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Biology

Membranes lipidiques bicouches attachées pour surveiller le transfert de chaleur entre les nanoparticules d’or et les membranes lipidiques

Published: December 8, 2020 doi: 10.3791/61851
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 1,2, 3, 2,4, 1,2,5
1School of Life Sciences, University of Technology Sydney, 2ARC Research Hub for Integrated Devices for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL), Faculty of Science, University of Technology Sydney, 3School of Mechanical and Manufacturing Engineering, The University of New South Wales, 4Surgical Diagnostics Pty Ltd., 5Institute for Biomedical Materials and Devices, University of Technology Sydney

Summary

Ce travail décrit un protocole permettant de réaliser une surveillance dynamique et non invasive du transfert de chaleur des nanoparticules d’or irradiées au laser vers les tBLM. Le système combine la spectroscopie d’impédance pour la mesure en temps réel des changements de conductance à travers les tBLM, avec un faisceau laser focalisé horizontalement qui entraîne l’éclairage des nanoparticules d’or, pour la production de chaleur.

Abstract

Nous rapportons ici un protocole pour étudier le transfert de chaleur entre les nanoparticules d’or irradiées (PNB) et les membranes lipidiques bicouches par électrochimie à l’aide de membranes lipidiques bicouches attachées (tBLM) assemblées sur des électrodes en or. Les GNP modifiés irradiés, tels que les GNP conjugués à la streptavidine, sont incorporés dans des tBLM contenant des molécules cibles, telles que la biotine. En utilisant cette approche, les processus de transfert de chaleur entre les PNB irradiés et la membrane lipidique bicouche modèle avec des entités d’intérêt sont médiés par un faisceau laser focalisé horizontalement. Le modèle de calcul prédictif thermique est utilisé pour confirmer les changements de conductance induits électrochimiquement dans les tBLM. Dans les conditions spécifiques utilisées, la détection des impulsions de chaleur nécessitait une fixation spécifique des nanoparticules d’or à la surface de la membrane, tandis que les nanoparticules d’or non liées ne paraissaient pas à provoquer une réponse mesurable. Cette technique sert de biocapteur de détection puissant qui peut être directement utilisé pour la conception et le développement de stratégies de thérapies thermiques qui permettent d’optimiser les paramètres laser, la taille des particules, les revêtements de particules et la composition.

Introduction

La performance hyperthermique des nanomatériaux d’or irradiés offre une nouvelle classe de traitement mini-invasif, sélectif et ciblé pour les infections et les tumeurs1. L’utilisation de nanoparticules pouvant être chauffées par un laser a été utilisée pour détruire sélectivement les cellules malades ainsi que pour fournir un moyen d’administration sélective demédicaments 2,3. Une conséquence des phénomènes de photothermolyse des nanoparticules plasmoniques chauffées est l’endommagement des membranes cellulaires. La membrane bicouche lipidique fluide est considérée comme un site particulièrement vulnérable pour les cellules subissant de tels traitements, car la dénaturation des protéines membranaires intrinsèques ainsi que les dommages membranaires peuvent également entraîner la mort cellulaire4,car de nombreuses protéines sont là pour maintenir le gradient de potentiel ionique à travers les membranes cellulaires. Alors que la capacité de déterminer et de surveiller le transfert de chaleur à l’échelle nanométrique est d’un intérêt clé pour l’étude et l’application des GNP irradiés1,5,6,7, l’évaluation et la compréhension des interactions moléculaires entre les GNP et les bio-membranes, ainsi que les conséquences directes des phénomènes de chauffage induits par laser des GNP incorporés dans les tissus biologiques, n’ont pas encore été entièrement élucidés8. Par conséquent, une compréhension approfondie du processus d’hyperthermie des GNP irradiés reste un défi. En tant que tel, le développement d’une interface nanomatériau-électrode qui imite l’environnement naturel des cellules pourrait fournir un moyen d’entreprendre une étude approfondie des caractéristiques de transfert de chaleur des nanoparticules d’or irradiées dans les systèmes biologiques.

