Summary
Detta protokoll beskriver metoder bakom Ramsay-analysen, jonselektiva mikroelektroder, scanning jonselektiv elektrodteknik (SIET) och in vitro-kontraktionsanalyser, som tillämpas för att studera det vuxna myggutsöndringssystemet, bestående av malpighiska tubuler och hindgut, för att kollektivt mäta jon- och vätskeutsöndringshastigheter, kontraktil aktivitet och transepithelial jontransport.
Abstract
Studier av insektsfysiologi, särskilt i de arter som är vektorer av patogener som orsakar sjukdom hos människor och andra ryggradsdjur, ger grunden för att utveckla nya strategier för skadedjursbekämpning. Här beskrivs en serie metoder som rutinmässigt används för att bestämma de funktionella rollerna för neuropeptider och andra neuronala faktorer (dvs. biogena aminer) på myggans utsöndringssystem, Aedes aegypti. Malpighian tubules (MTs), som ansvarar för primär urinbildning, kan fortsätta att fungera i timmar när de avlägsnas från myggan, vilket möjliggör vätskeutsöndringsmätningar efter hormonbehandlingar. Ramsay-analysen är därför en användbar teknik för att mäta utsöndringshastigheter från isolerade MTs. Jonselektiva mikroelektroder (ISME) kan sekventiellt användas för att mäta jonkoncentrationer (dvs. Na+ och K+) i den utsöndrade vätskan. Denna analys möjliggör mätning av flera MTs vid en given tidpunkt, bestämma effekterna av olika hormoner och läkemedel. Scanning jonselektiv elektrodteknik använder ISME för att mäta spännings representativ för jonisk aktivitet i det oförändrat skiktet intill ytan av jontransportande organ för att bestämma transepithelial transport av joner i nära realtid. Denna metod kan användas för att förstå rollen av hormoner och andra regulatorer på jonabsorption eller utsöndring över epitel. Hindgut kontraktionsanalyser är också ett användbart verktyg för att karakterisera myoaktiva neuropeptider, som kan förbättra eller minska detta organs förmåga att ta bort överskott av vätska och avfall. Sammantaget ger dessa metoder insikt i hur utsöndringssystemet regleras hos vuxna myggor. Detta är viktigt eftersom funktionell samordning av utsöndringsorganen är avgörande för att övervinna utmaningar som uttorkning stress efter eklosion och innan du hittar en lämplig ryggradsdjur värd för att få ett blodsocker.
Introduction
Underhåll av salt- och vattennivåer i insekter gör det möjligt för dem att lyckas i många ekologiska och miljömässiga nischer, med hjälp av en mängd olika utfodringsstrategier1. De flesta insekter har utvecklat mekanismer för att reglera sammansättningen av sin hemolymf inom snäva gränser för att motstå de olika utmaningarna i samband med deras speciella miljö2. Terrestra insekter står ofta inför utmaningen att bevara vatten och utsöndringssystemet genomgår anti-diuresis för att förhindra förlust av vatten och vissa väsentliga salter, vilket undviker uttorkning. Däremot uppstår diures när insekten matar och utmanas med överskott av vatten och potentiellt salter3,4. Genom sitt specialiserade och mycket aktiva utsöndringssystem har insekter utvecklat regleringsmekanismer som verkar för att motverka deras osmoregulatoriska utmaningar. Hos vuxna Aedes aegypti myggor består utsöndringssystemet av malpighiska tubuler (MTs) och hindgut, varav den senare består av det främre ileum och bakre ändtarmen5. MTs är ansvariga för att generera primär urin, vanligtvis rik på NaCl och/eller KCl. Den primära urinen modifieras sedan genom sekretoriska och reabsorptive processer när den färdas nedströms tubule och går in i bakgut5. Den slutliga utsöndring kan vara hyper- eller hypoosmotisk för hemolymfen, beroende på utfodring/ miljöförhållanden, och berikas i giftigt och kvävehaltigt avfall2.
MTs är idealiska för att studera många funktioner i epitelvätska och lösningstransport eftersom de utför ett stort utbud av transport- och utsöndringsfunktioner2,6. Genom hormonell reglering2 fungerar MTs genom att utsöndra joner och andra lösgöringar från blodet till tubule lumen7, vilket ger en osmotisk gradient som gör det möjligt att transportera vatten med aquaporins8,9, vilket tillsammans skapar den primära urinen, innan den reser mot den reabsorptive hindgut2. Således, genom att samla den utsöndrade vätskan från isolerade MTs, kan man kontinuerligt övervaka transepithelial transport av vätska och joner. Mätning av utsöndringshastighet och urinsammansättning ger insikt om mekanismer som ansvarar för transepithelial jon och vätsketransport. En populär metod för att studera vätskeutsöndringshastigheter är Ramsay-analysen, som först introducerades av Ramsay 195310. I denna metod behandlas tubuleens distala (slutna) ände med ett hormon (eller annan testförening/läkemedel), medan den proximala (öppna) änden lindas runt en stift i vattenmättad paraffinolja, som utsöndrar den primära urinen och ackumuleras som en droppe på stiftspetsen. Isolerade MTs kan överleva och fungera under långa perioder (upp till 24 h) under optimerade in vitro-förhållanden, vilket gör dem lämpliga och effektiva modeller för vätskeutsöndringsmätning. Insekter har öppna cirkulationssystem, så MTs dissekeras lätt och avlägsnas eftersom de vanligtvis flyter fritt i hemolymph6. Dessutom, med undantag för bladlöss - som saknar MTs11 - kan antalet MTs i en viss insektsart variera avsevärt från fyra till hundratals (fem i Aedes myggor) vilket möjliggör flera mätningar från en insekt.
MTs i Aedes myggor, i likhet med andra endopterygote insekter, består av två celltyper som bildar ett enkelt epitel2,12; stora huvudceller, som underlättar aktiv transport av katjoner (dvs. Na+ och K+) till lumen, och tunna stellatceller, vilket hjälper till vid transepithelial Cl-utsöndring13. MTs är inte innervated2, och regleras istället av flera hormoner inklusive både diuretiska och anti-diuretiska faktorer, vilket möjliggör kontroll av jontransport (främst Na +, K+, och Cl-) och osmotiskt skyldigt vatten2. Många studier har undersökt hormonella regleringen av Aedes MTs för att förstå betydelsen av endokrina faktorer på transepithelial transport14,15,16,17,18. Som framgår av de representativa resultaten visar protokollen häri effekterna av olika hormonella faktorer på isolerade MTs från vuxna kvinnliga A. aegypti myggor, inklusive både diuretisk och anti-diuretisk kontroll (figur 1). Ramsay-analysen används för att visa hur ett anti-diuretiskt hormon, AedaeCAPA-1, hämmar vätskeutsöndring av MTs stimuleras av diuretiskt hormon 31 (DH31) (figur 1).
Den mindre storleken på insekter har krävt utveckling av mikrometoder för att mäta jonisk aktivitet och koncentrationer i vätskeprover, eller nära ytan av isolerade vävnader som MTs och tarm. Olika metoder har implementerats, inklusive användning av radioisotoper av joner19, vilket kräver insamling av de utsöndrade vätskedropparna för mätning av jonkoncentrationer20. Stimulerade Aedes tubules in vitro utsöndrar vanligtvis ~ 0,5 nL / min21, vilket innebär att hantering av sådana små volymer kan utgöra en utmaning och potentiellt införa fel vid överföring. Till följd av detta har jonselektiva mikroelektroder (ISMEs) använts i stor utsträckning för att mäta jonkoncentrationer i utsöndrade droppar av MTs in vitro. I denna metod placeras en referenselektrod och ISME, fylld med lämplig återfyllningslösning och jonofor, i den utsöndrade urindroppen för att bestämma jonkoncentrationer22. Anpassat från Donini och kollegor23, använder detta nuvarande protokoll en Na + selektiv jonofor för att mäta jonaktivitet i utsöndrade droppar från stimulerade MTs hos vuxna Aedes myggor. Eftersom jonselektiva mikroelektroder mäter jonaktivitet kan dessa data uttryckas som jonkoncentrationer efter antagandet att kalibreringslösningarna och försöksproverna har samma jonaktivitetskoefficient21 (figur 1B,C).
Scanning Jonselektiv elektrodteknik (SIET) använder också ISMEs för att mäta jonkoncentrationsgradienter i det ofeldade skiktet intill organ, vävnader eller celler som transporterar joner. ISMEs mäter spänningsgradienter som sedan kan användas för att beräkna jonkoncentrationens gradienter och jonflödets riktning och storlek över organet, vävnaden eller cellen20. I denna teknik är ISME monterad på en manipulator med tre axlar som styrs av datoriserade mikrostegmotorer så att dess 3D-position styrs till mikrometernivån20. Spänningar mäts på två punkter i det oförtred skiktet med hjälp av ett provtagningsprotokoll som är programmerat till och styrt av datorprogramvara. De två punkterna separeras vanligtvis med ett avstånd på 20–100 μm med en punkt inom 5–10 μm från ytan på organet, vävnaden eller cellen och den andra punkten ytterligare 20–100 μm bort. Skillnaden i spänningsstorlek mellan de två punkterna beräknas för att erhålla en spänningsgradient24,25,26, som sedan används för att beräkna koncentrationsgradienten och därefter nettoflödet med ficks lag24,27. Denna metod är användbar för att bedöma transport av specifika joner över olika regioner i insektsmagen och MTs, eller vid specifika tidpunkter efter blodmjöl eller behandlingsexponering. Till exempel kan SIET användas för att förstå hur absorptiv och sekretoriska processer i myggsöndringssystemet regleras av hormoner28 samt olika utfodringsbeteenden och uppfödningsförhållanden25. Tidigare arbete med hjälp av SIET avslöjade platser som är involverade i jontransport längs analpapillen och ändtarmen av larval och vuxna myggor24,28. Det nuvarande protokollet, som tidigare beskrivits av Paluzzi och kollegor26, mäter Na+ fluss över rektal pad epithelia för den vuxna kvinnliga ändtarmen (figur 2).
