lipiden freigesetzt. Die Variation der Nanoscheibengröße ermöglicht das Einfügen und Einstellen von höheren oligomeren MP-Komplexen15,18. Unter anderem wurde der korrekte Aufbau homooligomerer Komplexe für den Ionenkanal KcsA, für die Ionenpumpe Proteorhodopsin (PR) und für den Multidrug-Transporter EmrE15,18 gezeigt. MPs werden wahrscheinlich von beiden Seiten mit relativ gleicher Frequenz in die symmetrische Nanoscheibenmembran eindringen. Es sollte daher berücksichtigt werden, dass verschiedene Monomere oder Oligomere, die in eine Nanoscheibe eingefügt werden, entgegengesetzte Orientierungen aufweisen können. Eine Verzerrung der Orientierung könnte jedoch durch kooperative Insertionsmechanismen verursacht werden, wie sie für die Bildung von PR-Hexamern und KcsA-Tetrameren berichtetwurden 18. Eine weitere Verzerrung in der MP-Orientierung könnte sich aus Orientierungsschaltern von eingefügten MPs ergeben, wahrscheinlich am Rand der Nanoscheibenmembranen.

Die Herstellung von CF-Lysaten aus E. coli-Stämmen ist eine zuverlässige Routinetechnik und kann in fast jedem biochemischen Labor durchgeführt werden19,20. Es sollte berücksichtigt werden, dass neben der Disulfidbrückenbildung die meisten anderen posttranslationalen Modifikationen fehlen, wenn ein MP mit E. coli-Lysaten synthetisiert wird. Während dies homogenere Stichproben für Strukturstudien erzeugen könnte, kann es notwendig sein, mögliche Auswirkungen auf die Funktion einzelner MP-Ziele auszuschließen. Die effiziente Herstellung von qualitativ hochwertigen Proben von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)14,21,22, eukaryotischen Transportern23 oder großen heteromeren Anordnungen 24 in E. coli-CF-Lysaten zeigt jedoch deren Eignung auch für komplexe Targets. Präparative Skalenmengen (≈ 1 mg/ml) einer Probe können mit der CECF-Konfiguration (Continuous Exchange Cell-Free) mit zwei Kompartimenten erhalten werden, die aus einem Reaktionsgemisch (RM) und einem Fütterungsgemisch (FM) besteht. Das FM-Volumen übersteigt das RM-Volumen um das 15- bis 20-fache und bietet ein Reservoir an niedermolekularen Energieverbindungen und Vorläufern19. Die Expressionsreaktion wird somit um mehrere Stunden verlängert und die Endausbeute des MP-Targets erhöht. Die RM- und FM-Fächer sind durch eine Dialysemembran mit einem Cutoff von 10-14 kDa getrennt. Die beiden Kompartimente erfordern ein spezielles Design des CECF-Reaktionsbehälters (Abbildung 1). Kommerzielle Dialysekassetten als RM-Container in Kombination mit maßgeschneiderten Plexiglasbehältern mit dem FM sind geeignete Beispiele. MP-Ausbeuten können weiter manipuliert werden, indem das RM:FM-Verhältnis geändert oder das FM nach einer bestimmten Inkubationszeit ausgetauscht wird.

Ausbeute und Qualität eines MP erfordern häufig eine intensive Optimierung der Reaktionsparameter. Ein wichtiger Vorteil der CF-Expression ist die Möglichkeit, nahezu jede Verbindung nach den individuellen Anforderungen eines MP zu modifizieren und zu feinabstimmen. Eine einfache Strategie besteht darin, sich zunächst auf die Verbesserung der Ausbeute eines MP zu konzentrieren, indem ein grundlegendes Produktionsprotokoll erstellt wird, und dann die MP-Qualität durch Feinabstimmung der Reaktions- und Faltbedingungen zu optimieren. Das Fehlen physiologischer Prozesse in CF-Lysaten und deren reduzierte Komplexität führen zu hohen Erfolgsraten für die effiziente Herstellung von MPs25. Routineüberlegungen für das Design von DNA-Templates und die Optimierung derMg2+-Ionenkonzentration reichen in den meisten Fällen aus, um zufriedenstellende Ausbeuten zu erzielen26. Je nach Ausdrucksmodus kann die Optimierung der MP-Qualität zeitaufwändig werden, da eine größere Vielfalt von Parametern gescreent werden muss14,17,22.

Um die beschriebene CF-Expressionsplattform zu etablieren, sind Protokolle für die Herstellung von E. coli-CF-Lysat (i), T7-RNA-Polymerase (ii), Nanodiscs (iii) und den grundlegenden CECF-Reaktionsverbindungen (iv) erforderlich (Abbildung 1). Die E. coli K12 Stamm A1927 oder BL21 Derivate werden häufig zur Herstellung von effizienten S30 (Zentrifugation bei 30.000 x g) Lysaten verwendet. Neben S30-Lysaten können entsprechende Lysate verwendet werden, die bei anderen g-Kräften (z.B. S12) zentrifugiert wurden. Die Lysate unterscheiden sich in der Expressionseffizienz und in der Proteomkomplexität. Das Proteom des nach dem beschriebenen Protokoll hergestellten S30-Lysats wurde eingehenduntersucht 28. Das S30-Proteom enthält noch einige restliche äußere Membranproteine, die Hintergrundprobleme bei der Expression und Analyse von Ionenkanälen verursachen könnten. Für solche Ziele wird die Verwendung von S80-S100-Lysaten empfohlen. Eine wertvolle Modifikation während der Lysataufbereitung ist die Induktion der SOS-Antwort durch kombinierte Hitzeschock- und Ethanolzufuhr in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase der Zellen. Die resultierenden HS30-Lysate sind mit Chaperonen angereichert und können in Mischungen mit S30-Lysaten für eine verbesserte MP-Faltungverwendet werden 22. Die CF-Expression in E. coli-Lysaten wird als gekoppelter Transkriptions-/Translationsprozess mit DNA-Templates betrieben, die Promotoren enthalten, die von der T7-RNA-Polymerase (T7RNAP) kontrolliert werden . Das Enzym kann effizient in BL21(DE3)-Sternzellen hergestellt werden, die das pAR1219-Plasmid29 tragen.

Zwei Kopien von MSP1E3D1 fügen sich zu einer Nanoscheibe mit einem Durchmesser von 10-12 nm zusammen, aber das unten beschriebene Protokoll kann auch für andere MSP-Derivate funktionieren. Nanoscheiben, die größer sind als die mit MSP1E3D1 gebildeten, sind jedoch tendenziell weniger stabil, während kleinere Nanoscheiben, die mit MSP-Derivaten wie MSP1 gebildet werden, möglicherweise keine größeren MPs oder MP-Komplexe aufnehmen. MSP1E3D1-Nanoscheiben können in vitro mit einer Vielzahl unterschiedlicher Lipide oder Lipidgemische zusammengesetzt werden. Vorgeformte Nanoscheiben sind in der Regel für > 1 Jahr bei -80 °C stabil, während die Stabilität für verschiedene Lipidkomponenten variieren kann. Für das Screening von Lipideffekten auf die Faltung und Stabilität eines MP ist es notwendig, einen umfassenden Satz von Nanoscheiben herzustellen, die mit einer repräsentativen Vielfalt von Lipiden / Lipidmischungen zusammengesetzt sind. Die folgenden Lipide können eine gute Ausgangsauswahl ergeben: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), 1,2 Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerin) (DOPG), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC).