La complexité des membranes cellulaires natives est l’un des défis importants dans la compréhension des interactions PNB irradiés dans les cellules. Diverses plates-formes de membranes artificielles ont été développées pour fournir des versions bio-mimétiques simples de l’architecture et de la fonctionnalité des membranes lipidiques naturelles, y compris, mais sans s’y limiter, les membranes lipidiques noires9,les membranes bicouches planes supportées10,les membranes bicouches hybrides11,les membranes bicouches lipidiques amorties par polymère12 et les membranes lipidiques bicouches attachées13. Chaque modèle de membrane lipidique artificielle présente des avantages et des limites distincts en ce qui concerne l’imitation des membranes lipidiques naturelles14.

Cette étude décrit l’utilisation d’électrodes revêtues de membrane lipidique comme capteur pour évaluer les interactions entre les nanoparticules d’or et les membranes lipidiques, à l’aide du modèle tBLM. Le schéma de détection de biocapteurs basé sur le tBLM offre une stabilité et une sensibilité inhérentes13 car les membranes attachées peuvent s’auto-réparer, contrairement à d’autres systèmes (tels que les membranes formées par patch-clamp ou liposomes) dans lesquels seule une petite quantité de dommages membranaires entraîne leur effondrement15,16,17,18. De plus, comme les tBLM sont de dimensions mm2, l’impédance de fond est inférieure d’un ordre de grandeur aux techniques d’enregistrement patch-clamp, ce qui permet d’enregistrer les changements dans le flux ionique de la membrane basale dus aux interactions entre nanoparticules. En conséquence, le protocole actuel peut contraster les changements de conductance membranaire par des PNB liés qui sont excités par des lasers dont les puissances sont aussi faibles que 135 nW / μm2.

Le système présenté ici fournit une méthode sensible et reproductible pour déterminer des paramètres laser précis, la taille des particules, les revêtements de particules et la composition nécessaires à la conception et au développement de thérapies thermiques. Ceci est essentiel pour le raffinement des thérapies photothermiques émergentes, ainsi que pour offrir des informations précieuses sur les mécanismes détaillés du transfert de chaleur au sein des systèmes biologiques. Le protocole présenté est basé sur des travaux publiés précédemment19. Un aperçu du protocole est le suivant: la première section définit la formation tBLM; la deuxième section explique comment construire la configuration et aligner la source laser d’excitation; la dernière section illustre comment extraire des informations des données de spectroscopie d’impédance électrique.

