Summary
يحدد هذا العمل بروتوكولا لتحقيق مراقبة ديناميكية غير غازية لنقل الحرارة من الجسيمات النانوية الذهبية المشععة بالليزر إلى tBLMs. يجمع النظام بين التحليل الطيفي للمعاوقة لقياس تغيرات التوصيل في الوقت الفعلي عبر tBLMs ، مع شعاع ليزر يركز أفقيا يدفع إضاءة الجسيمات النانوية الذهبية ، لإنتاج الحرارة.
Abstract
هنا نبلغ عن بروتوكول للتحقيق في نقل الحرارة بين الجسيمات النانوية الذهبية المشععة (GNPs) والأغشية الدهنية ثنائية الطبقات عن طريق الكيمياء الكهربائية باستخدام الأغشية الدهنية ثنائية الطبقة المربوطة (tBLMs) التي يتم تجميعها على أقطاب ذهبية. وغرض الشبكات العالمية المعدلة المشععة، مثل شبكات الجيل التالي المترافقة مع الستريبتافيدين، مضمنة في ال TBLMs التي تحتوي على جزيئات مستهدفة، مثل البيوتين. وباستخدام هذا النهج، تتم توسط عمليات نقل الحرارة بين شبكات الجيل التالي المشععة والغشاء الدهني ثنائي الطبقة النموذجي مع الكيانات ذات الاهتمام بواسطة شعاع ليزر يركز أفقيا. ويستخدم النموذج الحسابي التنبؤي الحراري لتأكيد التغيرات الناجمة عن التوصيل الكهروكيميائية في tBLMs. وفي ظل الظروف المحددة المستخدمة، يتطلب الكشف عن نبضات الحرارة تعلقا محددا بالجسيمات النانوية الذهبية بسطح الغشاء، في حين فشلت الجسيمات النانوية الذهبية غير المقيدة في الحصول على استجابة قابلة للقياس. هذه التقنية بمثابة جهاز استشعار حيوي قوي للكشف يمكن استخدامه مباشرة لتصميم وتطوير استراتيجيات العلاجات الحرارية التي تسمح بتحسين معلمات الليزر وحجم الجسيمات وطلاء الجسيمات وتكوينها.
Introduction
الأداء الحراري المفرط للمواد النانوية الذهبية المشععة يقدم فئة جديدة من العلاج الحد الأدنى من الغازية والانتقائية والمستهدفة للعدوى والأورام1. وقد استخدمت توظيف الجسيمات النانوية التي يمكن تسخينها بواسطة الليزر لتدمير انتقائي الخلايا المريضة، فضلا عن توفير وسيلة لتسليم المخدراتالانتقائية 2,3. نتيجة لظاهرة انحلال الخلايا من الجسيمات النانوية البلازمونية الساخنة هو تلف أغشية الخلايا. يعتبر غشاء ثنائي الطبقة الدهنية السائل موقعا ضعيفا بشكل خاص للخلايا التي تخضع لمثل هذه العلاجات لأن تشبع بروتينات الغشاء الجوهري وكذلك تلف الغشاء يمكن أن يؤدي أيضا إلى موت الخلية4، حيث أن العديد من البروتينات موجودة للحفاظ على التدرج المحتمل الأيوني عبر أغشية الخلايا. في حين أن القدرة على تحديد ورصد نقل الحرارة على مقياس النانو هي ذات أهمية رئيسية لدراسة وتطبيق GNPs المشععة1و5و6و7، وتقييم وفهم التفاعلات الجزيئية بين GNPs والأغشية الحيوية ، وكذلك العواقب المباشرة لظواهر التدفئة الناجمة عن الليزر من GNPs المضمنة في الأنسجة البيولوجية ، لم يتم توضيحها بالكاملبعد 8. ولذلك، فإن الفهم الدقيق لعملية ارتفاع الحرارة في شبكات الجيل التالي المشععة لا يزال يشكل تحديا. وعلى هذا النحو، فإن تطوير واجهة للأقطاب الكهربائية النانوية تحاكي البيئة الطبيعية للخلايا يمكن أن يوفر وسيلة لإجراء تحقيق متعمق في خصائص نقل الحرارة للجسيمات النانوية الذهبية المشععة داخل النظم البيولوجية.