Det sista segmentet av myggutsöndringssystemet kräver samordnad muskelrörelse för att hjälpa till att blanda mat och utsöndra avfall26. Icke-absorberbara produkter av matsmältningen från midgut, tillsammans med primär urin som utsöndras av MTs, passerar genom pylorisk ventil och levereras till bakgut2. Spontana hindgut sammandragningar börjar vid pyloric ventilen och förekommer i peristaltiska vågor, som vidarebefordras över ileum genom samordnad sammandragning av cirkulära och längsgående muskler som omger den basala ytan av epitelceller26. Slutligen hjälper musklerna i ändtarmen till att driva och eliminera avfall genom analkanalen. Även om insekt hindgut motility är myogena, kräver extracellulär Ca2 + för att producera spontana sammandragningar, kan dessa processer också regleras neuronally26,29,30. Denna exogena reglering av nervsystemet är viktig efter utfodring, eftersom djuret måste utvisa avfall från tarmen och återställa hemolymfbalansen31. Som ett resultat, utföra in vitro bioassays för att identifiera myostimulatory eller myoinhibitory neuropeptides är användbart för att bedöma hur neurokemikalier påverkar hindgut motility. Det nuvarande protokollet, som utförs av Lajevardi och Paluzzi28, använder videoinspelningar för att undersöka ileal motilitet som svar på neuropeptider (figur 3). På samma sätt kan en kraftgivare eller impedansomvandlare också användas för att observera spår av sammandragningar genom en programvara för datainsamling32,33. Men med hjälp av videoteknik kan vi visuellt bedöma organet och ytterligare analysera med hjälp av en delmängd parametrar för att identifiera hormonernas roll på hindgutmotilitet.
Att använda dessa tekniker kan hjälpa till att karakterisera faktorer som reglerar och samordnar vätske- och jontransport längs utsöndringssystemet tillsammans med hindgutmotilitet. Viktigt är att en funktionell koppling mellan det diuretiska svaret från MTs och hindgut motility stöds, eftersom diuretiska hormoner, såsom DH31 och 5HT, kännetecknas av deras förmåga att stimulera vätskeutsöndring av MTs, har också visat sig uppvisa myotropa åtgärder längs mygga hindgut21,34,35 . Dessa resultat belyser vikten av strikt samordning mellan MTs och hindgut under händelser såsom post-prandial diuresis i insekter som kräver snabb avfall eliminering.
Häri beskrivs det detaljerade tillvägagångssättet bakom Ramsay-analystekniken för att mäta vätskeutsöndringshastigheten i myggan, A. aegypti, och användningen av jonselektiva mikroelektroder för att bestämma Na + koncentrationer inom den utsöndrade vätskan i MTs, vilket när de kombineras gör det möjligt att fastställa transepithelial jontransporthastigheter. Dessutom beskrivs scanning jonselektiv elektrodteknik och hindgutkontraktionsanalyser för att mäta jonflöde respektive motilitet, vilket hjälper till att klargöra hormonell reglering av bakguten (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Göra silikonfodrade rätter
OBS: Detta steg bör göras före experimenten. Dessa rätter kommer att göras för att förbereda analysrätten för dissekeringar och för kontraktionsanalysexperiment.
- Förbered silikonet med hjälp av ett silikonelastomersats enligt tillverkarens rekommendationer. Blanda de tvådelade flytande komponenterna i ett förhållande av 10 till 1. Blanda försiktigt och noggrant genom att invertera men se till att minimera bubbelbildningen.
- Häll silikonelastomer i standard 60 mm engångs-polystyrenkulturrätter till ett djup av normalt mellan 7-9 mm. Förbered så många rätter som behövs. Ta bort eventuella luftbubblor med en fin stift under ett mikroskop kort efter att silikon hällts i disken. Placera disken i en dammfri kammare eller ett skåp i rumstemperatur (RT) i minst 48 timmar eller i ugnen vid 50 °C i ca 4 timmar för att härda (figur 5A).
2. Göra Ramsay-analysen skål
OBS: Skålen kan återanvändas från experiment till experiment, så upprepa detta steg endast om skålen är skadad eller går sönder. En separat maträtt används för dissektioner.
- Använd en skalpell (med standard försiktighetsåtgärder), skapa brunnar i en av de silikonbelagda Petri-diskarna för att förbereda analysskålen genom att ta bort tillräckligt med silikon, ca ~ 5 mm, från toppen av skålen (detta bör passa ~ 20 μL baddroppe). Innan detta, använd en permanent markör för att markera positionerna under skålen för att notera var man ska göra brunnarna. Brunnarna ska vara ~ 1 cm ifrån varandra, med en diameter på ca ~ 4 mm för att låta tubuleens distala ände passa. Varje brunn kommer att innehålla en vätskesöndrande tubule, så en maträtt som innehåller 20 brunnar gör det möjligt att analysera upp till 20 MTs per experiment.
- För att förbereda Minutien-stiften, placera 0,1 mm rostfria stift i rad på en etiketttejp, vinkelrätt mot tejpens axel. Använd sax, skär längs bandets längd och skapa lika halvor av stiften. Använd en halv nål för varje brunn.
- Använd ett trubbigt par tångar och för in varje halvstift i den silikonbelagda analysskålen, bredvid varje brunn. Beroende på insektsbadullens längd, sätt in halvstiftet på ett avstånd som gör att tubuleens distala ände kan fördjupa sig i badsaltlinjen och den proximala änden för att linda runt stiftet. Detta steg kan göras under ett mikroskop för att enkelt visualisera brunnar. Stiften kan återanvändas, men byt ut halvstiftet om de är skadade eller förlorade. (Bild 5B)
3. Göra den poly-L-lysinbelagda SIET-skålen
OBS: Detta steg är viktigt för att organet ska hålla fast vid botten av skålen under SIET-mätningar så att mätstället förblir detsamma för varje prov. Beredning av dessa rätter bör göras minst 2 dagar före experimenten. Varje maträtt ska endast användas en gång när en viss behandling appliceras. Kassera efter varje prov eller om poly-L-lysinskiktet är repat av eller skadat.
- För varje prov, placera en 35 mm Petri-skål på en jämn yta. Ta bort locken och pipetten 70 μL poly-L-lysin (0,1 mg/ml) i mitten av varje skål. Sätt på locken igen och låt poly-L-lysinen torka (~48 h) ostört.
- När du är torr, markera skålbotten med en cirkel som beskriver den torkade poly-L-lysinbeläggningen för att bättre visualisera var det strukna organet ska placeras efter dissektioner. Om det behövs för att minimera volymer av saltlösning och behandlingslösningar i experiment, använd en varm limpistol för att omsluta poly-L-lysinbeläggningen, vilket ger tillräckligt med utrymme för elektroden att röra sig och göra bakgrundsmätningar (~ 20-25 mm diameter på den limmade cirkeln är tillräckligt). Dessa belagda rätter kan förvaras på obestämd tid på RT (figur 5C).
4. Förbereda Ramsay och sammandragningsanalysrätter för experiment
OBS: Skålen kan återanvändas (med lämplig tvätt för att avlägsna tidigare använda saltlösning/behandlingar), och upprepa därför endast detta steg om plattan är skadad eller går sönder. En separat maträtt används för dissektioner. Det här steget utförs på experimentdagen.
- För sammandragningsanalysrätten, använd en skalpell (med standard skarpa försiktighetsåtgärder), skapa brunnar i en av de silikonbelagda Petri-rätterna för att förbereda analysrätten. Vinkla skalpellen på ett sätt som brunnarna blir triangelformade för att underlätta fäste av den dissekerade vävnaden på kanterna. Brunnar bör vara tillräckligt stora för att rymma upp till 250 μL och passa hela matsmältningskanalen (i stället för att gräva för djupt, gör brunnen bredare till ca 0,5-1 cm) (figur 5D).
- För Ramsay-plattan, använd en pipett och fyll brunnar upp till 20 μL lösning (18 μL 1X Aedes saltlösning: Schneiders medium förberett i steg 5.2 och 2 μL hormon/läkemedel). För ostimulerade kontroller, fyll brunnar med 20 μL 1X Aedes saltlösning:Schneiders medium. När alla brunnar är fyllda, häll hydratiserad mineralolja i analysrätten tills brunnarna och Minutien-stiften är nedsänkta. Använd en pipettspets på 20 μL för att poppa eller ta bort luftbubblor som kan störa de utsöndrade dropparna.
