Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tøjrede Bilayer Lipid Membraner til at overvåge varmeoverførsel mellem Gold Nanopartikler og Lipid Membraner

Published: December 8, 2020 doi: 10.3791/61851
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 1,2, 3, 2,4, 1,2,5
1School of Life Sciences, University of Technology Sydney, 2ARC Research Hub for Integrated Devices for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL), Faculty of Science, University of Technology Sydney, 3School of Mechanical and Manufacturing Engineering, The University of New South Wales, 4Surgical Diagnostics Pty Ltd., 5Institute for Biomedical Materials and Devices, University of Technology Sydney

Summary

Dette arbejde skitserer en protokol for at opnå dynamisk, ikke-invasiv overvågning af varmeoverførsel fra laserbestrålede guld nanopartikler til tBLMs. Systemet kombinerer impedansspektroskopi til realtidsmåling af ledningsændringer på tværs af tBLMs, med en vandret fokuseret laserstråle, der driver guld nanopartikler belysning, til varmeproduktion.

Abstract

Her rapporterer vi en protokol til at undersøge varmeoverførslen mellem bestrålede guld nanopartikler (GNPs) og bilayer lipid membraner ved elektrokemi ved hjælp af tøjret bilayer lipid membraner (tBLMs) samlet på guld elektroder. Bestrålede modificerede GNP'er, såsom streptavidin-konjugerede GNP'er, er indlejret i tBLMs, der indeholder målmolekyler, såsom biotin. Ved at bruge denne tilgang medieres varmeoverførselsprocesserne mellem bestrålede GNP'er og model bilayer lipidmembran med interesseenheder af en vandret fokuseret laserstråle. Den termiske prædiktive beregningsmodel bruges til at bekræfte de elektrokemisk inducerede ledningsændringer i tBLMs. Under de særlige forhold, der blev anvendt, krævede detektering af varmeimpulser specifik fastgørelse af guldnanopartiklerne til membranoverfladen, mens ubundne guldnanopartikler ikke kunne fremkalde et målbart svar. Denne teknik fungerer som en kraftfuld detektion biosensor, som kan udnyttes direkte til design og udvikling af strategier for termiske behandlinger, der tillader optimering af laser parametre, partikelstørrelse, partikelbelægninger og sammensætning.

Introduction

Den hypertermiske ydeevne af bestrålede guld nanomaterialer tilbyder en ny klasse af minimalt invasiv, selektiv, målrettet behandling for infektioner og tumorer1. Ansættelsen af nanopartikler, der kan opvarmes af en laser, er blevet brugt til selektivt at ødelægge syge celler samt give et middel til selektiv lægemiddellevering2,3. En konsekvens af fototermikfænomenerne af opvarmede plasmonic nanopartikler er skader på cellemembranerne. Væsken lipid bilayer membran betragtes som et særligt sårbart sted for celler, der gennemgår sådanne behandlinger, fordi denaturering af iboende membranproteiner samt membranskader også kan føre til celledød4, da mange proteiner er der for at opretholde den ioniske potentielle gradient på tværs af cellemembraner. Selv om evnen til at bestemme og overvåge varmeoverførsel på nanoskalaen er af afgørende interesse for undersøgelse og anvendelse af bestrålede GNP'er1,5,6,7, vurdering og forståelse af de molekylære interaktioner mellem GNP'er og biomembraner samt de direkte konsekvenser af de laserinducerede opvarmningsfænomener af indlejrede GNP'er i biologisk væv, er endnu ikke fuldt belyst8. Derfor er en grundig forståelse af hypertermiprocessen med bestrålede GNP'er fortsat en udfordring. Som sådan kan udviklingen af en nanomaterialeelektrodegrænseflade, der efterligner cellernes naturlige omgivelser, være et middel til at foretage en tilbundsgående undersøgelse af varmeoverførselsegenskaberne for bestrålede guldnanopartikler i biologiske systemer.

Kompleksiteten af indfødte cellemembraner er en af de betydelige udfordringer i forståelsen af de bestrålede GNPs interaktioner i celler. Der har været forskellige kunstige membran platforme udviklet til at give tætte enkle bio-mimetiske versioner af naturlige lipid membran arkitektur og funktionalitet, herunder, men ikke begrænset til, sorte lipid membraner9, understøttet planar bilayer membraner10, hybrid bilayer membraner11, polymer-polstret lipid bilayer membraner12 og tøjret bilayer lipid membraner13. Hver kunstig lipidmembranmodel har klare fordele og begrænsninger med hensyn til at efterligne de naturlige lipidmembraner14.

