Summary
Este protocolo descreve metodologias por trás do ensaio ramsay, microeletrodos seletivos de íons, técnica de eletrodo seletivo de digitalização (SIET) e ensaios de contração in vitro, aplicados para estudar o sistema excretório de mosquitos adultos, composto pelos túbulos e traseiros malpighianos, para medir coletivamente as taxas de íons e secreção de fluidos, atividade contratil e transporte transepitelial.
Abstract
Estudos de fisiologia de insetos, particularmente nas espécies que são vetores de patógenos causando doenças em humanos e outros vertebrados, fornecem a base para desenvolver novas estratégias para o controle de pragas. Aqui, uma série de métodos são descritos que são rotineiramente utilizados para determinar os papéis funcionais de neuropeptídeos e outros fatores neuronais (ou seja, aminas biogênicas) no sistema excretório do mosquito, Aedes aegypti. Os túbulos malpighianos (TM), responsáveis pela formação primária da urina, podem continuar funcionando por horas quando removidos do mosquito, permitindo medidas de secreção de fluidos após tratamentos hormonais. Como tal, o ensaio ramsay é uma técnica útil para medir as taxas de secreção de MTs isolados. Microeletrodos seletivos de íons (ISME) podem ser usados sequencialmente para medir concentrações de íons (ou seja, Na+ e K+) no fluido secretado. Este ensaio permite a medição de vários MTs em um determinado momento, determinando os efeitos de vários hormônios e drogas. A Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização usa ISME para medir a tensão representativa da atividade iônica na camada não írpara adjacente à superfície dos órgãos de transporte de íons para determinar o transporte transepiteno de íons em tempo real. Este método pode ser usado para entender o papel dos hormônios e outros reguladores sobre absorção de íons ou secreção através da epitélio. Os ensaios de contração de porca também são uma ferramenta útil para caracterizar neuropeptídeos mioativos, que podem aumentar ou reduzir a capacidade deste órgão de remover o excesso de fluido e resíduos. Coletivamente, esses métodos fornecem uma visão de como o sistema excretório é regulado em mosquitos adultos. Isso é importante porque a coordenação funcional dos órgãos excretórios é crucial para superar desafios como o estresse de dessecação após o término e antes de encontrar um hospedeiro vertebrado adequado para obter uma farinha de sangue.
Introduction
A manutenção dos níveis de sal e água nos insetos permite que eles tenham sucesso em muitos nichos ecológicos e ambientais, utilizando uma variedade de estratégias de alimentação1. A maioria dos insetos desenvolveu mecanismos para regular a composição de seu hemoglifo dentro de limites estreitos, a fim de suportar os diferentes desafios associados ao seu ambiente particular2. Os insetos terrestres são frequentemente confrontados com o desafio de conservar a água e o sistema excretório sofre anti-diurese para evitar a perda de água e alguns sais essenciais, evitando, portanto, a dessecação. Em contraste, a diurese ocorre quando o inseto se alimenta e é desafiado com excesso de água e potencialmente sais3,4. Por meio de seu sistema excretório especializado e altamente ativo, os insetos desenvolveram mecanismos regulatórios que atuam para combater seus desafios osmoregulatórios. Em mosquitos Aedes aegypti adultos, o sistema excretório é composto pelos túbulos malpighianos (TM) e hindgut, este último é composto pelo íleo anterior e reto posterior5. Os MTs são responsáveis pela geração de urina primária, geralmente rica em NaCl e/ou KCl. A urina primária é então modificada através de processos secretos e reabsortivos à medida que viaja rio abaixo do túbulo e entra no hindgut5. A excreta final pode ser hiper ou hipoosmótica para o hemolítico, dependendo das condições alimentares/ambientais, e é enriquecida em resíduos tóxicos e nitrogenados2.
Os MTs são ideais para estudar muitas características do fluido epitelial e do transporte de soluto, pois realizam uma grande variedade de funções de transporte e excreção2,6. Através da regulação hormonal2, os TM funcionam segregando íons e outros solutos do sangue para o lúmen léculo7, fornecendo um gradiente osmótico permitindo que a água seja transportada por aquaporinas8,9, que cria coletivamente a urina primária, antes de viajar em direção ao traseiro reabsorguente2. Assim, coletando o fluido secretado de MTs isolados, pode-se monitorar continuamente o transporte transepitelial de fluidos e íons. A medição da taxa de secreção e a composição da urina fornecem uma visão sobre os mecanismos responsáveis pelo íon transepiteliol e transporte de fluidos. Um método popular para estudar taxas de secreção de fluidos é o ensaio ramsay, que foi introduzido pela primeira vez por Ramsay em 195310. Neste método, a extremidade distal (fechada) do túbulo é tratada com um hormônio (ou outro composto/droga de teste), enquanto a extremidade proximal (aberta) é enrolada em torno de um pino em óleo de parafina saturada de água, que secreta a urina primária, acumulando-se como uma gota na ponta do pino. Os MTs isolados são capazes de sobreviver e funcionar por longos períodos (até 24 h) em condições in vitro otimizadas, o que os torna modelos adequados e eficientes para a medição da secreção de fluidos. Os insetos têm sistemas circulatórios abertos, assim os MTs são facilmente dissecados e removidos, pois geralmente flutuam livremente no hemolymph6. Além disso, com exceção dos pulgões — que não possuem MTs11 — o número de TM em uma determinada espécie de inseto pode variar consideravelmente de quatro a centenas (cinco em mosquitos Aedes) permitindo múltiplas medições de um inseto.
Os MTs em mosquitos Aedes, em comum com outros insetos endopterygote, são compostos por dois tipos de células que formam um simples epitélio2,12; grandes células principais, que facilitam o transporte ativo de cálas (ou seja, Na+ e K+) para o lúmen, e células estelares finas, que auxiliam na secreção transepiteliol cl-secreção13. Os MTs não são inervados2, e em vez disso são regulados por vários hormônios, incluindo fatores diuréticos e anti-diuréticos, permitindo o controle do transporte de íons (principalmente Na+, K+, e Cl-) e água osmoticamente obrigatória2. Inúmeros estudos têm examinado a regulação hormonal dos Aedes MTs para entender o papel dos fatores endócrinos no transporte transepitelio14,15,16,17,18. Como mostrado nos resultados representativos, os protocolos aqui demonstram os efeitos de diferentes fatores hormonais em MTs isolados de mosquitos adultos A. aegypti, incluindo controle diurético e anti-diurético (Figura 1). O ensaio de Ramsay é usado para demonstrar como um hormônio anti-diurético, AedaeCAPA-1, inibe a secreção fluida de TM estimulado pelo hormônio diurético 31 (DH31) (Figura 1).
O tamanho menor dos insetos tem exigido o desenvolvimento de micro métodos para medir a atividade iônica e concentrações em amostras de fluidos, ou perto da superfície de tecidos isolados, como os MTs e intestino. Métodos variados foram implementados, incluindo o uso de radioisótopos de íons19, o que requer a coleta das gotas de fluido secretadas para medição de concentrações de íons20. Túbulos Aedes estimulados in vitro normalmente secretam ~0,5 nL/min21, assim o manuseio de volumes tão pequenos pode representar um desafio e potencialmente introduzir erro após a transferência. Como resultado, microeletrodos seletivos de íons (ISMEs) têm sido amplamente utilizados para medir concentrações de íons em gotículas secretas de MTs in vitro. Neste método, um eletrodo de referência e ISME, preenchidos com a solução de enchimento e ionfora apropriadas, são posicionados na gotícula de urina secretada para determinar as concentrações de íon22. Adaptado de Donini e colegas23, este protocolo atual utiliza um ionophore Na+-seletivo para medir a atividade de íons em gotículas secretas de MTs estimulados em mosquitos Aedes adultos. Uma vez que os microeletrores seletivos medem a atividade de íons, esses dados podem ser expressos como concentrações de íons, seguindo a suposição de que as soluções de calibração e amostras experimentais compartilham o mesmo coeficiente de atividade de íon21 (Figura 1B,C).