5. Förbereda lösningar
- Förbered 2X Aedes aegypti saltlösning och 10x glukos, enligt beskrivningen i tabell 1, anpassad från Petzel och kollegor36. Lagerlösningar bör förvaras vid 4 °C. Gör arbetslager av 1X Aedes aegypti saltlösning (tabell 1) och förvara vid 4 °C. På experimentdagen, låt arbetslagren komma till RT före användning. Förbered färska om det finns några tecken på svamp- eller bakterietillväxt.
- För att förbereda baddroppen, blanda Aedes saltlösning (från steg 5.1) med Schneiders medium, i förhållandet 1:1. Förbered i små alikvoter, beroende på hur mycket som behövs. Förvara Schneiders medium i kylskåpet, kassera om det finns tecken på svamp- eller bakterietillväxt. (Detta steg bör göras på experimentdagen).
- För flödesmätningar av Na+ med hjälp av SIET bereder du en modifierad Ca2+-fri Aedes-saltlösning (tabell 2), som tidigare beskrivits26.
6. Mygg-MTs och hindgut dissekeringar
- För vuxna mygg dissektioner, samla pupa i en liten bägare och placera i en burk som innehåller en sackaroslösning för utfodring. För att bestämma myggåldern, isolera kläckta myggor och placera i en annan burk som noterar myggens ålder och kön för framtida dissekeringar.
- Placera kort myggor som ska dissekeras på en CO2-platta och vänta tills de inte svarar. Använd fina tångar, plocka upp myggan från benet eller vingen och placera på en silikonelastomerbelagd dissekeringsfat som är beredd i steg 1. Placera myggan på ena sidan (lateral sida upp), och med en Minutien stift, spetsa in i bröstkorgen för att säkra myggan på plats. Alternativt ta bort vingar och ben från myggor för enklare dissekering.
- Använd en Pasteur pipette, tillsätt en droppe RT Aedes saltlösning för att helt fördjupa myggan i saltlösning. Kontrollera att dissekeringen är helt under saltlösning (se tabell 1 för att göra Aedes saltlösning).
- Placera dissekeringsfatet under ett stereoskopiskt mikroskop. Nyp ihop det sista buksegmentet med fina tångar och dra långsamt bort från myggan. Detta steg underlättas genom att samtidigt titta under mikroskopet. Mittpistolen, som är fäst med MT och bakgeväret, ska exponeras (figur 6).
- För Ramsay-analysen, ta försiktigt bort varje tubule från midgut-hindgut-korsningen och se till att inte skada organen. Använd vassa fina tångar för att ta bort tubulerna individuellt – använd inte skadade tubuler för analysen. (Se steg 7 för installation.)
- För SIET, dissekera bakguten i Ca2+-fri Aedes saltlösning (steg 5.3). Se till att poly-L-lysin skålen också har en fast volym Ca2 +-fri Aedes saltlösning. Ta försiktigt bort nagelbandet från ändtarmen och placera bakguten (kan ta bort andra bifogade organ, beroende på vad som mäts) i poly-L-lysin skålen. Om jontransporten mäts längs rektalplattan epithelia, placera den hemolymfvända sidan av minst en rektal dyna för att vara tillgänglig för mikroelektroden (figur 7).
- Använd tång för att ta tag i den mest bakre änden, ta bakguten ner till botten av skålen (utan att skada några strukturer som kommer att mätas). Så snart organet rör vid poly-L-lysinskiktet kommer det att klibba. Det dissekerade provet är klart för mätningar. (Se steg 14–16 för installation och mätning av SIET.)
- För ileumkontraktionsanalysen, se till att bakgeväret förblir fäst vid midguten under dissekeringen (figur 4D). Ta försiktigt bort MTs för att ha en obehindrad vy av bakgeväret. Detta organ kommer att överföras till en ny maträtt som bereds enligt beskrivningen i steg 4.1. (Se steg 17 för att få analysvideor.)
7. Ställa in Ramsay-analysen
- Använd tångspetsen och lyft försiktigt den proximala (öppna) änden av tubule genom att dra den över tången (nyp inte tubule) och överför till en brunn av analysskålen. Detta steg kan också göras med hjälp av fina glassonder.
- När tubule är nedsänkt i brunnen, plocka upp den proximala änden av tubule med tångarna, ta bort den från baddroppen och linda änden runt stiftet. Linda tubule runt stiftet två gånger – och håll längden på tubule kvar i baddroppar som överensstämmer med de andra tubules. Vid denna tidpunkt bör tubuleens distala ände vara i baddroppen, medan den proximala änden lindas runt stiftet bort från baddroppen så att den utsöndrade vätskan kan ackumuleras på stiftets spets från den öppna proximala änden.
- Omedelbart efter att tubule är lindad runt stiftet, notera brunnarna (t.ex. A, B, C), tiden (som kommer att vara starttiden för när vätskan börjar utsöndras från tubule) och annan identifierande information (t.ex. hormon, genotyp, etc.).
- Varje mygga har fem tubuler, vilket upprepar steg 7.1-7.3 med resten av tubules. För kontroll och experimentella behandlingar, dela de fem tubules inom de olika behandlingarna. Fortsätt med nästa dissekering tills hela analysrätten är fylld. Med övning bör denna teknik ta vanligtvis 2-3 min att dissekera tubulerna, överföra dem till badsaltlinjen och linda runt stiftet, vilket skapar en 2-3 min skillnad i starttiden mellan varje tubule.
OBS: Innan experimentet påbörjas kalibrerar du mikroskopets okulära mikrometer med en stegmikrometer under det valda målet. Utsöndrade droppar mäts rutinmässigt under en total förstoring på 40x–50x. - Efter den tilldelade inkubationstiden kan den utsöndrade droppen mätas. Använd mikroskopets okulära mikrometer och mät och registrera diametern på den utsöndrade droppen. Beräkna diametern (d) på den utsöndrade droppen genom att multiplicera den okulära enhetsdiametern mätt med kalibreringsomvandlingen (tabell 3). Beräkna volymen på den utsöndrade droppen med hjälp av ekvationen V = πd3/6.
- För att beräkna utsöndringshastigheten (nL min-1), använd ekvationen, vätskeutsöndringshastigheten = V/utsöndringstiden, där V är volymen på den utsöndrade droppen beräknad i steg 7,5, och utsöndringstiden avser tubuleens inkubationstid.
8. ISME-installation
- Placera mikromanipulatorer på vardera sidan av stereomikroskopet för att ställa in ISME-stationen. Klorering av silvertrådarna kan uppnås genom att doppa i en lösning av järnklorid och trä varje silvertråd i var och en av mikroelektrodhållarna (eller löd kablarna på koaxialkablarna, om det behövs). Upprepa detta steg när silvertrådarna lossas.
- Anslut silvertrådarna till en förstärkare, som kommer att läsas till ett datainsamlingssystem. Ställ in och kalibrera systemet enligt tillverkarens instruktioner. Vid ökad elektrisk störning, använd en korrekt jordad Faraday-bur.
9. Förbereda mikroelektroderna för ISME och SIET
- Använd en P-97 Flaming Brown pipette puller, dra ~5–6 ofilamenterade borosilikatglas kapillärer (ytterdiameter 1,5 mm, innerdiameter 1,12 mm, längd 100 mm) med en spets på 1–5 μm. Dessa kommer att användas som jonselektiva mikroelektroder. För SIET-mikroelektroder bör den resulterande elektroden ha en spetsöppning på ~ 5 μm, kännetecknad av ett kort skaft.
- Placera mikroelektroderna på en kokplatta i en huva (sätt ner försiktigt för att inte bryta elektrodernas spetsar). Tillsätt diklorodimetylsilane inuti en 15 cm glas Petri-skål och vänd över elektroderna på värmeplattan. Använd diklorodimetylsilane för att silanisera de jonselektiva elektroderna genom att tillsätta ett hydrofobiskt skikt på elektrodens alla ytor, så att den kan behålla den hydrofoba jonoforen37. Oanvända silaniserade elektroder kan lämnas i några veckor; Därför utförs detta steg med några veckors mellanrum, eller för nydragna elektroder.
OBS: Var försiktig vid hantering av dikloddmethylsilane – brandfarlig, frätande och giftig, se MSDS för säker hantering.- Vrid värmeplattan till 350 °C och låt den vara på plats i 75 minuter. Använd ett 1:2-förhållande mellan antalet mikroelektroder i volym (μL) diklodmetylsilane för att tillsätta på petriskålen i glas. För 10 mikroelektroder tillsätt således 20 μL diklododimetylsilane.
- Stäng av kokplattan efter 75 minuter. När elektroderna och värmeplattan har svalnat, ta bort glas Petri-skålen och överför elektroderna (med tång) till en förvaringslåda med gjutlera. Se till att elektrodens spets pekar uppåt för att förhindra skador.
- För att göra referenselektroderna för ISME, dra ~4–5 filamenterade kaposilikatglas kapillärrör (ytterdiameter 1 mm, innerdiameter 0,58 mm, längd 100 mm). Dessa elektroder behöver inte silaniseras. Märk och förvara i en liknande låda, så att spetsen inte skadas.
- SIET referenselektroder är tillverkade av standard kapillärer av glas (ytterdiameter 2 mm, innerdiameter 1,12 mm, längd 102 mm). Kapillärerna är fyllda med smält 1 M KCl + 3% agar och bör förvaras i ett 50 ml centrifugrör som innehåller 1 M KCl (helt nedsänkt) fram till användning. De kan användas upprepade gånger tills bubblor börjar bildas eller om agaren bryts. Om det finns något luftutrymme, kassera glaset och använd ett nytt för att säkerställa att kretsen är komplett.