Denne undersøgelse beskriver anvendelsen af lipidmembranbelagte elektroder som en sensor til vurdering af guldnanopartikler og lipidmembraninteraktioner ved hjælp af tBLM-modellen. Den tBLM-baserede biosensordetekteringsordning giver iboende stabilitet og følsomhed13, da tøjrede membraner kan selvreparere, i modsætning til andre systemer (såsom membraner dannet af patch-clamp eller liposomer), hvor kun en lille mængde membranskader resulterer i deres sammenbrud15,16,17,18. Endvidere, fordi tBLMs er af mm2 dimensioner, baggrunden impedans er størrelsesordener lavere end patch-clamp optagelse teknikker, som muliggør en registrering af ændringer i basal membran ioniske flux på grund af nanopartikler interaktioner. Som et resultat af dette kan den nuværende protokol kontrastændringer i membranledningsevnen ved bundne GNP'er, der er ophidset af lasere, hvis kræfter er så lave som 135 nW /μm2.

Systemet præsenteres her giver en følsom og reproducerbar metode til bestemmelse af præcise laser parametre, partikelstørrelse, partikelbelægninger og sammensætning er nødvendige for at designe og udvikle termiske behandlinger. Dette er afgørende for forfinelsen af nye fototermiske behandlinger samt for at give værdifulde oplysninger til detaljerede mekanismer for varmeoverførsel inden for biologiske systemer. Den præsenterede protokol er baseret på tidligere offentliggjort arbejde19. En oversigt over protokollen er som følger: det første afsnit definerer tBLM-formationen; I det andet afsnit beskrives, hvordan du konstruerer opsætningen og justerer excitationslaserkilden. Det sidste afsnit illustrerer, hvordan du kan udtrække oplysninger fra de elektriske impedansspektroskopidata.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tBLMs elektroder forberedelse