تعقيد أغشية الخلايا الأصلية هو واحد من التحديات الكبيرة في فهم التفاعلات GNPs المشععة في الخلايا. كانت هناك منصات مختلفة الأغشية الاصطناعية وضعت لتوفير إصدارات محاكاة بيولوجية بسيطة قريبة من بنية الغشاء الدهني الطبيعي والوظائف، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، أغشية الدهون السوداء9،دعمت الأغشية ثنائية الطبقات بلانار10،الأغشية ثنائية الطبقةالهجينة 11،البوليمر خففت الأغشية ثنائية الطبقة الدهنية12 والأغشية الدهنية ثنائية الطبقات المربوطة13. كل نموذج غشاء الدهون الاصطناعية له مزايا والقيود المتميزة فيما يتعلق تقليد الأغشية الدهنية الطبيعية14.
تصف هذه الدراسة توظيف الأقطاب الكهربائية المغلفة بالغشاء الدهني كمستشعر لتقييم الجسيمات النانوية الذهبية وتفاعلات غشاء الدهون ، باستخدام نموذج tBLM. يوفر نظام الكشف عن الاستشعار الحيوي القائم على tBLM الاستقرار المتأصل والحساسية13 حيث يمكن للأغشية المربوطة الإصلاح الذاتي ، على عكس الأنظمة الأخرى (مثل الأغشية التي تشكلها الرقعة المشبك أو الليبوسومات) التي ينتج فيهاسوى كميةصغيرة من تلف الغشاء في انهيارها 15و16و17و18. علاوة على ذلك ، لأن tBLMs هي من أبعاد مم2 ، فإن مقاومة الخلفية هي أوامر أقل من تقنيات التسجيل المشبك التصحيحي ، والتي تمكن من تسجيل التغيرات في التدفق الأيوني للغشاء القاعدي بسبب تفاعلات الجسيمات النانوية. ونتيجة لذلك، يمكن للبروتوكول الحالي أن يتناقض مع التغيرات في موصلية الأغشية بواسطة شبكات الجيل التالي المقيدة التي تتحمس لأشعة الليزر التي تكون قوتها منخفضة إلى 135 nW/μm2.
يوفر النظام المعروض هنا طريقة حساسة وقابلة للاستنساخ لتحديد معلمات الليزر الدقيقة وحجم الجسيمات وطلاء الجسيمات والتركيب اللازم لتصميم وتطوير العلاجات الحرارية. وهذا أمر بالغ الأهمية لصقل العلاجات الحرارية الضوئية الناشئة، فضلا عن تقديم معلومات قيمة للآليات التفصيلية لنقل الحرارة داخل النظم البيولوجية. ويستند البروتوكول المقدم على العمل المنشور سابقا19. وفيما يلي مخطط تفصيلي للبروتوكول: يعرف القسم الأول تشكيل TBLM؛ أما الجزء الأول فيحدد تشكيل TBLM؛ أما الجزء الأول فيحدد تشكيل البروتوكولات. يوضح القسم الثاني كيفية إنشاء الإعداد ومحاذاة مصدر ليزر الإثارة؛ يوضح المقطع الأخير كيفية استخراج المعلومات من بيانات التحليل الطيفي للمعاوقة الكهربائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tBLMs إعداد الأقطاب الكهربائية
- إعداد أول طلاء أحادي الطبقة
- تزج حديثا منقوشة الذهب القطب المجهر الشريحة في محلول الإيثانول تتألف من 3 M 1:9 نسبة البنزيل-ديسولفيد-رباعي-إيثيلينغليكول-OH "فاصل" جزيئات (البنزيل disulfide تتألف من أربعة أكسجين-إيثيلين غليكول فاصل, أنهيت مع مجموعة OH) وبنزويل-ديسولفيد (رباعي إيثيلينغليكول) ن = 2 C20-فيتانيل "المربوطة" جزيئات. وهذا يخلق طبقة الطلاء الأولى التي يمكن أن ترتكز على طبقة ثنائية.
ملاحظة: يرصد القطب الذهب عن طريق تبخر 100 نانومتر, 99.9995٪ الذهب (5n5 الذهب) الفيلم على مخصص 25 مم × 75 مم شرائح البولي20. - احتضان الأقطاب الكهربائية مع الطبقة الأولى في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل.
- شطف الأقطاب الكهربائية الذهب عن طريق الانغماس في كميات وفيرة من الإيثانول النقي أكثر من 30 ق.
- استخدم شريحة القطب الذهبي مع الطبقة الأحادية الأولى مباشرة للخطوة التالية أو قم بتخزينها في جرة مليئة بالإيثانول النقي.