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Protocol

1. Préparation des électrodes tBLMs

  1. Préparation du premier revêtement monocouche
    1. Immerger une lame de microscope à électrodes à motif d’or fraîchement pulvérisée dans une solution éthanolique composée d’un rapport 3 mM 1:9 de molécules « d’espacement » benzyl-disulfure-tétra-éthylèneglycol-OH (le disulfure de benzyle comprenait quatre molécules d’espacement oxygène-éthylène glycol, terminées par un groupe OH) et de benzyl-disulfure (tétra-éthylèneglycol) n=2 molécules « attachées » en C20-phytanyle. Cela crée le premier revêtement de couche auquel une bicouche peut être ancrée.
      REMARQUE: L’électrode en or est fabriquée en évaporant un film en polycarbonate de 100 nm, 99,9995% d’or (or 5n5) sur des lames en polycarbonate personnalisées de 25 mm x 75 mm20.
    2. Incuber les électrodes avec la première couche à température ambiante pendant au moins 1 h.
    3. Rincez les électrodes en or en les immergeant dans de grandes quantités d’éthanol pur sur 30 s.
    4. Utilisez la glissière d’électrode en or avec la première monocouche directement pour l’étape suivante ou stockez-la dans un pot rempli d’éthanol pur.
    5. REMARQUE: Pour assurer l’intégrité de la première couche, minimisez tout contact direct avec les parties dorées de la glissière
  2. Assemblage de la première glissière revêtue monocouche
    1. Retirez soigneusement une glissière d’électrode en or coplanaire de son récipient à l’aide d’une pince à épileuse, en veillant à ne pas entrer en contact avec les zones à motifs où les tBLM se formeront.
      REMARQUE: Veillez à identifier le côté de la glissière sur lequel l’or est déposé.
    2. Faire glisser à l’air sec pendant 1 à 2 minutes pour éliminer tout éthanol résiduel.
    3. Placez l’électrode en or sur une surface sèche, assurez-vous que l’électrode en or est correctement orientée avec une surface en or à motifs orientée vers le haut.
    4. Décollez le couvercle de la couche adhésive transparente d’un mince stratifié et placez-le sur les 6 canaux pour définir chaque puits.
    5. Utilisez un rouleau de pression pour libérer de l’air entre la glissière et la couche adhésive transparente, comme illustré à la Figure 1A.
      REMARQUE: Le temps requis pour cette étape devra être optimisé par le chercheur. Dans ce protocole, les temps sont allant de 2 à 3 min.
    6. Introduisez dès que possible (dans les 1 à 2 minutes) la deuxième bicouche lipidique dans la première électrode revêtue de monocouche assemblée pour l’auto-assemblage afin d’éviter d’endommager la première couche.
  3. Préparation de la deuxième bicouche lipidique
    1. Ajouter 6 μL de lipides d’intérêt de 3 mM au premier puits de la lame des six puits. Ne laissez pas le bord de la pointe de la micropipette toucher la surface en or, ce qui peut endommager les produits chimiques attachés à l’électrode.
      REMARQUE: Le mélange lipidique utilisé dans ce travail était composé de 3 mM 70% de diphytanyl-éther-glycéro-phosphatidylcholine (DPEPC) et de 30% de lipides d’éther diphytanyldiglycérides en C20 (GDPE) mélangés à 3 mM de cholestérol-PEG-biotine dans un rapport molaire de 50: 1.
    2. Introduire 6 μL du mélange lipidique dans les autres puits avec un intervalle de 10 s entre chaque addition.
    3. Incuber chaque puits pendant exactement 2 min à température ambiante avant d’échanger le mélange lipidique sur les électrodes avec un tampon tel que pbS. Espacez les temps pour l’addition et l’échange de tampon de 10 s d’intervalle afin que chaque puits soit incubé avec le lipide pendant exactement 2 min chacun.
    4. Lavez 3 fois de plus avec 50 μL de tampon PBS (pH 7,0). Assurez-vous de laisser 50 μL de tampon sur les électrodes en tout temps. Ne laissez pas les électrodes sécher.
      REMARQUE: Le déplacement du solvant éthanolique avec la solution aqueuse de cette manière (la méthode d’échangede solvant) permet la formation rapide d’une seule bicouche lipidique ancrée à l’électrode d’or via les chimies attachées.
  4. Test de la formation de tBLM à l’aide de mesures par spectroscopie d’impédance électrique (EIS)
    1. Insérez une glissière d’électrode préparée dans un spectromètre d’impédance CA (p. ex., téthapode). Assurez-vous que le spectromètre est connecté via un port USB à un ordinateur exécutant le logiciel.
    2. Ouvrez le logiciel, cliquez sur Configuration et ouvrez Matériel.
    3. Réglez les paramètres matériels pour utiliser une excitation AC de crête à crête de 25 mV.
    4. Réglez les fréquences entre 0,1 et 10 000 Hz avec deux étapes par décennie pour des mesures d’impédance rapides, appuyez sur ok.
    5. Cliquez sur le menu Configuration et ouvrez Modèle.
    6. Utilisez un modèle de circuit équivalent qui décrit l’électrode d’or d’attache comme un élément de phase constante en série avec une résistance décrivant le tampon électrolytique et un réseau résistance-condensateur parallèle pour décrire la bicouche lipidique, puis appuyez sur OK.
    7. Appuyez sur le bouton Démarrer pour démarrer une mesure en temps réel de la capacité membranaire (Cm)et de la conduction m (Gm). Les valeurs Cm des tBLM typiques doivent être comprises entre 12,5 nF et 15,5 nF pour les chimies attachées à 10 %21,22.
    8. Après avoir exécuté le protocole et terminé l’expérience, enregistrez les données.
    9. Répétez la mesure avec le puits suivant.