  1. Forberedelse af første monolagsbelægning
    1. Fordyb en frisk sputtered guld mønstret elektrode mikroskop dias i en ethanolisk opløsning bestående af en 3 mM 1:9 forholdet mellem benzyl-disulfid-tetra-ethylenglycol-OH "spacer" molekyler (benzyl disulfid bestående af en fire ilt-ethylenglycol spacer, afsluttet med en OH gruppe) og benzyl-disulfid (tetra-ethylenglycol) n =2 C20-phytanyl "tethered" molekyler. Dette skaber det første lag belægning, som en bilayer kan forankres.
      BEMÆRK: Guldelektroden er lavet ved at fordampe 100 nm, 99,9995% guld (5n5 guld) film på custom 25 mm x 75 mm polycarbonat dias20.
    2. Inkuber elektroder med det første lag ved stuetemperatur i mindst 1 time.
    3. Skyl guldelektroderne ved at nedsænke i rigelige mængder ren ethanol over 30 s.
    4. Brug guldelektrode slide med den første monolayer direkte til næste trin eller opbevares i en krukke fuld af ren ethanol.
    5. BEMÆRK: For at sikre det første lags integritet skal du minimere enhver direkte kontakt til gulddelene af diaset
  2. Samling af den første monolag belagt dias
    1. Tag forsigtigt en coplanar guldelektrode slide fra sin beholder ved hjælp af pincet, og sørg for ikke at komme i kontakt med de mønstrede områder, hvor tBLMs vil danne.
      BEMÆRK: Vær opmærksom på at identificere den side af diaset, som guldet er deponeret på.
    2. Lufttør rutsjebane i 1 - 2 min ind for at fjerne eventuelle resterende ethanol.
    3. Placer guldelektroden over en tør overflade, sørg for, at guldelektroden er korrekt orienteret med mønstret guldoverflade, der vender op.
    4. Skræl det gennemsigtige klæbelagsdæksel fra et tyndt laminat, og placer over de 6 kanaler for at definere hver brønd.
    5. Brug en trykrulle til at frigøre luft mellem diaset og det gennemsigtige klæbelag, som vist i figur 1A.
      BEMÆRK: Den tid, der kræves for dette trin, skal optimeres af forskeren. I denne protokol er tiderne fra 2-3 min.
    6. Indfør så hurtigt som muligt (inden for 1-2 minutter) den anden lipid bilayer til den samlede første monolag belagt elektrode for selvmontering for at undgå at beskadige det første lag.
  3. Forberedelse af anden lipid bilayer
    1. Tilsæt 6 μL af 3 mM lipider af interesse til den første brønd af de seks brønde dias. Lad ikke kanten af mikropipetspidsen røre guldoverfladen, hvilket kan beskadige de tøjrede kemiker på elektroden.
      BEMÆRK: Lipidblandingen, der blev anvendt i dette arbejde, bestod af 3 mM 70% zwitterionisk C20 diphytanyl-ether-glycero-fosphatidylcholin (DPEPC) og 30% C20 diphytanyldiglyceidethher lipider (GDPE) blandet med 3 mM kolesterol-PEG-Biotin i 50:1 molar ratio.
    2. Indfør 6 μL af lipidblandingen til de andre brønde med en 10'er-afstand mellem hver tilsætning.
    3. Inkuber hver brønd i præcis 2 min ved stuetemperatur, før du udskifter lipidblandingen over elektroderne med en buffer som PBS. Plads tiderne for tilsætning og buffer udveksling 10 s fra hinanden, så hver brønd er inkuberet med lipid i præcis 2 min hver.
    4. Vask 3 gange mere med 50 μL PBS buffer (pH 7.0). Sørg for at lade 50 μL buffer over elektroderne hele tiden. Lad ikke elektroderne tørre.
      BEMÆRK: Fortrængning af ethanolopløsningsmidlet med den vandige opløsning på denne måde (opløsningsmiddeludvekslingsmetoden)muliggør hurtig dannelse af en enkelt lipid-bilayer, der er forankret til guldelektroden via de tøjrede kemiker.
  4. Test af tBLM-formation ved hjælp af EIS-målinger (Electrical Impedance spektroskopi)
    1. Indsæt forberedt elektrode slide i en AC impedans spektrometer (f.eks Tethapod). Sørg for, at spektrometeret er tilsluttet via en USB-port til en computer, der kører softwaren.
    2. Åbn softwaren, klik på Installation, og åbn Hardware.
    3. Indstil hardwareindstillingerne til at bruge 25 mV-top-til-spids-ac-excitation.
    4. Indstil frekvenser mellem 0,1 og 10.000 Hz med to trin pr årti for hurtig impedans foranstaltninger tryk ok.
    5. Klik på menuen Opsætning , og åbn Model.
    6. Brug en tilsvarende kredsløbsmodel, der beskriver den tøjrende guldelektrode som et konstant faseelement i serie med en modstand, der beskriver elektrolytbufferen og et parallelt modstandskondensatornetværk til at beskrive lipid-bilayeren, og tryk på OK.
    7. Tryk på knappen Start for at starte en realtidsmåling af membrankapacitans (Cm)og membranledning (Gm). Cm-værdier for typiske tBLMs bør ligge mellem 12,5 og 15,5 nF for 10 % tøjredekemiker 21,22.
    8. Når du har kørt protokollen og afsluttet eksperimentet, skal du gemme dataene.
    9. Gentag målingen med den næste brønd.