10. Förbereda återfyllningssprutorna
OBS: Detta steg görs för att skapa finspetsade sprutor för att fylla elektroder för ISME.
- Använd en 1 mL glidspetsspruta med en engångsnål. Kassera nålen och dra tillbaka sprutan tills 1 ml-märket. Under röken slår du på Bunsenbrännaren och värmer upp sprutans plastspets tills den börjar smälta. Använd ett gammalt par tångar, nyp försiktigt den smälta sprutaspetsen och dra ner för att sträcka spetsen.
- Skär den smälta spetsen med hjälp av saxen till önskad längd och lämna diametern tillräckligt liten för att passa inuti elektroderna (se diagram). När sprutan har svalnat, testa sprutans tryck med vatten för att säkerställa att det inte finns någon blockering. Skapa en för varje återfyllningslösning som krävs och etikett i enlighet därmed (bild 8).
11. Fyllning av jonselektiv och referensmikroelektrod för ISME och SIET
OBS: Mikroelektrod kan återanvändas så länge den fortfarande fungerar (kalibrera före varje experiment). För ISME kan detta steg göras medan MTs inkuberas i Ramsay-analysen.
- För att göra en Na+-selektiv mikroelektrod, använd 1 ml sprutan som skapats i steg 10 för att fylla på elektroden med 100 mM NaCl. Se till att återfyllningslösningen fylls tills elektrodens spets. Om luftbubblor uppstår, snärta försiktigt mikroelektroden eller ta bort lösningen och fyll på igen. Detta bör göras under ett stereoskopiskt mikroskop för att visualisera bättre.
- Doppa en 10 μL pipettspets i den Na+-selektiva jonoforlösningen under ett stereoskopiskt mikroskop. Rada upp elektroden vinkelrätt mot pipetten, placera ett handskfinger över botten av spetsen för att skapa tryck och utvisa en liten droppe jonofor. Titta under högt mål av ett mikroskop, tryck försiktigt jonoforen till mikroelektrodspetsen och undvik att bryta spetsen. Normalt fylls mikroelektroder framåt med en jonoforcocktailkolonnlängd på mellan 150–300 μm tills jonofor-/återfyllningslösningsgränsen är platt.
VARNING: Denna jonofor är giftig, se MSDS för säker hantering. - I en liten bägare, fyll upp halvvägs med 100 mM NaCl och placera lite modelleringslera på insidan högst upp i bägaren. När Na+ jonofor har tagits upp placerar du elektrodspetsen nedåt på bägarens vägg och låter spetsen sitta inom 100 mM NaCl och håll ISME i bägaren tills den är klar att användas.
- För att göra ISME-referenselektroden, fyll i en elektrod med 500 mM KCl så att lösningen fylls på spetsen (följ samma protokoll som ovan). Förvara KCl i en bägare.
12. Kalibreringselektroder för ISME
OBS: Detta steg utförs precis innan du tar mätningar av den utsöndrade vätskan (~ 10-15 min innan). Kalibreringar bör göras var 5–6 för att säkerställa att lutningen är jämn.
- Täck elektrodspetsarna med en lösning på ~3,5% (w/v) polyvinylklorid upplöst i tetrahydrofuran, för att undvika förskjutning av jonoforen när den sänks i paraffinolja.
VARNING: Detta är brandfarligt, se MSDS för säker hantering. - För att kalibrera Na+- elektroden placerar du 10 μL droppar av följande NaCl-standardkoncentrationer på kanten av Ramsay-skålen med de inkuberade MT: 200 mM NaCl och 20 mM + 180 mM LiCl. Placera standarddropparna ~ 2 cm ifrån varandra, med den högre koncentrationen på toppen.
- För in både referenselektrod och jonselektiv elektrod över de klorerade silvertrådarna och fäst dem säkert med hjälp av elektrodhållare som är fästa vid mikromanipulatorer. Navigera båda elektroderna mot 200 mM NaCl-droppen med hjälp av mikromanipulatorerna, så att elektrodspetsarna inte vidrör botten av skålen. Slå på elektrometern för att börja spela in och låt avläsningen stabiliseras.
- Spela in avläsningen och fortsätt till nästa standard (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Beräkna lutningen, och om elektrodavläsningen är stabil och lutningen är inom räckhåll, fortsätt att använda elektroden för de utsöndrade droppmätningarna. Om avläsningen är instabil, inte ger en korrekt inspelning eller lutning, eller tar ett tag att balansera, förbered antingen en ny jonselektiv elektrod eller bryt själva spetsen på referenselektroden genom att köra en vävnad över spetsen. Lutningen för Na+ ska vara ~58–60 mV38, även om ett acceptabelt intervall är 50–60 mV.
13. ISME-inspelningar och beräkningar
- Efter mätningar av vätskeutsöndringshastigheten (se steg 7.7) flyttar du försiktigt både referens- och jonselektiv elektrod till den utsöndrade droppen med hjälp av mikromanipulatorerna. Slå på inspelningen och låt avläsningen stabiliseras och registrera värdet. Upprepa det här steget för de andra dropparna (upprepa kalibreringsmätningar var ~5–6 mätningar).
- Katjonkoncentrationer beräknas med hjälp av den ekvation som tidigare beskrivits22,38, [jon] = [C] x 10ΔV/m, där [C] är koncentrationen i mmol L-1 av kalibreringslösningen som används för att kalibrera ISME, ΔV är spänningsförändringen mellan spänningen som registreras från den utsöndrade vätskedroppe och spänningen för samma kalibreringslösning. och m är spänningsskillnaden mellan de två standardkalibreringarna, som också är lutningen.
14. SIET-installation
OBS: SIET-systemet har beskrivits tidigare27,39. För att minska bakgrundsljudet installeras en Faraday-bur runt ljusmikroskopet och huvudstängret. Experiment som presenteras i detta dokument använder följande inställningar på ASET-programvaran (Automated Scanning Electrode Technique) 2.0: en 4 sekunders väntetid för att tillåta jongradienter att helt återupprättas efter mikroelektrodrörelser, med spänning som registreras i 0,5 s efter väntetiden, ett utflyktsavstånd på 100 μm och tre repetitioner för varje inspelning. Vissa inställningar kan ändras av användaren i ASET efter behov.
- Slå på IPA-2 Ion/Polarographic Amplifier, ljusmikroskopet (med en ansluten videokamera) och datorn/datorerna som är anslutna till var och en av dessa aset- och cellSens.
- Förbered mikroelektroder och referenselektroder som beskrivs i steg 9.1–9.3, 9.5, 10 och 11.1–11.3. Jonselektiv mikroelektrod kommer alltid att innehålla Na+ jonofor med 100 mM NaCl-återfyllning och referenselektroden (med agarbryggorna) kommer alltid att fyllas med 3 M KCl.
- Placera Na+-selektiv mikroelektrod på hållaren bestående av en silverkloridtråd (AgCl) och fäst den i honkontaktuttag. Fyll referenselektrodhållaren med färska 3 M KCl (kan göras före experimentdagen och förvaras på RT) med hjälp av en spruta.
OBS: Tvätta efter experiment ut referenselektrodhållaren med ddH2O. - Ta bort en referenselektrod från bägaren som innehåller alla referenselektroder nedsänkta i 3 M KCl, placera ett finger i ena änden och luta glaskapillären mot detta finger för att förhindra att agaren faller ut. Placera försiktigt ena änden i hållaren och se till att inga bubblor bildas. Om det finns en bubbla, ta bort referenselektroden, fyll igen hållaren med mer än 3 M KCl och upprepa. Placera elektrodhållaren i honkontaktuttaget.
15. Kalibreringselektroder för SIET
- För Na+-mätningar, använd en 150 mM NaCl och 15 mM NaCl + 135 mM LiCl-lösningar24. Det bör finnas en 10-faldig skillnad i Na+ koncentrationer mellan de två lösningarna, som omfattar intervallet av Na+ (20 mM) nivåer i saltlösning (tabell 2).
- Förvara kalibreringslösningar på RT i ett 50 ml centrifugrör och alikvot i en Petri-skål när experimentet genomförs. Denna alikvot kasseras i slutet av dagen. Om det finns några tecken på kontaminering i lagerlösningarna, kassera och gör nya lösningar.
- För att kalibrera, aliquot de två kalibreringslösningarna (steg 15.1) i enskilda 35 mm Petri-rätter och placera dessa på mikroskopstadiet. Se till att mikroelektrodspetsen placeras inuti kalibreringslösningen med hjälp av de manuella justeringsknapparna som styr stegmotorerna med "inaktivera" valda på datorns rörelsestyrenhet. Sänk inte ned spetsen för långt, eftersom den kan gå sönder. Om spetsen går sönder bereder du en ny jonselektiv mikroelektrod och kalibrerar om.
