Summary
这项工作概述了一项协议，以实现从激光辐照的金纳米粒子到tBLM的热传递的动态、非侵入性监测。该系统结合阻抗光谱，用于实时测量 TBLM 的传导变化，并配有水平聚焦激光束，驱动金纳米粒子照明，用于热生产。
Abstract
在这里，我们报告了一项协议，使用用金电极组装的系绳双层脂质膜（tBLMs）进行电化学，调查辐照金纳米粒子（GNPs）和双层脂质膜之间的热传递。辐照改性GNP，如链球菌素结合的GNP，嵌入含有目标分子（如生物素）的tBLM中。通过使用这种方法，辐照GNP和具有相关实体的双层脂膜之间的传热过程由水平聚焦激光束进行介导。热预测计算模型用于确认 tBLM 中的电化学诱导导电导变化。在所使用的特定条件下，检测热脉冲需要金纳米粒子与膜表面的特定附着，而未绑定的金纳米粒子则无法引起可测量的反应。该技术作为强大的检测生物传感器，可直接用于设计和开发热疗法策略，从而优化激光参数、颗粒大小、粒子涂层和成分。
Introduction
辐照金纳米材料的高温性能为感染和肿瘤提供了一类新的微创、选择性、有针对性的治疗方法。可以用激光加热的纳米粒子被用来选择性地摧毁患病细胞，并为选择性药物输送提供手段。加热质子纳米粒子光热化现象的后果是对细胞膜的损害。流体脂质双层膜被认为是接受此类治疗的细胞特别脆弱的部位，因为内膜蛋白的变性以及膜损伤也可能导致细胞死亡4，因为许多蛋白质在那里维持细胞膜的离子潜在梯度。虽然确定和监测纳米级传热的能力对研究和应用辐照GNP1、5、6、7、评估和理解GNP与生物膜之间的分子相互作用以及嵌入式GNP在生物组织中的激光诱发加热现象的直接后果至关重要， 尚未完全阐明8。因此，彻底了解辐照GNP的体温过高过程仍然是一个挑战。因此，开发一个模拟细胞自然环境的纳米材料电极接口，可以提供一种手段，对生物系统中辐照金纳米粒子的传热特性进行深入研究。
原生细胞膜的复杂性是理解细胞中辐照GNP相互作用的重大挑战之一。已开发出各种人造膜平台，提供接近简单的生物模仿版本的天然脂膜结构和功能，包括，但不限于，黑色脂膜9，支持平面双层膜10，混合双层膜11，聚合物缓冲脂质双层膜12和系绳双层脂膜13。每个人造脂膜模型在模仿天然脂膜方面具有明显的优点和局限性。
本研究利用tBLM模型，将脂质膜涂层电极作为评估金纳米粒子和脂膜相互作用的传感器。基于tBLM的生物传感器检测方案提供了固有的稳定性和灵敏度13作为系绳膜可以自我修复，不像其他系统（如膜形成的补丁夹或脂质体），其中只有少量的膜损伤导致其崩溃15，16，17，18。此外，由于 tBLM 的尺寸为 mm2，因此背景阻抗的幅度比贴片夹式记录技术低，从而能够记录由于纳米粒子相互作用而导致的基底膜离子通量的变化。因此，本协议可以对比受约束的GNP对膜传导的变化，这些GNP是由其功耗低至135 nW/μm2的激光激发的。
此处介绍的系统为确定设计和开发热疗法所需的精确激光参数、粒子大小、粒子涂层和成分提供了一种敏感且可重复的方法。这对改进新兴的光热疗法至关重要，并为生物系统内的详细传热机制提供了有价值的信息。提交的协议是基于先前公布的工作19。协议大纲如下：第一部分定义 tBLM 形成：第二部分概述了如何构建设置和对齐激发激光源：最后一部分说明了如何从电阻抗光谱数据中提取信息。
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Protocol
1. tBLM 电极制备
- 准备第一层单层涂层
- 浸入一个新鲜溅出的金色图案电极显微镜滑动在乙烷溶液中，该溶液由 3 mM 1：9 比例的苯二甲醚- 四乙二醇-OH"垫片"分子（苯二甲醚由四个氧乙二醇垫片组成， 终止与OH组）和苯二硫化物（四乙酰二醇）n=2 C20-植物基"系"分子。这将创建可以固定双层的第一层涂层。
注：金电极通过蒸发100纳米，99.9995%黄金（5n5金）薄膜到定制25毫米x75毫米聚碳酸酯幻灯片20。 - 在室温下用第一层孵化电极至少1小时。
- 通过浸入大量超过30的纯乙醇来冲洗金电极。
- 使用金电极滑梯与第一个单层直接为下一步或存储在一个充满纯乙醇的罐子。
- 注意：为了确保第一层的完整性，请尽量减少与幻灯片黄金部分的任何直接接触
- 浸入一个新鲜溅出的金色图案电极显微镜滑动在乙烷溶液中，该溶液由 3 mM 1：9 比例的苯二甲醚- 四乙二醇-OH"垫片"分子（苯二甲醚由四个氧乙二醇垫片组成， 终止与OH组）和苯二硫化物（四乙酰二醇）n=2 C20-植物基"系"分子。这将创建可以固定双层的第一层涂层。