2. Irradiation laser

  1. Configuration expérimentale
    REMARQUE: Le système sur mesure est configuré pour chaque puits tBLM individuellement.
    1. Effectuez des expériences dans une boîte à l’épreuve de la lumière pour minimiser la dangerité du laser.
    2. Utilisez une table optique pour configurer l’expérience afin de réduire les vibrations indésirables.
    3. Placez le lecteur d’impédance, où se trouve la glissière d’or, sur une scène XYZ et élevez-le de telle sorte qu’il se trouve sur le chemin de la source laser.
    4. Utilisez un engrenage microscopique à focalisation grossière et fine pour contrôler la hauteur de la source laser afin d’obtenir la précision appropriée.
    5. Ciblez le trajet laser le long de l’axe longitudinal de la glissière de l’électrode.
      ATTENTION: Portez toujours des lunettes de sécurité laser appropriées et maintenez de bons protocoles de sécurité laser.
    6. Laissez le laser réglé sélectionné se stabiliser avant de commencer l’expérience.
      REMARQUE : Un schéma de la configuration expérimentale est illustré à la figure 2A.
  2. Alignement des électrodes laser et or
    REMARQUE: Avant de commencer, évaluez toujours la puissance de sortie laser à l’aide d’un capteur de puissance pour vous assurer que seules de très faibles puissances sont fournies aux tBLM.
    1. Ajustez soit la trajectoire du laser, soit l’angle de l’électrode de telle sorte que le laser traverse le liquide recouvrant l’électrode et soit simplement visible, uniformément, à la surface de l’or.
    2. Ajustez la position de la lumière du faisceau laser pour chaque expérience en soulevant ou en abaissant la source du faisceau laser à l’aide du réglage fin tout en observant les changements de conductance de la membrane.
    3. Verrouillez le bouton pour sécuriser la position du trajet laser lorsqu’aucun changement de conductance n’est observé.
      REMARQUE: Des valeurs de conductance membranaire accrues seront générées lorsque le laser interagira avec l’électrode en or sous-jacente. Il est donc important d’ajuster le trajet du laser de manière à ce que de telles interactions ne soient pas possibles.
  3. Préparation des échantillons
    1. Préparer l’alignement de la lumière du faisceau laser (lorsqu’il n’y a pas de changement dans la conductance de la membrane), comme illustré à la Figure 2, position 3.
    2. Ajoutez des GNP d’intérêt (fonctionnalisés ou nus) au tampon PBS dans lequel les tBLM sont immergés pendant que le laser est éteint.
    3. Mélangez doucement le tampon PBS entourant les tBLM trois fois, en prenant soin de ne pas toucher l’électrode.
    4. Incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
    5. Allumez le laser pour irradier l’échantillon, en utilisant la position correcte de la lumière du faisceau laser aligné, comme on le voit à la figure 2,position 3.
    6. Utilisez la combinaison appropriée de taille, de forme et de concentration des GNP avec la longueur d’onde de la lumière laser.
      REMARQUE: Le faisceau laser de longueur d’onde définie doit se coupler à la fréquence de résonance plasmonique GNP correspondante.
    7. Enregistrez le courant mesuré en continu (mesures en temps réel).
    8. Effectuer les étapes 2.2.1 à 2.3.7, en omettant l’ajout de PNB pour les expériences de contrôle.