- Öppna ASET-programvaran på datorn som är ansluten till förstärkaren. Öppna kalibreringsinställningarna. Välj Nernst Slope för kalibreringstypen, ställ in provet på 3 sekunder och ange koncentrationerna av kalibreringslösningarna. För Na+ -mätningar anger du till exempel 150 mM i lösning 1, placera Na+-selektiv mikroelektrodspetsen och referenselektroden inuti denna kalibreringslösning. Spänningsavläsningen på förstärkaren ska vara stabil. Klicka på lösning 1, vänta på att spänning (i mV) registreras. Placera sedan mikroelektrod- och referenselektroden inuti 15 mM NaCl + 135 mM LiCl-lösningen, ange 15 mM i lösning 2 och klicka på lösning 2 för att få spänningsavläsningen. Lutningen kommer att vara skillnaden mellan dessa två spänningar, beräknade i dessa inställningar. Klicka på OK efter kalibrering.
- Sluttningar för Na+-selektiva mikroelektroder för en tiofaldig förändring av jonkoncentrationen bör vara cirka 59,0 ± 1,624. Om Nernst-lutningen avviker kraftigt från detta intervall, förbered en ny mikroelektrod eller alikvot nya standarder (eftersom de kan vara förorenade). Kalibrering krävs före varje 2–3-prov, beroende på spänningsstabilitet. Om spänningen blir instabil och börjar fluktuera, förbered en ny jonselektiv mikroelektrod.
16. SIET-mätningar
OBS: Motorbrytaren på Computer Motion Control-enheten ska alltid bytas till Inaktivera utom när du manipulerar elektroden med hjälp av datornycklar via ASET eller under mätinspelningar (då ska nyckeln bytas till Aktivera).
- Efter kalibrering dissekerar du organet (se steg 6.6). Placera poly-L-lysinformen med det dissekerade provet på mikroskopstadiet och sätt in spetsen på referenselektroden inuti saltlinjen. Sänk ner jonens spets selektiv mikroelektrod i saltlinjen och var försiktig så att spetsen inte bryts.
- Använd de manuella justeringsknapparna för att justera mikroelektrodpositionen medan du tittar under ljusmikroskopet. Justera mikroelektrodens vertikala position så att dess spets är på samma plan som organet eller vävnaden. Vrid motoromkopplaren till Aktivera när du befinner dig i önskat läge. Vid denna tidpunkt kan stegmotorerna endast drivas med hjälp av datorprogramvaran.
- Använd datorpiltangenterna och flytta mikroelektroden horisontellt till en position 3 mm från vävnaden för att mäta bakgrundsinspelningar. Infoga anteckningar genom att trycka på F2. När du är klar börjar du spela in (genom att trycka på F5). Få fem mätningar av bakgrundsaktivitet. Den genomsnittliga bakgrundsspänningsaktiviteten för varje prov kommer att subtraheras från spänningsgradienterna som mäts längs vävnaden för samma prov.
- Flytta mikroelektrodspetsen tillbaka nära vävnaden, var försiktig så att du inte genomborrar organet. Minska keyhitkänsligheten för att placera mikroelektrodspetsen 2 μm direkt till höger, vinkelrätt mot vävnaden. Få tre inspelningar på varje plats längs rektalplattan för att identifiera platsen för den största jonaktiviteten. Få baslinjemätningar för koksaltlösning på den plats som visar den största aktiviteten (hotspot-platsen).
- Byt motorn till Inaktivera och tillsätt lämplig behandling i skålen för att få den slutliga önskade dosen. Efter applicering, skapa en ny anteckning (dvs. behandlingsnamn och dos), byt motor tillbaka till Aktivera och ta spänningsinspelningar med F5. Om målet är att observera förändringar över tid, fortsätt att göra mätningar med specifika tidsintervall. Flera protokoll kan skapas för specifika applikationer med hjälp av SIET, beroende på forskarens syfte.
- Titta på ASET-programvaran spela in spänningen på platsen längs vävnaden och subtrahera detta från spänningen på ett utflyktsavstånd (bild 7) på 100 μm från vävnaden. Eftersom den första registreringen görs vid vävnaden indikerar en positiv spänningsskillnad att spänningen är högre vid epitel (vävnad) (figur 7A) än bort från epitel (figur 7B), och därmed absorberas katjonen. En negativ spänningsgradient tyder på katjonsekreation.
- Få bakgrundsregistreringar igen efter behandlingen (3 mm bort) och använd dessa vid beräkning av jonflöde efter behandlingen. Gör en uppsättning bakgrundsinspelningar i "baslinje" och en uppsättning efter behandlingen. Byt motor till Inaktivera när mikroelektroden inte justeras med datornycklarna eller när spänningen inte registreras. Exportera data till en textfil och öppna med Excel för att utföra alla beräkningar.
- Beräkna jonflöde med ekvationer som beskrivits tidigare24,26. Nettojonflödet för varje behandling kan uttryckas som en absolut förändring från mätningar av jonflödet vid baslinjen. För att kontrollera resultatens betydelse kan en fordonskontroll (dvs. lägga till saltlösning ensam i skålen istället för en behandling). Förändringar i jontransport efter den hormonella behandlingen bör bedömas i förhållande till eventuella förändringar i svaret på denna kontroll.
17. Hindgut kontraktionsanalyser
- Fyll en av brunnarna i skålen som beskrivs i steg 4.1 med en känd volym Aedes saltlösning (steg 5.1). Efter dissekering (steg 6.7), överför försiktigt den dissekerade bakguten fäst vid mittpistolen till brunnen i den andra skålen och se till att inte nypa det organ som undersöks (ileum). Doppa tarmen i saltlinjen inuti brunnen och placera Minutien stift i midgut och ändtarmen. Genom att göra det bör ileum inte vara under spänning, och spontana sammandragningar, som har sitt ursprung vid pyloric ventilen vid främre ileum, bör observeras.
- Anslut en videokamera till ett stereoskopiskt mikroskop och spela in videor med hjälp av en videoinspelningsprogramvara (t.ex. Lumineras INFINITY CAPTURE). Placera skålen som innehåller det dissekerade organet under mikroskopet och spela in i 2 min. Detta kommer att vara villkoret "Baslinje".
- Lägg till en känd volym av 1X Aedes saltlösning (steg 5.1) till brunnen för att ta hänsyn till eventuella förändringar i ileal motilitet vid ökande volym i brunnen. Vänta i 1 min efter ansökan och spela sedan in igen i 2 min. Detta är "saltlösning" villkoret.
- Tillsätt en känd behandlingsvolym (från en 10x lagerkoncentration för att få önskad dos i brunnen). Vänta i 1 min efter ansökan och spela sedan in igen i 2 min. Detta kommer att vara "behandling" villkoret.
- Spara alla videor och konvertera dem till MP4. För att analysera, räkna antalet sammandragningar i 2 minuters intervall (definieras som en peristaltisk våg som initierar vid pyloricventilen och sträcker sig genom hela ileum). Dividera detta tal med 2 min för att få sammandragningshastigheten. Andra parametrar kan också bedömas, såsom sammandragning eller avslappningstid. Efter insamling av rådata uttrycker du varje parameter i förhållande till data för "baslinje"-villkor för varje prov. Rita vikförändringen för "saltlösning" och "behandling" alla i förhållande till "baslinjen".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillämpning av DH31 mot ostimulerade MTs resulterar i en betydande ökning av vätskesekrendehastigheten, vilket bekräftar dess roll som ett diuretiskt hormon i Aedes myggor (figur 1A). När tubuler behandlas med AedaeCAPA-1 observeras en minskning av utsöndringshastigheten i DH31-stimulerade MTs. Figur 1B visar användningen av jonselektiva elektroder för att mäta Na+ koncentrationer i de utsöndrade dropparna. Behandling av DH31 på MTs hade ingen effekt på Na + koncentrationen i den utsöndrade droppen; Med tillämpning av AedaeCAPA-1 ökades dock Na+ koncentrationen i den utsöndrade vätskan avsevärt. Jämfört med ostimulerade kontroller ledde DH31 dessutom till en betydligt högre transporthastighet på Na+ , medan AedaeCAPA-1 avskaffade denna ökning av DH31-stimulerade tubule (figur 1C). Tillsammans visar dessa provresultat hur vätskesekretionshastigheter efter applicering av diuretiska och anti-diuretiska hormoner kan mätas samt jonkoncentrationen i de utsöndrade dropparna. Tre till sex dagar gamla kvinnor dissekerades och mellan 23-35 MTs analyserades för experimentet. Skillnader betecknades som statistiskt signifikanta om p < 0,05 med hjälp av en enkelriktad ANOVA och oparade t-tester.
SIET användes för att bedöma förändringar i Na+ transport längs rektal pad epithelia av vuxna kvinnliga myggor. De flesta ostimulerade recta undersökta uppvisade haemolymph-riktade Na + transport (absorption), och så endast dessa preparat undersöktes. På grund av variabilitet i baslinjeaktiviteten beräknades skillnaden i jonflöde, efter antingen saltlösning eller peptidapplikation, i förhållande till den initiala transportaktiviteten i saltlösning. Dessa värden ger en negativ förändring i jonflödet (jonflöde efter behandling – jonflöde i utgångsläget), även om alla organ förblev absorptiva efter behandlingar. En leucokinin analog (Drosokinin) användes för att undersöka förändringar i Na+ absorption, vilket resulterade i en fyrfaldig minskning av Na + absorption jämfört med saltlösning kontroll (figur 2).
För att bedöma rollen av en neuropeptid, pyrokinin-2 (PK2), på ileal motilitet, användes en Rhodnius prolixus analog, som tidigare visade sig aktivera A. aegypti PK2 receptorn, berikad i myggan ileum28. I förhållande till baslinjenivåerna hämmar PK2 signifikant ileala sammandragningar (figur 3).