Ein Protokoll zur Herstellung einer 3-ml-CECF-Reaktion wird beschrieben. Eine weitere Skalierung nach oben oder unten im Verhältnis 1:1 ist möglich. Für die CECF-Konfiguration mit zwei Kompartimenten muss ein RM hergestellt werden, der alle Verbindungen enthält, und ein FM, der nur die niedermolekularen Verbindungen enthält. Handelsübliche 3-ml-Dialysegeräte mit 10-14 kDa MWCO können als RM-Behälter verwendet werden, die dann in speziell angefertigte Plexiglasbehälter mit dem FM (Abbildung 1D)30 gelegt werden. Das Verhältnis von RM:FM beträgt 1:20, so dass 60 mL FM für 3 mL RM vorbereitet werden müssen. Qualität, Konzentration oder Art mehrerer Komponenten können für die Endausbeute und/oder Qualität des synthetisierten MP entscheidend sein (Tabelle 1). DNA-Templates sollten nach veröffentlichten Richtlinien erstellt werden und die Codon-Optimierung des Leserahmens des Ziels kann die Produktausbeute weiter signifikant verbessern26. Für die CECF-Reaktion im präparativen Maßstab wird ein etabliertes Protokoll für die Herstellung von PR beschrieben. Um Expressionsprotokolle für neue MPs zu erstellen, ist es in der Regel notwendig, Optimierungsscreens bestimmter Verbindungen (Tabelle 1) durchzuführen, um Ausbeute und Qualität zu verbessern. Für Mg2+ Ionen existiert ein gut fokussiertes Konzentrationsoptimal, das häufig signifikante Variationen für verschiedene DNA-Templates zeigt. Andere CF-Reaktionsverbindungen wie neue Chargen von T7RNAP oder S30-Lysaten können die optimaleMg2+ -Konzentration weiter verschieben. Als Beispiel wird ein typischer Mg 2+ Bildschirm im Bereich von 14-24 mM Konzentration und in Schritten von 2 mM beschrieben. Jede Konzentration wird in Duplikaten und in analytischen Reaktionen des CECF untersucht. Als CECF-Reaktionsbehälter werden kundenspezifische Mini-CECF-Plexiglasbehälter30 mit dem RM in Kombination mit Standard-24-Well-Mikroplatten verwendet, die das FM enthalten (Abbildung 1B). Alternativ können handelsübliche Dialysekartuschen in Kombination mit 96-tiefen Mikrotiterplatten oder anderen handelsüblichen Dialysatorgeräten in geeigneten Aufbauten verwendet werden (Abbildung 1C).

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Protocol

1. Herstellung von S30-Lysat

  1. Tag 1: Streifen Sie Zellen aus Glycerinvorräten auf einer LB-Agarplatte aus und inkubieren Sie bei 37 ° C über Nacht.
  2. Tag 2: 200 ml LB-Medium mit den Zellen von der Agarplatte inokulieren und bei 37 °C für 12-14 h inkubieren.
  3. Tag 3: 10 l steriles YPTG-Medium (10 g/L Hefeextrakt, 16 g/L Trypton, 5 g/L NaCl, 19,8 g/L Glucose, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) temperiert auf 37 °C in einem 15 L Rührkesselreaktor mit 100 mL der Vorkultur (1:100) temperiert. Bei 37 °C, 500 U/min und hoher Belüftung (~ 3 Luftmengen pro Minute) kultivieren. Um übermäßige Schaumbildung zu vermeiden, fügen Sie steriles Antischaum hinzu.
  4. Messen Sie die optische Dichte (OD) bei 600 nm in regelmäßigen Zeitintervallen. Nach ca. 2 h tritt die Kultur in die Log-Phase ein.
  5. Modifikation für HS30 Lysat: Wenn sich die Zellen in der mittleren Log-Phase befinden (OD600 ≈ 3,6-4,2), fügen Sie dem Kulturmedium 300 ml Ethanol hinzu und setzen Sie die Kultivierung bei 42 °C, 500 U/min und hoher Belüftung (ca. 3 Luftvolumina pro Minute) für weitere 45 Minuten fort. Fahren Sie dann mit dem Abkühlen und Ernten der Zellkultur fort, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Für die Herstellung von Standard-S30-Lysat überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 1.6 fort.
  6. Wenn sich die Zellen in der mittleren Log-Phase befinden (OD600 ≈ 3,6-4,2), kühlen Sie den Fermenter innerhalb von < 30 min unter 20 °C. Der endgültige OD600 sollte etwa 4,5-5,5 betragen. Ernten Sie die Zellen bei 4.500 x g für 20 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Halten Sie die Zellen während der folgenden Schritte bei 4 °C.
    HINWEIS: Während des Abkühlens kann es zu übermäßiger Schaumbildung kommen. In diesem Fall entweder Antischaummittel hinzufügen oder die Rührgeschwindigkeit reduzieren und/oder den Luftstrom im Bioreaktor verringern.
  7. Die Zellen werden vollständig in 300 mL S30-A-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-Mercaptoethanol) mit einem Spatel suspendiert, gefolgt von einer Pipettierung der Suspension auf und ab bis zur Homogenität. Zentrifugieren bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
    ACHTUNG: 2-Mercaptoethanol ist giftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut oder Atemwegen. Wenn möglich, arbeiten Sie unter einer Haube. Wiegen Sie das leere Zentrifugenbecherglas vor dem letzten Waschschritt. Nach der Zentrifugation das Nasszellenpellet wiegen und entweder mit Schritt 1.8 fortfahren oder das Pellet bis zur weiteren Verwendung lagern.
    HINWEIS: Das Gewicht des Nasszellenpellets beträgt 5-7 g pro 1 L Bioreaktorkultur. An diesem Punkt kann das Protokoll pausiert werden und das Pellet kann in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C für 4-8 Wochen gelagert werden.
  8. Suspendieren Sie die Zellen gründlich in 1,1 Volumina (1 g = 1 ml) S30-B-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 Tablette cOmplete Proteaseinhibitor). Füllen Sie die Suspension in eine vorgekühlte französische Pressdruckzelle und brechen Sie die Zellen bei 1.000 psig. Einmal Zellen durch die französische Presse führen.
  9. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 30.000 x g für 30 min bei 4 °C. Den Überstand in ein frisches Röhrchen geben und den Zentrifugationsschritt wiederholen.
    HINWEIS: Auf dem Pellet kann nach der ersten Zentrifugation eine lose und schleimige Schicht vorhanden sein, die nicht mit dem Überstand übertragen werden sollte.
  10. Wenden Sie einen hohen Salz- und Hitzeschritt an, um instabile Lysatkomponenten zu entfernen und mRNA aus Ribosomen freizusetzen. Das Lysat wird auf 0,4 M NaCl eingestellt und bei 42 °C 45 Minuten im Wasserbad inkubiert.
    HINWEIS: Dieser Schritt führt zu einer signifikanten Niederschlagsbildung. Drehen oder invertieren Sie das Röhrchen während der Inkubation von Zeit zu Zeit.
  11. Die trübe Suspension (normalerweise 50-80 ml) wird in Dialyseröhrchen mit einem Cutoff von 10-14 kDa überführt und gegen 5 L S30-C Puffer dialysiert (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Tauschen Sie den S30-C Dialysepuffer nach 2-3 h aus und dialysieren Sie für weitere 12-14 h.
  12. Tag 4: Die dialysierte Suspension in Zentrifugenröhrchen geben und bei 30.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Überstand (S30-Lysat) in frische 50-ml-Röhrchen geben und vorsichtig mischen. Die Proteinkonzentration des Lysats sollte ca. 30-40 mg/ml betragen. Aliquots (z.B. 0,5 ml, 1 ml) in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern. Die Aliquots sind für > 1 Jahr stabil.