2. Laserbestråling

  1. Eksperimentel opsætning
    BEMÆRK: Det skræddersyede system er konfigureret for hver tBLM godt individuelt.
    1. Udfør eksperimenter i en lyssikker boks for at minimere laser farligt.
    2. Brug en optiktabel til at konfigurere eksperimentet for at reducere uønskede vibrationer.
    3. Placer impedans læseren, hvor er guld dias er forbundet, på en XYZ fase og hæve sådan, at det sidder i vejen for laserkilden.
    4. Brug grovfin fokus på mikroskopisk gearing til at styre laserkildens højde for at opnå den rette præcision.
    5. Målret laserstien langs elektrodediasens langsgående akse.
      FORSIGTIG: Brug altid passende lasersikkerhedsbriller, og vedligehold gode lasersikkerhedsprotokoller.
    6. Lad den valgte indstillede laser stabilisere sig, før eksperimentet startes.
      BEMÆRK: Et skema over forsøgsopsætningen er illustreret i figur 2A.
  2. Justering af laser- og guldelektroder
    BEMÆRK: Før du begynder, skal du altid vurdere lasereffekten ved hjælp af en effektmåler for at sikre, at der kun leveres meget lave watt til tBLMs.
    1. Juster enten laservejen eller elektrodens vinkel, så laseren passerer gennem væsken, der dækker elektroden, og er lige synlig, jævnt, på guldoverfladen.
    2. Juster laserstrålens lysposition for hvert eksperiment ved at hæve eller sænke laserstrålekilden ved hjælp af finjusteringen, mens du observerer ændringer i membranledningsevnen.
    3. Lås knappen for at sikre placeringen af laservejen, når der ikke observeres nogen ledningsændringer.
      BEMÆRK: Der genereres øgede membranledningsværdier, når laseren interagerer med den underliggende guldelektrode. Det er derfor vigtigt at justere laserstien, så sådanne interaktioner ikke er mulige.
  3. Prøveforberedelse
    1. Klargør justeringen af laserstrålelyset (hvor der ikke er nogen ændring i membranledning), som vist i figur 2, position 3.
    2. Føj GNP'er af interesse (funktionaliseret eller bar) til PBS-bufferen, hvor tBLMs er nedsænket, mens laseren slukkes.
    3. Bland PBS bufferen omkring tBLMs forsigtigt tre gange, og pas på ikke at røre elektroden.
    4. Inkuber i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
    5. Tænd laseren for at bestråle prøven ved hjælp af den korrekte justerede laserstrålelysposition som det ses i figur 2, position 3.
    6. Brug den passende kombination af GNP'ers størrelse, form og koncentration med laserlysbølgelængde.
      BEMÆRK: Laserstrålen af sæt bølgelængde bør parre til den tilsvarende BNI plasmon resonans frekvens.
    7. Registrer målt strøm kontinuerligt (realtidsmålinger).
    8. 2.2.1 - 2.3.7, uden at BNI tilser til kontrolforsøgene.

3. Statistisk dataanalyse og præsentation

  1. Eksporter dataene til et regneark.
  2. Udtræk membranledningsparameteren i forhold til tiden.
  3. Brug de registrerede data efter indstilling af et laserstrålelys med den rigtige position og før INTRODUKTION AF GNPs.
  4. Normalisere data ved at dividere den målte membranledning over baseline membranledning.
    BEMÆRK: Dette bekræfter, at relative ændringer i membranledningsværdierne fremkaldt af inkrerede bestrålede GNP'er.
  5. Præsenter data som tidsplotter (x-akse) i forhold til normaliseret membranledning (y-akse).

4. Forudsige mængden af lokaliseret varme, der genereres i tBLMs fra bestrålede nanopartikler (termisk forudsigende model)

  1. Løs strålingsoverførselsproblemet ifølge Dombrovsky23, for at beregne absorberet strålingskraft i bestrålede nanopartikler.
  2. Beregn varmeproduktionen ved at indarbejde varmekilden på grund af absorberet stråling i energiligningen.
    BEMÆRK: For en detaljeret forklaring af den numeriske analyse af varmeproduktionen i tBLMs fra bestrålede nanopartikler og nanomateriale-elektrode interface, henvises til 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det guldsubstrat, som tBLMs kan oprettes på, er vist i figur 1. Et skema over forsøgsopsætningen vises i figur 2.

Coplanar guldelektroder, som vist i figur 1A, er lavet af 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonatbasesubstrat med mønstrede guld arrays. Et gennemsigtigt klæbelag definerer de seks individuelle målekamre. Coplanar guld elektroden tillader direkte eksponering af laserlys til tBLMs membran. Hver brønd af elektrode array indeholder en cirkelformet arbejdselektrode (område: 0,707 cm2) og halvcirkelformet counter elektrode eller coplanar elektrode (område: ~ 0,725 cm2), som er adskilt af et hul på ~ 2 mm. Det gennemsigtige klæbelag isolerer resten af det deponerede guld fra bulkelektrolytten. I modsætning hertil forbinder det underliggende guldlayout arbejdselektroderne med kontaktområder uden for målekamrene for at give den elektriske forbindelse til EIS-læseren uden behov for en referenceelektrode.

Laserstien er justeret på en måde, hvor den interagerer med tBLMs og spredes gennem væskebufferen omkring den, men ikke sådan, at den kan interagere med det underliggende guldsubstrat. Dette bestemmes let via vandret hævning og sænkning af laseren, indtil den korrekte position er etableret. Denne position er lige på det punkt, hvor ingen ændringer i membranledning kan observeres. Da tBLMs er dannet ved fastgørelse til et substratlag af bulkguld, forekommer det sandsynligt, at ændringerne i membranledningsevnen ved position 1 og 2 i figur 2 er et resultat af varme fra laserinteraktioner med nanostrukturer i det sputterede bulkguldlag. Således ved hjælp af den nøjagtige position af vandret lysstråle justering med fokus på at eliminere samspillet mellem laserlys og bulk guld substrat findes under tBLMs.