Figur 1: Effekt av diuretiska och anti-diuretiska neuropeptider på in vitro-vätskesekretionshastighet, Na+ koncentration och transporthastighet av vuxna kvinnliga A. aegypti MTs. Aedae CAPA-1 (0,1 fM) tillämpades på MTs stimuleras med DromeDH31 (25 nM). (A) MT inkuberades i 60 min med neuropeptider och 120 min för ostimulerade kontroller. (B) Na+-koncentrationerna i den utsöndrade droppen mättes med hjälp av ISME och värden användes för att beräkna transporthastigheten (C). Kolumner som skiljer sig avsevärt från kontrollerna betecknas med samma bokstav, som bestäms av ett enkelriktat ANOVA- och Bonferroni-eftertest (n = 23–35). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Förändringar i Na+ transport över kvinnliga rektal pad epithelia mätt med hjälp av SIET. Na+ absorption registrerades i ostimulerade saltlösningsförhållanden vid baslinjen, följt av behandling med antingen ytterligare saltlösning (fordonskontroll) eller 1 μM Drosokinin (n = 10–12). Förändringar i hemolymf-riktat Na+ flöde mättes för varje behandling. det fanns en fyrfaldig minskning av Na + absorption som svar på Drosokinin, som bestäms av en unpaired två-tailed t-test. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Förändring i ileal motilitet hos kvinnliga myggor efter saltlösning (fordonskontroll) och RhoprPK2-applikation. Förändringen i kontraktionsfrekvensen efter båda behandlingarna registrerades för varje prov i förhållande till utgångsförhållandena (n = 32). Rhopr PK2 minskade ileal motilitet, som bestäms av en parad två-tailed t-test. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Schematisk ramsayanalys, användning av jonselektiva mikroelektroder (ISME), skanningsjonselektiv elektrodteknik (SIET) och hindgutkontraktionsanalyser. Illustrationer av de fyra metoder som används för att bestämma de funktionella rollerna för endokrina faktorer på myggans utsöndringssystem, Aedes aegypti. (A) Ramsay-analysen används för att mäta vätskeutsöndringshastigheter i isolerade malpighiska tubules. Tubuleens proximala (öppna) ände är lindad runt en stift, omgiven av mineralolja, medan den distala (slutna) änden badar i behandlingssaltlinjen. Efter en viss tidsperiod utsöndrar den proximala änden den primära urinen och ackumuleras som droppar på stiftet. B) En referenselektrod och ISME placeras i den utsöndrade droppen, som är ansluten till ett dataförvärvssystem, för att mäta jonkoncentrationen. C) SIET mäter jontransport med hjälp av en jonselektiv mikroelektrod som placeras ~2 μm från det organ som fästs vid botten av en poly-L-lysinrätt. Riktningen för de röda pilarna i detta schematiska indikerar att Na+ absorberas i saltlinjen, indikerad av en större spänningsregistrering längs epitelet i förhållande till regionen bort från orgelytan. (D) Hindgut kontraktionsanalyser utförs med hjälp av videoinspelningar för att bedöma förändringar i sammandragningsfrekvens, längd och avslappningstid. I denna schematiska placeras organen inuti en brunn, och en metallstift sätts in direkt i midgut och ändtarmen för att ileumet fritt ska flyta och dra ihop sig. Behandlingar läggs till i brunnen för att bedöma förändringar i motilitet både kvalitativt och kvantitativt. Skapad med BioRender. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Rätter som används för (A) dissekerande myggor, (B) Ramsay-analys, (C) SIET- och D) sammandragningsanalysmätningar. A, B och D är helt belagda med silikon, medan C är belagt med poly-L-lysin i mitten. För att förbereda skålen som används för Ramsay-analysen (B) används en liten silikonbelagd Petri-skål och små ~ 4-5 mm brunnar är snidade 1 cm ifrån varandra (cirka ~ 20 brunnar kan snidas / skål). Minutien metallstift placeras bredvid varje brunn för att hålla fast vid den isolerade tubule för att mäta vätskeutsöndringshastigheten. Poly-L-lysin skålen (C) gör det möjligt för organet att hålla fast vid botten under SIET mätningar. Brunnarna i sammandragningsskålen (D) är fyllda med saltlösning och eventuella följande behandlingar. Det fördragande organet som placeras inuti brunnen observeras med hjälp av en videokamera. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Myggans utsöndringssystem, Aedes aegypti. Efter ett blodmjöl passerar lösing, vatten och näringsämnen längs matsmältningskanalen, som inkluderar (men är inte begränsad till) midgut, pylorisk ventil, MTs och hindgut. Midgut är huvudplatsen för matsmältning av mat och näringsupptag. De fem MTs transporterar vatten, löstor och avfall från den omgivande hemolymfen och utsöndrar denna primära urin i bakguten, bestående av ett främre ileum och bakre ändtarm, varav den senare innehåller fyra (manliga) eller sex (kvinnliga) rektalkuddar. Bakgutten fungerar som den slutliga reabsorptionsplatsen innan avfallet utsöndras. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 7: Stillbilder av en dissekerad mygghågevär under SIET-mätningar. För att mäta jonaktivitet längs epitelen hos en av de sex rektalkuddarna placeras Na+-selektiv mikroelektrod 2 μm från vävnaden (A). Spänningen registreras på denna plats innan mikroelektrodspetsen flyttas på ett utflyktsavstånd (Δx) på 100 μm från denna punkt (B). Spänningsgradienten mellan dessa två punkter används för att beräkna koncentrationsgradienten och jonflödet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Återfyllningssprutorna för ISME och SIET. En bild av sprutorna som används för att fylla i NaCl- och KCl-lösningarna i mikroelektroderna. Detta visar fyra 1 mL glidspetssprutor med engångsnålar, med en modifierad sträckt spets för att möjliggöra infogning i en elektrod. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| 2X Aedes aegypti saltlösning | ||
| För 500 ml: | ||
| I en bägare lägger du till 400 ml ddH2O och lägger sedan till följande lösningar: | ||
| Komponent | Vikt g) | Slutlig koncentration (mM) |
| NaCl | 8.766 | 150 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| KCl | 0.253 | 3.4 |
| NaOH | 0.3 | 7.5 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| CaCl2-2H20 | 0.249 | 1.7 |
| Rör om och justera pH-värdet till 7,1 | ||
| Tillsätt ddH2O till den slutliga volymen på 500 ml för att göra 2x Aedes saltlösning | ||
| 10X glukos | ||
| För 500 ml: | ||
| I en bägare lägger du till 450 ml ddH2O och lägger sedan till: | ||
| Komponent | Vikt g) | Slutlig koncentration (mM) |
| Glukos | 4.5 | 5 |
| Rör om och tillsätt ddH2O till den slutliga volymen på 500 ml | ||
| Så här gör du 1X Aedes aegypti saltlösning: | ||
| För 100 ml: | ||
| I en bägare lägger du till 40 ml ddH2O och lägger sedan till: | ||
| Komponent | Volym (mL) | |
| 2x Aedes saltlösning | 10 | |
| Rör om, justera pH till 7,1 | ||
| Filtersterilisering | ||
Tabell 1: Att göra Aedes aegypti saltlösning. För att göra Aedes saltlösning, förbered separat 2X Aedes saltlösning och 10x glukos, förvara i 4 °C kylskåp. Använd dessa två lösningar för att förbereda arbetslager (1x Aedes saltlösning), som används för dissekering av vävnader, Ramsay-analyser och kontraktionsanalyser.
| Kalciumfri Aedes aegypti Saltlösning + NMDG | ||
| För 500 ml: | ||
| I en bägare lägger du till 400 ml ddH2O och lägger sedan till följande lösningar: | ||
| Komponent | Vikt g) | Slutlig koncentration (mM) |
| NaCl | 1.17 | 20 |
| NMDG | 25.38 | 130 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| KCl | 0.253 | 3.4 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| Glukos | 0.9 | 5 |
| Rör om och justera pH-värdet till 7,1 | ||
| Lägg till ddH2O till slutlig volym på 500 ml | ||
Tabell 2: Modifierad Aedes aegypti saltlösning som används för SIET-mätningar. Denna Ca2+-fria saltlösning används för att förhindra spontana hindgut sammandragningar under SIET mätningar. Denna saltlösning är specifik för mätning av Na+ transport, eftersom den består av reducerad Na+ (20 mM) som består av equimolar substitution med N-metyl-D-glucamine (NMDG) för att minska bakgrundsljud.