2. Expression und Aufreinigung der T7-RNA-Polymerase

  1. Tag 1: 200 mL LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin mit frisch plattierten BL21(DE3) Star x pAR1219-Zellen inokulieren und bei 37 °C und 180 U/min für 12-16 h inkubieren.
  2. Tag 2: 1 L große Brühe (12 g/L Trypton, 24 g/L Hefeextrakt, 4 ml/L Glycerin) in einem 2 L Kolben mit 10 ml der Vorkultur inokulieren und bei 37 °C und 180 U/min Rühren inkubieren. Der Start-OD600 sollte etwa 0,1 betragen.
  3. Wenn der OD600 0,6-0,9 erreicht, fügen Sie IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzu, um die T7RNAP-Expression zu induzieren, und setzen Sie die Kultivierung für weitere 5 Stunden fort.
  4. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.500 x g für 20 min bei 4 °C. Zellen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
  5. Tag 3: 30 mL eiskalter Suspensionspuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 mit einer Tablette cOmplete-Proteaseinhibitor) in das gefrorene Zellpellet geben und das Pellet in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auftauen. Dann suspendieren Sie das Pellet, indem Sie auf und ab pipettieren, bis die Homogenität erreicht ist.
  6. Führen Sie den Zellaufschluss mit einer französischen Presse durch, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, oder verwenden Sie ein Ultraschallgerät gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Anschließend bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren und Überstand in ein frisches Röhrchen überführen.
  7. Um genomische DNA auszufällen, fügen Sie Streptomycinsulfat langsam und unter sanftem Rühren zum Überstand hinzu, bis eine Endkonzentration von 3% (w/v) erreicht ist. Bei 4 °C 5-10 min unter leichtem Rühren inkubieren. Zentrifugieren bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C.
  8. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45 μm-Filter und laden Sie ihn mit einer Schlauchpumpe mit einer Durchflussrate von 4 ml/min auf eine Q-Sepharose-Säule mit einem Säulenvolumen (CV) von 40 mL, das mit 2 CV-Äquilibrierungspuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% Glycerin und 10 mM 2-Mercaptoethanol) ausgeglichen ist. Verbinden Sie dann die Säule mit einem UV-Detektor und setzen Sie die Elution mit Gleichgewichtspuffer fort, bis das UV-Signal bei 280 nm eine stabile Basislinie erreicht.
  9. Elue T7RNAP mit einem Gradienten von 50 mM bis 500 mM NaCl pro CV bei einer Flussrate von 3 mL/min. Sammeln Sie 1 ml Fraktionen und bereiten Sie Proben für die SDS-PAGE-Analyse vor, indem Sie 10 μL jeder Fraktion mit 2 x SDS-Probenpuffer mischen. Führen Sie SDS-PAGE aus und färben Sie das Gel mit Coomassie Blue R. T7RNAP sollte als prominente Bande bei etwa 90 kDa zusammen mit zahlreichen zusätzlichen Verunreinigungsbanden erscheinen.
  10. Poolfraktionen, die T7RNAP enthalten und unter Verwendung von Membranen mit einem 12-14 kDa MWCO für 12-16 h in Dialysepuffer (10 mMK2HPO4/KH2PO4, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) Glycerin) dialysieren).
  11. Tag 4: T7RNAP-Lösung sammeln und mit Filtereinheiten mit 12-14 MWCO auf eine Endkonzentration von 3-10 mg/ml konzentrieren. T7RNAP kann während der Konzentration ausfallen. Stoppen Sie die Konzentration sofort, sobald Trübung in der Probe auftritt. Fügen Sie Glycerin auf eine Endkonzentration von 50% (w/v) hinzu und mischen Sie vorsichtig. 0,5-1 ml Aliquots schockgefrieren und bei -80 °C lagern. Funktionierende T7RNAP-Aliquots können bei -20 °C gelagert werden.
    HINWEIS: Etwa 20-40 mL 5 mg/ml teilgereinigtes T7RNAP mit 20.000-40.000 Einheiten sollten aus einer 1-L-Fermentation gewonnen werden. Um die optimale Menge jeder T7RNAP-Charge zu testen, sollten CF-Expressionsreaktionen von grün fluoreszierendem Protein (GFP) durchgeführt werden, die 0,02 mg/ml-0,1 mg/ml der vorbereiteten T7RNAP-Probe enthalten.

3. Expression und Reinigung von MSP1E3D1

  1. Tag 1: Transformation von E. coli BL21 (DE3) Sternzellen mit dem pET28(a)-MSP1E3D1-Vektor31 unter Verwendung von Standard-Hitzeschocktransformations- oder Elektroporationsprotokollen. Streifen oder plattentransformierte Zellen auf LB-Agar mit 30 μg/ml Kanamycin aus und inkubieren bei 37 °C für 12-16 h.
  2. Tag 2: Beimpfen Sie 200 ml LB-Medium, ergänzt mit 0,5% (w/v) Glucose und 30 μg/ml Kanamycin mit einer einzigen Kolonie, die von der Agarplatte gepflückt wird, und inkubieren Sie bei 37 °C bei 180 U/min für 12-16 h.
  3. Tag 3: 10 L LB-Medium ergänzt mit 0,5% (w/v) Glucose und 30 μg/ml Kanamycin mit 100 mL der Vorkultur in einem Rührkessel-Bioreaktor. Fermentation bei 37 °C, 500 U/min und Belüftung von ca. 3 Bioreaktorvolumina pro Minute. Bei übermäßiger Schaumbildung Antischaum hinzufügen.
    HINWEIS: Anstelle eines Fermenters können verwirrte Schüttelkolben verwendet werden.
  4. Bei OD600 von 6,5-7,5 wird IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt und die Inkubation bei 37 °C für 1 h fortgesetzt. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.500 x g für 20 min bei 4 °C. Zellpellets mit 200 mL 0,9% (w/v) NaCl waschen und nochmals bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und übertragen Sie die Zellen mit einem Spatel in 50-ml-Röhrchen. Das erwartete Gewicht der nassen Pellets beträgt 8-12 g pro L Bioreaktorkultur. Schockgefrierzellpellets in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
  5. Tag 4: Zur Reinigung die Zellpellets in einem Wasserbad bei RT auftauen. Suspendieren Sie die Zellen in MSP-A-Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, 1 Tablette c0mplete protease inhibitor cocktail pro 50 ml Zellsuspension), um eine 30-40% (w/v) Zellsuspension zu erhalten.
  6. Zellen durch Ultraschall oder mit einer französischen Presse aufbrechen und bei 30.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird in ein frisches Rohr überführt und durch einen 0,45-μm-Filter gefiltert. Das Filtrat wird unter Verwendung einer Peristaltikpumpe auf eine mit Ni2+ beladene Nitrilotriessigsäuresäule (CV > 15 ml) aufgetragen, die mit 5 CV MSP-B-Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100) äquilibriert ist.
    HINWEIS: Um die Filtration zu erleichtern, kann der Überstand für eine weitere Minute beschallt werden, um große DNA-Fragmente abzubauen.
  7. Nach dem Beladen der Probe die Säule mit 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM Cholsäure), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) und 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol).
    HINWEIS: Cholsäure im MSP-C-Puffer ist wichtig, um an MSP gebundene Lipide zu entfernen. Cholsäure ist bei niedrigen pH-Werten nicht vollständig löslich. Der pH-Wert muss daher bei MSP-C und MSP-D auf 8,9 eingestellt werden. Es ist wichtig, die Säule mit MSP-D-Puffer zu waschen, da ein niedrigerer pH-Wert dazu führen kann, dass Restcholsäure ausfällt und die Säule blockiert oder beschädigt.
  8. Elue MSP mit MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazol). Sammeln Sie Fraktionen von 1 ml und überwachen Sie die UV-Absorption bei 280 nm. Sammeln und bündeln Sie die Fraktionen des Elution Peaks.
  9. Gepoolte MSP-Fraktionen in 12-14 kDa MWCO Dialysemembranröhrchen überführen und gegen 5 L MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/v) Glycerin) für 2-3 h bei 4 °C dialysieren. Wechsel zu frischem 5 L MSP-H Puffer und Dialyse für weitere 12-16 h bei 4 °C.
  10. Tag 5: MSP-Lösung in Zentrifugenröhrchen geben und bei 18.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren, um Niederschlag zu entfernen. Überstand in ein frisches Röhrchen überführen und mit Ultrafiltrationsgeräten mit 12-14 kDa MWCO bei 4 °C auf 200-800 μM konzentrieren. Konzentrationsmessung mit einem UV/VIS-Messgerät. Verwenden Sie den Extinktionskoeffizienten von 27,31 M-1 cm-1 und die Molekülmasse von 31,96 kDa zur Berechnung der Konzentration.
    HINWEIS: Die Expression in einem Bioreaktor ergibt normalerweise 15-30 mg MSP1E3D1 pro L-Kultur.
  11. Aliquots der konzentrierten MSP-Lösung in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80 °C lagern.