A Técnica de Eletrodo Seletivo de Digitalização (SIET) também faz uso de ISMEs para medir gradientes de concentração de íons na camada não tumercada adjacente a órgãos, tecidos ou células que estão transportando íons. Os ISMEs medem gradientes de tensão que podem ser usados para calcular os gradientes de concentração de íons e direção e magnitude do fluxo de íons através do órgão, tecido ou célula20. Nesta técnica, o ISME é montado em um manipulador de três eixos controlado por motores micro-passo computadorizados para que sua posição 3D seja controlada até o nível de micrômetro20. As tensões são medidas em dois pontos dentro da camada não-rarizado usando um protocolo de amostragem programado e controlado por software de computador. Os dois pontos são tipicamente separados por uma distância de 20-100 μm com um ponto dentro de 5-10 μm da superfície do órgão, tecido ou célula e o segundo ponto a mais 20-100 μm de distância. A diferença de magnitude das tensões entre os dois pontos é calculada para obter um gradiente de tensão24,25,26, que é então usado para calcular o gradiente de concentração e, posteriormente, o fluxo líquido utilizando a Lei de Fick24,27. Este método é útil para avaliar o transporte de íons específicos em diferentes regiões do intestino e MTs de insetos, ou em momentos específicos após uma exposição de farinha de sangue ou tratamento. Por exemplo, o SIET pode ser usado para entender como processos absortivos e secretores no sistema excretório do mosquito são regulados por hormônios28, bem como diferentes comportamentos alimentares e condições de criação25. Trabalhos anteriores utilizando o SIET revelaram locais envolvidos no transporte de íons ao longo das papilas anais e reto de mosquitos larvais e adultos24,28. O protocolo atual, descrito anteriormente por Paluzzi e seus colegas26, mede o fluxo na+ através da epitélio retal pad do reto feminino adulto (Figura 2).
O segmento final do sistema excretório do mosquito requer movimento muscular coordenado para ajudar a misturar alimentos e segregar o desperdício26. Produtos não absorvíveis de digestão a partir do midgut, juntamente com a urina primária secretada pelos TM, são passados através da válvula pilênca e entregues ao hindgut2. Contrações espontâneas de hindguta começam na válvula pilórica e ocorrem em ondas peristálticas, que são transmitidas sobre o íleo através da contração coordenada de músculos circulares e longitudinais ao redor da superfície basal das células epiteliais26. Finalmente, os músculos dentro do reto ajudam a impulsionar e eliminar o desperdício através do canal anal. Embora a motilidade do inseto hindgut seja miogênica, exigindo Ca2+ extracelular para produzir contrações espontâneas, esses processos também podem ser regulados neuronalmente26,29,30. Essa regulação exógena pelo sistema nervoso é importante após a alimentação, pois o animal deve expulsar resíduos do intestino e restaurar o equilíbrio hemólquio31. Como resultado, a realização de bioensações in vitro para identificar neuropeptídeos miostimulatórios ou mioinhibitórios é útil para avaliar como os neuroquímicos influenciam a motilidade hindgut. O protocolo atual, realizado por Lajevardi e Paluzzi28, utiliza gravações de vídeo para examinar a motilidade ileal em resposta a neuropeptídeos (Figura 3). Da mesma forma, um transdutor de força ou conversor de impedância também pode ser usado para observar traços de contrações através de um software de aquisição de dados32,33. No entanto, o uso da tecnologia de vídeo nos permite avaliar visualmente o órgão e analisar melhor usando um subconjunto de parâmetros para identificar o papel dos hormônios na motilidade hindgut.
O uso dessas técnicas pode ajudar a caracterizar fatores que regulam e coordenam o transporte de fluidos e íons ao longo do sistema excretório, juntamente com a motilidade hindgut. É importante ressaltar que é suportada uma ligação funcional entre a resposta diurética pelos TM e a motilidade hindgut, pois hormônios diuréticos, como DH31 e 5HT, caracterizados por sua capacidade de estimular a secreção de fluidos pelos TM, também foram encontrados para exibir ações miotrópicas ao longo do mosquito hindgut21,34,35 . Esses achados destacam a importância de uma coordenação rigorosa entre os TM e o hindgut durante eventos como diurese pós-prandial em insetos que requerem eliminação rápida de resíduos.
Aqui, são descritas a abordagem detalhada por trás da técnica de ensaio de Ramsay para medir a taxa de secreção de fluidos no mosquito A. aegypti e o uso de microeletrodos seletivos para determinar as concentrações na+ dentro do fluido secreto dos MTs, que quando combinado permite que as taxas de transporte de íons transepitelais sejam determinadas. Além disso, a Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização e ensaios de contração de contração de porcas são descritos para medir o fluxo de íons e a motilidade, respectivamente, o que ajuda a elucidar a regulação hormonal do hindgut (Figura 4).
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Protocol
1. Fazendo pratos forrados de silicone
NOTA: Esta etapa deve ser feita antes dos experimentos. Esses pratos serão feitos para preparar o prato de ensaio para dissecções, e para experimentos de ensaio de contração.
- Prepare o silicone usando um kit de elastômero de silicone seguindo as recomendações do fabricante. Misture os componentes líquidos de duas partes a uma razão de 10 a 1. Misture suavemente e completamente invertendo, mas certifique-se de minimizar a formação de bolhas.
- Despeje o elastômero de silicone em pratos padrão de cultura de poliestireno descartável de 60 mm a uma profundidade normalmente entre 7-9 mm. Prepare quantos pratos necessários. Remova quaisquer bolhas de ar usando um pino fino sob um microscópio logo após derramar silicone em pratos. Coloque os pratos em uma câmara ou armário sem poeira à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 48 h ou no forno a 50 °C por cerca de 4h para curar (endurecer) (Figura 5A).
2. Fazendo o prato de ensaio Ramsay
NOTA: O prato pode ser reutilizado de experimento para experimento, assim, repita esta etapa somente se o prato estiver danificado ou quebrar. Um prato separado é usado para dissecções.
- Usando um bisturi (com precauções de afiadas padrão), crie poços em uma das placas de Petri revestidas de silicone para preparar a placa de ensaio, removendo o suficiente do silicone, cerca de ~5 mm, do topo da placa (isso deve caber ~20 μL de gotícula de banho). Antes disso, use um marcador permanente para marcar as posições sob o prato para observar onde fazer os poços. Os poços devem ter ~1 cm de distância, com um diâmetro de cerca de ~4 mm para permitir que a extremidade distal do túbulo se encaixe. Cada poço conterá um túbulo segregador de fluidos, assim um prato contendo 20 poços permitirá que até 20 MTs sejam analisados por experimento.
- Para preparar os pinos Minutien, coloque os pinos de aço inoxidável de 0,1 mm em uma fileira em um pedaço de fita de rotulagem, perpendicular ao eixo da fita. Usando uma tesoura, corte ao longo do comprimento da fita, criando metades iguais dos pinos. Use meio pino para cada poço.
- Usando um par de fórceps sem cortes, insira cada meio pino no prato de ensaio revestido de silicone, ao lado de cada poço. Dependendo do comprimento do túbulo do inseto, insira o meio pino a uma distância que permitirá que a extremidade distal do túbulo mergulhe no soro fisiológico e na extremidade proximal para enrolar ao redor do pino. Esta etapa pode ser feita sob um microscópio para visualizar poços facilmente. Os pinos podem ser reutilizados, no entanto, substituir o meio pino se danificado ou perdido. (Figura 5B)
3. Fazendo o prato SIET revestido de poli-L-lysine
NOTA: Esta etapa é importante para que o órgão adere à parte inferior do prato durante as medições do SIET, garantindo que o local de medição permaneça o mesmo para cada amostra. A preparação desses pratos deve ser feita pelo menos 2 dias antes dos experimentos. Cada prato só deve ser usado uma vez ao aplicar um tratamento específico. Descarte após cada amostra ou se o revestimento de poli-L-lysine estiver riscado ou danificado.
- Para cada amostra, coloque uma placa de Petri de 35 mm em uma superfície nivelada. Remova as tampas e a pipeta 70 μL de poli-L-lysine (0,1 mg/mL) no centro de cada prato. Coloque as tampas de volta e deixe a poli-L-lysina seca (~48 h) intacta.
- Uma vez seco, marque o fundo do prato com um círculo delineando a camada seca de poli-L-lysine para melhor visualizar onde o órgão excisado deve ser colocado após dissecções. Se necessário para minimizar os volumes de soluções salinas e de tratamento em experimentos, use uma pistola de cola quente para cercar o revestimento poli-L-lysine, deixando espaço suficiente para o eletrodo se mover e fazer medições de fundo (~20-25 mm de diâmetro do círculo colado é suficiente). Estes pratos revestidos podem ser armazenados indefinidamente na RT (Figura 5C).