- ملاحظة: لضمان سلامة الطبقة الأولى، قم بتصغير أي اتصال مباشر إلى الأجزاء الذهبية من الشريحة
- تزج حديثا منقوشة الذهب القطب المجهر الشريحة في محلول الإيثانول تتألف من 3 M 1:9 نسبة البنزيل-ديسولفيد-رباعي-إيثيلينغليكول-OH "فاصل" جزيئات (البنزيل disulfide تتألف من أربعة أكسجين-إيثيلين غليكول فاصل, أنهيت مع مجموعة OH) وبنزويل-ديسولفيد (رباعي إيثيلينغليكول) ن = 2 C20-فيتانيل "المربوطة" جزيئات. وهذا يخلق طبقة الطلاء الأولى التي يمكن أن ترتكز على طبقة ثنائية.
- تجميع الشريحة المغلفة أحادية الطبقة الأولى
- تقلع بعناية واحدة قطب الذهب coplanar الشريحة من الحاوية باستخدام ملاقط، مع التأكد من عدم إجراء اتصال مع المناطق المنقوشة حيث سيتم تشكيل tBLMs.
ملاحظة: يجب الانتباه إلى تحديد جانب الشريحة التي يتم إيداع الذهب عليها. - الهواء الجاف الشريحة لمدة 1- 2 دقيقة في لإزالة أي الإيثانول المتبقية.
- ضع قطبا ذهبيا فوق سطح جاف ، وتأكد من توجيه القطب الذهبي بشكل صحيح مع سطح ذهبي منقوش مواجه لأعلى.
- قشر غطاء طبقة لاصقة شفافة من صفح رقيقة ومكان على 6 قنوات لتحديد كل بئر.
- استخدم بكرة ضغط لتحرير أي هواء بين الشريحة وطبقة لاصقة شفافة، كما هو موضح في الشكل 1A.
ملاحظة: الوقت المطلوب لهذه الخطوة سوف تحتاج إلى تحسين بواسطة الباحث. في هذا البروتوكول، تتراوح الأوقات من 2-3 دقائق. - أعرض في أقرب وقت ممكن عمليا (في غضون 1-2 دقيقة) ثنائي الدهون الثانية إلى القطب المغلفة أحادية الطبقة الأولى تجميعها للتجميع الذاتي لتجنب إتلاف الطبقة الأولى.
- تقلع بعناية واحدة قطب الذهب coplanar الشريحة من الحاوية باستخدام ملاقط، مع التأكد من عدم إجراء اتصال مع المناطق المنقوشة حيث سيتم تشكيل tBLMs.
- إعداد ثنائية الدهون الثانية
- إضافة 6 ميكرولتر من 3 مل من الدهون ذات الفائدة إلى البئر الأول من الشريحة الآبار الستة. لا تدع حافة طرف micropipette تلمس سطح الذهب، والتي يمكن أن تلحق الضرر الكيمياء المربوطة على القطب الكهربائي.
ملاحظة: يتكون خليط الدهون المستخدمة في هذا العمل من 3 MM 70٪ zwitterionic C20 ثنائي فيتانيل-الأثير-الجليسيرو-فوسفاتيديلكولين (DPEPC) و 30٪ C20 diphytanyldiglyceride الدهون الأثيرية (GDPE) مختلطة مع 3 MM الكوليسترول-PEG-بيوتين في 50:1 نسبة الضرس. - أدخل 6 ميكرولتر من خليط الدهون إلى الآبار الأخرى مع فجوة 10 s بين كل إضافة.
- احتضان كل بئر لمدة 2 دقيقة بالضبط في درجة حرارة الغرفة قبل تبادل خليط الدهون على الأقطاب الكهربائية مع عازلة مثل برنامج تلفزيوني. الفضاء الأوقات لإضافة وتبادل العازلة 10 ق وبصرف النظر حتى يتم احتضان كل بئر مع الدهون لمدة دقيقة 2 بالضبط لكل منهما.
- اغسل 3 مرات أخرى مع 50 ميكرولتر من مخزن PBS المؤقت (درجة الحموضة 7.0). تأكد من ترك 50 ميكرولتر من العازلة على الأقطاب الكهربائية في جميع الأوقات. لا تسمح للأقطاب أن تجف.
ملاحظة: إزاحة المذيبات الإيثانول مع محلول مائي بهذه الطريقة (طريقة تبادل المذيبات)تمكن من تشكيل سريع من ثنائي الطبقة الدهون واحدة راسية على القطب الذهب عن طريق الكيمياء المربوطة.
- إضافة 6 ميكرولتر من 3 مل من الدهون ذات الفائدة إلى البئر الأول من الشريحة الآبار الستة. لا تدع حافة طرف micropipette تلمس سطح الذهب، والتي يمكن أن تلحق الضرر الكيمياء المربوطة على القطب الكهربائي.