4. Bestückung von MSP1E3D1 Nanoscheiben

  1. Tag 1: Bereiten Sie 1-2 ml 50 mM Lipidvorräte (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC oder POPC) in 100 mM Natriumholat vor. Bei Nichtgebrauch am selben Tag bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Die Lipidlösung muss klar sein. Wenn die Lösung nicht klar ist, kann die Natriumcholatkonzentration auf 150 mM erhöht werden.
  2. Mischen Sie die MSP1E3D1-Lösung mit der Lipidlösung. Fügen Sie Dodecylphosphocholin (DPC) in einer Endkonzentration von 0,1% (w / v) hinzu. Montagereaktionen können auf Endvolumina von 3 ml (Tabelle 2) oder 12 ml entsprechend typischen Volumina von Dialysekassetten (10 kDa MWCO) eingestellt werden. Montagereaktionen für 1 h bei 21 °C unter leichtem Rühren inkubieren.
    HINWEIS: Für jedes Lipid muss ein spezifisches MSP1E3D1:Lipid-Verhältnis verwendet werden, um eine homogene Nanoscheibenpräparation zu gewährleisten (Tabelle 2). Für neue Lipide oder Lipidgemische sollte das optimale Verhältnis mit einem Pilotversuch und einer Größenausschlusschromatographie-Analyse bestimmt werden14.
  3. Die Membran einer Dialysekassette mit Disc Formation (DF) Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl) vorbenetzen. Das Montagegemisch mit einer Spritze in die Dialysekassette überführen. Potentielle Luftblasen können durch Absaugen mit der Spritze entfernt werden.
  4. Tag 1-4: Dialysieren gegen 3 x 5 L DF Puffer für 10-20 h bei RT unter Rühren mit einem Rührstab. Anschließend wird das Montagegemisch von der Dialysekassette in Zentrifugalfiltereinheiten mit 10 kDa MWCO mit DF-Puffer überführt. Konzentrat bei 4.000 x g bei 4 °C.
    HINWEIS: Eine trübe Dialysemischung könnte auf ein falsches stöchiometrisches Verhältnis von MSP:Lipid hinweisen. Der Niederschlag muss bei 18.000 x g für 20 min bei 4 °C vor der Konzentration der Probe entfernt werden. Um Ausfällungen während der Probenkonzentration zu vermeiden, verwenden Sie Ultrafiltrationseinheiten mit einem großen Deadstop.
  5. Die zusammengesetzten Nanoscheiben werden auf eine Konzentration von mindestens 300 μM konzentriert. Messen Sie die Konzentration mit einem UV/VIS-Lesegerät. Bedenken Sie, dass eine Nanoscheibe aus zwei MSP1E3D1-Molekülen besteht und daher die Konzentration von MSP durch 2 geteilt werden muss, um die richtige Menge an Nanoscheiben zu bestimmen.
    HINWEIS: Der beschriebene Aufbau (Tabelle 2) ergibt 0,6-1 ml einer 300 μM Nanoscheibenlösung.
  6. Zentrifugieren Sie das konzentrierte Nanoscheibenpräparat bei 18.000 x g für 20 min bei 4 °C, um Niederschlag zu entfernen. Dann saugen Sie den Überstand an und frieren Sie 50 μL Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und lagern Sie ihn bei -80 °C.
    HINWEIS: Es ist ratsam, den Erfolg der Nanoscheibenbildung mittels Größenausschlusschromatographie zu bewerten. Die Probe sollte monodispers sein und nur eine geringe Menge an Aggregaten enthalten. Aggregate zeigen an, dass die Lipidmenge im Setup zu hoch ist. Als Referenz kann gereinigtes MSP1E3D1 verwendet werden. Wenn das Nanoscheibenpräparat einen Peak in Höhe des Referenz-MSP1E3D1-Peaks aufweist, war das gewählte Verhältnis von Lipid zu MSP1E3D1 zu niedrig.

5. Präparativer Skala 3 mL CECF Reaktionsaufbau

  1. Tag 1: Bereiten Sie alle erforderlichen Stammlösungen wie aufgeführt vor (Tabelle 3). Die Bestände werden bei -20 °C gelagert und bei Raumtemperatur aufgetaut. Achten Sie darauf, alle Bestände nach dem Auftauen und vor dem Pipettieren gründlich zu mischen. Berechnen Sie die erforderlichen Volumina für alle Bestände, und erstellen Sie ein Pipettierschema (Tabelle 4). Hochmolekulare Verbindungen werden nur dem RM zugesetzt. Für die niedermolekularen Verbindungen kann ein kombinierter 3 x Mastermix für RM und FM hergestellt werden.
    HINWEIS: Die Endvolumina von Mischungen können aufgrund des Volumenverlusts während des Mischens geringer sein als berechnet. Dies kann vermieden werden, indem ein überschüssiges Volumen von 2-5% hinzugefügt wird, um den Volumenverlust auszugleichen.
  2. Die Membran einer 3-ml-Dialysekassette wird in 100 mM Tris-Acetat, pH 8,0 ausgeglichen. Stellen Sie sicher, dass Sie überschüssigen Puffer entfernen.
  3. Verwenden einer Spritze, um die RM in die Dialysekassette zu übertragen. Entfernen Sie überschüssige Luft im RM-Fach durch Absaugen mit der Spritze. Legen Sie die Dialysekassette in die Dialysekammer.
  4. Füllen Sie die Dialysekammer mit 60 ml FM. Setzen Sie den Deckel auf die Kammer und ziehen Sie die Schrauben fest, um sie zu fixieren. Die Kammer 12-16 h bei 30 °C bei 200 U/min inkubieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kammer während des Rührens in der aufrechten Position bleibt, da sonst der Austausch niedermolekularer Verbindungen behindert wird.
  5. Tag 2: Saugen Sie das RM mit einer Spritze aus der Dialysekammer ab. Das RM in frische Röhrchen geben und bei 16.000 x g bei 4 °C 10 min zentrifugieren, um den Niederschlag zu entfernen. Den Überstand in frische Röhrchen überführen. Das Protein im Überstand kann nun weiter analysiert werden.
    HINWEIS: In einigen Fällen ist nach der Zentrifugation ein Pellet vorhanden. Dies kann wichtige Informationen über die Eignung der analysierten Nanoscheiben oder der Reaktionsverbindungen liefern, um das synthetisierte MP löslich zu halten. Es ist daher ratsam, die Menge des potentiell im Niederschlag vorhandenen Ziels mit SDS-PAGE, Western Blot oder durch visuelle Auswertung der Pelletgröße zu analysieren.