4. Preparando os pratos de ensaio ramsay e contração para experimentos
NOTA: O prato pode ser reutilizado (desde que a lavagem adequada para remover o soro fisiológico/tratamentos usados anteriormente), portanto, só repita esta etapa se a placa estiver danificada ou quebrar. Um prato separado é usado para dissecções. Esta etapa é realizada no dia do experimento.
- Para a placa de ensaio de contração, use um bisturi (com precauções de afiadas padrão), crie poços em uma das placas de Petri revestidas de silicone para preparar o prato de ensaio. Angueta o bisturi de uma forma que os poços se tornem em forma de triângulo para facilitar a fixação do tecido dissecado nas bordas. Os poços devem ser grandes o suficiente para aguentar até 250 μL e se encaixar em todo o canal alimentar (em vez de cavar muito fundo, tornar o poço mais largo para cerca de 0,5-1 cm) (Figura 5D).
- Para placa de Ramsay, use uma pipeta e encha poços de até 20 μL de solução (18 μL de 1X Aedes soro fisiológico : o meio de Schneider preparado na etapa 5.2, e 2 μL de hormônio/droga). Para controles não estimulados, encha os poços com 20 μL de 1X Aedes salina:médio de Schneider. Uma vez que todos os poços estejam cheios, despeje óleo mineral hidratado no prato de ensaio até que os poços e pinos minutien estejam submersos. Use uma ponta de pipeta de 20 μL para estourar ou remover bolhas de ar que possam interferir com as gotículas secretas.
5. Preparar soluções
- Prepare 2X Salina Aedes aegypti e glicose 10x, conforme descrito na Tabela 1, adaptado de Petzel e colegas36. As soluções de estoque devem ser armazenadas a 4 °C. Faça estoques de 1X salina Aedes aegypti (Tabela 1) e armazene a 4 °C. No dia do experimento, permita que as ações de trabalho cheguem ao RT antes do uso. Prepare-se fresco se houver alguma evidência de crescimento fúngico ou bacteriano.
- Para preparar a gota de banho, misture o soro fisiológico Aedes (a partir da etapa 5.1) com o médio de Schneider, em uma proporção de 1:1. Prepare-se em pequenas alíquotas, dependendo do quanto é necessário. Mantenha o meio de Schneider na geladeira, descarte se houver alguma evidência de crescimento fúngico ou bacteriano. (Esta etapa deve ser feita no dia do experimento).
- Para medições de fluxo Na+ usando o SIET, prepare um soro fisiológico Aedes modificado de Ca2+free (Tabela 2), como descrito anteriormente26.
6. MTs de mosquitos e dissecções de hindgut
- Para dissecções de mosquitos adultos, colete pupa em um pequeno béquer e coloque em um frasco contendo uma solução de sacarose para alimentação. Para determinar a idade do mosquito, isole mosquitos eclodidos e coloque em um frasco diferente observando a idade e o sexo dos mosquitos para futuras dissecções.
- Coloque brevemente os mosquitos para serem dissecados em uma almofada de CO2 e espere até não responder. Usando fórceps finos, pegue o mosquito de sua perna ou asa e coloque em um prato de dissecação revestido de silicone, preparado na etapa 1. Coloque o mosquito de um lado (lateral para cima), e com um pino Minutien, empalideça no tórax para fixar o mosquito no lugar. Opcionalmente, remova asas e pernas dos mosquitos para facilitar a dissecção.
- Usando uma pipeta Pasteur, adicione uma gota de soro fisiológico RT Aedes para imergir totalmente o mosquito em soro fisiológico. Certifique-se de que a dissecção está toda sob soro fisiológico (ver Tabela 1 para fazer salina do Aedes ).
- Coloque o prato de dissecação sob um microscópio estereoscópico. Aperte o último segmento abdominal com fórceps finos e lentamente afaste-se do mosquito. Esta etapa é facilitada olhando simultaneamente sob o microscópio. O midgut, anexado com os MTs e o hindgut, deve ser exposto (Figura 6).
- Para o ensaio ramsay, remova cuidadosamente cada túbulo da junção midgut-hindgut, certificando-se de não danificar os órgãos. Use fórceps finos afiados para remover os túbulos individualmente – não use túbulos danificados para o ensaio. (Veja o passo 7 para a configuração.)
- Para o SIET, disseca o hindgut em salina Aedes livre de Ca2 +(passo 5.3). Certifique-se de que o prato de poli-L-lysine também tenha um volume fixo de soro fisiológico Aedes sem Ca2+. Remova cuidadosamente a cutícula do reto e coloque o hindgut (pode remover qualquer outro órgão anexado, dependendo do que está sendo medido) no prato de poli-L-lysine. Se medir o transporte de íon ao longo da epitélio da almofada retal, posicione o lado hemisfânfio de pelo menos uma almofada retal para ser acessível à microeletrídrica (Figura 7).
- Usando fórceps para pegar a extremidade mais posterior, leve o traseiro para baixo para o fundo do prato (sem danificar nenhuma estrutura que será medida). Assim que o órgão tocar o casaco de poli-L-lysine, ele vai aderir. Esta amostra dissecada está pronta para medições. (Consulte as etapas 14-16 para configuração e medições do SIET.)
- Para o ensaio de contração de íleo, certifique-se de que o traseiro permaneça preso ao midgut durante a dissecção (Figura 4D). Remova cuidadosamente os MTs para ter uma visão sem obstáculos do hindgut. Este órgão será transferido para um novo prato preparado como descrito na etapa 4.1. (Veja o passo 17 para obter vídeos de ensaio.)
7. Configuração do ensaio Ramsay
- Usando a ponta dos fórceps, levante cuidadosamente a extremidade proximal (aberta) do túbulo, arrastando-a sobre os fórceps (não aperte o túbulo) e transfira para um poço do prato de ensaio. Esta etapa também pode ser feita usando sondas de vidro fino.
- Uma vez que o túbulo esteja imerso no poço, pegue a extremidade proximal do túbulo com as fórceps, remova-a da gota de banho e enrole a extremidade em torno do pino. Enrole o túbulo ao redor do pino duas vezes – e mantenha o comprimento do túbulo restante na gotícula de banho consistente com os outros túbulos. Neste ponto, a extremidade distal do túbulo deve estar na gota de banho, enquanto a extremidade proximal enrolada ao redor do pino longe da gota de banho permitindo que o fluido secretado se acumule na ponta do pino a partir da extremidade proximal aberta.
- Imediatamente após o túbulo ser enrolado ao redor do pino, anote os poços (por exemplo, A, B, C), o tempo (que será o horário de início de quando o fluido começará a ser secretado do túbulo), e qualquer outra informação de identificação (por exemplo, hormônio, genótipo, etc.).
- Cada mosquito tem cinco túbulos, repetindo passos 7,1-7,3 com o resto dos túbulos. Para tratamentos de controle e experimentais, divida os cinco túbulos dentro dos diferentes tratamentos. Continue com a próxima dissecação, até que todo o prato de ensaio esteja preenchido. Com a prática, essa técnica deve levar tipicamente de 2 a 3 minutos para dissecar os túbulos, transferi-los para o soro fisiológico de banho e enrolar ao redor do pino, criando assim uma diferença de 2 a 3 minutos no tempo de partida entre cada túbulo.
NOTA: Antes de iniciar o experimento, calibrar o micrômetro ocular do microscópio com um micrômetro de estágio sob o objetivo selecionado. Gotículas secretas são rotineiramente medidas sob uma ampliação total de 40x-50x. - Após o tempo de incubação alocado, a gota secreta pode ser medida. Usando o micrômetro ocular do microscópio, meça e registe o diâmetro da gotícula secretada. Calcule o diâmetro (d) da gotícula secretada multiplicando o diâmetro da unidade ocular medido pela conversão de calibração (Tabela 3). Calcule o volume da gotícula secretada usando a equação, V = πd3/6.
- Para calcular a taxa de secreção (nL min-1), use a equação, taxa de secreção de fluido = tempo de secreção v/secreção, onde V é o volume da gotícula secretada calculada na etapa 7.5, e o tempo de secreção refere-se ao período de incubação da banheira.