- اختبار تشكيل tBLM باستخدام قياسات مطياف المقاومة الكهربائية (EIS)
- أدخل انزلاقا كهربائيا معدا في مطياف مقاومة التيار المتردد (مثل Tethapod). تأكد من توصيل مطياف عبر منفذ USB بجهاز كمبيوتر يعمل بالبرنامج.
- افتح البرنامج، وانقر فوق الإعداد وافتح الأجهزة.
- تعيين إعدادات الأجهزة لاستخدام 25 mV الذروة إلى الذروة AC الإثارة.
- تعيين الترددات بين 0.1 و 10،000 هرتز مع خطوتين في العقد لتدابير المعاوقة السريعة اضغط موافق.
- انقر فوق القائمة الإعداد ثم افتح طراز.
- استخدم نموذج دائرة مكافئ يصف قطب الربط الذهبي كعنصر مرحلة ثابت في السلسلة مع مقاوم يصف المخزن المؤقت للكهارل وشبكة مقاومة مكثف موازية لوصف الطبقة ثنائية الدهون ، واضغط على موافق.
- اضغط على زر البدء لبدء قياس في الوقت الحقيقي لسعة الغشاء (Cm)ومجرى الغشاء (Gm). يجب أن تكون قيم Cm ل tBLMs النموذجية في نطاق 12.5 nF إلى 15.5 nF للكيمياء المربوطة بنسبة 10٪21،22.
- بعد تشغيل البروتوكول والانتهاء من التجربة، حفظ البيانات.
- كرر القياس مع البئر التالي.
2. إشعاع الليزر
- الإعداد التجريبي
ملاحظة: يتم إعداد النظام المخصص لكل tBLM بشكل جيد بشكل فردي.- إجراء تجارب في صندوق مقاوم للضوء لتقليل الليزر بشكل خطير.
- استخدم جدول البصريات لإعداد التجربة لتقليل الاهتزازات غير المرغوب فيها.
- ضع قارئ المعاوقة ، حيث يتم توصيل الشريحة الذهبية ، على مرحلة XYZ ورفع بحيث يجلس في مسار مصدر الليزر.
- استخدام الخشنة غرامة التركيز المجهرية تستعد للسيطرة على ارتفاع مصدر الليزر لتحقيق الدقة المناسبة.
- استهدف مسار الليزر على طول المحور الطولي لشريحة القطب الكهربائي.
تنبيه: ارتد نظارات السلامة الليزرية المناسبة دائما وحافظ على بروتوكولات سلامة الليزر الجيدة. - السماح الليزر ضبطها المحدد لتحقيق الاستقرار قبل بدء التجربة.
ملاحظة: تخطيطي الإعداد التجريبي موضح في الشكل 2A.
- محاذاة الليزر والذهب الأقطاب الكهربائية
ملاحظة: قبل البدء، قم دائما بتقييم مخرج طاقة الليزر باستخدام مقياس طاقة لضمان توصيل القوة الكهربائية المنخفضة جدا فقط إلى tBLMs.- ضبط إما مسار الليزر أو زاوية القطب بحيث الليزر يمر عبر السائل الذي يغطي القطب ومرئية فقط، بالتساوي، على سطح الذهب.
- ضبط موضع ضوء شعاع الليزر لكل تجربة عن طريق رفع أو خفض مصدر شعاع الليزر باستخدام التعديل الدقيق مع ملاحظة التغيرات في توصيل الغشاء.
- قفل مقبض الباب لتأمين موقف مسار الليزر عندما لا تكون هناك تغييرات التوصيل لوحظ.
ملاحظة: سيتم إنشاء قيم توصيل الأغشية المتزايدة عندما يتفاعل الليزر مع القطب الذهبي الأساسي. ولذلك، من المهم ضبط مسار الليزر بحيث لا يمكن إجراء مثل هذه التفاعلات.
- إعداد العينة
- إعداد محاذاة ضوء شعاع الليزر (حيث لا يوجد أي تغيير في موصلية الغشاء)، كما هو مبين في الشكل 2،الموقف 3.
- إضافة GNPs ذات أهمية (وظيفية أو عارية) إلى المخزن المؤقت PBS التي يتم غمر tBLMs أثناء إيقاف تشغيل الليزر.
- امزج المخزن المؤقت PBS المحيط ب tBLMs برفق ثلاث مرات ، مع الحرص على عدم لمس القطب الكهربائي.
- حضانة لمدة 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تشغيل الليزر لتشعيع العينة، وذلك باستخدام الصحيح محاذاة ضوء شعاع الليزر الموقف كما رأينا في الشكل 2،الموقف 3.
