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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Inserción co-traduccional de proteínas de membrana en nanodiscos preformados

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

La inserción co-traduccional en nanodiscos preformados permite estudiar proteínas de membrana sintetizadas libres de células en ambientes lipídicos definidos sin contacto con detergentes. Este protocolo describe la preparación de los componentes esenciales del sistema y los parámetros críticos para mejorar la eficiencia de la expresión y la calidad de la muestra.

Abstract

Los sistemas de expresión libre de células permiten el diseño personalizado de entornos de reacción para apoyar el plegamiento funcional de proteínas incluso complejas como las proteínas de membrana. Se demuestran los procedimientos experimentales para la inserción co-traslacional y el plegamiento de proteínas de membrana en membranas preformadas y definidas suministradas como nanodiscos. El protocolo es completamente libre de detergente y puede generar miligramos de muestras purificadas en un día. Las muestras resultantes de proteínas de membrana / nanodiscos se pueden usar para una variedad de estudios funcionales y aplicaciones estructurales, como cristalización, resonancia magnética nuclear o microscopía electrónica. Se describe la preparación de componentes clave básicos como lisados libres de células, nanodiscos con membranas diseñadas, soluciones madre críticas, así como el ensamblaje de reacciones de expresión libre de células de dos compartimentos. Dado que los requisitos de plegamiento de las proteínas de membrana pueden ser muy diversos, un enfoque importante de este protocolo es la modulación de los parámetros y los pasos de reacción importantes para la calidad de la muestra, como los compuestos de reacción básicos críticos, la composición de membrana de los nanodiscos, el entorno redox y chaperona, o el diseño de plantillas de ADN. Todo el proceso se demuestra con la síntesis de proteorhodopsina y un receptor acoplado a proteína G.

Introduction

Las proteínas de membrana (MP) son objetivos desafiantes en los estudios de producción de proteínas debido a su insolubilidad en ambientes acuosos. Las plataformas de producción de MP convencionales comprenden sistemas basados en células como E. coli, levadura o células eucariotas. Los MPs recombinantes sintetizados se extraen de las membranas celulares o se vuelven a plegar de los cuerpos de inclusión1. Después de la solubilización del detergente, los MP pueden transferirse a ambientes de membrana adecuados mediante protocolos de reconstitución in vitro establecidos. Además de vesículas y liposomas, la reconstitución de MP en membranas planas en forma de nanodiscos2 o partículas de salipro3 se ha convertido en técnicas de rutina en los últimos tiempos. Sin embargo, todas estas estrategias implican el contacto del detergente con los MP que puede resultar en desestabilización, disociación de oligómeros e incluso pérdida de la estructura y actividad de las proteínas4. Por lo tanto, la detección de condiciones óptimas de solubilización y reconstitución del detergente puede ser tediosa y consumir muchotiempo 5.

La naturaleza abierta de los sistemas libres de células (CF) permite que la reacción de expresión se suministre directamente con membranas preformadas con una composición lipídica definida. En este modo de expresión basado en lípidos (L-CF), los MPs sintetizados tienen la oportunidad de insertarse co-traduccionalmente en las bicapas proporcionadas 6,7 (Figura 1). Los nanodiscos constituidos por una proteína de andamio de membrana (MSP) que rodea un disco de bicapa lipídica plana8 parecen ser particularmente adecuados para esta estrategia 9,10. Los nanodiscos se pueden ensamblar rutinariamente in vitro con una variedad de lípidos diferentes, son muy estables y las existencias se pueden concentrar hasta 1 mM. Sin embargo, la expresión de MSP en E. coli y su purificación es necesaria. Como estrategia alternativa, la MSP puede ser co-expresada junto con el MP objetivo en reacciones de FQ suministradas con liposomas11,12,13. Las plantillas de ADN para MSP y MP se agregan a la reacción y MP / nanodiscos pueden formarse al expresarse. Si bien se evita la producción de MSP, la estrategia de coexpresión requiere un ajuste cuidadoso de las concentraciones finales de la plantilla de ADN y se pueden esperar mayores variaciones en la eficiencia de la producción de muestras.

La inserción co-traduccional de MPs en membranas de nanodiscos preformados es un mecanismo no fisiológico y aún en gran parte desconocido independiente de las maquinarias de translocon y las secuencias de señales13,14,15,16. Los principales determinantes de la eficiencia de inserción son el tipo de proteína de membrana, así como la composición lipídica de la membrana proporcionada, con una preferencia frecuente por lípidos cargados negativamente15,17. Como las membranas de los nanodiscos son relativamente limitadas en tamaño, se libera una cantidad sustancial de lípidos tras la inserción de MP18. La variación del tamaño del nanodisco permite la inserción y puesta a punto de complejos MP oligoméricos superiores15,18. Entre otros, se demostró el correcto ensamblaje de complejos homooligoméricos para el canal iónico KcsA, para la bomba iónica proteorhodopsina (PR) y para el transportador multifármaco EmrE15,18. Es probable que los MP entren en la membrana simétrica del nanodisco desde ambos lados con una frecuencia relativamente igual. Por lo tanto, debe considerarse que diferentes monómeros u oligómeros insertados en un nanodisco pueden tener orientaciones opuestas. Sin embargo, un sesgo en la orientación podría ser causado por mecanismos de inserción cooperativa como se informó para la formación de hexámeros PR y tetrámeros KcsA18. Un sesgo adicional en la orientación de MP podría resultar de interruptores de orientación de MP insertados probablemente en el borde de las membranas de nanodisco.

La producción de lisados de FQ a partir de cepas de E. coli es una técnica de rutina confiable y puede realizarse en casi cualquier laboratorio bioquímico19,20. Debe considerarse que, además de la formación del puente disulfuro, la mayoría de las otras modificaciones postraduccionales están ausentes si se sintetiza un MP utilizando lisados de E. coli. Si bien esto podría generar muestras más homogéneas para estudios estructurales, puede ser necesario excluir los efectos potenciales sobre la función de los objetivos individuales de MP. Sin embargo, la producción eficiente de muestras de alta calidad de receptores acoplados a proteínas G (GPCR)14,21,22, transportadores eucariotas 23 o grandes conjuntos heteroméricos 24 en lisados CF de E. coli indica su idoneidad incluso para objetivos complejos. Se pueden obtener cantidades de escala preparativa (≈ 1 mg/ml) de una muestra con la configuración libre de células de intercambio continuo (CECF) de dos compartimentos, compuesta por una mezcla de reacción (RM) y un compartimento de mezcla de alimentación (FM). El volumen de FM excede el volumen de RM de 15 a 20 veces y proporciona un reservorio de compuestos energéticos de bajo peso molecular y precursores19. La reacción de expresión se extiende así durante varias horas y el rendimiento final del objetivo MP aumenta. Los compartimentos RM y FM están separados por una membrana de diálisis con un corte de 10-14 kDa. Los dos compartimentos requieren un diseño especial del contenedor de reacción CECF (Figura 1). Los casetes de diálisis comerciales como contenedores RM en combinación con contenedores de plexiglás a medida que contienen el FM son ejemplos adecuados. Los rendimientos de MP se pueden manipular modificando las relaciones RM:FM o intercambiando el FM después de un cierto período de incubación.