6. Analyseskala 60 μL CECF-Reaktionsaufbau für Mg2+ Ionenscreening

  1. Tag 1: Mischen Sie alle Komponenten des jeweiligen 3x Mastermixes und verteilen Sie 60 μL auf den RM und 825 μL auf den FM. FM mit H2O auffüllen und FM durchWirbeln mischen. Übertragen Sie FM in 3 Vertiefungen der 24-Well-Mikroplatte (Tabelle 5).
    HINWEIS: Da der kundenspezifische Mini-CECF-Behälter möglicherweise nicht zugänglich ist, werden die Volumina in Tabelle 5 für eine Reaktion berechnet, die in Dialysekartuschen (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) mit einem FM-Volumen von 1,7 ml in 96 Vertiefungsplatten (2 ml) durchgeführt wird (Abbildung 1).
  2. Regenerierte Cellulosedialyseschläuche mit einem 10-14 kDa MWCO in ca. 25 x 20 mm große Stücke schneiden und inH2Omit 0,05% (w/v) Natriumazid lagern.
    ACHTUNG: Natriumazid ist sehr giftig. Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit Haut oder Schleimhaut. Verwenden Sie keine Metallbehälter, da Natriumazid mit Metallen reagieren kann, um explosive Metallazide zu bilden.
  3. Entfernen Sie vor der Mini-CECF-Behältermontage überschüssiges H2O mit einem Gewebe von den Dialysemembranen. Legen Sie ein Membranstück auf jeden Behälter und fixieren Sie die Membranen mit einem Polytetrafluorethylenring.
  4. Den Mini-CECF-Behälter in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 825 μL FM überführen. Vermeiden Sie Luftblasen unter der Dialysemembran des Mini-CECF-Behälters.
  5. Fügen Sie dem RM wie beschrieben hochmolekulare Komponenten hinzu (Tabelle 5) und mischen Sie durch Pipettieren auf und ab. 60 μL in den Reaktionsbehälter geben. Vermeiden Sie Luftblasen während des Transfers der viskosen Lösung.
  6. Schneiden Sie 2 8 x 10 cm große Platten einer thermoplastischen Dichtungsfolie aus und wickeln Sie sie um die 24-Well-Platte mit den Reaktionsbehältern im Inneren. Dadurch wird die Verdampfung aus dem Reaktionsgemisch reduziert. Legen Sie nun den Deckel der Zellkulturplatte auf die Platte und fixieren Sie sie mit Klebeband. Die Platte bei 30 °C und 200 U/min Rühren für 12-16 h inkubieren.
  7. Tag 2: Die Reaktionsmischung wird durch Durchstechen der Dialysemembran mit der Pipetenspitze am Mini-CECF-Behälter geerntet und die RM abgesaugt. RM in frische Röhrchen geben und 10 min bei 16.000 x g bei 4 °C zentrifugieren, um Ausscheidungen zu entfernen. Den Überstand in frische Röhrchen überführen. Das Protein im Überstand kann nun weiter analysiert werden.
    HINWEIS: In einigen Fällen ist nach der Zentrifugation ein Pellet vorhanden. Dies kann wichtige Informationen über die Eignung der analysierten Nanoscheiben oder anderer Reaktionsverbindungen liefern, um das synthetisierte MP löslich zu halten. Es ist daher ratsam, die Menge des potentiell im Niederschlag vorhandenen Ziels durch SDS-PAGE, Western Blot oder visuelle Bewertung der Pelletgröße zu analysieren.

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Representative Results

Der Einfluss der Feinabstimmung von Reaktionsverbindungen auf die Endausbeute oder Qualität synthetisierter MPs wird veranschaulicht. Ein häufiger Routineansatz besteht darin, die optimaleMg2+-Konzentration in CF-Reaktionen durch Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als bequemen Monitor der Systemeffizienz einzustellen. Als Beispiel wurde GFP aus einem pET-21a(+)-Vektor beiMg2+-Konzentrationen zwischen 14 und 24 mM synthetisiert (Abbildung 2). Die SDS-PAGE-Analyse identifizierte die optimaleMg2+-Konzentration bei 20 mM (Abbildung 2A), die gut mit komplementären Fluoreszenzmessungen (Anregung bei 485 nm, Emissionsmessung bei 535 nm) des CF-Reaktionsüberstands (Abbildung 2B) übereinstimmt. Für die CF-Expression der bakteriellen PR aus pIVEX 2.3-Vektor und des adrenergen Truthahnrezeptors β 1 (Tβ1AR), exprimiert aus pET-21a(+)-Vektor, wurde die optimale Mg2+-Konzentration bei 20-22 mM identifiziert.

Als weiteres Beispiel wird die Qualitätsverfeinerung synthetisierter MPs mit der beschriebenen Strategie gezeigt. Abstimmbare Parameter für die kotranslationale Insertion von MPs in vorgeformte Nanoscheiben sind (i) die Lipidzusammensetzung der Nanoscheibenmembran und (ii) die endgültige Nanoscheibenkonzentration in der Reaktion. Es ist bekannt, dass die hydrophobe Umgebung ein wichtiger Parameter für die korrekte Faltung, oligomere Montage und Stabilität von MPs ist. Da die Lipidzusammensetzung in Nanoscheiben moduliert werden kann, ermöglicht der beschriebene Ansatz ein einfaches systematisches Screening von Lipideffekten auf Struktur und Funktion eines MP. In ersten Versuchen wird empfohlen, Lipide mit Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylglycerin (PG) Kopfgruppen zu screenen und verschiedene Kettenlängen und Sättigungen zu testen. Der Einfluss der Membranzusammensetzung und der Nanoscheibenkonzentration auf die Solubilisierungseffizienz und -qualität von zwei verschiedenen MPs wird gezeigt. PR ist eine lichtaktivierte Protonenpumpe und ein sehr stabiles und hochsynthetisiertes MP, das Endkonzentrationen von > 100 μM im RM erreicht. Daher wird empfohlen, es als Positivkontrolle zu verwenden, um einen korrekten Reaktionsaufbau zu gewährleisten, da die PR-Konzentration leicht durch Messung der Absorption bei 530 nm im RM-Überstand beurteilt werden kann. Im Gegensatz dazu ist Tβ1AR ein Beispiel für die große Familie der eukaryotischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und ist ein komplexes und instabiles MP. Zur bequemen Überwachung wurde ein Tβ1AR-GFP-Fusionskonstrukt synthetisiert und die Gesamtkonzentration des Nanodisc-solubilisierten Rezeptors in den CF-Reaktionen mittels GFP-Fluoreszenz bestimmt (Abbildung 3A). Der Anteil des funktionell gefalteten und ligandenbindenden aktiven Rezeptors wurde weiter mit einem Filterbindungsassay und dem markierten Liganden [3H]-Dihydroalprenolol bestimmt (Abbildung 3B). Der Filterbindungsassay wurde wie zuvor beschriebendurchgeführt 14. Kurz gesagt, wurde die Tβ1AR-GFP-Konzentration im RM über seine Fluoreszenz bestimmt. Der GPCR wurde mit dem radioaktiv markierten Liganden für 1 Stunde bei 20 °C inkubiert, auf einen Filter aufgetragen und ungebundener Ligand wurde abgewaschen. Zur Bestimmung der unspezifischen [3H]-Dihydroalprenololbindung wurde der Rezeptor in einer Kontrollreaktion mit unmarkiertem Alprenolol gesättigt. Die Anzahl des radioaktiven Liganden in den Filtern wurde in einem Szintillationszähler gemessen und die Menge des gebundenen Liganden über seine spezifische Markierungsaktivität bestimmt. Die prozentuale GPCR-Bindungsaktivität wurde dann aus der Menge des gebundenen Liganden, der Tβ1AR-GFP-Konzentration und dem Assay-Volumen berechnet. Die Gesamtsynthese und Nanoscheiben-Solubilisierung von Tβ1AR-GFP ist bei allen analysierten Membranzusammensetzungen ähnlich und liegt im Bereich von 8-13 μM (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu ist eine viel höhere Variation in der Qualität des synthetisierten GPCR nachweisbar. Die niedrigste Aktivität mit weniger als 10% aktiver Fraktion wird mit den Lipiden DMPC und POPC erreicht. Mit DOPG und POPG konnte der aktive Anteil von Tβ1AR-GFP auf ca. 30% erhöht werden (Abbildung 3B). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ladung der Lipidkopfgruppe sowie die Flexibilität der Fettsäurekette wichtige Modulatoren für die Faltung und Aktivität dieses GPCR sind.