- 组装第一个单层涂层幻灯片
- 小心地从容器中取出一个胶质金电极滑梯，使用钳子，确保不会与 tBLM 形成的图案区域接触。
注意：注意识别存放黄金的幻灯片的侧面。 - 空气干燥滑梯1 -2分钟，以消除任何残留乙醇。
- 将金电极置于干燥表面，确保金电极正确定位，图案金面朝上。
- 将透明胶粘层盖从薄层压板中剥离，并放置在 6 个通道上以定义每个井。
- 使用压力辊在滑梯和透明粘合层之间释放任何空气，如图1A所示。
注：此步骤所需的时间需要由研究人员优化。在此协议中，时间范围为 2-3 分钟。 - 尽快（在 1-2 分钟内）将第二个脂质双层引入组装的第一层涂层电极进行自组装，以避免损坏第一层。
- 小心地从容器中取出一个胶质金电极滑梯，使用钳子，确保不会与 tBLM 形成的图案区域接触。
- 准备第二脂质双层
- 在六口井滑梯中的第一口井中加入 6 μL 的 3 mM 脂质。不要让微管尖的边缘接触金表面，金表面会损坏电极上的系绳化学。
注：本工作使用的脂质混合物包括3 mM 70% zwitterionic C20 二苯二甲醚-甘油磷酸酯 （DPEPC） 和 30% C20 二苯二甲醚乙醚脂质 （GDPE） 与 3 mM 胆固醇-PEG-Biotin 混合在 50：1 摩尔比。 - 将 6 μL 的脂质混合物引入其他油井，每口油井之间的间隙为 10。
- 在室温下将每口井孵育整整2分钟，然后用PBS等缓冲器将脂质混合物交换到电极上。空间的时间添加和缓冲交换10秒分开，所以每口井孵育与脂质正好2分钟每个。
- 再洗 3 次，用 50 μL 的 PBS 缓冲器 （pH 7.0） 清洗 3 次。请务必在电极上随时留下 50 μL 的缓冲。不要让电极干燥。
注：用这种方式（溶剂交换方法）将乙醇溶剂与溶剂分离，通过系绳化学快速形成固定在金电极上的单脂双层。
- 在六口井滑梯中的第一口井中加入 6 μL 的 3 mM 脂质。不要让微管尖的边缘接触金表面，金表面会损坏电极上的系绳化学。
- 使用电气阻抗光谱 （EIS） 测量测试 tBLM 形成
- 将准备好的电极滑动插入交流阻抗光谱仪（例如 Tethapod）。确保光谱仪通过 USB 端口连接到运行软件的计算机。
- 打开软件，单击设置并打开硬件。
- 设置硬件设置，使用 25 mV 峰值到峰值交流激发。
- 将频率设置在 0.1 到 10，000 Hz 之间，每十年设置两个步骤，用于快速阻抗措施按 OK。
- 单击设置菜单并打开模型。
- 使用等效电路模型，将系绳金电极描述为连续的恒定相位元件，电阻器描述电解质缓冲器和并行电阻电容器网络来描述脂质双层，并按确定。
- 按下"开始"按钮，开始实时测量膜电容 （Cm）和膜传导 （Gm）。Cm值的典型 tBLM 应在 12.5 nF 到 15.5 nF 的范围内为 10% 系绳化学21，22。
- 运行协议并完成实验后，保存数据。
- 用下一口井重复测量。
2.激光照射
- 实验设置
注：为每个 tBLM 单独设置定制系统。- 在防光箱中执行实验，以最大限度地减少激光危险。
- 使用光学表设置实验以减少不必要的振动。
- 将阻抗读器（黄金幻灯片连接在哪里）放在 XYZ 舞台上，并提升使其位于激光源的路径上。
- 使用粗细聚焦微观齿轮控制激光源的高度，达到适当的精度。
- 沿着电极滑梯的纵向轴瞄准激光路径。
注意：始终佩戴合适的激光安全眼镜，保持良好的激光安全规程。 - 在开始实验之前，允许选定的调谐激光器稳定下来。
注：实验设置的示意图在图2A中说明。
- 激光和金电极的对齐
注：在开始之前，请始终使用功率计评估激光功率输出，以确保仅向 tBLM 输送非常低的功率。- 调整激光路径或电极的角度，使激光穿过覆盖电极的液体，在金表面均匀可见。
- 通过在观察膜传导变化的同时，通过微调提高或降低激光束源来调整每个实验的激光束光位置。
- 在没有电导变化时，锁定旋钮以固定激光路径的位置。
注：当激光与底层金电极相互作用时，将产生增加的膜传导值。因此，调整激光路径非常重要，因此不可能进行这种相互作用。
- 样品制备
- 准备激光束光对齐（膜传导没有变化），如图2所示，位置3。
- 将感兴趣的 GNP（功能化或裸露）添加到 PBS 缓冲器中，当激光关闭时，TBLM 会沉浸其中。
- 轻轻混合 TBLM 周围的 PBS 缓冲器三次，小心不要触摸电极。
- 在室温下孵育5-10分钟。
- 将激光打开以照射样品，使用图2、位置3中正确的对齐激光束光位置。