3. Analyse et présentation des données statistiques

  1. Exportez les données dans une feuille de calcul.
  2. Extraire le paramètre de conductance de la membrane par rapport au temps.
  3. Utilisez les données enregistrées après avoir installé une lumière de faisceau laser avec la bonne position et avant l’introduction des GNP.
  4. Normalisez les données en divisant la conductance membranaire mesurée sur la conductance membranaire de base.
    REMARQUE: Cela confirme que les changements relatifs dans les valeurs de conduction membranaire provoqués par l’introduction de PNB irradiés.
  5. Présentez les données sous forme de diagrammes de temps (axe des x) par rapport à la conduction membranaire normalisée (axe des y).

4. Prédire la quantité de chaleur localisée générée dans les tBLM à partir de nanoparticules irradiées (modèle prédictif thermique)

  1. Résoudre le problème de transfert de rayonnement selon Dombrovsky23, afin de calculer la puissance de rayonnement absorbée dans les solutions de nanoparticules irradiées.
  2. Calculez la production de chaleur en incorporant la source de chaleur due au rayonnement absorbé dans l’équation énergétique.
    REMARQUE: Pour une explication détaillée de l’analyse numérique de la génération de chaleur dans les tBLM à partir de nanoparticules irradiées et de l’interface nanomatériau-électrode, reportez-vous à la section 19.

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Representative Results

Le substrat d’or sur lequel les tBLM peuvent être créés est illustré à la figure 1. Un schéma de la configuration expérimentale est présenté à la figure 2.

Les électrodes coplanaires en or, comme le montre la figure 1A,sont fabriquées à partir d’un substrat de base en polycarbonate de 25 mm x 75 mm x 1 mm avec des réseaux d’or à motifs. Une couche adhésive transparente définit les six chambres de mesure individuelles. L’électrode coplanaire en or permet l’exposition directe de la lumière laser à la membrane tBLM. Chaque puits du réseau d’électrodes contient une électrode de travail en forme de cercle (surface: 0,707 cm2)et une contre-électrode ou une électrode coplanaire en forme de demi-cercle (surface: ~ 0,725 cm2), qui sont séparées par un espace d’environ 2 mm. La couche adhésive transparente isole le reste de l’or déposé de l’électrolyte en vrac. En revanche, la disposition en or sous-jacente relie les électrodes de travail aux zones de contact à l’extérieur des chambres de mesure pour fournir la connexion électrique au lecteur EIS sans avoir besoin d’une électrode de référence.

Le chemin laser est aligné de manière à interagir avec les tBLM et est dispersé à travers le tampon liquide qui l’entoure, mais pas de manière à pouvoir interagir avec le substrat aurifère sous-jacent. Ceci est facilement déterminé par le levage horizontal et l’abaissement du laser jusqu’à ce que la position correcte soit établie. Cette position est juste au point où aucun changement dans la conductance de la membrane ne peut être observé. Étant donné que les tBLM sont formés par fixation à une couche de substrat d’or en vrac, il semble probable que les changements de conductance de la membrane aux positions 1 et 2 de la figure 2 sont le résultat de la chaleur provenant des interactions du laser avec les nanostructures dans la couche d’or en vrac pulvérisée. Ainsi, en utilisant la position précise de l’alignement horizontal du faisceau lumineux, en se concentrant sur l’élimination de l’interaction entre la lumière laser et le substrat d’or en vrac trouvé sous les tBLM.

La focalisation de la lumière laser horizontale directement vers l’électrode en or provoque une augmentation de la conductance membranaire, comme présenté à la figure 2, positions 1 et 2. La position précise du laser a révélé une variation négligeable des enregistrements de conductance membranaire pendant les périodes de laser ON et laser OFF (Figure 2B, position 3). L’échantillon PNB a été ajouté après avoir établi des enregistrements de référence, comme le montre la figure 2,position 3. L’ajout de nanoparticules d’or de 30 nm conjuguées à la streptavidine aux tBLM contenant du cholestérol biotinylé a montré une nette différence entre les périodes ON et OFF du laser, ainsi que par rapport à la position 3, avec des augmentations distinctes de l’amplitude de conductance pendant la phase ON du laser(Figure 2B, position 4).