El rendimiento y la calidad de un MP a menudo requieren una intensa optimización de los parámetros de reacción. Una ventaja importante de la expresión de CF es la posibilidad de modificar y ajustar casi cualquier compuesto de acuerdo con los requisitos individuales de un MP. Una estrategia sencilla es centrarse primero en mejorar el rendimiento de un MP estableciendo un protocolo de producción básico y luego optimizar la calidad del MP ajustando la reacción y las condiciones de plegado. La ausencia de procesos fisiológicos en los lisados de FQ y su reducida complejidad resultan en altas tasas de éxito para la producción eficiente de MPs25. Las consideraciones rutinarias para el diseño de plantillas de ADN y la optimización de la concentración de iones Mg 2+ son en la mayoría de los casos suficientes para obtener rendimientos satisfactorios26. Dependiendo del modo de expresión, la optimización de la calidad de MP puede llevar mucho tiempo, ya que es necesario examinar una mayor variedad de parámetros14,17,22.

Para establecer la plataforma de expresión de FQ descrita, son necesarios protocolos para la producción de lisado de CF de E. coli (i), ARN polimerasa T7 (ii), nanodiscos (iii) y los compuestos básicos de reacción CECF (iv) (Figura 1). Los derivados de E. coli K12 cepa A1927 o BL21 se utilizan con frecuencia para la preparación de lisados eficientes de S30 (centrifugación a 30.000 x g). Además de los lisados S30, se pueden utilizar los lisados correspondientes centrifugados a otras fuerzas g (por ejemplo, S12). Los lisados difieren en la eficiencia de expresión y en la complejidad del proteoma. El proteoma del lisado S30 preparado por el protocolo descrito ha sido estudiado en detalle28. El proteoma S30 todavía contiene algunas proteínas residuales de la membrana externa que podrían dar problemas de fondo sobre la expresión y el análisis de los canales iónicos. Para tales objetivos, se recomienda el uso de lisados S80-S100. Una modificación valiosa durante la preparación del lisado es la inducción de la respuesta SOS por choque térmico combinado y suministro de etanol en la fase de crecimiento logarítmico medio de las células. Los lisados HS30 resultantes están enriquecidos en chaperonas y se pueden utilizar en mezclas con lisados S30 para mejorar el plegado MP22. La expresión de FQ en los lisados de E. coli se opera como un proceso acoplado de transcripción/traducción con plantillas de ADN que contienen promotores controlados por la ARN polimerasa T7 (T7RNAP). La enzima se puede producir eficientemente en células estelares BL21 (DE3) que transportan el plásmido pAR121929.

Dos copias de MSP1E3D1 se ensamblan en un nanodisco con un diámetro de 10-12 nm, pero el protocolo descrito a continuación también puede funcionar para otros derivados de MSP. Sin embargo, los nanodiscos más grandes que los formados con MSP1E3D1 tienden a ser menos estables, mientras que los nanodiscos más pequeños formados con derivados de MSP como MSP1 pueden no acomodar MPs más grandes o complejos MP. Los nanodiscos MSP1E3D1 se pueden ensamblar in vitro con una gran variedad de diferentes lípidos o mezclas de lípidos. Los nanodiscos preformados suelen ser estables durante > 1 año a -80 °C, mientras que la estabilidad puede variar para diferentes componentes lipídicos. Para la detección de los efectos lipídicos sobre el plegamiento y la estabilidad de un MP, es necesario preparar un conjunto completo de nanodiscos ensamblados con una variedad representativa de mezclas de lípidos / lípidos. Los siguientes lípidos pueden dar una buena selección inicial: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) y 1-palmitoil-2-oleoil-glycero-3-phosphocholine (POPC).

Se describe un protocolo para la preparación de una reacción CECF de 3 ml. Es posible escalar más arriba o hacia abajo en una proporción de 1: 1. Para la configuración CECF de dos compartimentos, se debe preparar un RM que contenga todos los compuestos y un FM que contenga solo los compuestos de bajo peso molecular. Los dispositivos comerciales de diálisis de 3 ml con MWCO de 10-14 kDa se pueden usar como contenedores RM, que luego se colocan en recipientes de plexiglás hechos a medida que contienen el FM (Figura 1D)30. La relación de RM:FM es de 1:20, por lo que se deben preparar 60 mL de FM para 3 mL RM. La calidad, concentración o tipo de varios componentes pueden ser críticos para el rendimiento final y/o la calidad del MP sintetizado (Tabla 1). Las plantillas de ADN deben prepararse de acuerdo con las directrices publicadas y la optimización del codón del marco de lectura del objetivo puede mejorar significativamente el rendimiento del producto26. Para la reacción CECF a escala preparativa, se describe un protocolo establecido para la producción de PR. Para establecer protocolos de expresión para nuevos MPs, suele ser necesario realizar cribados de optimización de determinados compuestos (Tabla 1) para mejorar el rendimiento y la calidad. Para los iones Mg2+ , existe una concentración óptima bien enfocada que con frecuencia muestra una variación significativa para diferentes plantillas de ADN. Otros compuestos de reacción de CF, como los nuevos lotes de lisados T7RNAP o S30, pueden cambiar aún más la concentración óptima de Mg2+ . Como ejemplo, se describe una pantalla típica de Mg 2+ dentro del rango de concentración de14-24 mM y en pasos de 2 mM. Cada concentración se examina por duplicados y en reacciones CECF a escala analítica. Como contenedor de reacción CECF, los contenedores de plexiglás Mini-CECF30 hechos a medida que contienen el RM se utilizan en combinación con microplacas estándar de 24 pocillos que contienen el FM (Figura 1B). Alternativamente, se pueden usar cartuchos de diálisis comerciales en combinación con microplacas de pocillos de 96 profundidades u otros dispositivos dializadores comerciales en configuraciones apropiadas (Figura 1C).