| DH31-stimulerade MTs | Droppdiameter (enheter) | Droppdiameter (um) | Droppvolym (um3) | Utsöndringsgrad (nl/min) |
| n | Behandling #1 (60 min) | Behandling #1 (60 min) | Behandling #1 (60 min) | Behandling #1 (60 min) |
| 1 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 2 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 3 | 17 | 333.33 | 19392547.25 | 0.32 |
| 4 | 13 | 254.90 | 8671977.67 | 0.14 |
| 5 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 6 | 22 | 431.37 | 42029685.15 | 0.70 |
| 7 | 15 | 294.12 | 13321768.16 | 0.22 |
| 8 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 9 | 20 | 392.16 | 31577524.53 | 0.53 |
| Betyda | 16.33333333 | 320.26 | 18776785.52 | 0.31 |
| STD ERR | 0.06 |
Tabell 3: Exempel på Ramsay-analysdata. Tabell som visar provdata som samlats in från DH31-stimulerade MTs från vuxna kvinnliga myggor. Vid mätning av diametern på den utsöndrade droppen, mät först med stereomikroscope okulär mikrometer och notera ner värdet. Multiplicera sedan okulärenhetsdiametern med kalibreringsomvandlingen som utfördes före experimentet för att få droppens diameter i μm. Beräkna volymen av ekvationen härnäst, med hjälp av ekvationen som anges i steg 7.7, följt av utsöndringshastigheten, med hjälp av ekvationen som anges i steg 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid intag av en blodmåltid står hematofaginsekter inför utmaningen med överskott av lösgöring och vatten i deras hemolymf2. För att klara av detta har de ett specialiserat utsöndringssystem, som är tätt kontrollerat av hormonella faktorer, vilket gör det möjligt för insekterna att snabbt initiera post-prandial diuresis. Ramsay-analysen och användningen av jonselektiva mikroelektroder möjliggör mätning av vätskeutsöndringshastigheter tillsammans med jonkoncentrationer och transporthastigheter i isolerade insekts-MTs. Kritiska steg inom dessa metoder inkluderar att säkerställa korrekt dissekering av insekten MTs. Individuellt avlägsnande av varje tubule från insekten måste göras noggrant, eftersom eventuella skador på tubule kommer att orsaka att vätskan utsöndras från revan eller leder till ett icke-funktionellt preparat. Aedes MT utsöndrar inte lätt i ostimulerade kontroller, så hormoner och läkemedel kan appliceras för att stimulera utsöndring. Men även med diuretisk tillämpning eller noggranna dissektioner kan vissa MTs misslyckas med att utsöndra om de skadas (även om de inte alls är uppenbara med visuell inspektion), vilket innebär att flera rundor av analysen kan behöva utföras. För korrekt användning av jonselektiva elektroder under både ISME- och SIET-mätningar, se till att standardslutningen ligger inom det normala intervall som rapporterats för jonoforen, vilket ger de mest exakta avläsningarna. Men om avläsningarna är instabila, undersök elektroden under mikroskopet för att bekräfta att jonoforen har tagits upp och inte läcker. En ny elektrod bör beredas om det finns luftbubblor, spetsen är bruten eller jonoforen inte har tagits upp ordentligt. Om jonofor-/återfyllningsgränsen är konvex är elektroderna undersidaniserade och mer diklododimetylsilane ska användas. Om gränsen är konkav är elektroderna överslamade och mindre diklododimetylsilane ska användas. Dessutom kan vissa elektroder vara mindre stabila än andra, såsom den Na+-selektiva elektroden, varigenom lutningen försämras snabbare jämfört med K+ eller H+.
Dessa metoder ger obegränsade möjligheter att studera mekanismerna bakom vätskeutsöndring av MTs. På grund av de senaste framstegen inom genomisk redigering kan omvända genetiska strategier som CRISPR-Cas9 genredigering och RNA-interferens användas för att undersöka den regulatoriska och/ eller funktionella rollen för specifika gener uttryckta i utsöndringsorgan. Studier har använt sådana verktyg för att förstå hormonregleringen i Aedes40 och Drosophila41 MTs. Dessutom kan baddroppen modifieras för att titta på de specifika rollerna för hormoner14,15,18,21,42, andra budbärarsystem och läkemedel på utsöndringshastighet och jonkoncentrationer. Dessa metoder har tillämpats i olika andra insekter såsom Rhodnius prolixus38, larval och vuxna myggarter, Drosophila41, och kan flyga arter (Hexagenia rigida)43. På samma sätt kan olika joner undersökas, såsom Cl-, K+, H+ och NH4+.
Under SIET-mätningar kan det finnas variationer mellan varje prov under utgångsförhållandena. Skillnader kan fortfarande uppstå vid kontroll av myggans ålder, kön och utfodringstillstånd, särskilt när man undersöker olika delar av tarmen (dvs. vissa avstånd främre eller bakre från korsningen ileum-ändtarmen). Dessa skillnader kan förklaras genom att uttrycka jonflöde efter behandling som en förändring i förhållande till utgångsläget. Med tiden kan jonaktiviteten också fluktuera och därför är det viktigt att bedöma förändringar i jämförelse med en fordonskontroll (saltlösning), vilket framgår av de resultat som presenteras här. Om spänningsavläsningarna börjar fluktuera drastiskt, förbered en ny jonselektiv mikroelektrod och kalibrera om. Att använda en tredje kalibreringslösning (utspädd 10 gånger från den lägsta kalibreringslösningskoncentrationen) kan ytterligare bidra till att etablera en mer exakt Nernst-lutning. Eftersom Na+- aktivitet vanligtvis är mycket känslig för bakgrundsljud används en modifierad Aedes-saltlösning bestående av mindre Na+ (tabell 2). Det är också viktigt att hålla avstånd till Faraday-buren under mätningar för att undvika störningar och minska eventuell bakgrund. Dessutom, om organet fortfarande producerar spontana sammandragningar när det klibbas vid poly-L-lysin i botten av skålen, kommer tillsats av en kalciumchelator till saltlösning ytterligare att bidra till att förhindra detta. Om undersöka jontransport längs rektal pad epithelia, som visas i resultaten som presenteras här, är det viktigt att identifiera "hotspot" webbplats uppvisar största jonaktivitet genom att flytta mikroelektrodspetsen i små steg längs hemolymf-lagda sidan av rektalplattan. Om det inte går att upptäcka några stora förändringar i jonaktiviteten kan organet ha skadats eller mikroelektrodspetsen är inte i samma tredimensionella plan som rektalkuddeöppningen, och därför bör en annan mygga dissekeras.
SIET kan användas för olika experiment, såsom att undersöka jonaktivitet hos myggor uppfödda under olika förhållanden25 eller matas olika dieter (dvs. sackaros-matas kontra blodmatad kontra unfed), vilket kan vara användbart för att identifiera jontransportmekanismer som är kritiska efter ett blodmjöl. Det är därför viktigt att se till att mätningar erhålls från samma plats mellan proverna. Till exempel kan mätningar göras från korsningen ileum-ändtarmen eller på specifika avstånd som ligger främre från denna plats (längs ileum) eller bakre (längs rektalepitelet). Dessa mätningar kan också erhållas längs rektal pad epitel som kräver olika positionering av organet i skålen. Dessutom är det viktigt att notera att SIET inte är begränsat till att mäta jonaktivitet enbart längs bakguten. andra organ, inklusive midgut och MTs kan också undersökas. På samma sätt kan K+, H+, NH4+ och Cl- fluss med hjälp av SIET25,44,45 och mätningar kan göras med inställda tidsintervall efter en behandling44. Denna teknik har använts på både larv och vuxna myggor26,44, liksom olika andra insekter, inklusive Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 och Hexagenia rigida43. Dessa experiment kan användas tillsammans med Ramsay-analysen och ISME för att få en bättre förståelse för olika behandlingars och miljöfaktorers roll för vätskeutsöndring, jonkoncentration och jontransport.
Slutligen är sammandragningsanalyser användbara för att identifiera neuroendokrina faktorer som påverkar tarmmotilitet. Det är viktigt att det organ som studeras inte skadas eftersom denna analys bygger på rörelser som genereras av muskulatur. Därför bör tång endast användas för att ta tag i omgivande strukturer när organen överförs till analysrätten. Att greppa dessa intilliggande organ med en stift inuti brunnen hindrar dem också från att röra sig och påverka rörelsen hos det isolerade organet som undersöks. Om inga spontana sammandragningar observeras kan vävnaden ha skadats och en ny dissekering krävs. Andra metoder som ofta används för att undersöka insektsälskontraktil aktivitet inkluderar användning av en kraftgivare32 eller impedans monitor33. Dessa metoder kan också användas för att mäta sammandragningshastighet i mygga hindgut; Men om målet är att visuellt undersöka dessa förändringar genom videoinspelningar, kommer de metoder som beskrivs i detta protokoll att vara fördelaktiga och kan användas för ytterligare analys48.
De fyra teknikerna som beskrivs i detta protokoll har bidragit till att härleda rollen av ett antal neuropeptider i utsöndringssystemet för olika insekter. Att använda dessa metoder i kombination med ytterligare tekniker som används av insektsfysiologer, såsom kvantitativ PCR och immunohistokemi, kan ge en mer omfattande förståelse för underliggande vägar och signalsystem, som kan fungera som nya potentiella mål för vektorkontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants till AD och J-PP. AL och FS fick NSERC CGS-M-utmärkelser till stöd för sin forskarutbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955456 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning Falcon (Fisher Scientific) | C351008 | |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | used for ISME reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm) |
World Precision Instruments | 1B200F-4 | used for SIET reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | TW150-4 | used for ISME and SIET electrodes |
| CO2 pad | Diamed | GEN59-114 | |
| Dimethyltrimethylsilylamine solution | Sigma-Aldrich | 41716 | |
| Faraday cage | Custom | Can be fabricated by local machine shop | |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-748A | |
| Hydrated mineral oil | Fisher Scientific | 8042-47-5 | Specific brand is not important |
| INFINITY1-2CB video camera | Luminera | INFINITY1-2CB | |
| Micromanipulators (left and right handed) | World Precision Instruments | MMJL and MMJR | Specific brand is not important so long as high quality manipulator |
| Mineral Oil, Light | Fisher Scientific | 0121-4 | |
| Minutien pins (0.1 mm stainless steel) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Non-hardening modeling clay | Sargent Art | Specific brand is not important | |
| Olympus light microscope (FOR SIET) | Olympus | customized system | |
| Plastic Pasteur (transfer) pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) | Sigma-Aldrich | A-005-M | 84 kDa |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81395 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10053-09 | |
| Schneider's Drosophila medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| SIET system | Applicable Electronics | customized system | Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGW1010 | |
| Sodium ionophore II cocktail A | Fluka | 99357 | |
| Standard polystyrene Petri (culture) dishes | Fisherbrand | FB012921 | Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | |
| Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller | Sutter Instruments | FGPN7 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Chemical Company | NC9285739 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| VWR advanced hotplate stirrer - aluminum | VWR | 9578 | Specific brand is not important |
References
- Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Experimental Biology. 206, 3845-3856 (2003).