- 使用 GNP 大小、形状和浓度与激光波长的适当组合。
注：设置波长的激光束应耦合到相应的GNP质子共振频率。 - 记录连续测量电流（实时测量）。
- 执行步骤 2.2.1 - 2.3.7，省略控制实验的 GNP 添加。
3.统计数据分析和介绍
- 将数据导出到电子表格中。
- 提取膜传导参数与时间。
- 在以正确位置设置激光束灯后和引入 GNP 之前使用记录的数据。
- 通过将测量的膜导电度除以基线膜导电性来使数据正常化。
注：这证实了引入辐照GNP引起的膜传导值的相对变化。 - 将数据作为时间图（x轴）与规范化膜传导（y轴）。
4.预测从辐照纳米粒子（热预测模型）中TBLM中产生的局部热量量
- 根据多布罗夫斯基23日解决辐射转移问题，以计算辐照纳米粒子溶液中的吸收辐射功率。
- 通过将吸收辐射产生的热源纳入能量方程来计算热量生成。
注：有关辐照纳米粒子和纳米电极界面的tBLM中热生成数值分析的详细解释，请参阅19。
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Representative Results
可以创建 tBLM 的黄金基板显示在图 1中。实验设置的示意图在图2中提出。
如图1A所示，平面金电极由25毫米×75毫米×1毫米聚碳酸酯基底基板制成，并配有图案黄金阵列。透明胶粘层定义了六个单独的测量室。平面金电极允许激光直接照射到tBLMs膜上。电极阵列的每个井都包含一个圆形工作电极（区域：0.707 cm2）和半圆形反极或平面电极（区域：=0.725 cm2），它们由 +2 mm 的间隙隔开。透明胶粘层将沉积的黄金与散装电解质隔离开来。相比之下，底层的黄金布局将工作电极连接到测量室外的接触区域，以提供与 EIS 读取器的电气连接，而无需参考电极。
激光路径与 tBLM 相互作用的方式对齐，并分散在它周围的液体缓冲器中，但无法与底层的金基板相互作用。这很容易通过水平提升和降低激光来确定，直到建立正确的位置。此位置正好在无法观察到膜传导性变化的点。鉴于 tBLM 是由散装黄金基板层的附件形成的，图 2中位置 1 和 2 的膜传导变化很可能是由于激光与溅射散装金层内的纳米结构相互作用产生的热量。因此，使用水平光束对齐的准确位置，重点消除激光与 tBLM 下方散装金基板之间的相互作用。
将水平激光直接聚焦到金电极上会导致膜传导率增加，如图2、位置 1 和 2 所介绍的那样。精确的激光位置显示，在激光开口和激光关闭（图2B，位置3）期间，膜传导记录的变异微乎其微。GNP 样本是在建立基线记录后添加的，如图2 所示，位置 3。在含有生物素胆固醇的 tBLM 中加入链球菌素结合的 30 nm 金纳米粒子表明，激光开和关周期之间以及与位置 3 相比有明显差异，激光 ON 相期间的传导振幅显著增加（图 2B，位置 4）。
图1：金基板上系绳双层脂膜（tBLM）模型的示意图表示。（A）用六口井滑动的胶质金电极滑梯，最终由添加薄透明胶粘层定义。（B） tBLM 模型包括垫片（乙二醇链以羟基组结束）和系绳分子（乙二醇组以疏水植物链结束）系绳到金基板表面，形成第一层。第二层包括非绳带脂质。修改后的数字是根据康奈尔等人24。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：激光照明产生的tBLM对齐和相应测量膜传导变化的测定设置图解（+530纳米）。（A） 水平激光对齐不同位置的示意图表示：位置 1：与金基板对齐的激光束（当激光打开时指示为红色）：位置2 水平激光与膜和金基板混合：位置 3 激光聚焦到 tBLM 周围的散装流体中;位置 4 激光束光聚焦到 tBLM 周围的流体中，在链球形素结合的 30 nm 球形 GNP 的存在下。 （B） 随着时间推移，正常传导记录对应于不同的对齐位置。在没有GNP的情况下，位置 1、2 和 3 测量 tBLM 导电性，而位置 4 是在链球形素结合的 30 nm 球形 GNP 在场的情况下测量 tBLM 导电性。膜传导值在 tBLM 形成时正常化为膜传导的初始值。结果至少代表了三个独立的实验。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议描述了使用tBLM模型与平面电极基板结合水平激光对齐设置，使实时电阻抗记录响应激光照射金纳米粒子。此处介绍的 EIS 记录方法构建了一个最少的实验列表，用于记录整个膜的离子电流变化，这与耦合激光和金纳米粒子相互作用产生的热量相对应。本协议中的关键步骤是激光路径向双层脂膜周围的缓冲器的仔细和精确对齐。