Neben der Zusammensetzung der Nanoscheiben kann ihre Endkonzentration in der CF-Reaktion ein wichtiger Faktor für die MP-Qualität sein. Sobald eine geeignete Membranzusammensetzung einer Nanoscheibe identifiziert wurde, sollte ihre Konzentration während der MP-Synthese untersucht werden. Es ist offensichtlich, dass die Nanoscheibenkonzentration entsprechend der Expressionseffizienz eines MP angepasst werden muss. Die CF-Synthese des Tβ1AR-GFP-Rezeptors und PR führt zu Endkonzentrationen von etwa 10 μM bzw. 100 μM im RM. Wenn die Nanoscheibenkonzentration in einem Bereich von 3,75-60 μM gescreent wird, wird eine vollständige Solubilisierung der GPCR bei etwa 30 μM Nanoscheiben erreicht, was ein Verhältnis von Tβ 1 AR:Nanodisc von1:3 ergibt (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu wird eine vollständige Solubilisierung der PR bereits mit ca. 10 μM Nanoscheiben erreicht und ergibt ein PR:Nanoscheiben-Verhältnis von 10:1 (Abbildung 4B). Ein Überschuss an Nanoscheiben ist daher notwendig, um eine nahezu vollständige Solubilisierung von Tβ1AR-GFP zu erreichen, während ein invertiertes Verhältnis im Falle von PR das Einfügen mehrerer PR-Kopien in eine Nanoscheibe anzeigt. Nachfolgende Studien von gereinigten PR/Nanoscheiben-Komplexen mit nativer Massenspektrometrie bestätigten diese Beobachtung und fanden eine Prävalenz höherer oligomerer Formen von PR, wenn sie bei niedrigeren Nanoscheibenkonzentrationen synthetisiert wurden15,18. Die Titration von CF-synthetisierten MPs mit Nanoscheiben kann daher als Werkzeug verwendet werden, um oligomere Anordnungen auszulösen und ihre Auswirkungen auf die MP-Funktion zu untersuchen.

Figure 1
Abbildung 1: CECF-Expressionsstrategie für die Insertion von Membranproteinen in Nanodiscs. (A) Grundlegender Arbeitsablauf, der die wichtigsten Schritte des Prozesses veranschaulicht. (B) Maßgeschneiderte Reaktionsgefäße im analytischen Maßstab für die CECF-Expression. (C) Handelsübliche Dialysekartuschen für den CECF-Aufbau im Analysemaßstab. (D) Präparativer Waagenaufbau (3 ml RM) mit einer 3-ml-Dialysekassette und einem kundenspezifischen FM-Behälter aus Plexiglas. (E) Kotranslationale Insertion von MPs in vorgeformte Nanoscheiben und Lipidscreening in der CECF-Konfiguration. Der RM enthält die erforderlichen Transkriptions-/Übersetzungsmaschinen und Nanoscheiben, während in beiden Kompartimenten niedermolekulare Verbindungen vorhanden sind. Biochemische und strukturelle Anwendungen der hergestellten MP/Nanodisc-Proben werden weiter veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Einfluss verschiedenerMg2+ -Konzentrationen auf die CF-GFP-Synthese. GFP wurde in CF-Reaktionen mit Mg2+ -Konzentrationen in einem Bereich von 14-24 mM synthetisiert. (A) SDS-PAGE-Analyse zeigt die stärkste Bande von GFP bei 20 mM Mg2+. M: Marker. (B) GFP-Fluoreszenz nach CF-Expression mit unterschiedlichenMg2+ -Konzentrationen. Die maximale GFP-Fluoreszenz bei 20 mM Mg2+ entspricht 4,6 mg/ml. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung einer doppelten Messung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Einfluss der Nanoscheibenmembranzusammensetzung auf die Solubilisierung und Qualität eines CF-synthetisierten GPCR. Ausbeute und Aktivität von Tβ1AR-GFP synthetisiert in Gegenwart von 30 μM Nanoscheiben mit unterschiedlichen Membranzusammensetzungen. Das gesamte synthetisierte Protein ( A ) und der Anteil des ligandenbindenden aktiven Rezeptors (B) werden in μM angegeben. Die Gesamtkonzentration wurde durch Fluoreszenzmessung der GFP-Fusion bestimmt. Die Aktivität wurde mittels Filterbindungsassay mit dem radioaktiv markierten Liganden [3H]-Dihydroalprenolol gemessen. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen unabhängiger Dreifache dar. Daten aus dem zuvor veröffentlichten Manuskript14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Solubilisierungsscreening von CF-synthetisierten MPs mit steigenden Nanoscheibenkonzentrationen. Die MPs wurden in Gegenwart von zugeführten Nanoscheiben in einem Bereich von 3,75-60 μM synthetisiert. (A) Expression von Tβ1AR-GFP mit Nanoscheiben (DMPC) in der CF-Reaktion. Die Gesamtkonzentration wurde mittels Fluoreszenzmessung der GFP-Fusion bestimmt. Daten aus dem zuvor veröffentlichten Manuskript14. Affinity-Tag-gereinigte Proben wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die Coomassie-Blue-Färbung zeigt zwei prominente Banden, die Tβ1AR-GFP bei etwa 50 kDa und MSP1E3D1 über 25 kDa (B) entsprechen. Expression von PR mit Nanodiscs (DOPG) in der CF-Reaktion. Die Gesamtkonzentration von PR wurde durch Absorptionsmessung bei 530 nm bestimmt. Daten aus dem zuvor veröffentlichten Manuskript10,18. Die Fotos zeigen die rote Farbe der letzten Reaktionen aufgrund des Vorhandenseins von gefalteter PR. Die Piktogramme veranschaulichen die modulierte PR-Anordnung in Richtung niedrigerer oligomerer Konformationen bei erhöhten Nanoscheibenkonzentrationen, wie sie durch anschließende native Massenspektrometrie18 gezeigt wurde. Affinity-Tag-gereinigte Proben wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die Coomassie-Blue-Färbung zeigt zwei prominente Banden, die PR bei etwa 20 kDa und MSP1E3D1 über 25 kDa entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Verbindung Endkonzentrationsbereich Auswirkung auf die MP-Probe
Mg2+ 10 - 30 mM Ertrag
DVB-T 1 - 20 mM Disulfidbrückenbildung, Faltung
20 Aminosäurenmischung1 0,2 – 2 mM Ertrag
GSSG : GSH2 (1-10 μM) : (1-10 μM) Disulfidbrückenbildung, Faltung
Nanoscheiben 10 - 100 μM Solubilisierung, oligomere Montage, Faltung
Lipidtyp Solubilisierung, oligomere Montage, Faltung
S30 : HS30 Lysat3 (50-100 %) : (50-100 %) Klapp
S12 - S100 20 – 50 % Ausbeute, MP-Hintergrund in Kanalassays
DNA-Vorlage 0,5 – 30 ng/μL RM Ausbeute, oligomere Montage, Falzung
DNA-Template-Design Ertrag
1 kann die Mischung entsprechend der individuellen Zusammensetzung eines MP variiert werden, um z. B. die Ausbeute zu verbessern oder NMR-Kennzeichnungssysteme zu optimieren.
2, GSH sollte immer frisch zubereitet werden.
3 sollte die Gesamtkonzentration von CF-Lysat im RM mindestens 35 % bei einem S30-Gehalt von mindestens 50 % betragen, um hohe Expressionswerte zu gewährleisten.