Hvis det vandrette laserlys fokuseres direkte mod guldelektroden, øges membranens ledningsevne, som vist i figur 2, position 1 og 2. Den præcise laserposition afslørede ubetydelig variation i membranledningsoptagelserne i begge perioder med laser ON og laser OFF (Figur 2B, position 3). BNI-stikprøven blev tilføjet efter fastsættelse af basisregistreringer, som vist i figur 2, position 3. Tilsætning af strøppeavidin-konjugeret 30 nm guld nanopartikler til tBLMs, der indeholdt biotinyleret kolesterol viste en klar forskel mellem laser ON og OFF perioder, samt i forhold til position 3, med tydelige stigninger i ledningsstyrke i laser ON fase (Figur 2B, position 4).

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af den tøjrede bilayer lipidmembran (tBLM) model på et guldsubstrat. (A) Coplanar guld elektrode slide med seks brønde, i sidste ende defineret ved tilsætning af en tynd gennemsigtig klæbemiddel lag. (B) TBLM-modellen består af spacer (ethylenglykolkæder, der sluttede med en hydroxylgruppe) og tøjrede molekyler (ethylenglykolgrupper, der sluttede med hydrofobiske fylylkæde) tethers til guldsubstratoverfladen for at danne det første lag. Det andet lag omfatter de ikke-tøjrede lipider. Det ændrede tal var baseret på Cornell et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Illustration af analyseopsætningen til justering og tilsvarende målemembranledningsændringer på tværs af tBLMs som følge af laserbelysning ( λ = 530 nm). (A) Skematisk repræsentant for de forskellige positioner for vandret laserjustering hvor position 1: laserlysstrålen, der er justeret med guldsubstratet (når laseren blev tændt, er angivet med rødt) position 2 det vandrette laserlys blandet med membran og guldsubstrat position 3 laserlys fokuseret ind i bulkvæsken omkring tBLMs; Position 4 laserstrålelys fokuseret ind i væsken omkring tBLMs i nærværelse af streptavidin-konjugeret 30 nm sfæriske GNPs. (B) Normaliserede ledningsoptagelser over tid svarer til de forskellige tilpasningspositioner. Positions 1, 2 og 3 målinger af tBLMs-ledningsevne i mangel af GNP'er, mens position 4 er en måling af tBLMs-ledningsevne i nærværelse af streptavidin-konjugerede 30 nm sfæriske GNP'er. Membranledningsværdierne blev normaliseret til den oprindelige værdi af membranledning ved tBLMs dannelse. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver brugen af tBLM-model med et coplanar elektrodesubstrat i forbindelse med en vandret laserjustering, der er oprettet, der muliggør realtids elektrisk impedansregistrering som reaktion på laserbestråling af guldnanopartikler. Metoden til EIS-optagelse, der præsenteres her, konstruerer en minimal liste over eksperimenter, der er nødvendige for at give registrering af ionstrømsændringer på tværs af membranen, hvilket svarer til den varme, der genereres af den koblede laser- og guldnanopartiklers interaktion. Der er et kritisk skridt i denne protokol, som er den omhyggelige og præcise justering af laservejen mod bufferen omkring bilayer lipidmembran.

Brugen af tBLM-modellen tilbyder forskellige elektriske tætningsegenskaber, der efterligner naturlige lipidmembraner egenskaber24. tBLMs giver også en vandig ionisk reservoir region mellem guld substratet og den efterfølgende dannede membran, hvor de tøjrede molekyler og spacer molekylet havde en tykkelse på 11 Å25, og bilayer lipid membran tykkelse var omkring 6,5 nm19. Dette kan give plads til at indarbejde membranproteiner, ionkanaler eller andre specifikke funktionaliserede molekyler13,22. Udvælgelsen af 70 % DPEPC og 30 % GDPE lipider giver optimal forsegling af bilayer lipidmembran for at undersøge tBLMs elektriske egenskaber ved hjælp af EIS-system24. Ligeledes, indførelsen af kolesterol i bilayer lipid membraner nøje efterligner indfødte biomimetiske model membraner. Kolesterol moieties forbedre bilayer lipid membran stabilitet, samt minimere membranen permeabilitet til ioner ved at give høj pakning af fosfolipid bilayer26,27. Ved at kombinere tBLMs med EIS-systemet giver indirekte måling af varmeoverførsel mellem bestrålede GNP'er og bilayer lipidmembraner. Desuden muliggør brugen af coplanarguldelektroder i denne protokol EIS-målinger i realtid uden indblanding fra reference- eller kontraelektroder.