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Protocol

1. Preparación del lisado S30

  1. Día 1: Extraer las células de las reservas de glicerol en una placa de agar LB e incubar a 37 °C durante la noche.
  2. Día 2: Inocular 200 mL de medio LB con las células de la placa de agar e incubar a 37 °C durante 12-14 h.
  3. Día 3: Inocular 10 L de medio YPTG estéril (10 g/L de extracto de levadura, 16 g/L triptona, 5 g/L de NaCl, 19,8 g/L de glucosa, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) templado a 37 °C en un reactor de tanque agitado de 15 L con 100 mL de precultivo (1:100). Cultivar a 37 °C, 500 rpm y alta aireación (~ 3 volúmenes de aire por minuto). Para evitar la formación excesiva de espuma, agregue antiespumante estéril.
  4. Mida la densidad óptica (OD) a 600 nm en intervalos de tiempo regulares. Después de aproximadamente 2 h, el cultivo entrará en la fase logarítmica.
  5. Modificación para el lisado HS30: Cuando las células estén en la fase logarítmica media (OD600 ≈ 3.6-4.2) agregue 300 ml de etanol al medio de cultivo y proceda al cultivo a 42 °C, 500 rpm y alta aireación (aproximadamente 3 volúmenes de aire por minuto) durante otros 45 minutos. A continuación, proceda con el enfriamiento y la recolección del cultivo celular como se describe en el paso 1.6. Para la producción de lisado S30 estándar, omita este paso y continúe con el paso 1.6.
  6. Cuando las células estén en la fase logarítmica media (OD600 ≈ 3.6-4.2), enfriar el fermentador por debajo de 20 °C en < 30 min. El OD600 final debe estar alrededor de 4.5-5.5. Cosechar las células a 4.500 x g durante 20 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Mantener las celdas a 4 °C durante los siguientes pasos.
    NOTA: Durante el enfriamiento, puede producirse una formación excesiva de espuma. En este caso, agregue antiespumante o reduzca la velocidad de agitación y / o disminuya la corriente de aire en el biorreactor.
  7. Suspender las células completamente en 300 ml de tampón S30-A (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoetanol) usando una espátula seguida de pipeteo de la suspensión hacia arriba y hacia abajo hasta la homogeneidad. Centrifugar a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Repita este paso dos veces.
    PRECAUCIÓN: El 2-mercaptoetanol es tóxico. Evite el contacto con la piel o las vías respiratorias. Si es posible, trabaje bajo una capucha. Pese el vaso de precipitados de la centrífuga vacío antes del último paso de lavado. Después de la centrifugación, pesar el pellet de celda húmeda y continuar con el paso 1.8 o almacenar el pellet hasta su uso posterior.
    NOTA: El peso del pellet de células húmedas es de 5-7 g por 1 L de cultivo de biorreactor. En este punto, el protocolo puede detenerse y el pellet puede congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 ° C durante 4-8 semanas.
  8. Suspender completamente las células en 1,1 volúmenes (1 g = 1 ml) de tampón S30-B (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 comprimido de inhibidor de la proteasa cOmplete). Llene la suspensión en una celda de presión de prensa francesa preenfriada e interrumpa las celdas a 1,000 psig. Pase las celdas a través de la prensa francesa una vez.
  9. Centrifugar el lisado a 30.000 x g durante 30 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y repita el paso de centrifugación.
    NOTA: Una capa suelta y viscosa puede estar presente en la parte superior del pellet después de la primera centrifugación, que no debe transferirse con el sobrenadante.
  10. Aplique un paso alto en sal y calor para eliminar los componentes inestables del lisado y liberar el ARNm de los ribosomas. Ajustar el lisado a 0,4 M NaCl e incubar a 42 °C durante 45 minutos en un baño maría.
    NOTA: Este paso causará una formación significativa de precipitados. Voltee o invierta el tubo durante la incubación de vez en cuando.
  11. Transfiera la suspensión turbia (generalmente 50-80 ml) a tubos de diálisis con un corte de 10-14 kDa y dialice contra tampón S30-C de 5 L (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 0.5 mM DTT). Cambie el tampón de diálisis S30-C después de 2-3 h y dialice durante otras 12-14 h.
  12. Día 4: Transfiera la suspensión dializada a tubos de centrífuga y centrifuga a 30.000 x g durante 30 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante (lisado S30) en tubos frescos de 50 ml y mezcle suavemente. La concentración proteica del lisado debe ser de aproximadamente 30-40 mg/ml. Alícuotas por congelación por choque (por ejemplo, 0,5 ml, 1 ml) en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C. Las alícuotas son estables durante > 1 año.

2. Expresión y purificación de la ARN polimerasa T7

  1. Día 1: Inocular 200 ml de medio LB que contenga 100 μg/ml de ampicilina con células BL21(DE3) Star x pAR1219 recién chapadas e incubar a 37 °C y 180 rpm durante 12-16 h.
  2. Día 2: Inocular 1 L de caldo terrífero (12 g/L de triptona, 24 g/L de extracto de levadura, 4 mL/L de glicerol) en un matraz deflector de 2 L con 10 mL de precultivo e incubar a 37 °C y agitación a 180 rpm. El OD600 inicial debe estar alrededor de 0,1.
  3. Cuando el OD600 alcance 0.6-0.9, agregue IPTG a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de T7RNAP y continúe el cultivo durante otras 5 h.
  4. Cosechar células por centrifugación a 4.500 x g durante 20 min a 4 °C. Congelar las células en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
    NOTA: El protocolo puede estar en pausa aquí.
  5. Día 3: Agregue 30 ml de tampón de suspensión helada (30 mM Tris-HCl, pH 8.0 con una tableta de inhibidor de proteasa cOmplete) al pellet de celda congelada y descongele el pellet en un baño de agua a temperatura ambiente. Luego, suspende el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta la homogeneidad.
  6. Realice la interrupción celular utilizando una prensa francesa como se describe en la sección anterior o use un dispositivo de sonicación de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Posteriormente, centrifugar a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C y transferir sobrenadante a un tubo nuevo.
  7. Para precipitar el ADN genómico, agregue sulfato de estreptomicina lentamente y bajo agitación suave al sobrenadante hasta que se alcance una concentración final del 3% (p/v). Incubar a 4 °C durante 5-10 min bajo agitación suave. Centrifugar a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C.
  8. Filtrar el sobrenadante con un filtro de 0,45 μm y cargarlo en una columna Q-Sepharose con un volumen de columna (CV) de 40 mL equilibrado con tampón de equilibrio de 2 CV (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glicerol y 10 mM 2-mercaptoetanol) utilizando una bomba peristáltica a un caudal de 4 mL/min. Luego, conecte la columna a un detector UV y continúe la elución con tampón de equilibrio hasta que la señal UV a 280 nm alcance una línea de base estable.
  9. Eluto T7RNAP con un gradiente de 50 mM a 500 mM NaCl por CV a un caudal de 3 mL/min. Recoja fracciones de 1 ml y prepare muestras para el análisis SDS-PAGE mezclando 10 μL de cada fracción con 2 x tampón de muestra SDS. Ejecute SDS-PAGE y tiñe el gel con Coomassie Blue R. T7RNAP debe aparecer como una banda prominente a aproximadamente 90 kDa junto con numerosas bandas adicionales de impurezas.
  10. Agrupar fracciones que contienen T7RNAP y dializar utilizando membranas con un MWCO de 12-14 kDa durante 12-16 h en tampón de diálisis (10 mM K 2 HPO 4/KH2PO4, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (p/v) glicerol).
  11. Día 4: Recolectar la solución de T7RNAP y concentrar utilizando unidades de filtro con 12-14 MWCO hasta una concentración final de 3-10 mg / ml. T7RNAP puede comenzar a precipitar durante la concentración. Detenga la concentración instantáneamente tan pronto como se produzca turbidez en la muestra. Agregue glicerol a una concentración final de 50% (p/v) y mezcle suavemente. Congelar por choque 0,5-1 ml de alícuotas y almacenar a -80 °C. Las alícuotas T7RNAP de trabajo pueden almacenarse a -20 °C.
    NOTA: Se deben obtener aproximadamente 20-40 ml de T7RNAP parcialmente purificado de 5 mg / ml con 20,000-40,000 unidades de una fermentación de 1 L. Para probar la cantidad óptima de cada lote de T7RNAP, se deben realizar reacciones de expresión de FQ de proteína verde fluorescente (GFP) que contenga 0,02 mg/mL-0,1 mg/ml de la muestra preparada de T7RNAP.