- استخدم التركيبة المناسبة من حجم وشكل وتركيز شبكات الجيل التالي مع الطول الموجي للضوء بالليزر.
ملاحظة: يجب أن يكون شعاع الليزر من الطول الموجي المحدد ثنائيا لتردد الرنين المقابل ل GNP plasmon. - قياس السجل الحالي باستمرار (قياسات في الوقت الحقيقي).
- تنفيذ الخطوات 2.2.1 - 2.3.7 حذف إضافة الناتج القومي الإجمالي لتجارب التحكم.
3. تحليل البيانات الإحصائية وعرضها
- تصدير البيانات إلى جدول بيانات.
- استخراج معلمة التوصيل الغشاء مقابل الوقت.
- استخدم البيانات المسجلة بعد ضبط ضوء شعاع الليزر بالموضع الصحيح وقبل إدخال GNPs.
- تطبيع البيانات عن طريق تقسيم موصل الغشاء المقاس على موصل الغشاء الأساسي.
ملاحظة: هذا يؤكد أن التغيرات النسبية في قيم التوصيل الغشاء التي أثارتها GNPs المشععة المقدمة. - تقديم البيانات كمؤامرات زمنية (محور س) مقابل توصيل الغشاء الطبيعي (المحور ص).
4. التنبؤ بكمية الحرارة الموضعية المتولدة في tBLMs من الجسيمات النانوية المشععة (نموذج التنبؤ الحراري)
- حل مشكلة نقل الإشعاع وفقا لDombrovsky23، من أجل حساب الطاقة الإشعاعية الممتصة في حلول الجسيمات النانوية المشععة.
- حساب توليد الحرارة عن طريق دمج مصدر الحرارة بسبب الإشعاع الممتص في معادلة الطاقة.
ملاحظة: للحصول على شرح مفصل للتحليل العددي لتوليد الحرارة في tBLMs من الجسيمات النانوية المشععة وواجهة الأقطاب النانوية ، راجع 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر الركيزة الذهبية التي يمكن إنشاء tBLMs عليها في الشكل 1. يتم تقديم تخطيطي للإعداد التجريبي في الشكل 2.
مصنوعة أقطاب الذهب Coplanar، كما هو مبين في الشكل 1A،من 25 مم × 75 ملم × 1 مم البولي الركيزة الأساسية مع صفائف الذهب منقوشة. تحدد طبقة لاصقة شفافة غرف القياس الفردية الست. القطب الذهب coplanar يسمح التعرض المباشر للضوء الليزر لغشاء tBLMs. كل بئر من صفيف القطب يحتوي على قطب كهربائي على شكل دائرة العمل (المنطقة: 0.707 سم2)ونصف دائرة على شكل قطب مضاد أو قطب كهربائي coplanar (المنطقة: ~ 0.725 سم2)،والتي تفصلها فجوة من ~ 2 ملم. طبقة لاصقة شفافة يعزل بقية الذهب المودعة من المنحل بالكهرباء السائبة. وعلى النقيض من ذلك، يربط التخطيط الذهبي الأساسي الأقطاب الكهربائية العاملة بالاتصال بالمناطق خارج غرف القياس لتوفير الاتصال الكهربائي بقارئ EIS دون الحاجة إلى قطب كهربائي مرجعي.
يتم محاذاة مسار الليزر بطريقة حيث يتفاعل مع tBLMs وتنتشر من خلال المخزن المؤقت السائل المحيط به ، ولكن ليس من هذا القبيل بحيث يمكن أن تتفاعل مع الركيزة الذهبية الأساسية. يتم تحديد ذلك بسهولة عن طريق رفع أفقي وخفض الليزر حتى يتم تأسيس الموضع الصحيح. هذا الموقف هو فقط في النقطة التي لا يمكن أن يلاحظ أي تغييرات في التوصيل الغشاء. وبالنظر إلى أن tBLMs تتشكل من خلال التعلق بطبقة ركيزة من الذهب السائب ، يبدو من المرجح أن التغيرات في توصيل الأغشية في الموضع 1 و 2 في الشكل 2 هي نتيجة للحرارة الناجمة عن تفاعلات الليزر مع الهياكل النانوية داخل طبقة الذهب السائبة. وهكذا، وذلك باستخدام موقف دقيق من محاذاة شعاع الضوء الأفقي مع التركيز على القضاء على التفاعل بين ضوء الليزر وركيزة الذهب السائبة وجدت تحت tBLMs.