Guld i nanopartikler skalaen har forskellige fysiske og optiske egenskaber til større guld aggregater. Nanopartiklernes størrelse og form får adgang til deres biofordeling, cirkulationslevetid og celleoptagelse, hvor nanopartikler i mellemstørrelser (20-60 nm) udviser maksimal celleoptagelse samt giver et højt areal til volumen-forhold, hvilket giver mulighed for efterfølgende funktionalisering28,29. Den implementerede 30 nm BNI-størrelse i denne undersøgelse repræsenterede mellemliggende GNP'er, mens valget af laserbølgelængde var i henhold til absorptionstoppen for GNP'er for at give den mest effektive excitation, hvilket derfor fører til opvarmning. Laserbelysningen af tBLMs guldoverflader løfter membranledningstoppene i laser ON-fasen. Dette foreslås at være som et resultat af bulk guld overflade nanostrukturer, der interagerer med laseren, som ville maskere varmeproduktion fænomener efter tilføjelsen af GNPs30. For at overvinde dette belyses den udviklede tilgang her GNP'er ved hjælp af vandret laserjustering på tværs af lipidbuffergrænsefladen, som illustreret i figur 2, position 3 og 4.

De protokoller, der er beskrevet her, kan ændres let ved at ændre membranens lipidsammensætning for at efterligne forskellige naturlige celletyper eller ved at ændre de indførte GNPs størrelse og form som 100 nm guld nanourchins med det tilsvarende laserstrålelys19. Dette kan derefter bruges til at bestemme virkningen af lokaliserede GNPs induceret stråling på specifikke celletyper.