3. Expresión y purificación de MSP1E3D1

  1. Día 1: Transforme las células estrella BL21 (DE3) de E. coli con el vector 31 pET28(a)-MSP1E3D1 utilizando protocolos estándar de transformación de choque térmico o electroporación. Rayar o placar células transformadas en agar LB que contiene 30 μg/ml de kanamicina e incubar a 37 °C durante 12-16 h.
  2. Día 2: Inocular 200 mL de medio LB suplementado con 0,5% (p/v) de glucosa y 30 μg/ml de kanamicina con una sola colonia recogida de la placa de agar e incubar a 37 °C a 180 rpm durante 12-16 h.
  3. Día 3: Inocular 10 L LB medio suplementado con 0,5% (p/v) de glucosa y 30 μg/mL de kanamicina con 100 mL del precultivo en un biorreactor de tanque agitado. Realizar fermentación a 37 °C, 500 rpm y aireación de aproximadamente 3 volúmenes de biorreactores por minuto. En el caso de espuma excesiva, agregue antiespumante.
    NOTA: Se pueden usar matraces de agitación desconcertados en lugar de un fermentador.
  4. A OD600 de 6.5-7.5, añadir IPTG a una concentración final de 1 mM y continuar la incubación a 37 °C durante 1 h. Cosechar células por centrifugación a 4.500 x g durante 20 min a 4 °C. Lavar los gránulos de celda con 200 ml de NaCl al 0,9% (p/v) y centrifugar de nuevo a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y transfiera las células a tubos de 50 ml con una espátula. El peso esperado del pellet húmedo es de 8-12 g por L de cultivo de biorreactor. Congelar los gránulos de células de choque en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta su posterior uso.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
  5. Día 4: Para la purificación, descongele los gránulos de células en un baño de agua en RT. Suspenda las células en tampón MSP-A (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 1% (p/v) Triton X-100, 1 tableta de cóctel de inhibidor de proteasa c0mplete por suspensión celular de 50 ml) para obtener una suspensión celular del 30-40% (p/v).
  6. Interrumpir las células mediante sonicación o utilizando una prensa francesa y centrifugar a 30.000 x g durante 30 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y filtre a través de un filtro de 0,45 μm. Aplicar el filtrado sobre una columna de ácido nitrilotriacético cargada con Ni2+ (CV > 15 mL) equilibrada con 5 CV de tampón MSP-B (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 1% (p/v) Triton X-100) mediante el uso de una bomba peristáltica.
    NOTA: Para facilitar la filtración, el sobrenadante se puede sonicar durante otro minuto para descomponer grandes fragmentos de ADN.
  7. Después de cargar la muestra, lavar la columna con 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl, 50 mM ácido cólico), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl) y 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol).
    NOTA: El ácido cólico en el tampón MSP-C es importante para eliminar los lípidos unidos a MSP. El ácido cólico no es completamente soluble a valores de pH bajos. Por lo tanto, el valor de pH debe ajustarse a 8.9 en MSP-C y MSP-D. Es importante lavar la columna con tampón MSP-D, ya que un pH más bajo puede causar que el ácido cólico residual precipite y bloquee o dañe la columna.
  8. Eluto MSP con MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol). Recoja fracciones de 1 ml y monitoree la absorción UV a 280 nm. Recolectar y agrupar las fracciones del pico de elución.
  9. Transfiera fracciones de MSP agrupadas a tubos de membrana de diálisis MWCO de 12-14 kDa y dialice contra 5 L de MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 10% (p/v) glicerol) durante 2-3 h a 4 °C. Cambiar a tampón MSP-H fresco de 5 L y dializar durante otras 12-16 h a 4 °C.
  10. Día 5: Transfiera la solución MSP a tubos de centrífuga y centrifuga a 18.000 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar el precipitado. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y concentre a 200-800 μM utilizando dispositivos de ultrafiltración con 12-14 kDa MWCO a 4 °C. Mida la concentración utilizando un dispositivo de medición UV/VIS. Utilice el coeficiente de extinción de 27,31 M-1 cm-1 y la masa molecular de 31,96 kDa para el cálculo de la concentración.
    NOTA: La expresión en un biorreactor generalmente produce 15-30 mg de MSP1E3D1 por cultivo L.
  11. Alícuotas de choque y congelación de la solución concentrada de MSP en nitrógeno líquido y conservar a -80 °C.

4. Montaje de nanodiscos MSP1E3D1

  1. Día 1: Preparar 1-2 ml de 50 mM de reservas de lípidos (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC o POPC) en 100 mM de colilato de sodio. Conservar a -20 °C si no se utiliza el mismo día.
    NOTA: La solución lipídica debe ser transparente. Si la solución no es clara, la concentración de colato de sodio puede aumentarse a 150 mM.
  2. Mezclar la solución MSP1E3D1 con la solución lipídica. Añadir dodecil fosfocolina (CPD) a una concentración final de 0,1% (p/v). Las reacciones de ensamblaje pueden ajustarse a volúmenes finales de 3 ml (Tabla 2) o 12 ml correspondientes a volúmenes típicos de casetes de diálisis (10 kDa MWCO). Incubar las reacciones de montaje durante 1 h a 21 °C bajo agitación suave.
    NOTA: Para cada lípido, se debe utilizar una relación específica MSP1E3D1:lípido para garantizar una preparación homogénea del nanodisco (Tabla 2). Para nuevos lípidos o mezclas de lípidos, la relación óptima debe determinarse con un experimento piloto y un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño14.
  3. Prehumedezca la membrana de un casete de diálisis con tampón de formación de disco (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl). Transfiera la mezcla de ensamblaje al casete de diálisis con una jeringa. Las posibles burbujas de aire se pueden eliminar por aspiración con la jeringa.
  4. Días 1-4: Dializar contra tampón DF de 3 x 5 L durante 10-20 h a RT bajo agitación utilizando una barra de agitación. A continuación, transfiera la mezcla de ensamblaje del casete de diálisis a unidades de filtro centrífugas con MWCO de 10 kDa equilibrado con tampón DF. Concentrado a 4.000 x g a 4 °C.
    NOTA: Una mezcla de diálisis turbia podría indicar una relación estequiométrica incorrecta de MSP:lípido. El precipitado debe eliminarse a 18.000 g durante 20 min a 4 °C antes de la concentración de la muestra. Para evitar la precipitación durante la concentración de la muestra, utilice unidades de ultrafiltración con un punto muerto grande.
  5. Concentrar los nanodiscos ensamblados a una concentración de al menos 300 μM. Mida la concentración utilizando un lector UV/VIS. Considere que un nanodisco está formado por dos moléculas MSP1E3D1 y, por lo tanto, la concentración de MSP debe dividirse por 2 para determinar la cantidad correcta de nanodiscos.
    NOTA: La configuración descrita (Tabla 2) producirá 0.6-1 ml de una solución de nanodisco de 300 μM.
  6. Centrifugar la preparación concentrada de nanodiscos a 18.000 x g durante 20 min a 4 °C para eliminar el precipitado. A continuación, aspirar el sobrenadante y congelar 50 μL de alícuotas en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
    NOTA: Es aconsejable evaluar el éxito de la formación de nanodiscos mediante cromatografía de exclusión de tamaño. La muestra debe ser monodispersa y debe contener sólo una baja cantidad de agregados. Los agregados indican que la cantidad de lípidos en la configuración es demasiado alta. Como referencia, se puede utilizar MSP1E3D1 purificado. Si la preparación del nanodisco muestra un pico a la altura del pico MSP1E3D1 de referencia, la relación lípido / MSP1E3D1 elegida fue demasiado baja.