تركيز ضوء الليزر الأفقي مباشرة نحو القطب الذهب يسبب زيادة في التوصيل الغشاء، كما هو معروض في الشكل 2،الموقف 1 و 2. كشف موقع الليزر الدقيق عن اختلاف لا يذكر في تسجيلات توصيل الأغشية خلال فترتي الليزر ON و LASER OFF(الشكل 2B، الموضع 3). وأضيفت عينة الناتج القومي الإجمالي بعد وضع تسجيلات خط الأساس، كما هو مبين في الشكل 2،الموضع 3. إضافة streptavidin-المقترنة 30 نانوية الذهب نانومتر إلى tBLMs التي تحتوي على الكولسترول البيوتينيلات أظهرت فرقا واضحا بين الليزر على وفترات إيقاف، وكذلك بالمقارنة مع الموقف 3، مع زيادات واضحة في سعة التوصيل خلال مرحلة الليزر على(الشكل 2B،الموقف 4).
الشكل 1:التمثيل التخطيطي لنموذج الغشاء الدهني ثنائي الطبقة المربوط (tBLM) على ركيزة ذهبية. (أ) شريحة القطب الذهب Coplanar مع ست آبار، التي حددت في نهاية المطاف بإضافة طبقة لاصقة شفافة رقيقة. (ب) يشمل نموذج TBLM فاصلا (سلاسل جلايكول الإيثيلين المنتهية بمجموعة هيدروكسيل) والجزيئات المربوطة (مجموعات جلايكول الإيثيلين المنتهية بسلسلة فيتانيل الكارهة للماء) إلى سطح الركيزة الذهبية لتشكيل الطبقة الأولى. وتشمل الطبقة الثانية الدهون غير المربوطة. واستند الرقم المعدل على كورنيلوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:توضيح لإعداد المقايسة للمحاذاة والتغيرات المقابلة في توصيل الأغشية قياس عبر tBLMs الناشئة عن إضاءة الليزر ( λ = 530 نانومتر). (أ) ممثل تخطيطي لمختلف المواقف من المحاذاة الأفقية الليزر؛ حيث الموضع 1: شعاع ضوء الليزر محاذاة مع الركيزة الذهبية (عندما تم تشغيل الليزر يشار في الحمراء); موقف 2 ضوء الليزر الأفقي مختلطة مع الغشاء والذهب الركيزة؛ موقف 3 ضوء الليزر تركز على السائل السائبة المحيطة tBLMs; موقف 4 ضوء شعاع الليزر تركز على السائل المحيط tBLMs في وجود streptavidin-اقتران 30 نانومتر كروية GNPs. (ب) تسجيلات التوصيل تطبيع مع مرور الوقت تتوافق مع مواقف المحاذاة المختلفة. المواضع 1 و2 و3 قياسات لمجرى tBLMs في غياب شبكات الجيل التالي، في حين أن الموضع 4 هو قياس التوصيل tBLMs في وجود 30 نانومتر من شبكات الجيل التالي الكروية المترافقة مع العقدية. تم تطبيع قيم توصيل الغشاء إلى القيمة الأولية لمجرى الغشاء عند تكوين tBLMs. تمثل النتائج ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول استخدام نموذج tBLM مع ركيزة قطب كهربائي coplanar بالتزامن مع محاذاة الليزر الأفقي التي تم إعدادها والتي تمكن تسجيل المعاوقة الكهربائية في الوقت الحقيقي استجابة لتشعيع الليزر من الجسيمات النانوية الذهبية. طريقة تسجيل EIS المعروضة هنا يبني قائمة الحد الأدنى من التجارب اللازمة لتوفير تسجيل التغيرات الحالية الأيونية عبر الغشاء، والذي يتوافق مع الحرارة الناتجة عن الليزر المقترن والتفاعل نانوجسيمات الذهب. هناك خطوة حاسمة في هذا البروتوكول ، وهي المحاذاة الدقيقة والدقيقة لمسار الليزر نحو العازلة المحيطة بغشاء الدهون ثنائي الطبقة.