tBLM模型的使用提供了独特的电气密封性能，模仿天然脂膜特征24。tBLM还提供了黄金基板和随后形成的膜之间的水性离子储层区域，其中系绳分子和垫片分子的厚度为11+25，双层脂膜厚度约为6.5纳米19。这可以提供空间，以纳入膜蛋白，离子通道或其他特定的功能化分子13，22。选择70%的DPEPC和30%的GDPE脂质提供了双层脂质膜的最佳密封，以检查tBLM的电气特性使用EIS系统24。同样，双层脂膜内胆固醇的引入也与本地生物仿生模型膜非常相似。胆固醇摩尔提高双层脂膜的稳定性，以及通过提供磷脂双层26，27的高包装，尽量减少膜渗透到离子。将 tBLM 与 EIS 系统相结合，可间接测量辐照 GNP 和双层脂膜之间的热传递。此外，本协议中使用平面金电极可实现实时 EIS 测量，而无需参考或计数器电极的任何干扰。
纳米粒子尺度中的黄金具有与较大的黄金聚合体不同的物理和光学特性。纳米粒子的大小和形状可获得其生物分布、循环寿命和细胞吸收，其中中等大小的纳米粒子（20-60纳米）具有最大的细胞吸收率，并提供了较高的表面积与体积比，从而允许随后的功能化28，29。本研究中实施的 30 纳米 GNP 大小表示中等 GNP 大小，而激光波长选择则根据 GNP 的吸收峰值产生最有效的激发，从而导致加热。tBLM 金表面的激光照明提升了激光 ON 相的膜传导峰值。这被认为是由于与激光相互作用的散装金表面纳米结构的结果，这将掩盖GNP30加入后的热生产现象。为了克服这一点，这里开发的方法GNP通过在脂质缓冲界面上使用水平激光对齐来照明，如图2、位置3和4所示。
这里描述的协议可以通过改变膜的脂质组成来模仿各种自然细胞类型，或者通过改变引入的GNP大小和形状，如100纳米金纳米钦与相应的激光束光19，很容易修改。然后，这可用于确定局部GNP诱导辐射对特定细胞类型的影响。
总之，本协议作为一个强大的检测生物传感器，用于研究原位辐照GNP与感兴趣的双层脂膜实体的相互作用，以回答有关传热现象的问题。这将有助于开发更高效的光热疗法，并为生物系统内的详细传热机制提供有价值的信息。这种方法可以用作预测这些加热纳米粒子所体验的细胞膜破坏程度的工具。
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Disclosures
作者宣布了以下经济利益/个人关系，这可能被视为潜在的竞争利益：布鲁斯·康奈尔教授是外科诊断SDx系绳膜有限公司的科学和技术总监。
Acknowledgments
这项工作得到了澳大利亚研究理事会 （ARC） 发现计划 （DP150101065） 和 ARC 低级最终用户分析集成设备研究中心 （理想） （IH150100028） 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
| 30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
| Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
| C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
| Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
| Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
| 532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
| tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
| tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
| tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
| 99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |
References
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