8. Configuração ISME
- Coloque micromanípulos em ambos os lados do estereóscópio para configurar a estação ISME. A cloreto dos fios de prata pode ser alcançada imergindo em uma solução de cloreto férrico e rosqueiar cada fio de prata em cada um dos suportes de microeletroder (ou soldar os fios nos cabos coaxiais, se necessário). Repita este passo sempre que os fios de prata ficarem sem cloreto.
- Conecte os fios de prata a um amplificador, que será lido a um sistema de aquisição de dados. Configure e calibrar o sistema de acordo com as instruções do fabricante. Em caso de aumento da interferência elétrica, use uma gaiola faraday adequadamente aterrada.
9. Preparando as microeletrês para ISME e SIET
- Usando um puxador de pipeta marrom em chamas P-97, puxe ~5-6 capilares de vidro borossilicato não filtrados (diâmetro externo 1,5 mm, diâmetro interno 1,12 mm, comprimento 100 mm) com uma ponta de 1-5 μm. Estes serão usados como microeletrodo seletivos de íons. Para microeletrodos SIET, o eletrodo resultante deve ter uma abertura de ponta de ~5 μm, caracterizada por uma haste curta.
- Em um capô, coloque os microeletrodos em uma placa de aquecimento (estabelecendo cuidadosamente para não quebrar as pontas dos eletrodos). Adicione dichlorodimethylsilano dentro de uma placa de vidro de 15 cm e inverta sobre os eletrodos na placa quente. Use dichlorodimethylsilane para silanizar os eletrodos seletivos de íons adicionando uma camada hidrofóbica a todas as superfícies do eletrodo, permitindo que ele retenha o ionofóbico ionofóbico37. Eletrodos silanizados nãousuados podem ser deixados por algumas semanas; portanto, esta etapa é realizada a cada poucas semanas, ou para eletrodos recém-puxados.
NOTA: Tenha cuidado ao manusear dichlorodimethylsilano – inflamável, corrosivo e tóxico, consulte MSDS para um manuseio seguro.- Gire a placa de 350 °C e deixe no lugar por 75 min. Use uma proporção de 1:2 de número de microeletrodos para volume (μL) de dichlorodimethylsilano para adicionar à placa de vidro Petri. Assim, para 10 microeletrodos, adicione 20 μL de dichlorodimilane.
- Depois de 75 min, desligue a placa quente. Depois que os eletrodos e a placa quente esfriarem, remova a placa de vidro Petri e transfira os eletrodos (com fórceps) para uma caixa de armazenamento com argila de moldagem. Certifique-se de que a ponta do eletrodo está apontando para cima para evitar qualquer dano.
- Para fazer os eletrodos de referência para ISME, puxe ~4-5 tubos capilares de vidro borosssilicato filamentado (diâmetro externo 1 mm, diâmetro interno 0,58 mm, comprimento 100 mm). Estes eletrodos não têm que ser silanizados. Etiquetar e armazenar em uma caixa semelhante, evitando qualquer dano à ponta.
- Os eletrodos de referência SIET são feitos de capilares de vidro padrão (diâmetro externo 2 mm, diâmetro interno 1,12 mm, comprimento 102 mm). Os capilares são preenchidos com 1 M KCl derretido + 3% de ágar e devem ser armazenados em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 1 M KCl (totalmente submerso) até o uso. Eles podem ser usados repetidamente até que as bolhas comecem a se formar ou se o ágar quebrar. Se houver algum espaço de ar, descarte o vidro e use um novo para garantir que o circuito esteja completo.
10. Preparando as seringas de enchimento traseiro
NOTA: Este passo é feito para criar seringas finas para eletrodos de enchimento para ISME.
- Use uma seringa de ponta de deslizamento de 1 mL com uma agulha descartável. Descarte a agulha e puxe a seringa para trás até a marca de 1 mL. Sob a fumehood, ligue o queimador Bunsen e aqueça a ponta plástica da seringa até que comece a derreter. Usando um par velho de fórceps, belisque cuidadosamente a ponta da seringa derretida e puxe para baixo para esticar a ponta.
- Com a tesoura, corte a ponta derretida até o comprimento desejado, deixando o diâmetro pequeno o suficiente para caber dentro dos eletrodos (Veja diagrama). Depois que a seringa esfriar, teste a pressão da seringa com água para garantir que não haja bloqueio. Crie um para cada solução de enchimento necessária e rotule em conformidade (Figura 8).
11. Preenchendo o Ion-Selective and Reference Microelectrode para ISME e SIET
NOTA: O microeletrodo pode ser reutilizado desde que ainda esteja funcionando (calibrar antes de cada experimento). Para o ISME, este passo pode ser feito enquanto os MTs são incubados no ensaio ramsay.
- Para fazer uma microeletrídua na+-seletiva, use a seringa de 1 mL criada na etapa 10 para fazer o eletrodo de enchimento com 100 mM NaCl. Certifique-se de que a solução de enchimento de enco tudo se encha até a ponta do eletrodo. Se aparecerem bolhas de ar, gire suavemente o microeletrodo ou remova a solução e reencha. Isso deve ser feito sob um microscópio estereoscópico para visualizar melhor.
- Sob um microscópio estereoscópico, mergulhe uma ponta de pipeta de 10 μL na solução ionofófora na+-seletiva. Alinhando o eletrodo perpendicular à pipeta, coloque um dedo enluvado sobre a parte inferior da ponta para criar pressão e expulse uma pequena gota de ionóforo. Visualização sob alto objetivo de um microscópio, toque cuidadosamente a gota de ionophore para a ponta do microelerode, evitando quebrar a ponta. Normalmente, os microeletrodos são encaminhados com uma coluna de coquetel de ionóforo de comprimento entre 150-300 μm, até que a borda da solução ionófora/enchimento seja plana.
ATENÇÃO: Este ionóforo é tóxico, consulte MSDS para um manuseio seguro. - Em um pequeno béquer, encha no meio do caminho com 100 mM NaCl, e coloque um pouco de argila modeladora no interior no topo do béquer. Depois que o na+ ionophore tiver sido tomado, coloque o eletrodo na parede do béquer, deixando a ponta sentar dentro do NaCl de 100 mM, e manter o ISME no béquer até que esteja pronto para usar.
- Para fazer o eletrodo de referência ISME, encha um eletrodo com 500 mM KCl garantindo que a solução seja preenchida até a ponta (siga o mesmo protocolo que acima). Guarde o KCL em um béquer.
12. Calibrar eletrodos para ISME
NOTA: Esta etapa é realizada logo antes de tomar medidas do fluido secretado (~10-15 min antes). As calibrações devem ser feitas a cada ~5-6 medidas para garantir que a inclinação seja consistente.
- Cubra as pontas do eletrodo usando uma solução de ~3,5% (w/v) cloreto de polivinil dissolvido em tetrahidrofurano, para evitar o deslocamento do ionóforo quando submerso em óleo de parafina.
ATENÇÃO: Isto é inflamável, consulte MSDS para um manuseio seguro. - Para calibrar o eletrodo Na+ , coloque gotículas de 10 μL das seguintes concentrações padrão NaCl na borda do prato Ramsay com os MTs incubados: 200 mM NaCl e 20 mM + 180 mM LiCl. Coloque as gotículas padrão ~ 2 cm de distância, com maior concentração em cima.
- Insira eletrodo de referência e eletrodo seletivo de íon sobre os fios de prata com cloreto e fixe-os com segurança usando suportes de eletrodos que estão ligados a micromanipuladores. Navegue pelos dois eletrodos em direção à gotícula NaCl de 200 mM usando os micromanipuladores, garantindo que as pontas do eletrodo não toquem na parte inferior do prato. Ligue o eletrometro para iniciar a gravação e deixe a leitura estabilizar.
- Registo a leitura e continue para o próximo padrão (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Calcule a inclinação, e se a leitura do eletrodo estiver estável e a inclinação estiver dentro do alcance, proceda ao uso do eletrodo para as medições secretas de gotículas. Se a leitura estiver instável, não dando uma gravação ou inclinação adequada, ou demorando um pouco para equilibrar, prepare um novo eletrodo seletivo de íons ou quebre a ponta do eletrodo de referência, passando um tecido pela ponta. A inclinação para Na+ deve ser ~58-60 mV38, embora uma faixa aceitável seja de 50-60 mV.