Tabelle 1: Kritische Screening-Komponenten von CF-Reaktionen.

MSP1E3D1 Lipid DPC
Verhältnis (410 μM Vorrat) (50 000 μM Aktien) (10 % (w/v) Lagerbestand)
Lipid Lipid : MSP V(MSP) c(MSPfinal) V(Lipid) C (Lipid Final) V(DPC) c(DPCendgültig) DF-Puffer
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
DMPC 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
DOPC 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
DMPG 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
DOPG 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPG 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

Tabelle 2: Verhältnis von Lipid zu MSP1E3D1 für 3 ml In-vitro-Assemblierungsaufbauten .

Verbindung Konzentration Präparat
DNA-Plasmid-Vorlage1 > 400 μg/ml bei 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Midi/Maxi-Kit (z.B. Qiagen) Vorbereitung2
Mischung aus 20 Aminosäuren3 je 25 mM inH2O Niederschlagsreste4
Mischung aus 4 NTPs (75 x) c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM
inH2O. pH-Wert mit KOH auf 7-8 einstellen		 Ein wenig Niederschlag bleibt4
Acetylphosphat 1 M in H2O, pH 7-8 mit KOH einstellen Niederschlagsreste4
Phospho(enol)brenztraubensäure (K+) 1 M in H2O, pH 7-8 mit KOH einstellen
Folinsäure 10 mg/ml inH2O Niederschlagsreste4
DVB-T 0,5 m in H2O
C0mplete Protease Inhibitor Cocktail 1 Tablette pro 1 ml inH2O
Trisacetat, pH 8,0 2,4 m in H2O
Mg(OAc)2 1 m in H2O
KOAc 10 m in H2O
Ribolock RNase-Inhibitor 40 U/ml Thermo Fisher Wissenschaftlich
tRNA (E. coli) 40 mg/ml inH2O Roche (Deutschland)
T7RNAP 3-7 mg/ml5 siehe Protokollabschnitt 2
Pyruvatkinase 10 mg/ml Roche (Deutschland)
Nanodiscs (DMPG) 0,2-1,0 mM6 Zoll 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl siehe Protokollabschnitte 3 und 4
1, PCR-Vorlage könnte in ähnlichen Konzentrationen verwendet werden.
2, die Qualität der "Mini"-Kit vorbereiteten DNA ist nicht zufriedenstellend.
3, Cystein neigt dazu, instabil zu sein und kann separat hinzugefügt werden.
4, Lösung ist übersättigt, gründliches Mischen sofort vor dem Entfernen von Aliquots ist notwendig.
5 wird für jede neue T7RNAP-Charge ein erstes Screening empfohlen, um die beste Endkonzentration zu ermitteln.
6 kann die Löslichkeit von Nanoscheiben von ihrer Lipidzusammensetzung abhängen.

Tabelle 3: Herstellung von CF-Stammlösungen.

Verbindung
Für Mastermix (3.0 x) c(endgültig) V [μL]
Mischung aus 20 Aminosäuren 1 mM 2520.0
Mischung aus 4 NTPs (75 x) 1x 840.0
Acetylphosphat 20 mM 1260.0
Phospho(enol)
Brenztraubensäure		 20 mM 1260.0
Folinsäure 0,1 mg/ml 630.0
Trisacetat, pH 8,0 100 mM 2625.0
c0mplete 50 x 1x 1260.0
Mg(OAc)2 19,8 (= 20)1 mM 1260.0
KOAc 180 (= 270)2 mM 1140.0
DVB-T 2 mM 252.0
H2O 7953.0
Gesamt 21 000
Für RM c(endgültig) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
RNase-Inhibitor 0,3 U/μL 22.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 37.5
Nanodiscs (DMPG)3 10 μM 75.0
DNA-Vorlage4 0,015 ng/μL 112.5
Pyruvatkinase 0,04 mg/ml 12.0
T7RNAP5 0,03 mg/ml 15.0
S30-Lysat 0.35 % 1050.0
All-trans Netzhaut6 0,6 mM 9.0
H2O - 666.5
Gesamt 3000.0
Für FM c(endgültig) V [μL]
Mastermix (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
Gesamt 60 000
1 ,0,2 mMMg2+ werden aus dem S30-Lysat beigesteuert.
2 ,90 mM K+ werden aus Acetylphosphat und Phospho(enol)brenztraubensäure beigesteuert.
3, berechnete Stammlösung ist 400 μM.
4, berechnete Stammlösung beträgt 400 μg/ml.
5, berechnete Stammlösung beträgt 6 mg/ml.
6, spezifischer Cofaktor für PR, Stammlösung ist 200 mM in DMSO.

Tabelle 4: Pipettschema für eine CECF-Reaktion mit 3 mL RM und 60 mL FM

Verbindung
Für Mastermix (3.0 x) c(endgültig) V [μL]
Mischung aus 20 Aminosäuren 1 mM 864.0
Mischung aus 4 NTPs 1x 288.0
Acetylphosphat 20 mM 432.0
Phospho(enol)brenztraubensäure 20 mM 432.0
Folinsäure 0,1 mg/ml 216.0
Trisacetat, pH 8,0 100 mM 900.0
c0mplete 1x 432.0
Mg(OAc)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KOAc 180 (= 270) mM2 389.0
DVB-T 2 mM 86.4
H2O - 2862.6
Gesamt [μL]1 - 7200.0
Mg2+ Konzentration
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
Für RM c(endgültig) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0,1 M mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
RNase-Inhibitor 0,3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNA-Vorlage3 0,015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Pyruvatkinase 0,04 mg/ml 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0,03 mg/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30-Lysat 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
Gesamt [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Mg2+ Konzentration
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
Für RM c(endgültig) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0,1 M mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
Gesamt [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
1 ,0,2 mMMg2+ werden aus dem S30-Lysat beigesteuert. Der Mastermix wird auf die niedrigste Siebkonzentration eingestellt.
2 ,90 mM K+ werden aus Acetlyphosphat und Phospho(enol)brenztraubensäure beigesteuert.
3, berechnete Stammlösung beträgt 400 μg/ml.
4, berechnete Stammlösung beträgt 6 mg/ml.
5 werden Reaktionen in Duplikaten durchgeführt.

Tabelle 5: Pipettierschema für Mg2+ Konzentrationssieb mit 100 μL RM und 1,7 ml FM.