- Bradley, T. J. Physiology of osmoregulation in mosquitoes. Annual Review of Entomology. 32, 439-462 (1987).
- Patrick, M. L., Aimanova, K., Sanders, H. R., Gill, S. S. P-type Na+/K+-ATPase and V-type H+-ATPase expression patterns in the osmoregulatory organs of larval and adult mosquito Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 209, 4638-4651 (2006).
- Coast, G. The endocrine control of salt balance in insects. General and Comparative Endocrinology. 152, 332-338 (2007).
- Maddrell, S. H. P., Overton, J. A. Methods for the study of fluid and solute transport and their control in insect Malpighian tubules. Methods in Enzymology. , 617-632 (1990).
- Beyenbach, K. W., Oviedo, A., Aneshansley, D. J. Malpighian tubules of Aedes aegypti: Five tubules, one function. Journal of Insect Physiology. 39, 639-648 (1993).
- Misyura, L., Yerushalmi, G. Y., Donini, A. A mosquito entomoglyceroporin, Aedes aegypti AQP5, participates in water transport across the Malpighian tubules of larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 3536-3544 (2017).
- Drake, L. L., Rodriguez, S. D., Hansen, I. A. Functional characterization of aquaporins and aquaglyceroporins of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 5, 7795 (2015).
- Ramsay, J. A. Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus (Orthoptera, Phasmidae). Journal of Experimental Biology. 31, 104-113 (1954).
- Jing, X., White, T. A., Yang, X., Douglas, A. E. The molecular correlates of organ loss: the case of insect Malpighian tubules. Biology Letters. 11, 20150154 (2015).
- Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. T. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
- O'Connor, K. R., Beyenbach, K. W. Chloride channels in apical membrane patches of stellate cells of Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 204, 367-378 (2001).
- Ionescu, A., Donini, A. AedesCAPA-PVK-1 displays diuretic and dose dependent antidiuretic potential in the larval mosquito Aedes aegypti (Liverpool). Journal of Insect Physiology. 58, 1299-1306 (2012).
- Coast, G. M., Garside, C., Webster, S. G., Schegg, K. M., Schooley, D. A. Mosquito natriuretic peptide identified as a calcitonin-like diuretic hormone in Anopheles gambiae (Giles). Journal of Experimental Biology. 208, 3281-3291 (2005).
- Clark, T. M., Bradley, T. J. Additive effects of 5-HT and diuretic peptide on Aedes Malpighian tubule fluid secretion. Comparative Biochemistry and Physiology. 119, 599-605 (1998).
- Veenstra, J. A. Effects of 5-hydroxytryptamine on the Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 34, 299-304 (1988).
- Pollock, V. P., et al. Conservation of capa peptide-induced nitric oxide signalling in Diptera. Journal of Experimental Biology. 207, 4135-4145 (2004).
- Maddrell, S. H. P., Gardiner, B. O. C. The passive permeability of insect Malpighian tubules to organic solutes. Journal of Experimental Biology. 60, 641-652 (1974).
- O'Donnell, M. J. Too much of a good thing: How insects cope with excess ions or toxins in the diet. Journal of Experimental Biology. 212, 363-372 (2009).
- Sajadi, F., Curcuruto, C., Al Dhaheri, A., Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic action of a CAPA neuropeptide against a subset of diuretic hormones in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Donini, A., O'Donnell, M. J., Orchard, I. Differential actions of diuretic factors on the Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 42-48 (2008).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by Malpighian tubules of larval mosquitoes: Effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiological and Biochemical Zoology. 79, 645-655 (2006).
- Donini, A., O'Donnell, M. J. Analysis of Na+, Cl-, K+, H+ and NH4+ concentration gradients adjacent to the surface of anal papillae of the mosquito Aedes aegypti: Application of self-referencing ion-selective microelectrodes. Journal of Experimental Biology. 208, 603-610 (2005).
- Durant, A. C., Donini, A. Development of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito larvae in high ammonia sewage in septic tanks causes alterations in ammonia excretion, ammonia transporter expression, and osmoregulation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Paluzzi, J. P. V., Vanderveken, M., O'Donnell, M. J. The heterodimeric glycoprotein hormone, GPA2/GPB5, regulates ion transport across the hindgut of the adult mosquito, Aedes aegypti. PLoS One. 9, 86386 (2014).
- Nguyen, H., Donini, A. Larvae of the midge Chironomus riparius possess two distinct mechanisms for ionoregulation in response to ion-poor conditions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299, 762-773 (2010).
- Lajevardi, A., Paluzzi, J. -P. V. Receptor characterization and functional activity of pyrokinins on the hindgut in the adult mosquito, Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 11, 490 (2020).
- Cook, B. J., Holman, G. M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology. 80, 65-73 (1985).
- Robertson, L., Rodriguez, E. P., Lange, A. B. The neural and peptidergic control of gut contraction in Locusta migratoria: The effect of an FGLa/AST. Journal of Experimental Biology. 215, 3394-3402 (2012).
- Te Brugge, V. A., Schooley, D. A., Orchard, I. Amino acid sequence and biological activity of a calcitonin-like diuretic hormone (DH31) from Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 382-390 (2008).
- Lange, A. B., et al. The distribution and physiological effects of the myoinhibiting peptides in the kissing bug, Rhodnius prolixus. Frontiers in Neuroscience. 6, 98 (2012).
- Robertson, L., Chasiotis, H., Galperin, V., Donini, A. Allatostatin A-like immunoreactivity in the nervous system and gut of the larval midge Chironomus riparius: Modulation of hindgut motility, rectal K+ transport and implications for exposure to salinity. Journal of Experimental Biology. 217, 3815-3822 (2014).
- Kwon, H., Pietrantonio, P. V. Calcitonin receptor 1 (AedaeGPCRCAL1) hindgut expression and direct role in myotropic action in females of the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43, 588-593 (2013).
- Messer, A. C., Brown, M. R. Non-linear dynamics of neurochemical modulation of mosquito oviduct and hindgut contractions. Journal of Experimental Biology. 198, 2325-2336 (1995).
- Petzel, D. H., Berg, M. M., Beyenbach, K. W. Hormone-controlled cAMP-mediated fluid secretion in yellow-fever mosquito. The American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 253, 701-711 (1987).
- Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the Drosophila melanogaster Malpighian tubule. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53144 (2015).
- Paluzzi, J. -P. V., Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Natriuresis and diuretic hormone synergism in R. prolixus upper Malpighian tubules is inhibited by the anti-diuretic hormone, RhoprCAPA-α2. Journal of Insect Physiology. 58, 534-542 (2012).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J., Morris, C. E. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. Journal of Experimental Biology. 207, 2173-2184 (2004).
- Sajadi, F., et al. CAPA neuropeptides and their receptor form an anti-diuretic hormone signaling system in the human disease vector, Aedes aegypti. Scientific Reports. 10, 1755 (2020).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. American Journal of Physiology. 303, 883-894 (2012).
- Yu, M. J., Beyenbach, K. W. Effects of leucokinin-VIII on Aedes Malpighian tubule segments lacking stellate cells. Journal of Experimental Biology. 207, 519-526 (2004).
- Nowghani, F., et al. Impact of salt-contaminated freshwater on osmoregulation and tracheal gill function in nymphs of the mayfly Hexagenia rigida. Aquatic Toxicology. 211, 92-104 (2019).
- D'Silva, N. M., O'Donnell, M. J. Mechanisms of transport of H+, Na+ and K+, across the distal gastric caecum of larval Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 121, 103997 (2020).
- Kolosov, D., O'Donnell, M. J. Malpighian tubules of caterpillars: blending RNAseq and physiology to reveal regional functional diversity and novel epithelial ion transport control mechanisms. Journal of Experimental Biology. 222, (2019).
- Jonusaite, S., Kelly, S. P., Donini, A. Tissue-specific ionomotive enzyme activity and K+ reabsorption reveal the rectum as an important ionoregulatory organ in larval Chironomus riparius exposed to varying salinity. Journal of Experimental Biology. 216, 3637-3648 (2013).
- O'Donnell, M. J., Ruiz-Sanchez, E. The rectal complex and Malpighian tubules of the cabbage looper (Trichoplusia ni): regional variations in Na+ and K+ transport and cation reabsorption by secondary cells. Journal of Experimental Biology. 218, 3206-3214 (2015).
- Simo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44, 819-826 (2014).