5. Configuración de la reacción CECF de 3 ml de escala preparativa

  1. Día 1: Preparar todas las soluciones madre necesarias enumeradas (Tabla 3). Las existencias se almacenan a -20 °C y se descongelan a temperatura ambiente. Asegúrese de mezclar bien todos los caldos después de la descongelación y antes del pipeteo. Calcular los volúmenes requeridos para todas las existencias y hacer un esquema de pipeteo (Tabla 4). Los compuestos de alto peso molecular solo se agregarán al RM. Para los compuestos de bajo peso molecular, se puede preparar una mezcla maestra combinada de 3 x para RM y FM.
    NOTA: Los volúmenes finales de las mezclas de compuestos pueden ser menores que los calculados debido a la pérdida de volumen durante la mezcla. Esto se puede evitar agregando un exceso de volumen de 2-5% para compensar la pérdida de volumen.
  2. Equilibrar la membrana de un casete de diálisis de 3 mL en 100 mM de Tris-acetato, pH 8.0. Asegúrese de eliminar el exceso de búfer.
  3. Usar una jeringa para transferir el RM al casete de diálisis. Elimine el exceso de aire en el compartimento RM por aspiración con la jeringa. Coloque el casete de diálisis en la cámara de diálisis.
  4. Llene la cámara de diálisis con 60 ml de FM. Coloque la tapa en la cámara y apriete los tornillos para fijarla. Incubar la cámara durante 12-16 h a 30 °C a 200 rpm.
    NOTA: Asegúrese de que la cámara permanezca en posición vertical durante la agitación, de lo contrario se obstaculizará el intercambio de compuestos de bajo peso molecular.
  5. Día 2: Con una jeringa, aspire el RM de la cámara de diálisis. Transfiera el RM a tubos nuevos y centrifugar a 16.000 x g a 4 °C durante 10 min para eliminar el precipitado. Transfiera el sobrenadante a tubos nuevos. La proteína en el sobrenadante ahora se puede analizar más a fondo.
    NOTA: En algunos casos, un pellet estará presente después de la centrifugación. Esto puede proporcionar información importante sobre la idoneidad de los nanodiscos analizados o los compuestos de reacción para mantener el MP sintetizado soluble. Por lo tanto, es aconsejable analizar la cantidad de objetivo potencialmente presente en el precipitado mediante el uso de SDS-PAGE, Western Blot o mediante una evaluación visual del tamaño del pellet.

6. Configuración de la reacción CECF de 60 μL a escala analítica para el cribado de iones Mg2+

  1. Día 1: Mezcle todos los componentes de la mezcla maestra 3x respectiva y distribuya 60 μL al RM y 825 μL a la FM. Llene FM con H2O y mezcle FM por vórtice. Transfiera FM a 3 pocillos de la microplaca de 24 pozos (Tabla 5).
    NOTA: Dado que el contenedor Mini-CECF personalizado podría no ser accesible, los volúmenes de la Tabla 5 se calculan para una reacción realizada en cartuchos de diálisis (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) con un volumen de FM de 1,7 ml en placas de 96 pozos profundos (2 ml) (Figura 1).
  2. Corte tubos de diálisis de celulosa regenerada con un MWCO de 10-14 kDa en piezas de aproximadamente 25 x 20 mm y guárdelos enH2Ocon azida sódica al 0,05% (p/v).
    PRECAUCIÓN: La azida de sodio es muy tóxica. Evite cualquier contacto con la piel o la membrana mucosa. No utilice recipientes metálicos ya que la azida de sodio puede reaccionar con los metales para formar azidas metálicas explosivas.
  3. Antes del montaje del envase Mini-CECF, retire el exceso deH2Ode las membranas de diálisis con un pañuelo de papel. Coloque una pieza de membrana en cada recipiente y fije las membranas con un anillo de politetrafluoretileno.
  4. Transfiera el contenedor Mini-CECF a los pocillos de una placa de 24 pocillos con 825 μL de FM. Evite las burbujas de aire debajo de la membrana de diálisis del contenedor Mini-CECF.
  5. Agregue componentes de alto peso molecular al RM como se describe (Tabla 5) y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Añadir 60 μL al recipiente de reacción. Evite las burbujas de aire durante la transferencia de la solución viscosa.
  6. Corte 2 láminas de 8 x 10 cm de una película termoplástica de sellado y envuélvalas alrededor de la placa de 24 pocillos con los recipientes de reacción dentro. Esto reducirá la evaporación de la mezcla de reacción. Ahora coloque la tapa de la placa de cultivo celular en la placa y fíjela con cinta adhesiva. Incubar la placa a 30 °C y agitación a 200 rpm durante 12-16 h.
  7. Día 2: Cosechar la mezcla de reacción perforando a través de la membrana de diálisis con la punta de pipeta en el recipiente Mini-CECF y aspirar el RM. Transfiera RM a tubos nuevos y centrifugar a 16,000 x g a 4 °C durante 10 min para eliminar los precipitados. Transfiera el sobrenadante a tubos nuevos. La proteína en el sobrenadante ahora se puede analizar más a fondo.
    NOTA: En algunos casos, después de la centrifugación un pellet estará presente. Esto puede proporcionar información importante sobre la idoneidad de los nanodiscos analizados u otros compuestos de reacción para mantener el MP sintetizado soluble. Por lo tanto, es aconsejable analizar la cantidad de objetivo potencialmente presente en el precipitado mediante SDS-PAGE, Western Blot o evaluación visual del tamaño del pellet.

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Representative Results

Se ejemplifica el impacto de los compuestos de reacción de ajuste fino en el rendimiento final o la calidad de los MP sintetizados. Un enfoque de rutina frecuente es ajustar la concentración óptima de Mg2+ en las reacciones de FQ mediante la expresión de proteína fluorescente verde (GFP) como un monitor conveniente de la eficiencia del sistema. Como ejemplo, GFP se sintetizó a partir de un vector pET-21a(+) a concentraciones de Mg 2+ entre 14 y24 mM (Figura 2). El análisis SDS-PAGE identificó la concentración óptima de Mg 2+ a 20 mM (Figura 2A), que está en buena conformidad con las mediciones de fluorescencia complementarias (excitación a 485 nm, medición de emisión a 535 nm) del sobrenadante de reacción CF (Figura 2B). Para la expresión de CF del PR bacteriano expresado a partir del vector pIVEX 2.3 y del receptor adrenérgico de pavo β 1 (Tβ1AR) expresado a partir del vector pET-21a(+), se identificó la concentración óptimade Mg 2+ a 20-22 mM.