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Discussion

Der Aufbau und die Strategien zur Optimierung der CF-Expression und der co-translationalen Insertion von funktionellen MPs in Nanoscheiben werden beschrieben. Die erforderliche Ausrüstung umfasst einen Bioreaktor, eine französische Pressvorrichtung oder ähnliches, einen UV/VIS- und Fluoreszenzreader, CF-Reaktionsgefäße, die für einen Zwei-Kompartiment-Konfigurationsaufbau geeignet sind, und einen temperaturgesteuerten Inkubator. Weitere Standardgeräte sind Zentrifugen zur Gewinnung von E. coli-Zellen sowie Tischzentrifugen bis mindestens 30.000 x g zur Herstellung von S30-Lysaten. Wenn S80-S100-Lysate hergestellt werden sollen, sind Ultrazentrifugen notwendig. Die aufgeführten Geräte stehen regelmäßig in biochemischen Labors zur Verfügung und es sind keine größeren Anfangsinvestitionen erforderlich, um mit der CF-Expression zu beginnen. Darüber hinaus sind die Fermentation und Handhabung von E. coli-Zellen für CF-Lysat und T7RNAP-Präparate gängige und robuste Techniken. Die teuersten Verbindungen sind CF-Lysat, T7RNAP und Nanoscheiben. Sie können durch zuverlässige und effiziente Protokolle hergestellt werden und Aliquots sind jahrelang bei -80 °C stabil. Die Protokolle erfordern jeweils drei Tage für die Herstellung von CF-Lysat und T7RNAP und etwa eine Woche für die Expression und Reinigung von MSP und das Preforming von Nanodiscs. Zielvorlagen-DNA kann mit pET-21, pIVEX oder ähnlichen Vektorsystemen geliefert werden. Für den Aufbau und die Optimierung von CF-Expressionssystemen kann die Herstellung von GFP-Varianten wie verschobene GFP (GFP+) oder SuperfolderGFP als Monitor20,32 verwendet werden. Für MP-Produktionsbedingungen ist der Ausdruck von PR ein gutes Modellsystem oder eine Positivkontrolle, da es sich unter vielen verschiedenen Bedingungen faltet und leicht durch Absorption bei 530 nm10,15,18 überwacht werden kann. Um ein effizientes CF-Expressionsprotokoll für ein neues MP zu etablieren, wird die Codon-Optimierung des Zielleserahmens und die Verwendung von Fusionen mit C-terminal-angehängtem GFP empfohlen25,26. Weitere benötigte Materialien sind Chemikalien und Enzyme, die alle kommerziell erhältlich sind. Diese Komponenten müssen in hoher Qualität erhalten werden und eine Gesamtkostenkalkulation für die beschriebene CF-Reaktion mit 3 mL RM und 60 mL FM würde ca. 150-200 € betragen. Eine Hauptanwendung für CF-Expressionssysteme ist daher die Herstellung von Proteinen, die in klassischen zellbasierten Expressionssystemen wie vielen MPs oder Toxinen schwer zu erhalten sind. CF-Systeme sind darüber hinaus Kernplattformen in der Synthetischen Biologie und stetig wachsende Anwendungsfelder machen sie als Werkzeug in der molekularen Forschung immer unverzichtbarer. Routineanwendungen sind unter anderem die Markierung von Proteinen, Hochdurchsatzprozesse oder das Design synthetischer Zellen.

Die demonstrierte Strategie ermöglicht die waschmittelfreie Herstellung von reinen MPs, die bereits in gewünschte Lipidumgebungen hochlöslicher Nanoscheiben eingebracht wurden. Sobald das CF-Expressionsprotokoll für ein MP etabliert und optimiert ist, ist die Produktion sehr schnell und reine Proben können in weniger als 24 h auch im präparativen Maßstab gewonnen werden. Die MP/Nanodisc-Komplexe werden direkt aus der CF-Reaktion über Streptavidin II oder Polyhistidin-Tags, die an das MP angehängt sind, gereinigt. Das Verfahren ermöglicht eine parallele Funktions- und Strukturanalyse identischer MP-Proben durch eine Reihe verschiedener Techniken33. Die Schnelligkeit und Effizienz der Strategie ist daher wettbewerbsfähig gegenüber herkömmlichen Ansätzen, die zellbasierte Expressionssysteme und die Extraktion von MPs aus Zellmembranen mit anschließender routinemäßiger In-vitro-Rekonstitution verwenden 5,34. Die offene Zugänglichkeit von CF-Reaktionen erleichtert darüber hinaus zahlreiche einzigartige mechanistische Studien der MP-Faltung und Membraninsertion 15,16,18, MP-Komplexanordnung15,18,24 oder Funktionsregulation 23.

Ein wichtiger Unterschied der CF-Expression zur zellbasierten Expression ist das Fehlen von Qualitätskontrollsystemen für das synthetisierte Proteinprodukt. Jedes übersetzte Polypeptid landet unabhängig von seiner funktionellen Faltung in der Endproduktprobe. Darüber hinaus ist der Insertionsprozess in Nanoscheibenmembranen künstlich und translokunabhängig und kann entweder zu einer unvollständigen Integration führen oder mit einer Reihe von MP-Targets überhaupt nicht funktionieren. Die schließlich solubilisierte Produktfraktion in einer CF-Reaktion könnte somit recht heterogen sein, enthaltend vollständig eingesetzte, aber auch nur teilweise integrierte oder membranassoziierte MPs. Folglich könnte nur ein kleiner Bruchteil einer gereinigten Probe von MP/Nanoscheiben-Komplexen funktionell gefaltet werden. Die Modifizierung der Membranzusammensetzung und die sorgfältige Feinabstimmung des MP-zu-Nanoscheiben-Verhältnisses durch Modulation der Konzentrationen von Nanoscheiben und DNA-Templates sind geeignete Werkzeuge zur Optimierung. Dennoch sind nachgelagerte Qualitätskontrollansätze wie Größenausschlussprofilierung und zielspezifische quantitative Funktionsassays immer notwendig, um CF-Expressionsprotokolle zu optimieren. Die Verfügbarkeit solcher Assays kann daher Anwendungen einschränken, insbesondere in Projekten mit MPs, die Liposomenumgebungen für Funktionen wie Transporter, Kanäle oder Pumpen benötigen. Darüber hinaus könnten die Größenbeschränkungen von Nanoscheiben das Einsetzen großer MP-Baugruppen einschränken.

In den dokumentierten Beispielen liegt die Variation des funktionell gefalteten Anteils des GPCR Tβ1AR-GFP im Bereich von wenigen Prozent, bis zu etwa 30%. Die funktionelle Faltung erfordert eine sorgfältige Einstellung einer Reihe vonParametern 14 und ein ähnlicher individueller und langwieriger Optimierungsprozess kann auch für andere GPCRs erforderlich sein22. Die schließlich erreichte Ausbeute an funktionell gefaltetem GPCR ist jedoch wettbewerbsfähig mit anderen Produktionssystemen und ermöglicht den Aufbau von > 1.000 Radioassays für Ligandenbindungsstudien aus einer einzigen 60-μL-Reaktion in einem Mini-CECF-Reaktor im analytischen Maßstab. Es ist erwähnenswert, dass Ligandenbindungsstudien von GPCR-GFP-Fusionskonstrukten keine Reinigungsschritte erfordern. Bei Bedarf kann die Reinigung durch Ausnutzung von Affinity-Tags erreicht werden, die an dem synthetisierten MP angebracht sind, wie z.B. His-Tags oder Strep-Tag II. Der RM wird dann im gewünschten Puffer verdünnt und auf die entsprechende Affinitätschromatographiesäule geladen, die entsprechend voräquilibriert wurde. Die strukturelle Bewertung von PR und anderen CF-synthetisierten MPs durch NMR-Spektroskopie oder Kristallisation hat bereits dazu beigetragen, CF-Expressionssysteme als Kernplattformen in der MP-Forschung zu etablieren. Die beschriebene Strategie zur Herstellung von MP/Nanoscheiben-Komplexen könnte für zukünftige Strukturuntersuchungen mittels Elektronenmikroskopie besonders interessant werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken der Förderung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) BE1911/8-1, dem LOEWE-Projekt GLUE und dem Sonderforschungsbereich Transport and Communication across Membranes (SFB807) für die finanzielle Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

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References

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Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben
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