13. Gravações e cálculos do ISME
- Após as medições da taxa de secreção de fluidos (ver passo 7.7), mova cuidadosamente tanto o eletrodo de referência quanto o eletrodo seletivo de íons para a gotícula secretada usando os micromanípulos. Ligue a gravação e permita que a leitura estabilize e regisse o valor. Repita esta etapa para as outras gotículas (repita as medidas de calibração a cada ~5-6 medidas).
- As concentrações de cátion são calculadas utilizando-se a equação descrita anteriormente22,38, [íon] = [C] x 10ΔV/m, onde [C] é a concentração em mmol L-1 da solução de calibração usada para calibrar o ISME, ΔV é a mudança de tensão entre a tensão registrada a partir da gotícula de fluido secretado e a tensão da mesma solução de calibração, e m é a diferença de tensão entre as duas calibrações padrão, que também é a inclinação.
14. Configuração do SIET
NOTA: O sistema SIET foi descrito anteriormente27,39. Para reduzir o ruído de fundo, uma gaiola faraday é instalada ao redor do microscópio de luz e do headstage. Os experimentos apresentados neste artigo utilizam as seguintes configurações do software ASET (Automated Scanning Electrode Technique) 2.0: um período de espera de 4 segundos para permitir que os gradientes de íons se restabeleçam totalmente após os movimentos de microeletrodos, com a voltagem sendo registrada para 0,5 s após o período de espera, uma distância de excursão de 100 μm e três repetições para cada gravação. Certas configurações podem ser modificadas pelo usuário no ASET, conforme necessário.
- Ligue o Amplificador IPA-2 Ion/Polarographic, o microscópio de luz (com uma câmera de vídeo anexada) e o computador(s) conectado a cada um desses ASET e cellSens em execução.
- Prepare microeletrodos e eletrodos de referência descritos nas etapas 9.1-9.3, 9.5, 10 e 11.1-11.3. A microeletrísmo ion-seletiva conterá na+ ionóforo com enchimento de 100 mM NaCl e o eletrodo de referência (com as pontes de ágar) será sempre preenchido com 3 M KCl.
- Coloque a microeleroda na+-seletiva no suporte consistindo de um fio de cloreto de prata (AgCl) e conecte-o na tomada do conector feminino. Usando uma seringa, encha o suporte de eletrodo de referência com 3 M KCl fresco (pode ser feito antes do dia do experimento e armazenado no RT).
NOTA: Após os experimentos, lave o suporte de eletrodo de referência com ddH2O. - Remova um eletrodo de referência do béquer contendo todos os eletrodos de referência submersos em 3 M KCl, colocando um dedo em uma extremidade e inclinando o capilar de vidro em direção a este dedo para evitar que o ágar caia. Coloque cuidadosamente uma extremidade no suporte, garantindo que não se forme bolhas. Se houver uma bolha, remova o eletrodo de referência, rechee o suporte com mais 3 M KCl e repita. Coloque o suporte de eletrodo na tomada do conector feminino.
15. Calibrar eletrodos para SIET
- Para medições Na+ , use uma solução NaCl de 150 mM e 15 mM NaCl + 135 mM LiCl24. Deve haver uma diferença de 10 vezes nas concentrações na+ entre as duas soluções, abrangendo a faixa de níveis de Na+ (20 mM) no soro fisiológico (Tabela 2).
- Armazene soluções de calibração em RT em um tubo de centrífugas de 50 mL e alíquota em uma placa de Petri ao conduzir o experimento. Esta alíquota é descartada no final do dia. Se houver alguma evidência de contaminação nas soluções de estoque, descarte e faça novas soluções.
- Para calibrar, aliquot as duas soluções de calibração (passo 15.1) em pratos petri individuais de 35 mm, e coloque-as no estágio do microscópio. Usando os botões de ajuste manual que controlam os motores do estepe com "desativar" selecionados na unidade de controle de movimento do computador, certifique-se de que a ponta do microeletrodes seja colocada dentro da solução de calibração. Não submergir a ponta muito longe, pois ela pode quebrar. Se a ponta quebrar, prepare uma nova microeletríscula seletiva de íons e recalibrar.
- No computador conectado ao amplificador, abra o software ASET. Abra as configurações de calibração. Selecione Nernst Slope para o tipo de calibração, defina a amostra por 3 segundos e digite as concentrações das soluções de calibração. Por exemplo, para medições Na+ , digite 150 mM na solução 1, coloque a ponta de microeletroderda na+-seletiva e eletrodo de referência dentro desta solução de calibração. A leitura de tensão no amplificador deve ser estável. Clique na Solução 1, aguarde que a tensão (em mV) seja gravada. Em seguida, coloque o microeletrodo e o eletrodo de referência dentro da solução De 15 mM NaCl + 135 mM LiCl, insira 15 mM na solução 2 e clique na Solução 2 para obter a leitura de tensão. A inclinação será a diferença entre essas duas tensões, calculadas nessas configurações. Após a calibração, clique em OK.
- As encostas para microeletrodos na+seletivas para uma mudança de dez vezes na concentração de íons devem ficar em torno de 59,0 ± 1.624. Se a inclinação Nernst se desviar muito dessa faixa, prepare um novo microeletromes, ou aliquot novos padrões (como eles podem estar contaminados). A calibração é necessária antes de cada 2-3 amostras, dependendo da estabilidade da tensão. Se a tensão se tornar instável e começar a flutuar, prepare uma nova microeletrídroa ion-seletiva.
16. Medidas do SIET
NOTA: O interruptor do motor na unidade de controle de movimento do computador deve ser sempre alterado para desativar, exceto ao manipular o eletrodo usando teclas de computador através do ASET, ou durante gravações de medição (momento em que a chave deve ser comutada para Habilitar).
- Após a calibração, disseca o órgão (ver passo 6.6). Coloque o prato de poli-L-lysine com a amostra dissecada no estágio do microscópio e insira a ponta do eletrodo de referência dentro do soro fisiológico. Submergir a ponta do íon seletivo microelerode no soro fisiológico tomando cuidado para não quebrar a ponta.
- Use os botões de ajuste manual para ajustar a posição de microeletrídro enquanto olha sob o microscópio de luz. Ajuste a posição vertical do microeletrou de tal forma que sua ponta esteja no mesmo plano que o órgão ou tecido. Uma vez na posição desejada, gire o interruptor do motor para Habilitar. Neste ponto, os motores stepper só podem ser operados usando o software do computador.
- Usando as teclas de seta do computador, mova o microeletrodo horizontalmente para uma posição de 3 mm de distância do tecido para medir gravações de fundo. Insira notas pressionando F2. Quando estiver pronto, comece a gravar (pressionando F5). Obtenha cinco medições de atividade de fundo. A atividade média de tensão de fundo para cada amostra será subtraída dos gradientes de tensão medidos ao longo do tecido para a mesma amostra.
- Mova a ponta de microeletrodo para perto do tecido, tomando cuidado para não perfurar o órgão. Reduza a sensibilidade do keyhit para colocar a ponta de microelerode 2 μm diretamente para a direita, perpendicular ao tecido. Obtenha três gravações em cada local ao longo da almofada retal para identificar o local de maior atividade de íons. Obtenha medições salinas de base no local que exiba maior atividade (o local "hotspot").
- Mude o motor para Desativar e adicione o tratamento adequado ao prato para obter a dose final desejada. Após a aplicação, crie uma nova nota (ou seja, nome do tratamento e dose), troque o motor de volta para Habilitar e faça gravações de tensão usando F5. Se o objetivo é observar as mudanças ao longo do tempo, continue a fazer medições em intervalos de tempo específicos. Vários protocolos podem ser criados para aplicações específicas usando o SIET, dependendo do objetivo do pesquisador.
- Observe o software ASET registrar a tensão no local ao longo do tecido e subtrair isso da tensão a uma distância de excursão (Figura 7) de 100 μm de distância do tecido. Uma vez que o primeiro registro é feito no tecido, uma diferença positiva de tensão indica que a tensão é maior no epitélio (tecido) (Figura 7A) do que longe do epitélio (Figura 7B), e assim a cáção está sendo absorvida. Um gradiente de tensão negativa é indicativo de secreção de ceda.