Como ejemplo adicional, se muestra el refinamiento de la calidad de los parlamentarios sintetizados con la estrategia descrita. Los parámetros sintonizables para la inserción co-traduccional de MPs en nanodiscos preformados son (i) la composición lipídica de la membrana del nanodisco y (ii) la concentración final de nanodiscos en la reacción. Es bien sabido que el ambiente hidrofóbico es un parámetro importante para el correcto plegado, el ensamblaje oligomérico y la estabilidad de los MP. Dado que la composición lipídica en nanodiscos puede ser modulada, el enfoque descrito permite un cribado sistemático directo de los efectos lipídicos sobre la estructura y función de un MP. En experimentos iniciales, se recomienda examinar lípidos con grupos de cabeza de fosfatidilcolina (PC) y fosfatidilglicerol (PG) y probar diferentes longitudes de cadena y saturaciones. Se muestra el impacto de la composición de la membrana y la concentración de nanodiscos en la eficiencia de solubilización y la calidad de dos MP diferentes. PR es una bomba de protones activada por luz y un MP muy estable y altamente sintetizado que alcanza concentraciones finales de > 100 μM en el RM. Por lo tanto, se recomienda usarlo como control positivo para garantizar la configuración correcta de la reacción, ya que la concentración de PR se puede evaluar fácilmente mediante la medición de la absorción a 530 nm en el sobrenadante RM. En contraste, Tβ1AR es un ejemplo de la gran familia de receptores acoplados a proteínas G eucariotas (GPCR) y es un MP complejo e inestable. Para un monitoreo conveniente, se sintetizó una construcción de fusión Tβ1AR-GFP y se determinó la concentración total del receptor solubilizado de nanodisco en las reacciones de CF a través de la fluorescencia GFP (Figura 3A). La fracción del receptor activo funcionalmente plegado y de unión al ligando se determinó además mediante un ensayo de unión al filtro y el ligando marcado [3H]-dihidroalprenolol (Figura 3B). El ensayo de unión al filtro se realizó como se describió anteriormente14. Brevemente, la concentración de Tβ1AR-GFP en el RM se determinó a través de su fluorescencia. El GPCR se incubó con el ligando radiomarcado durante 1 hora a 20 °C, se aplicó a un filtro y se lavó el ligando no unido. Para la determinación de la unión inespecífica de [3H]-dihidroalprenolol, el receptor se saturó con alprenolol no marcado en una reacción de control. Los recuentos del ligando radiactivo en los filtros se midieron en un contador de centelleo y la cantidad de ligando unido se determinó a través de su actividad específica de etiquetado. El porcentaje de actividad de unión a GPCR se calculó a partir de la cantidad de ligando unido, la concentración de Tβ1AR-GFP y el volumen del ensayo. La síntesis general y la solubilización de nanodiscos de Tβ1AR-GFP es similar con todas las composiciones de membrana analizadas y dentro del rango de 8-13 μM (Figura 3A). En contraste, una variación mucho mayor es detectable en la calidad del GPCR sintetizado. La actividad más baja con menos del 10% de fracción activa se obtiene con los lípidos DMPC y POPC. Con DOPG y POPG, la fracción activa de Tβ1AR-GFP podría incrementarse a aproximadamente el 30% (Figura 3B). Los resultados indican que la carga del grupo de cabeza lipídica, así como la flexibilidad de la cadena de ácidos grasos son moduladores importantes para el plegamiento y la actividad de este GPCR.

Además de la composición del nanodisco, su concentración final en la reacción de CF puede ser un factor importante para la calidad del MP. Una vez que se ha identificado una composición de membrana adecuada de un nanodisco, se debe analizar su concentración durante la síntesis de MP. Es obvio que la concentración de nanodiscos debe ajustarse de acuerdo con la eficiencia de expresión de un MP. La síntesis de CF del receptor Tβ1AR-GFP y PR da como resultado concentraciones finales de aproximadamente 10 μM y 100 μM en el RM, respectivamente. Si la concentración de nanodiscos se tamiza dentro de un rango de 3.75-60 μM, se obtiene una solubilización completa del GPCR a aproximadamente 30 μM nanodiscos, dando una relación de Tβ 1 AR:nanodisco de1:3 (Figura 4A). En contraste, la solubilización completa de PR ya se logra con nanodiscos de aproximadamente 10 μM y da una relación PR:nanodisco de 10:1 (Figura 4B). Por lo tanto, es necesario un exceso de nanodiscos para lograr una solubilización casi completa de Tβ1AR-GFP, mientras que una relación invertida en el caso de PR indica la inserción de múltiples copias de PR en un nanodisco. Estudios posteriores de complejos PR/nanodiscos purificados con espectrometría de masas nativa confirmaron esta observación y encontraron una prevalencia de formas oligoméricas más altas de PR si se sintetizan a concentraciones más bajas de nanodiscos15,18. Por lo tanto, la titulación de MPs sintetizados con CF con nanodiscos se puede utilizar como una herramienta para desencadenar ensamblajes oligoméricos y estudiar sus efectos sobre la función de MP.

Figure 1
Figura 1: Estrategia de expresión de CECF para la inserción de proteínas de membrana en nanodiscos. (A) Flujo de trabajo básico que ilustra los principales pasos del proceso. (B) Recipientes de reacción a escala analítica personalizados para la expresión de CECF. (C) Cartuchos de diálisis disponibles comercialmente para la configuración de CECF a escala analítica. (D) Configuración de escala preparatoria (3 ml RM) que incluye un casete de diálisis de 3 ml y un contenedor FM de plexiglás personalizado. (E) Inserción co-traslacional de MPs en nanodiscos preformados y cribado de lípidos en la configuración CECF. El RM contiene la maquinaria de transcripción/traducción y nanodiscos necesarios, mientras que los compuestos de bajo peso molecular están presentes en ambos compartimentos. Las aplicaciones bioquímicas y estructurales de las muestras de MP/nanodiscos producidas se ilustran aún más. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Efecto de diferentes concentraciones de Mg2+ en la síntesis de CF GFP. La GFP se sintetizó en reacciones de FQ con concentraciones de Mg 2+ dentro de un rango de14-24 mM. (A) El análisis SDS-PAGE muestra la banda más fuerte de GFP a 20 mM Mg2+. M: Marcador. (B) fluorescencia de GFP después de la expresión de CF con diferentes concentraciones de Mg2+ . La fluorescencia máxima de GFP a 20 mM Mg2+ corresponde a 4,6 mg/mL. Las barras de error representan la desviación estándar de una medición duplicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efecto de la composición de la membrana del nanodisco sobre la solubilización y calidad de un GPCR sintetizado por CF. Rendimiento y actividad de Tβ1AR-GFP sintetizados en presencia de nanodiscos de 30 μM que contienen diferentes composiciones de membrana. La proteína sintetizada total ( A ) y la fracción del receptor activo de unión al ligando (B) se dan en μM. La concentración total se determinó mediante la medición de fluorescencia de la fusión GFP. La actividad se midió mediante un ensayo de unión al filtro con el ligando radiomarcado [3H]-dihidroalprenolol. Las barras de error representan desviaciones estándar de triplicados independientes. Datos tomados de manuscritos publicados anteriormente14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Pantalla de solubilización de MPs sintetizados por CF con concentraciones crecientes de nanodiscos. Los MPs se sintetizaron en presencia de nanodiscos suministrados dentro de un rango de 3.75-60 μM. (A) Expresión de Tβ1AR-GFP con nanodiscos (DMPC) en la reacción CF. La concentración total se determinó mediante la medición de fluorescencia de la fusión GFP. Datos tomados de manuscritos publicados anteriormente14. Las muestras purificadas de etiquetas de afinidad se analizaron mediante SDS-PAGE y la tinción de Coomassie-Blue muestra dos bandas prominentes correspondientes a Tβ1AR-GFP a aproximadamente 50 kDa y MSP1E3D1 por encima de 25 kDa (B) Expresión de PR con nanodiscos (DOPG) en la reacción CF. La concentración total de PR se determinó mediante la medición de absorción a 530 nm. Datos tomados del manuscrito previamente publicado10,18. Las fotos muestran el color rojo de las reacciones finales debido a la presencia de relaciones públicas plegadas. Los pictogramas ilustran el ensamblaje PR modulado hacia conformaciones oligoméricas más bajas sobre concentraciones aumentadas de nanodiscos, como lo revela la espectrometría de masas nativa posterior18. Las muestras purificadas de la etiqueta de afinidad se analizaron mediante SDS-PAGE y la tinción de Coomassie-Blue muestra dos bandas prominentes correspondientes a PR a aproximadamente 20 kDa y MSP1E3D1 por encima de 25 kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Compuesto Rango de concentración final Efecto sobre la muestra MP
Mg2+ 10 - 30 mM rendimiento
TDT 1 - 20 mM formación de puente disulfuro, plegado
20 Mezcla de aminoácidos1 0,2 – 2 mM rendimiento
GSSG : GSH2 (1-10 μM) : (1-10 μM) formación de puente disulfuro, plegado
Nanodiscos 10 - 100 μM solubilización, ensamblaje oligomérico, plegado
Tipo de lípido solubilización, ensamblaje oligomérico, plegado
S30 : HS30 lisado3 (50-100 %) : (50-100 %) plegable
S12 - S100 20 – 50 % rendimiento, antecedentes de MP en ensayos de canal
Plantilla de ADN 0.5 – 30 ng/μL RM rendimiento, ensamblaje oligomérico, plegado
Diseño de plantilla de ADN rendimiento
1, la mezcla puede variar de acuerdo con la composición individual de un MP para, por ejemplo, mejorar el rendimiento u optimizar los esquemas de etiquetado de RMN.
2, GSH siempre debe prepararse fresco.
3, la concentración total de lisado de CF en el RM debe ser de al menos el 35 % con un contenido de S30 de al menos el 50 % para garantizar altos niveles de expresión.