Figure 1
Figure 1: Représentation schématique du modèle de membrane lipidique bicouche attachée (tBLM) sur un substrat d’or. (A) Glissière d’électrode d’or coplanaire avec six puits, finalement définie par l’ajout d’une fine couche adhésive transparente. (B) Le modèle tBLM comprend des attaches d’espacement (chaînes d’éthylène glycol terminées par un groupe hydroxyle) et de molécules attachées (groupes éthylène glycol terminés par une chaîne phytanyle hydrophobe) à la surface du substrat d’or pour former la première couche. La deuxième couche comprend les lipides non attachés. La figure modifiée était basée sur Cornell et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Illustration de la configuration du test pour l’alignement et des changements de conductance membranaire de mesure correspondants entre les tBLM résultant de l’éclairage laser ( λ = 530 nm). A) Schéma représentatif des différentes positions de l’alignement horizontal du laser; où Position 1: faisceau de lumière laser aligné avec le substrat d’or (lorsque le laser a été allumé est indiqué en rouge); position 2 la lumière laser horizontale mélangée à une membrane et à un substrat d’or; position 3 lumière laser focalée dans le fluide en vrac entourant les tBLM; Position 4 faisceau laser lumineux focalisé dans le fluide entourant les tBLM en présence de PNB sphériques 30 nm conjugués à la streptavidine. (B) Les enregistrements de conductance normalisés dans le temps correspondent aux différentes positions d’alignement. Positions 1, 2 et 3 mesures de la conductance des tBLM en l’absence de PNB, tandis que la position 4 est une mesure de la conductance des tBLM en présence de PNB sphériques 30 nm conjugués à la streptavidine. Les valeurs de conduction membranaire ont été normalisées à la valeur initiale de conduction membranaire lors de la formation de tBLM. Les résultats sont représentatifs d’au moins trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation du modèle tBLM avec un substrat d’électrode coplanaire en conjonction avec une configuration d’alignement laser horizontal qui permet l’enregistrement de l’impédance électrique en temps réel en réponse à l’irradiation laser de nanoparticules d’or. La méthode d’enregistrement EIS présentée ici construit une liste minimale d’expériences nécessaires pour permettre l’enregistrement des changements de courant ionique à travers la membrane, ce qui correspond à la chaleur générée par l’interaction couplée entre le laser et les nanoparticules d’or. Il y a une étape critique dans ce protocole, qui est l’alignement minutieux et précis de la trajectoire laser vers le tampon entourant la membrane lipidique bicouche.

L’utilisation du modèle tBLM offre des propriétés d’étanchéité électrique distinctes qui imitent les caractéristiques des membranes lipidiques naturelles24. Les tBLM fournissent également une région de réservoir ionique aqueux entre le substrat d’or et la membrane formée par la suite, où les molécules attachées et la molécule d’espacement avaient une épaisseur de 11 Å25, et l’épaisseur de la membrane lipidique bicouche était d’environ 6,5 nm19. Cela peut offrir de l’espace pour incorporer des protéines membranaires, des canaux ioniques ou d’autres molécules fonctionnalisées spécifiques13,22. La sélection de 70% de lipides DPEPC et 30% de GDPE assure une étanchéité optimale de la membrane lipidique bicouche pour examiner les caractéristiques électriques des tBLM à l’aide du système EIS24. De même, l’introduction de cholestérol dans les membranes lipidiques bicouches imite étroitement les membranes modèles biomimétiques natives. Les fractions de cholestérol améliorent la stabilité de la membrane lipidique bicouche, ainsi que la minimisation de la perméabilité de la membrane aux ions en fournissant un emballage élevé de la bicouche phospholipide26,27. La combinaison des tBLM avec le système EIS permet de mesurer indirectement le transfert de chaleur entre les GNP irradiés et les membranes lipidiques bicouches. De plus, l’utilisation d’électrodes coplanaires en or dans ce protocole permet les mesures EIS en temps réel sans aucune interférence des électrodes de référence ou de compteur.