- Obtenha gravações de fundo novamente após o tratamento (3 mm de distância) e use-as no cálculo do fluxo de íons após o tratamento. Faça um conjunto de gravações de fundo em "linha de base" e um conjunto após o tratamento. Mude o motor para Desativar sempre que o microeletro não estiver sendo ajustado com as teclas do computador ou quando a tensão não estiver sendo registrada. Exporte os dados para um arquivo de texto e abra usando o Excel para realizar todos os cálculos.
- Calcular fluxo de íons usando equações descritas anteriormente24,26. O fluxo de íons líquidos para cada tratamento pode ser expresso como uma mudança absoluta das medidas de fluxo de íons de base. Para verificar a significância dos resultados, um controle de veículo (ou seja, adicionando soro fisiológico sozinho no prato em vez de um tratamento) pode ser usado. Alterações no transporte de íons após o tratamento hormonal devem ser avaliadas em relação a quaisquer alterações em resposta a este controle.
17. Ensaios de contração de porção hindgut
- Encha um dos poços do prato descrito na etapa 4.1 com um volume conhecido de soro fisiológico do Aedes (passo 5.1). Após a dissecação (etapa 6.7), transfira cuidadosamente o hindgut dissecado ligado ao midgut para o poço no outro prato, certificando-se de não beliscar o órgão que está sendo examinado (íleo). Submergir o intestino no soro fisiológico dentro do poço, e coloque pinos minutien no meio do degrau e no reto. Ao fazê-lo, o íleo não deve estar sob tensão, e contrações espontâneas, originárias da válvula pilórica no íleo anterior, devem ser observadas.
- Conecte uma câmera de vídeo a um microscópio estereoscópico e grave vídeos usando um software de captura de vídeo (por exemplo, o INFINITY CAPTURE da Luminera). Coloque o prato contendo o órgão dissecado sob o microscópio e grave por 2 min. Esta será a condição "Linha de Base".
- Adicione um volume conhecido de 1X Aedes salina (passo 5.1) ao poço para explicar quaisquer alterações na motilidade ileal após o aumento do volume dentro do poço. Aguarde 1 min após a aplicação, depois grave novamente por 2 minutos. Esta é a condição "salina".
- Adicione um volume conhecido de tratamento (a partir de uma concentração de estoque de 10x para obter a dose desejada no poço). Aguarde 1 min após a aplicação, depois grave novamente por 2 minutos. Esta será a condição de "tratamento".
- Salve todos os vídeos e converta-os em MP4. Para analisar, conte o número de contrações nos intervalos de 2 minutos (definido como uma onda peristáltica iniciando na válvula pilórica e estendendo-se por todo o íleo). Divida este número em 2 minutos para obter a taxa de contração. Outros parâmetros também podem ser avaliados, como contração ou duração de relaxamento. Após a coleta de dados brutos, expresse cada parâmetro relativo aos dados para condições de "linha de base" para cada amostra. Plote a troca de dobra para o "soro fisiológico" e "tratamento" tudo relativo à "linha de base".
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Representative Results
A aplicação de DH31 contra MTs não estimulados resulta em um aumento significativo na taxa de secreção de fluidos, confirmando seu papel como hormônio diurético em mosquitos Aedes (Figura 1A). Quando os túbulos são tratados com AedaeCAPA-1, observa-se uma redução na taxa de secreção em MTs estimulados por DH31. A Figura 1B demonstra o uso de eletrodos seletivos de íons para medir as concentrações na+ nas gotículas secretadas. O tratamento do DH31 nos TM não teve efeito sobre a concentração de Na+ na gotícula secretada; no entanto, com a aplicação do AedaeCAPA-1, a concentração de Na+ no fluido secretado foi significativamente aumentada. Além disso, em comparação com os controles não estimulados, o DH31 levou a uma taxa de transporte Na+ significativamente maior, enquanto o AedaeCAPA-1 aboliu esse aumento em túbulos estimulados por DH31 (Figura 1C). Juntos, esses resultados amostrais demonstram como as taxas de secreção de fluidos após a aplicação de hormônios diuréticos e anti-diuréticos podem ser medidas, bem como a concentração de íons dentro das gotículas secretadas. As fêmeas de três a seis dias foram dissecadas e entre 23 e 35 MTs foram analisadas para o experimento. As diferenças foram denotadas como estatisticamente significativas se p < 0,05 utilizando um ANOVA unidirecional e t-testes não pagos.
O SIET foi utilizado para avaliar alterações no transporte na+ ao longo da epitélia da almofada retal de mosquitos fêmeas adultas. A maioria das retas não estimuladas examinou o transporte Na+ dirigido por hemolymph (absorção), e por isso apenas essas preparações foram examinadas. Devido à variabilidade na atividade da linha de base, calculou-se a diferença no fluxo de íons, seguindo a aplicação de soro fisiológico ou peptídeo, em relação à atividade inicial de transporte em soro fisiológico. Esses valores produzem uma mudança negativa no fluxo de íons (fluxo de íons após o tratamento – fluxo de íons em condições de linha de base), embora todos os órgãos tenham permanecido absortivos após os tratamentos. Um analógico leucocina (Drosokinin) foi usado para examinar alterações na absorção de Na+ , o que resultou em uma redução de quatro vezes na absorção de Na+ em comparação com o controle salino (Figura 2).
Para avaliar o papel de um neuropeptídeo, piroquinina-2 (PK2), na motilidade ileal, foi utilizado um análogo de Rodélio prolixus , que foi mostrado anteriormente para ativar o receptor A. aegypti PK2, enriquecido no ileum do mosquito28. Em relação aos níveis de linha de base, o PK2 inibe significativamente as contrações ileais (Figura 3).
Figura 1: Efeito de neuropeptídeos diuréticos e anti-diuréticos na taxa de secreção de fluidos in vitro, concentração na+ e taxa de transporte por MTs adultos fêmeas A. aegypti. Aedae CAPA-1 (0,1 fM) foi aplicado aos MTs estimulados com DromeDH31 (25 nM). (A) Os MTs foram incubados por 60 minutos com neuropeptídeos e 120 min para controles não estimulados. (B) As concentrações na+ na gotícula secretada foram medidas utilizando-se ISME e os valores foram utilizados para calcular a taxa de transporte (C). Colunas significativamente diferentes dos controles são denotadas com a mesma letra, determinadas por um pós-teste de ANOVA e Bonferroni unidirecional (n = 23-35). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alterações no transporte na+ através da epíte celeia retal feminina medida utilizando o SIET. A absorção de Na+ foi registrada em condições salinas não estimuladas, seguida de tratamento com soro fisiológico adicional (controle do veículo) ou 1 μM Drosokinin (n = 10-12). Foram medidas alterações no fluxo Na+ direcionado a hemolymph para cada tratamento. Houve uma redução de quatro vezes na absorção de Na+ em resposta à Drosokinin, como determinado por um teste t de duas caudas não verificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mudança na motilidade ileal de mosquitos fêmeas após a aplicação de soro fisiológico (controle de veículo) e RhoprPK2. A alteração na frequência de contração após ambos os tratamentos foi registrada para cada amostra relativa às condições da linha de base (n = 32). Rio Rhopr PK2 diminuiu a motilidade ileal, conforme determinado por um teste t de duas caudas emparelhado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Esquema do ensaio ramsay, uso de microeletrodos seletivos de íons (ISME), a técnica de eletrodo seletivo de ion de digitalização (SIET) e ensaios de contração de porcas. Ilustrações dos quatro métodos utilizados para determinar os papéis funcionais de fatores endócrinos no sistema excretório do mosquito, Aedes aegypti. (A) O ensaio de Ramsay é usado para medir taxas de secreção de fluidos em túbulos malpighianos isolados. A extremidade proximal (aberta) do túbulo é enrolada em torno de um pino, cercada por óleo mineral, enquanto a extremidade distal (fechada) é banhada no soro fisiológico do tratamento. Após um período de tempo definido, o final proximal segregará a urina primária, acumulando-se como gotículas no pino. (B) Um eletrodo de referência e ISME são colocados na gotícula secretada, conectada a um sistema de aquisição de dados, para medir a concentração de íons. (C) O SIET mede o transporte de íons usando um microeletroderado seletivo de íons colocados perpendicularmente ~2 μm de distância do órgão aderido ao fundo de um prato de poli-L-lysine. A direção das setas vermelhas neste esquema indicam que Na+ está sendo absorvido no soro fisiológico, indicado por um maior registro de tensão ao longo do epitélio em relação à região longe da superfície do órgão. (D) Os ensaios de contração de por trás são realizados usando gravações de vídeo para avaliar alterações na frequência de contração, comprimento e duração de relaxamento. Neste esquema, os órgãos são colocados dentro de um poço, e um pino de metal é inserido diretamente no meio do ínteo e no reto para permitir que o íleo flutue livremente e contraa. Os tratamentos são adicionados ao poço para avaliar mudanças na motilidade tanto qualitativamente quanto quantitativamente. Criado usando BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Pratos utilizados para (A) dissecando mosquitos, (B) ensaio Ramsay, (C) SIET e (D) medidas de ensaio de contração. A, B e D são completamente revestidos com silicone, enquanto C é revestido com poli-L-lysine no centro. Para preparar a placa usada para o ensaio Ramsay (B), uma pequena placa de Petri revestida de silicone é utilizada, e pequenos poços de ~4-5 mm são esculpidos a 1 cm de distância (cerca de ~20 poços podem ser esculpidos/prato). Pinos metálicos minutien são colocados ao lado de cada poço para segurar o túbulo isolado para medir a taxa de secreção de fluidos. O prato de poli-L-lysine (C) permite que o órgão adere ao fundo durante as medições do SIET. Os poços no prato de ensaio de contração (D) são preenchidos com soro fisiológico e quaisquer tratamentos seguintes. O órgão de contração colocado dentro do poço é observado usando uma câmera de vídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: O sistema excretório do mosquito , Aedes aegypti. Depois de uma farinha de sangue, solutos, água e nutrientes são passados ao longo do canal alimentar, que inclui (mas não se limita a) o midgut, válvula pilroal, MTs e hindgut. O midgut é o principal local para digestão alimentar e absorção de nutrientes. Os cinco MTs transportam água, solutos e resíduos do hemolymph circundante e secretam esta urina primária no hindgut, composto por um íleo anterior e reto posterior, este último inclui quatro almofadas retal (masculinas) ou seis (fêmeas). O hindgut funciona como o local final de reabsorção antes que os resíduos seja excretado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imagens de um mosquito dissecado em hindgut durante as medições do SIET. Para medir a atividade de íon ao longo da epitélio de uma das seis almofadas retais, a microeletrão na+-seletiva é colocada a 2 μm de distância do tecido (A). A tensão é registrada neste local antes que a ponta da microeletrísola seja movida a uma distância de excursão (Δx) de 100 μm a partir deste ponto (B). O gradiente de tensão entre esses dois pontos é usado para calcular o gradiente de concentração e o fluxo de íons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: As seringas de enchimento traseiro para ISME e SIET. Uma foto das seringas usadas para reabastecir soluções naCl e KCl nos microeletrodes. Isso mostra quatro seringas de ponta de deslizamento de 1 mL com agulhas descartáveis, com uma ponta esticada modificada para permitir a inserção em um eletrodo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 2X Salina do Aedes aegypti | ||
| Para 500 mL: | ||
| Em um béquer, adicione 400 mL de ddH2O e adicione os seguintes solutos: | ||
| Componente | Peso (g) | Concentração final (mM) |
| NaCl | 8.766 | 150 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| Kcl | 0.253 | 3.4 |
| Naoh | 0.3 | 7.5 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| CaCl2-2H20 | 0.249 | 1.7 |
| Mexa e ajuste o pH para 7.1 | ||
| Adicione ddH2O ao volume final de 500 mL para fazer soro fisiológico 2x Aedes | ||
| Glicose 10X | ||
| Para 500 mL: | ||
| Em um béquer, adicione 450 mL de ddH2O, em seguida, adicione: | ||
| Componente | Peso (g) | Concentração final (mM) |
| Glicose | 4.5 | 5 |
| Mexa e adicione ddH2O ao volume final de 500 mL | ||
| Para fazer salina 1X Aedes aegypti : | ||
| Por 100 mL: | ||
| Em um béquer, adicione 40 mL de ddH2O, em seguida, adicione: | ||
| Componente | Volume (mL) | |
| 2x Aedes soro fisiológico | 10 | |
| Mexa, ajuste o pH para 7.1 | ||
| Esterilizar filtro | ||
Tabela 1: Fazer salina do Aedes aegypti . Para fazer salina do Aedes , prepare separadamente 2X Aedes soro fisiológico e 10x de glicose, guarde na geladeira de 4 °C. Use essas duas soluções para preparar estoques de trabalho (1x Aedes salina), usado para dissecar tecidos, ensaios ramsay e ensaios de contração.
| Salina Aedes aegypti livre de cálcio + NMDG | ||
| Para 500 mL: | ||
| Em um béquer, adicione 400 mL de ddH2O e adicione os seguintes solutos: | ||
| Componente | Peso (g) | Concentração final (mM) |
| NaCl | 1.17 | 20 |
| NMDG | 25.38 | 130 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| Kcl | 0.253 | 3.4 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| Glicose | 0.9 | 5 |
| Mexa e ajuste o pH para 7.1 | ||
| Adicionar ddH2O ao volume final de 500 mL | ||
Tabela 2: Salina modificada do Aedes aegypti utilizada para medições de SIET. Este soro fisiológico sem ca2+é usado para evitar contrações espontâneas de porcas durante as medições do SIET. Esta solução salina é específica para medir o transporte Na+ , pois consiste em Na+ reduzido (20 mM) composta por substituição equimolar com N-metil-D-glucamine (NMDG) para reduzir o ruído de fundo.
| MTs estimulados por DH31 | Diâmetro da gotícula (unidades) | Diâmetro da gotícula (um) | Volume de gotícula (um3) | Taxa de Secreção (nl/min) |
| n | Tratamento #1 (60 min) | Tratamento #1 (60 min) | Tratamento #1 (60 min) | Tratamento #1 (60 min) |
| 1 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 2 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 3 | 17 | 333.33 | 19392547.25 | 0.32 |
| 4 | 13 | 254.90 | 8671977.67 | 0.14 |
| 5 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 6 | 22 | 431.37 | 42029685.15 | 0.70 |
| 7 | 15 | 294.12 | 13321768.16 | 0.22 |
| 8 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 9 | 20 | 392.16 | 31577524.53 | 0.53 |
| Significar | 16.33333333 | 320.26 | 18776785.52 | 0.31 |
| STD ERR | 0.06 |
Tabela 3: Amostra de dados de ensaio ramsay. Tabela mostrando dados amostrais coletadas de MTs estimulados pelo DH31 de mosquitos fêmeas adultas. Ao medir o diâmetro da gotícula secretada, primeiro meça com o micrômetro ocular estereomicroscope e anote o valor. Em seguida, multiplique o diâmetro da unidade ocular com a conversão de calibração realizada antes do experimento para obter o diâmetro da gotícula em μm. Calcule o volume da equação em seguida, usando a equação anotada na etapa 7.7, seguida pela taxa de secreção, usando a equação anotada na etapa 7.8.
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Discussion
Ao ingerir uma refeição de sangue, os insetos hematófagos enfrentam o desafio do excesso de solutos e água em seu hemolymph2. Para lidar com isso, eles possuem um sistema excretório especializado, que é fortemente controlado por fatores hormonais, permitindo que os insetos iniciem rapidamente a diurese pós-prandial. O ensaio ramsay e o uso de microeletrodos seletivos de íons permite a medição das taxas de secreção de fluidos, juntamente com concentrações de íons e taxas de transporte em MTs de insetos isolados. Aedes Os MTs não secretam prontamente em controles não estimulados, portanto, hormônios e drogas podem ser aplicados para estimular a secreção. No entanto, mesmo com aplicação diurética ou dissecções cuidadosas, alguns MTs podem não se segregar se danificados (mesmo que não seja de todo óbvio com inspeção visual), portanto, várias rodadas do ensaio podem ter que ser conduzidas. Para o uso adequado de eletrodos seletivos de íons durante as medições isme e SIET, certifique-se de que a inclinação das normas esteja dentro da faixa normal relatada para o ionóforo, o que dará as leituras mais precisas. No entanto, se as leituras forem instáveis, examine o eletrodo sob o microscópio para confirmar que o ionóforo foi retomado e não está vazando. Um novo eletrodo deve ser preparado se houver bolhas de ar presentes, a ponta está quebrada ou o ionóforo não foi tomado corretamente. Se a fronteira ionofhore/backfill for convexa, os eletrodos são sub-silanizados e mais dichlorodimethylsilano devem ser usados. Se a borda for côncava, os eletrodos são super silanizados, e menos dichlorodimethylsilano deve ser usado. Além disso, alguns eletrodos podem ser menos estáveis do que outros, como o eletrodo na+-seletivo, pelo qual a inclinação se deteriora mais rapidamente em comparação com K+ ou H+.