استخدام نموذج tBLM يقدم خصائص الختم الكهربائية المتميزة التي تحاكي خصائص الأغشية الدهنية الطبيعية24. tBLMs توفر أيضا منطقة خزان أيوني مائي بين ركيزة الذهب والغشاء الذي تشكل في وقت لاحق، حيث الجزيئات المربوطة وجزيئ المسافة كان سمك 11 Å25،وكان سمك غشاء الدهون ثنائية الطبقات حوالي 6.5 نانومتر19. هذا يمكن أن توفر مساحة لدمج البروتينات الغشائية، والقنوات الأيونية أو غيرها من جزيئات وظيفية محددة13،22. اختيار 70٪ DPEPC و 30٪ الدهون GDPE يوفر الختم الأمثل للغشاء الدهني ثنائي الطبقات لدراسة الخصائص الكهربائية ل tBLMs باستخدام نظام EIS24. وبالمثل ، فإن إدخال الكوليسترول داخل أغشية الدهون ثنائية الطبقة يحاكي عن كثب أغشية نموذج المحاكاة الحيوية الأصلية. الكوليسترول moieties تحسين استقرار غشاء الدهون ثنائي الطبقات، فضلا عن التقليل من نفاذية الغشاء إلى الأيونات من خلال توفير التعبئة عالية من طبقة ثنائية فوسفوليبيد26،27. الجمع بين tBLMs مع نظام EIS يوفر قياس غير مباشر لنقل الحرارة بين GNPs المشععة والأغشية الدهنية ثنائية الطبقة. علاوة على ذلك، فإن استخدام أقطاب الذهب coplanar في هذا البروتوكول يتيح قياسات EIS في الوقت الحقيقي دون أي تدخل من أقطاب مرجعية أو مضادة.
الذهب في مقياس الجسيمات النانوية له خصائص فيزيائية وبصرية مختلفة عن مجاميع الذهب الأكبر. حجم وشكل الجسيمات النانوية الوصول إلى التوزيع الحيوي، والعمر الدورة الدموية واستيعاب الخلية، حيث الجسيمات النانوية من أحجام وسيطة (20-60 نانومتر) المعرض امتصاص الخلية القصوى، فضلا عن تقديم مساحة سطح عالية إلى نسبة الحجم، مما يسمح لوظيفية لاحقة28،29. يمثل حجم الناتج القومي الإجمالي المنفذ في هذه الدراسة 30 نانومترا أحجاما متوسطة ل GNPs ، في حين كان اختيار الطول الموجي بالليزر وفقا لذروة امتصاص GNPs لتحقيق الإثارة الأكثر كفاءة ، مما يؤدي بالتالي إلى التدفئة. الإضاءة بالليزر من الأسطح الذهبية tBLMs يرفع قمم توصيل الغشاء في مرحلة الليزر ON. ويقترح أن يكون ذلك نتيجة للهياكل النانوية السائبة سطح الذهب التي تتفاعل مع الليزر، والتي من شأنها أن تخفي ظواهر الإنتاج الحراري بعد إضافة GNPs30. للتغلب على ذلك ، يتم إضاءة النهج المطور هنا باستخدام محاذاة الليزر الأفقي عبر واجهة الدهون العازلة ، كما هو موضح في الشكل 2، الموضع 3 و 4.
يمكن تعديل البروتوكولات الموصوفة هنا بسهولة عن طريق تغيير تكوين الدهون في الغشاء لمحاكاة أنواع الخلايا الطبيعية المختلفة ، أو عن طريق تغيير حجم وشكل GNPs المقدمة مثل 100 نانورشين ذهبي نانومتر مع ضوء شعاع الليزر المقابل19. ويمكن بعد ذلك استخدام ذلك لتحديد تأثير الإشعاع المستحث لشبكات الجيل التالي المترجمة على أنواع محددة من الخلايا.
وباختصار، يعمل هذا البروتوكول كمضاء حيوي قوي للكشف لدراسة تفاعلات GNPs المشععة في الموقع مع كيانات غشاء الدهون ثنائية الطبقة النموذجية ذات الأهمية للإجابة على الأسئلة المتعلقة بظواهر نقل الحرارة. وسيساعد ذلك في تطوير علاجات حرارية ضوئية أكثر كفاءة، فضلا عن توفير معلومات قيمة للآليات التفصيلية لنقل الحرارة داخل النظم البيولوجية. ويمكن استخدام هذا النهج كأداة للتنبؤ بمستوى تدمير غشاء الخلية التي يمكن أن تعاني منها هذه الجسيمات النانوية الساخنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عن المصالح المالية التالية / العلاقات الشخصية ، والتي يمكن اعتبارها مصالح منافسة محتملة: البروفيسور بروس كورنيل هو مدير - العلوم والتكنولوجيا في التشخيص الجراحي SDx الأغشية المربوطة Pty. Ltd.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل برنامج اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي (DP150101065) ومركز أبحاث ARC للأجهزة المتكاملة لتحليل المستخدم النهائي عند المستويات المنخفضة (IDEAL) (IH150100028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
| 30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
| Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
| C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
| Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
| Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
| 532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
| tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
| tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
| tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
| 99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |
References
- Her, S., Jaffray, D. A., Allen, C. Gold nanoparticles for applications in cancer radiotherapy: Mechanisms and recent advancements. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 84-101 (2017).
- Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. Journal of Nanoparticle Research. 9 (6), 1109-1124 (2007).
- Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Miller, C. M., Cortie, M. B. A golden bullet? Selective targeting of Toxoplasma gondii tachyzoites using antibody-functionalized gold nanorods. Nano Letters. 7 (12), 3808-3812 (2007).
- Zhang, H. -G., Mehta, K., Cohen, P., Guha, C. Hyperthermia on immune regulation: a temperature's story. Cancer Letters. 271 (2), 191-204 (2008).
- Gobin, A. M., et al. Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy. Nano Letters. 7 (7), 1929-1934 (2007).
- Jackson, J. B., Halas, N. J. Surface-enhanced Raman scattering on tunable plasmonic nanoparticle substrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (52), 17930-17935 (2004).
- Emelianov, S. Y., Li, P. -C., O'Donnell, M. Photoacoustics for molecular imaging and therapy. Physics Today. 62 (8), 34 (2009).
- Dimitriou, N. M., et al. Gold nanoparticles, radiations and the immune system: Current insights into the physical mechanisms and the biological interactions of this new alliance towards cancer therapy. Pharmacology & Therapeutics. 178, 1-17 (2017).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979 (1962).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47 (1), 105-113 (1985).
- Plant, A. L. Supported hybrid bilayer membranes as rugged cell membrane mimics. Langmuir. 15 (15), 5128-5135 (1999).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
- Alghalayini, A., Garcia, A., Berry, T., Cranfield, C. G. The Use of Tethered Bilayer Lipid Membranes to Identify the Mechanisms of Antimicrobial Peptide Interactions with Lipid Bilayers. Antibiotics. 8 (1), 12 (2019).
- Khan, M. S., Dosoky, N. S., Williams, J. D. Engineering lipid bilayer membranes for protein studies. International Journal of Molecular Sciences. 14 (11), 21561-21597 (2013).
- Urban, P., Kirchner, S. R., Mühlbauer, C., Lohmüller, T., Feldmann, J. Reversible control of current across lipid membranes by local heating. Scientific Reports. 6, 22686 (2016).
- Palankar, R., et al. Nanoplasmonically-induced defects in lipid membrane monitored by ion current: transient nanopores versus membrane rupture. Nano Letters. 14 (8), 4273-4279 (2014).
- Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
- Plaksin, M., Shapira, E., Kimmel, E., Shoham, S. Thermal transients excite neurons through universal intramembrane mechanoelectrical effects. Physical Review X. 8 (1), 011043 (2018).
- Alghalayini, A., et al. Real-time monitoring of heat transfer between gold nanoparticles and tethered bilayer lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 183334 (2020).
- Moradi-Monfared, S., Krishnamurthy, V., Cornell, B. A molecular machine biosensor: construction, predictive models and experimental studies. Biosensors and Bioelectronics. 34 (1), 261-266 (2012).
- Hoiles, W., Gupta, R., Cornell, B., Cranfield, C., Krishnamurthy, V. The effect of tethers on artificial cell membranes: A coarse-grained molecular dynamics study. PloS One. 11 (10), 0162790 (2016).
- Cranfield, C. G., et al. Transient potential gradients and impedance measures of tethered bilayer lipid membranes: pore-forming peptide insertion and the effect of electroporation. Biophysical Journal. 106 (1), 182-189 (2014).
- Dombrovsky, L. A. Radiation heat transfer in disperse systems. , Begell House. (1996).
- Cornell, B. A., Braach-Maksvytis, V., King, L., Osman, P. A biosensor that uses ion-channel switches. Nature. 387 (6633), 580 (1997).
- Maccarini, M., et al. Nanostructural determination of a lipid bilayer tethered to a gold substrate. The European Physical Journal E. 39 (12), 123 (2016).
- Beugin-Deroo, S., Ollivon, M., Lesieur, S. Bilayer stability and impermeability of nonionic surfactant vesicles sterically stabilized by PEG-cholesterol conjugates. Journal of Colloid and Interface Science. 202 (2), 324-333 (1998).
- Kendall, J. K., et al. Effect of the Structure of Cholesterol-Based Tethered Bilayer Lipid Membranes on Ionophore Activity. ChemPhysChem. 11 (10), 2191-2198 (2010).
- Jiang, W., Kim, B. Y., Rutka, J. T., Chan, W. C. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent. Nature Nanotechnology. 3 (3), 145 (2008).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Wang, F. X., et al. Surface and bulk contributions to the second-order nonlinear optical response of a gold film. Physical Review B. 80 (23), 233402 (2009).