L’or à l’échelle des nanoparticules a des caractéristiques physiques et optiques différentes de ceux des agrégats d’or plus grands. La taille et la forme des nanoparticules accèdent à leur biodisponse, à leur durée de vie de circulation et à leur absorption cellulaire, où les nanoparticules de tailles intermédiaires (20-60 nm) présentent une absorption cellulaire maximale et offrent un rapport surface/volume élevé, permettant une fonctionnalisation ultérieure28,29. La taille de PNB de 30 nm mise en œuvre dans cette étude représentait des tailles de PNB intermédiaires, tandis que la sélection de la longueur d’onde laser était en fonction du pic d’absorption des PNB pour produire l’excitation la plus efficace, ce qui conduit par conséquent au chauffage. L’éclairage laser des surfaces en or des tBLM élève les pics de conduction membranaire à la phase ON du laser. Il est proposé que cela soit dû à des nanostructures de surface d’or en vrac qui interagissent avec le laser, ce qui masquerait les phénomènes de production de chaleur suite à l’ajout des GNP30. Pour surmonter ce problème, l’approche développée ici Les GNP sont éclairés en utilisant un alignement laser horizontal à travers l’interface lipid-tampon, comme illustré à la figure 2,positions 3 et 4.

Les protocoles décrits ici peuvent être modifiés facilement en modifiant la composition lipidique de la membrane pour imiter divers types de cellules naturelles, ou en modifiant la taille et la forme des PNB introduits tels que les nanourchines d’or de 100 nm avec la lumière de faisceau laser correspondante19. Cela peut ensuite être utilisé pour déterminer l’impact du rayonnement induit par les GNP localisés sur des types de cellules spécifiques.

En résumé, ce protocole sert de biocapteur de détection robuste pour étudier les interactions des PNB irradiés in situ avec des entités de membrane lipidique bicouche modèles d’intérêt pour répondre aux questions sur les phénomènes de transfert de chaleur. Cela aidera à développer des thérapies photothermiques plus efficaces, ainsi qu’à fournir des informations précieuses pour les mécanismes détaillés de transfert de chaleur au sein des systèmes biologiques. Cette approche peut être utilisée comme un outil pour la prédiction du niveau de destruction de la membrane cellulaire qui peut être vécu par ces nanoparticules chauffées.

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Disclosures

Les auteurs déclarent les intérêts financiers / relations personnelles suivants, qui peuvent être considérés comme des intérêts concurrents potentiels: Le professeur Bruce Cornell est directeur - Science et technologie chez Surgical Diagnostics SDx tethered membranes Pty. Ltd.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le programme de découverte du Conseil australien de la recherche (ARC) (DP150101065) et le arc Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles Cytodiagnostics AC-30-04-05 This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles Sigma-Aldrich 753629 This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) NANOCS PG2-BNCS-10k Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S1 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl  SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Tethered molecules
532 nm green laser continuous light OBIS LS/OBIS CORE LS, China ND-1000 The power of this laser was ~135 mW 
tethaPod EIS reader SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-R1 A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-BG Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-A1 Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-T10 Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% 
tethaQuick software SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-B1 Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
 99.9% Pure ethanol Sigma-Aldrich  34963 Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 pH 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie numéro 166 Membranes lipidiques bicouches attachées (tBLM) Biocapteur Nanoparticules d’or Laser Transfert de chaleur Dynamique membranaire
Membranes lipidiques bicouches attachées pour surveiller le transfert de chaleur entre les nanoparticules d’or et les membranes lipidiques
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Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X., Yeoh, G. H., Cranfield, C. G., Timchenko, V., Cornell, B. A., Valenzuela, S. M. Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (166), e61851, doi:10.3791/61851 (2020).

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