Essas abordagens oferecem oportunidades ilimitadas para estudar os mecanismos por trás da secreção de fluidos pelos MTs. Devido aos recentes avanços na edição genômica, estratégias genéticas reversas como a edição de genes CRISPR-Cas9 e a interferência de RNA podem ser usadas para investigar o papel regulatório e/ou funcional de genes específicos expressos em órgãos excretoriais. Estudos têm utilizado tais ferramentas para entender a regulação hormonal em Aedes40 e Drosophila41 MTs. Além disso, a gotícula de banho pode ser modificada para olhar para os papéis específicos dos hormônios14,15,18,21,42, sistemas de segundo mensageiro e drogas sobre taxa de secreção e concentrações de íons. Essas metodologias têm sido aplicadas em vários outros insetos, como Rhodnius prolixus38, espécies de mosquitos larvais e adultos, Drosophila41, e espécies mayfly (Hexagenia rigida)43. Da mesma forma, diferentes íons podem ser examinados, como Cl-, K+, H+ e NH4+.
Durante as medições do SIET, pode haver variabilidade entre todas as amostras durante as condições da linha de base. Diferenças ainda podem surgir ao controlar a idade, o sexo e o estado alimentar do mosquito, particularmente quando examinando diferentes regiões do intestino (ou seja, certas distâncias anteriores ou posteriores da junção íleo-reto). Essas diferenças podem ser contabilizadas expressando fluxo de íons após o tratamento como uma mudança em relação às condições da linha de base. Com o tempo, a atividade de íons também pode flutuar e, portanto, é importante avaliar as mudanças em relação a um controle veicular (soro fisiológico), como mostrado nos resultados aqui apresentados. Se as leituras de tensão começarem a flutuar drasticamente, prepare uma nova microeletromes seletiva de íons e recalibrar. O uso de uma terceira solução de calibração (diluída 10 vezes da menor concentração de solução de calibração) pode ajudar ainda mais a estabelecer uma inclinação Nernst mais precisa. Uma vez que a atividade Na+ é tipicamente altamente suscetível ao ruído de fundo, um soro fisiológico modificado do Aedes consiste em menos Na+ é usado (Tabela 2). Também é importante manter distância da gaiola de Faraday durante as medições para evitar interferências e reduzir qualquer plano de fundo. Além disso, se o órgão ainda produz contrações espontâneas quando aderido à poli-L-lysina na parte inferior do prato, adicionar uma querata de cálcio ao soro fisiológico ajudará ainda mais a prevenir isso. Se examinar o transporte de íons ao longo da epitélio da almofada retal, como mostrado nos resultados aqui apresentados, é importante identificar o local "hotspot" que exibe maior atividade de íons, movendo a ponta de microelerode em pequenos incrementos ao longo do lado hemistal da almofada retal. Se não conseguir detectar grandes alterações na atividade de íons, o órgão pode ter sido danificado ou a ponta da microelerodia não está no mesmo plano tridimensional que a abertura da almofada retal, e, portanto, outro mosquito deve ser dissecado.
O SIET pode ser usado para vários experimentos, como examinar a atividade de íons em mosquitos criados em diferentes condições25 ou alimentados com diferentes dietas (ou seja, alimentadas com sacarose vs. alimentadas com sangue vs. não alimentadas), o que pode ser útil para identificar mecanismos de transporte de íons críticos após uma farinha de sangue. Por isso, é importante garantir que as medidas sejam obtidas do mesmo local entre as amostras. Por exemplo, as medidas podem ser tomadas a partir da junção íleo-reto ou a distâncias específicas localizadas anteriormente a partir deste local (ao longo do íleo) ou posteriormente (ao longo do epitélio retal). Essas medidas também podem ser obtidas ao longo do epitélio da almofada retal que requer posicionamento diferente do órgão no prato. Além disso, é importante notar que o SIET não se restringe à medição da atividade de íons apenas ao longo do hindgut; outros órgãos, incluindo o midgut e os MTs também podem ser examinados. Da mesma forma, k+, H+, NH4+e cisto podem ser medidos usando o SIET25,44,45 e as medidas podem ser tomadas em intervalos de tempo definidos após um tratamento44. Esta técnica tem sido usada tanto em mosquitos larvais quanto adultos26,44, bem como em vários outros insetos, incluindo Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 e Hexagenia rigida43. Esses experimentos podem ser usados em conjunto com o ensaio ramsay e o ISME para obter uma melhor compreensão do papel de diferentes tratamentos e fatores ambientais na secreção de fluidos, concentração de íons e transporte de íons.
Por fim, os ensaios de contração são úteis para identificar fatores neuroendócrinos que influenciam a motilidade intestinal. É fundamental que o órgão em estudo não seja danificado, pois este ensaio se baseia em movimentos gerados pela musculatura. Portanto, os fórceps só devem ser usados para agarrar estruturas circundantes ao transferir os órgãos para o prato de ensaio. Agarrar esses órgãos adjacentes com um pino dentro do poço também os impede de se mover e influenciar o movimento do órgão isolado sendo examinado. Se não forem observadas contrações espontâneas, o tecido pode ter sido danificado, e uma nova dissecção é necessária. Outros métodos comumente utilizados para examinar a atividade contraída do intestino de insetos incluem o uso de um transdutor de força32 ou monitor de impedância33. Esses métodos também podem ser usados para medir a taxa de contração no hindgut do mosquito; no entanto, se o objetivo é examinar visualmente essas alterações através de gravações de vídeo, os métodos descritos neste protocolo serão benéficos e poderão ser usados para análises posteriores48.
As quatro técnicas descritas neste protocolo ajudaram a deduzir o papel de uma série de neuropeptídeos no sistema excretório de vários insetos. O uso desses métodos em conjunto com técnicas adicionais utilizadas por fisiologistas de insetos, como PCR quantitativo e imunohistoquímica, pode fornecer uma compreensão mais abrangente das vias subjacentes e sistemas de sinalização, que podem servir como novos alvos potenciais para o controle vetorial.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants to AD e J-PP. A AL e a FS receberam prêmios NSERC CGS-M em apoio à sua pesquisa de pós-graduação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955456 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning Falcon (Fisher Scientific) | C351008 | |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | used for ISME reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm) |
World Precision Instruments | 1B200F-4 | used for SIET reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | TW150-4 | used for ISME and SIET electrodes |
| CO2 pad | Diamed | GEN59-114 | |
| Dimethyltrimethylsilylamine solution | Sigma-Aldrich | 41716 | |
| Faraday cage | Custom | Can be fabricated by local machine shop | |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-748A | |
| Hydrated mineral oil | Fisher Scientific | 8042-47-5 | Specific brand is not important |
| INFINITY1-2CB video camera | Luminera | INFINITY1-2CB | |
| Micromanipulators (left and right handed) | World Precision Instruments | MMJL and MMJR | Specific brand is not important so long as high quality manipulator |
| Mineral Oil, Light | Fisher Scientific | 0121-4 | |
| Minutien pins (0.1 mm stainless steel) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Non-hardening modeling clay | Sargent Art | Specific brand is not important | |
| Olympus light microscope (FOR SIET) | Olympus | customized system | |
| Plastic Pasteur (transfer) pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) | Sigma-Aldrich | A-005-M | 84 kDa |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81395 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10053-09 | |
| Schneider's Drosophila medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| SIET system | Applicable Electronics | customized system | Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGW1010 | |
| Sodium ionophore II cocktail A | Fluka | 99357 | |
| Standard polystyrene Petri (culture) dishes | Fisherbrand | FB012921 | Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | |
| Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller | Sutter Instruments | FGPN7 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Chemical Company | NC9285739 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| VWR advanced hotplate stirrer - aluminum | VWR | 9578 | Specific brand is not important |
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