Tabla 1: Componentes críticos de cribado de las reacciones de FQ.

MSP1E3D1 Lípido DPC
Proporción (410 μM de existencias) (50 000 μM de existencias) (10 % (h/v) existencias)
Lípido Lípidos : MSP V(MSP) c(MSP final) V(lípido) C(lípido final) V(DPC) c(CPD final) Búfer DF
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
DMPC 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
DOPC 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
DMPG 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
DOPG 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPG 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

Tabla 2: Proporciones de lípidos a MSP1E3D1 para configuraciones de ensamblaje in vitro de 3 ml.

Compuesto Concentración Preparación
Plantilla de plásmidode ADN 1 > 400 μg/mL en 10 mM Tris-HCl pH 8.0 Preparación del kit Midi/Maxi (por ejemplo, Qiagen)2
Mezcla de 20 aminoácidos3 25 mM cada uno en H2O Restos precipitados4
Mezcla de 4 NTPs (75 x) c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM
enH2O. Ajustar el pH a 7-8 con KOH		 Un poco de precipitado queda4
Fosfato de acetil 1 M en H2O, ajuste el pH 7-8 con KOH Restos precipitados4
Ácido fosfo(enol)pirúvico (K+) 1 M en H2O, ajuste el pH 7-8 con KOH
Ácido folínico 10 mg/ml enH2O Restos precipitados4
TDT 0,5 m en H2O
C0mplete Cóctel de inhibidores de la proteasa 1 comprimido por 1 ml enH2O
Tris-acetato, pH 8.0 2,4 m en H2O
Mg(OAc)2 1 m en H2O
KOAc 10 m en H2O
Ribolock RNasa-Inhibidor 40 U/ml Thermo Fisher Scientific
ARNt (E. coli) 40 mg/ml enH2O Roche (Alemania)
T7RNAP 3-7 mg/mL5 Consulte la sección 2 del protocolo
Piruvato quinasa 10 mg/ml Roche (Alemania)
Nanodiscos (DMPG) 0.2-1.0 mM6 en 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl Consulte las secciones 3 y 4 del protocolo.
1, la plantilla de PCR podría usarse a concentraciones similares.
2, la calidad del ADN preparado "Mini"-kit no es satisfactoria.
3, la cisteína tiende a ser inestable y puede agregarse por separado.
4, la solución está sobresaturada, es necesaria una mezcla completa al instante antes de eliminar las alícuotas.
5, para cada nuevo lote de T7RNAP, se recomienda un cribado inicial para identificar la mejor concentración final.
6, la solubilidad de los nanodiscos puede depender de su composición lipídica.

Tabla 3: Preparación de soluciones madre de CF.

Compuesto
Para Mastermix (3.0 x) c(final) V [μL]
Mezcla de 20 aminoácidos 1 mM 2520.0
Mezcla de 4 NTPs (75 x) 1x 840.0
Fosfato de acetil 20 mM 1260.0
Fosfo(enol)
ácido pirúvico		 20 mM 1260.0
Ácido folínico 0.1 mg/ml 630.0
Tris-acetato, pH 8.0 100 mM 2625.0
c0mplete 50 x 1x 1260.0
Mg(OAc)2 19,8 (= 20)1 mM 1260.0
KOAc 180 (= 270)2 mM 1140.0
TDT 2 mM 252.0
H2O 7953.0
Total 21 000
Para RM c(final) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
Inhibidor de la RNasa 0,3 U/μL 22.5
ARNt (E. coli) 0.5 mg/mL 37.5
Nanodiscos (DMPG)3 10 μM 75.0
Plantillade ADN 4 0,015 ng/μL 112.5
Piruvato quinasa 0.04 mg/mL 12.0
T7RNAP5 0.03 mg/mL 15.0
Lisado S30 0.35 % 1050.0
Retina todo-trans6 0,6 mM 9.0
H2O - 666.5
Total 3000.0
Para FM c(final) V [μL]
Mastermix (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
Total 60 000
1,2 mM Mg2+ son aportados por el lisado S30.
2,90 mM K+ se aportan a partir de acetilfosfato y fosfo(enol) ácido pirúvico.
3, la solución madre calculada es de 400 μM.
4, la solución madre calculada es de 400 μg/ml.
5, la solución madre calculada es de 6 mg/ml.
6, cofactor específico para PR, la solución madre es de 200 mM en DMSO.

Tabla 4: Esquema de pipeteo para una reacción CECF con 3 mL de RM y 60 mL de FM

Compuesto
Para Mastermix (3.0 x) c(final) V [μL]
Mezcla de 20 aminoácidos 1 mM 864.0
Mezcla de 4 NTPs 1x 288.0
Fosfato de acetil 20 mM 432.0
Ácido fosfo(enol)pirúvico 20 mM 432.0
Ácido folínico 0.1 mg/ml 216.0
Tris-acetato, pH 8.0 100 mM 900.0
c0mplete 1x 432.0
Mg(OAc)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KOAc 180 (= 270) mM2 389.0
TDT 2 mM 86.4
H2O - 2862.6
Total [μL]1 - 7200.0
Concentración de Mg2+
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
Para RM c(final) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0,1 m mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
Inhibidor de la RNasa 0,3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
ARNt (E. coli) 0.5 mg/mL 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Plantillade ADN 3 0,015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Piruvato quinasa 0.04 mg/mL 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0.03 mg/mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Lisado S30 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
Total [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Concentración de Mg2+
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
Para RM c(final) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0,1 m mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
Total [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
1,2 mM Mg2+ son aportados por el lisado S30. La mezcla maestra se ajusta a la concentración de cribado más baja.
2,90 mM K+ se aportan a partir de acetil fosfato y fosfo(enol)ácido pirúvico.
3, la solución madre calculada es de 400 μg/ml.
4, la solución madre calculada es de 6 mg/ml.
5, las reacciones se realizan por duplicado.

Tabla 5: Esquema de pipeteo para pantalla de concentración de Mg2+ con 100 μL de RM y 1,7 mL de FM.

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Discussion

Se describen la configuración y las estrategias para optimizar la expresión de CF y la inserción co-traduccional de MP funcionales en nanodiscos. El equipo requerido comprende un biorreactor, un dispositivo de prensa francés o similar, un lector UV / VIS y fluorescencia, recipientes de reacción CF adecuados para una configuración de dos compartimentos y una incubadora de temperatura controlada. Otros equipos estándar son centrífugas para cosechar células de E. coli, así como centrífugas de mesa que alcanzan al menos 30,000 x g para la preparación de lisados S30. Si se deben preparar lisados S80-S100, son necesarias ultracentrífugas. El equipo enumerado está disponible regularmente en laboratorios bioquímicos y no se requieren mayores inversiones iniciales para comenzar con la expresión de CF. Además, la fermentación y el manejo de células de E. coli para lisado de FQ y preparaciones T7RNAP son técnicas comunes y robustas. Los compuestos más caros son el lisado de CF, T7RNAP y nanodiscos. Se pueden preparar mediante protocolos fiables y eficientes y las alícuotas son estables durante años a -80 °C. Los protocolos requieren tres días cada uno para el lisado de CF y la preparación de T7RNAP y aproximadamente una semana para la expresión y purificación de MSP y preformación de nanodiscos. El ADN de la plantilla diana se puede suministrar utilizando pET-21, pIVEX o sistemas vectoriales similares. Para la configuración y optimización de sistemas de expresión de CF, la producción de variantes de GFP como GFP desplazada (GFP+) o supercarpetaGFP se puede utilizar como monitor 20,32. Para condiciones de producción de MP, la expresión de PR es un buen sistema modelo o control positivo, ya que se pliega en muchas condiciones diferentes y puede controlarse fácilmente mediante absorbancia a 530 nm10,15,18. Para establecer un protocolo de expresión de CF eficiente para un nuevo MP, se recomienda la optimización del codón del marco de lectura objetivo y el uso de fusiones con GFP conectado C-terminal25,26. Otros materiales requeridos incluyen productos químicos y enzimas que están disponibles comercialmente. Estos componentes deben obtenerse en alta calidad y un cálculo del costo total para la reacción de CF descrita con 3 mL de RM y 60 mL de FM ascendería a aproximadamente 150-200 €. Una aplicación principal para los sistemas de expresión de FQ es, por lo tanto, la producción de proteínas difíciles de obtener en sistemas de expresión basados en células clásicas, como muchos MP o toxinas. Los sistemas de FQ son, además, plataformas centrales en biología sintética y los campos de aplicación en continuo crecimiento los hacen cada vez más indispensables como herramienta en la investigación molecular. Entre otras, las aplicaciones rutinarias son el etiquetado de proteínas, procesos de alto rendimiento o diseño celular sintético.

La estrategia demostrada permite la producción sin detergente de MPs puros ya insertados en los entornos lipídicos deseados de nanodiscos altamente solubles. Una vez establecido y optimizado el protocolo de expresión de CF para un MP, la producción es muy rápida y se pueden obtener muestras puras en menos de 24 h incluso en escala preparativa. Los complejos MP/nanodisco se purifican directamente de la reacción CF a través de etiquetas de estreptavidina II o polihistidina unidas al MP. El proceso permite el análisis funcional y estructural paralelo de muestras de MP idénticas mediante una serie de diferentes técnicas33. La rapidez y eficiencia de la estrategia es, por lo tanto, competitiva para los enfoques convencionales que emplean sistemas de expresión basados en células y extracción detergente de MP de las membranas celulares seguida de reconstitución in vitro de rutina 5,34. La accesibilidad abierta de las reacciones CF facilita aún más numerosos estudios mecanicistas únicos de plegamiento de MP e inserción de membrana 15,16,18, ensamblaje complejo MP15,18,24 o regulación funcional 23.

Una diferencia importante de la expresión de CF sobre la expresión basada en células es la ausencia de sistemas de control de calidad para el producto proteico sintetizado. Cualquier polipéptido traducido independiente de su plegamiento funcional terminará en la muestra del producto final. Además, el proceso de inserción en las membranas de nanodiscos es artificial e independiente del translocon y puede resultar en una integración incompleta o puede no funcionar en absoluto con una serie de objetivos MP. La fracción de producto finalmente solubilizada en una reacción de CF podría ser bastante heterogénea conteniendo MP completamente insertados pero también solo parcialmente integrados o asociados a la membrana. En consecuencia, solo una pequeña fracción de una muestra purificada de complejos MP / nanodiscos podría plegarse funcionalmente. La modificación de la composición de la membrana y el ajuste cuidadoso de las proporciones de MP a nanodisco mediante la modulación de las concentraciones de nanodiscos y plantillas de ADN son herramientas adecuadas para la optimización. Sin embargo, los enfoques de control de calidad posteriores, como el perfil de exclusión de tamaño y los ensayos funcionales cuantitativos específicos del objetivo, siempre son necesarios para optimizar los protocolos de expresión de FQ. Por lo tanto, la disponibilidad de tales ensayos puede limitar las aplicaciones, particularmente en proyectos que incluyen MP que requieren entornos liposomales para su función, como transportadores, canales o bombas. Además, las limitaciones de tamaño de los nanodiscos podrían restringir la inserción de grandes ensamblajes MP.

En los ejemplos documentados, la variación en la fracción plegada funcionalmente del GPCR Tβ1AR-GFP está dentro del rango de un pequeño porcentaje, hasta aproximadamente el 30%. El plegado funcional requiere un ajuste cuidadoso de una serie de parámetros14 y un proceso de optimización individual y tedioso similar también podría ser necesario para otros GPCR22. Sin embargo, el rendimiento finalmente alcanzado de GPCR funcionalmente plegado es competitivo con otros sistemas de producción y permite la configuración de > 1.000 radioensayos para estudios de unión de ligandos a partir de una sola reacción de 60 μL en un reactor Mini-CECF a escala analítica. Vale la pena mencionar que los estudios de unión de ligandos de las construcciones de fusión GPCR-GFP no requieren ningún paso de purificación. Si es necesario, la purificación se puede lograr aprovechando las etiquetas de afinidad adjuntas al MP sintetizado, como las etiquetas His o la etiqueta Strep II. El RM se diluye en el tampón deseado y se carga en la columna de cromatografía de afinidad correspondiente que se ha preequilibrado en consecuencia. La evaluación estructural de PR y otros MP sintetizados de CF por espectroscopia de RMN o cristalización ya ha ayudado a establecer los sistemas de expresión de CF como plataformas centrales en la investigación de MP. La estrategia descrita para la producción de complejos MP/nanodisco podría ser particularmente interesante para futuros estudios estructurales por microscopía electrónica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a la subvención BE1911/8-1 de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), al proyecto GLUE de LOEWE y al centro de investigación colaborativa Transport and Communication across Membranes (SFB807) por su apoyo financiero.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

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References

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Inserción co-traduccional de proteínas de membrana en nanodiscos preformados
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