Sammenfattende fungerer denne protokol som en robust detektionsbiosensor til at studere interaktioner mellem in situ bestrålede GNP'er med model bilayer lipidmembranenheder af interesse for at besvare spørgsmål om varmeoverførselsfænomener. Dette vil bidrage til at udvikle mere effektive fototermiske behandlinger samt give værdifulde oplysninger til detaljerede mekanismer for varmeoverførsel inden for biologiske systemer. Denne tilgang kan bruges som et værktøj til forudsigelse af niveauet af cellemembran ødelæggelse, der kan opleves af disse opvarmede nanopartikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer følgende finansielle interesser / personlige relationer, som kan betragtes som potentielle konkurrerende interesser: Prof Bruce Cornell er direktør - Videnskab og teknologi på Kirurgisk Diagnostik SDx tøjret membraner Pty. Ltd.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Australian Research Council (ARC) Discovery Program (DP150101065) og ARC Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles Cytodiagnostics AC-30-04-05 This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles Sigma-Aldrich 753629 This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) NANOCS PG2-BNCS-10k Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S1 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl  SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Tethered molecules
532 nm green laser continuous light OBIS LS/OBIS CORE LS, China ND-1000 The power of this laser was ~135 mW 
tethaPod EIS reader SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-R1 A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-BG Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-A1 Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-T10 Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% 
tethaQuick software SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-B1 Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
 99.9% Pure ethanol Sigma-Aldrich  34963 Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 pH 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Her, S., Jaffray, D. A., Allen, C. Gold nanoparticles for applications in cancer radiotherapy: Mechanisms and recent advancements. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 84-101 (2017).
  2. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. Journal of Nanoparticle Research. 9 (6), 1109-1124 (2007).
  3. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Miller, C. M., Cortie, M. B. A golden bullet? Selective targeting of Toxoplasma gondii tachyzoites using antibody-functionalized gold nanorods. Nano Letters. 7 (12), 3808-3812 (2007).
  4. Zhang, H. -G., Mehta, K., Cohen, P., Guha, C. Hyperthermia on immune regulation: a temperature's story. Cancer Letters. 271 (2), 191-204 (2008).
  5. Gobin, A. M., et al. Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy. Nano Letters. 7 (7), 1929-1934 (2007).
  6. Jackson, J. B., Halas, N. J. Surface-enhanced Raman scattering on tunable plasmonic nanoparticle substrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (52), 17930-17935 (2004).
  7. Emelianov, S. Y., Li, P. -C., O'Donnell, M. Photoacoustics for molecular imaging and therapy. Physics Today. 62 (8), 34 (2009).
  8. Dimitriou, N. M., et al. Gold nanoparticles, radiations and the immune system: Current insights into the physical mechanisms and the biological interactions of this new alliance towards cancer therapy. Pharmacology & Therapeutics. 178, 1-17 (2017).
  9. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979 (1962).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47 (1), 105-113 (1985).
  11. Plant, A. L. Supported hybrid bilayer membranes as rugged cell membrane mimics. Langmuir. 15 (15), 5128-5135 (1999).
  12. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  13. Alghalayini, A., Garcia, A., Berry, T., Cranfield, C. G. The Use of Tethered Bilayer Lipid Membranes to Identify the Mechanisms of Antimicrobial Peptide Interactions with Lipid Bilayers. Antibiotics. 8 (1), 12 (2019).
  14. Khan, M. S., Dosoky, N. S., Williams, J. D. Engineering lipid bilayer membranes for protein studies. International Journal of Molecular Sciences. 14 (11), 21561-21597 (2013).
  15. Urban, P., Kirchner, S. R., Mühlbauer, C., Lohmüller, T., Feldmann, J. Reversible control of current across lipid membranes by local heating. Scientific Reports. 6, 22686 (2016).
  16. Palankar, R., et al. Nanoplasmonically-induced defects in lipid membrane monitored by ion current: transient nanopores versus membrane rupture. Nano Letters. 14 (8), 4273-4279 (2014).
  17. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  18. Plaksin, M., Shapira, E., Kimmel, E., Shoham, S. Thermal transients excite neurons through universal intramembrane mechanoelectrical effects. Physical Review X. 8 (1), 011043 (2018).
  19. Alghalayini, A., et al. Real-time monitoring of heat transfer between gold nanoparticles and tethered bilayer lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 183334 (2020).
  20. Moradi-Monfared, S., Krishnamurthy, V., Cornell, B. A molecular machine biosensor: construction, predictive models and experimental studies. Biosensors and Bioelectronics. 34 (1), 261-266 (2012).
  21. Hoiles, W., Gupta, R., Cornell, B., Cranfield, C., Krishnamurthy, V. The effect of tethers on artificial cell membranes: A coarse-grained molecular dynamics study. PloS One. 11 (10), 0162790 (2016).
  22. Cranfield, C. G., et al. Transient potential gradients and impedance measures of tethered bilayer lipid membranes: pore-forming peptide insertion and the effect of electroporation. Biophysical Journal. 106 (1), 182-189 (2014).
  23. Dombrovsky, L. A. Radiation heat transfer in disperse systems. , Begell House. (1996).
  24. Cornell, B. A., Braach-Maksvytis, V., King, L., Osman, P. A biosensor that uses ion-channel switches. Nature. 387 (6633), 580 (1997).
  25. Maccarini, M., et al. Nanostructural determination of a lipid bilayer tethered to a gold substrate. The European Physical Journal E. 39 (12), 123 (2016).
  26. Beugin-Deroo, S., Ollivon, M., Lesieur, S. Bilayer stability and impermeability of nonionic surfactant vesicles sterically stabilized by PEG-cholesterol conjugates. Journal of Colloid and Interface Science. 202 (2), 324-333 (1998).
  27. Kendall, J. K., et al. Effect of the Structure of Cholesterol-Based Tethered Bilayer Lipid Membranes on Ionophore Activity. ChemPhysChem. 11 (10), 2191-2198 (2010).
  28. Jiang, W., Kim, B. Y., Rutka, J. T., Chan, W. C. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent. Nature Nanotechnology. 3 (3), 145 (2008).
  29. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  30. Wang, F. X., et al. Surface and bulk contributions to the second-order nonlinear optical response of a gold film. Physical Review B. 80 (23), 233402 (2009).

Tags

Biologi Tøjret bilayer lipid membraner (tBLMs) Biosensor Guld nanopartikler Laser Varmeoverførsel Membran dynamik
Tøjrede Bilayer Lipid Membraner til at overvåge varmeoverførsel mellem Gold Nanopartikler og Lipid Membraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X.,… More

Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X., Yeoh, G. H., Cranfield, C. G., Timchenko, V., Cornell, B. A., Valenzuela, S. M. Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (166), e61851, doi:10.3791/61851 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter