Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים

Published: December 8, 2020 doi: 10.3791/61851
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 1,2, 3, 2,4, 1,2,5
1School of Life Sciences, University of Technology Sydney, 2ARC Research Hub for Integrated Devices for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL), Faculty of Science, University of Technology Sydney, 3School of Mechanical and Manufacturing Engineering, The University of New South Wales, 4Surgical Diagnostics Pty Ltd., 5Institute for Biomedical Materials and Devices, University of Technology Sydney

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקול להשגת ניטור דינמי ולא פולשני של העברת חום מננו-חלקיקי זהב מוקרנים בלייזר ל- tBLMs. המערכת משלבת ספקטרוסקופיית עבלה למדידה בזמן אמת של שינויי מוליכות על פני tBLMs, עם קרן לייזר ממוקדת אופקית המניעה תאורת ננו-חלקיקים מזהב, לייצור חום.

Abstract

כאן אנו מדווחים פרוטוקול כדי לחקור את העברת החום בין חלקיקי זהב מוקרן (GNPs) וקרום שומנים דו שכבתי על ידי אלקטרוכימיה באמצעות ממברנות שומנים דו שכבתיים קשורות (tBLMs) המורכב על אלקטרודות זהב. GNPs שעברו שינוי מוקרן, כגון GNPs מצומדים בסטרפטבידין, מוטבעים ב- tBLMs המכילים מולקולות יעד, כגון ביוטין. באמצעות גישה זו, תהליכי העברת החום בין GNPs מוקרן לבין קרום השומנים דו שכבתי מודל עם ישויות עניין מתווכים על ידי קרן לייזר ממוקד אופקית. המודל החישובי הניבוי התרמי משמש כדי לאשר את שינויי המוליך המושרים אלקטרוכימית ב- tBLMs. בתנאים הספציפיים בהם נעשה שימוש, זיהוי פולסים חום דרש התקשרות ספציפית של חלקיקי הזהב לפני השטח של הממברנה, בעוד חלקיקי זהב לא מאוגדים לא הצליחו לעורר תגובה מדידה. טכניקה זו משמשת biosensor גילוי רב עוצמה אשר ניתן להשתמש ישירות לתכנון ופיתוח של אסטרטגיות לטיפולים תרמיים המאפשר אופטימיזציה של פרמטרי לייזר, גודל החלקיקים, ציפוי החלקיקים והרכב.

Introduction

הביצועים היפרתרמיים של ננו ננו זהב מוקרן מציע סוג חדש של טיפול זעיר פולשני, סלקטיבי, ממוקד לזיהומים וגידולים1. העסקת חלקיקים שניתן לחמם על ידי לייזר שימשה להרוס תאים חולים באופן סלקטיבי, כמו גם מתן אמצעי לאספקת תרופות סלקטיבית2,3. תוצאה של תופעות פוטותרמיליזה של חלקיקים פלסמוניים מחוממים היא נזק לקרום התא. קרום דו שכבתי שומנים נוזלי נחשב אתר פגיע במיוחד עבור תאים העוברים טיפולים כאלה כי denaturation של חלבונים ממברנה פנימית, כמו גם נזק ממברנה יכול גם להוביל למוות תאים4, כמו חלבונים רבים נמצאים שם כדי לשמור על שיפוע הפוטנציאלי יוני על פני קרום התא. בעוד היכולת לקבוע ולנטר העברת חום בקנה מידה ננומטרי היא עניין מרכזי למחקר ויישום של GNPs מוקרן 1,5,6,7, הערכה והבנה של האינטראקציות המולקולריות בין GNPs ו bio-membranes, כמו גם את ההשלכות הישירות שלתופעותהחימום המושרה בלייזר של GNPs מוטבע ברקמות ביולוגיות, עדיין לא נוהרו במלואם8. לכן, הבנה מעמיקה של תהליך היפרתרמיה של GNPs מוקרן נשאר אתגר. ככזה, פיתוח של ממשק ננו-חומרים-אלקטרודה המחקה את הסביבה הטבעית של תאים יכול לספק אמצעי שבאמצעותו לבצע חקירה מעמיקה של מאפייני העברת החום של חלקיקי זהב מוקרן בתוך מערכות ביולוגיות.

המורכבות של קרום התא המקומי הוא אחד האתגרים המשמעותיים בהבנת אינטראקציות GNPs מוקרן בתאים. היו פלטפורמות ממברנה מלאכותית שונות שפותחו כדי לספק גרסאות ביו-מימטיות פשוטות קרובות של ארכיטקטורה ופונקציונליות של קרום השומנים הטבעי, כולל, אך לא רק, ממברנות שומנים שחורות9, ממברנות דו-שכבתיות פלנאריות נתמכות10, ממברנות דו-שכבתיות היברידיות11, ממברנות דו-שכבתיות מרופדות בשומןפולימר 12 וקרום השומנים הדו-שכבתי קשור13. לכל מודל קרום השומנים המלאכותי יש יתרונות ומגבלות ברורים ביחס לחיקוי ממברנות השומנים הטבעיות14.

מחקר זה מתאר את התעסוקה של אלקטרודות מצופות קרום השומנים כחיישן להערכת ננו-חלקיקי זהב ואינטראקציות קרום השומנים, באמצעות מודל tBLM. ערכת זיהוי הביו-סנסור המבוססת על tBLM מספקת יציבות ורגישות טבועה13 מכיוון שקרומים קשורים יכולים לתקן את עצמם, בניגוד למערכות אחרות (כגון ממברנות שנוצרו על ידי מהדק תיקון או ליפוזומים) שבהן רק כמות קטנה של נזק לממברנה גורמת לקריסתם15,16,17,18. יתר על כן, מכיוון ש- tBLMs הם בממדי מ"מ2, עבלה ברקע היא בסדרי גודל נמוכים יותר מטכניקות הקלטה של מהדק תיקון, המאפשרות הקלטה של שינויים בשטף היוני של הממברנה המבסאלית עקב אינטראקציות ננו-חלקיקים. כתוצאה מכך, הפרוטוקול הנוכחי יכול להשוות שינויים בהווכות הממברנה על ידי GNPs מאוגדים כי הם נרגשים על ידי לייזרים שכוחותיהם נמוכים כמו 135 nW / μm2.

המערכת המוצגת כאן מספקת שיטה רגישה וניתנת לשחזור לקביעת פרמטרי לייזר מדויקים, גודל חלקיקים, ציפוי חלקיקים והרכב הדרושים לתכנון ופיתוח טיפולים תרמיים. זה קריטי לעידון של טיפולים פוטותרמיים מתעוררים, כמו גם מציע מידע בעל ערך עבור מנגנונים מפורטים של העברת חום בתוך מערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מבוסס על עבודה19שפורסמה בעבר . חלוקה לרמות של הפרוטוקול היא כדלקמן: המקטע הראשון מגדיר את היווצרות tBLM; המקטע השני מתאר כיצד לבנות את ההתקנה וליישר את מקור לייזר העירור; החלק האחרון ממחיש כיצד לחלץ מידע מנתוני ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת אלקטרודות tBLMs

  1. הכנת ציפוי מונו-שכבתי ראשון
    1. לטבול שקופית מיקרוסקופ אלקטרודה בדוגמת זהב טרי בתמיסה אתנולית המורכבת מיחס של 3 מ"מ 1:9 של בנזיל-דיסולפיד-טטרה-אתילנגליקול-OH מולקולות "ספייסר" (בנזיל דיסולפיד כללה מרווח של ארבע אתילן גליקול חמצן, שהסתיים בקבוצת OH) ובנזל-דיסולפיד (טטרה-אתילנגליקול) n = 2 מולקולות C20-phytanyl "קשורות". פעולה זו יוצרת את ציפוי השכבה הראשון שאליו ניתן לעגן דו-שכבתי.
      הערה: אלקטרודה הזהב נעשה על ידי אידוי 100 ננומטר, 99.9995% זהב (5n5 זהב) סרט על מותאם אישית 25 מ"מ x 75 מ"מ פוליקרבונט שקופיות20.
    2. דגירה אלקטרודות עם השכבה הראשונה בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעה.
    3. לשטוף את אלקטרודות הזהב על ידי טבילה בכמויות גדולות של אתנול טהור מעל 30 s.
    4. השתמש שקופית אלקטרודה זהב עם monolayer הראשון ישירות לשלב הבא או לאחסן בצנצנת מלאה אתנול טהור.
    5. הערה: כדי להבטיח את תקינות השכבה הראשונה, מזער כל מגע ישיר לחלקי הזהב של השקופית
  2. הרכבת השקופית המצולמת הראשונה של השכבה המונו-שכבתית
    1. בזהירות לקחת שקופית אלקטרודה זהב coplanar אחד מן המיכל שלה באמצעות פינצטה, להיות בטוח לא ליצור קשר עם האזורים בדוגמת שבו tBLMs ייווצרו.
      הערה: שים לב לזהות את הצד של השקופית שעליה מופקד הזהב.
    2. החלקה יבשה באוויר במשך 1 - 2 דקות כדי להסיר כל אתנול שיורית.
    3. מניחים אלקטרודה מזהב על משטח יבש, ודאו שהאלקטרודה המוזהבת מכוונת כראוי עם משטח זהב בדוגמת פנים כלפי מעלה.
    4. מקלפים את שכבת הדבק השקופה מ למינציה דקה ומניחים מעל 6 הערוצים כדי להגדיר כל באר.
    5. השתמשו ברולר לחץ כדי לשחרר אוויר בין השקופית לשכבת הדבקה השקופה, כפי שמוצג באיור 1A.
      הערה: הזמן הנדרש עבור שלב זה יצטרך להיות מותאם על ידי החוקר. בפרוטוקול זה, הזמנים נעים בין 2-3 דקות.
    6. הציגו מיד עם המעשה (תוך 1-2 דקות) את דו-שכבתית השומנים השנייה לאלקטרודה המצולמת הראשונה של הקו המולייה הראשונה להרכבה עצמית כדי למנוע פגיעה בשכבה הראשונה.
  3. הכנת דו-שכבתית שומנים שניה
    1. הוסף 6 μL של 3 mM שומנים של עניין לבאר הראשונה של שקופית שש בארות. אל תתנו לקצה קצה המיקרופיט לגעת במשטח הזהב, מה שעלול לפגוע בכימיה קשורה באלקטרודה.
      הערה: תערובת השומנים המשמשת בעבודה זו כללה 3 mM 70% zwitterionic C20 דיפיטניל-אתר-גלייצרו-פוספטידילכולין (DPEPC) ו 30% C20 דיפיטנילדיגליצריד אתר שומנים (GDPE) מעורבב עם 3 mM כולסטרול-PEG-ביוטין ביחס טוחנת 50:1.
    2. הצג 6 μL של תערובת השומנים לבארות האחרות עם פער של 10 s בין כל תוספת.
    3. לדגור כל באר בדיוק 2 דקות בטמפרטורת החדר לפני החלפת תערובת השומנים מעל האלקטרודות עם חוצץ כגון PBS. חלל את הזמנים עבור תוספת חילופי חיץ 10 s זה מזה, כך כל באר הוא דגירה עם השומנים במשך בדיוק 2 דקות כל אחד.
    4. לשטוף 3 פעמים נוספות עם 50 μL של חוצץ PBS (pH 7.0). הקפד להשאיר 50 μL של חוצץ מעל האלקטרודות בכל עת. אל תאפשר לאלקטרודות להתייבש.
      הערה: עקירת ממס האתנול עם הפתרון המ מימי בדרך זו (שיטת החלפת ממסים)מאפשרת היווצרות מהירה של bilayer שומנים יחיד מעוגן אלקטרודה הזהב באמצעות הכימיות קשורות.
  4. בדיקת היווצרות tBLM באמצעות מדידות ספקטרוסקופיית מעיקה חשמלית (EIS)
    1. הכנס שקופית אלקטרודה מוכנה לספקטרומטר עקשת AC (למשל, טטפוד). ודא שהספקטרומטר מחובר באמצעות יציאת USB למחשב שבו פועלת התוכנה.
    2. פתח את התוכנה, לחץ על תוכנית ההתקנה ופתח חומרה.
    3. הגדר את הגדרות החומרה לשימוש בהתרגשות AC של 25 mV ממסך לשיא.
    4. הגדר תדרים בין 0.1 ל-10,000 הרץ עם שני שלבים לעשור לאמצעי עיקול מהירים לחץ על אישור.
    5. לחץ על תפריט התקנה ופתח את מודל.
    6. השתמש במודל מעגל שווה ערך המתאר את אלקטרודה הזהב הקוברת כאלמנט פאזה קבוע בסדרה עם נגד המתאר את מאגר האלקטרולים ורשת קבלי נגד מקבילה כדי לתאר את דוlayer השומנים, ולחץ על אישור.
    7. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל מדידה בזמן אמת של קיבוליות ממברנה (Cm)והולכת ממברנה (Gm). ערכי Cm של tBLMs טיפוסיים צריכים להיות בטווח של 12.5 nF עד 15.5 nF עבור 10% כימיה קשורה21,22.
    8. לאחר הפעלת הפרוטוקול וסיים את הניסוי, שמור את הנתונים.
    9. חזור על המדידה עם הבאר הבאה.

2. הקרנת לייזר

  1. התקנה ניסיונית
    הערה: המערכת המותאמת אישית מוגדרת עבור כל tBLM באר בנפרד.
    1. בצע ניסויים בקופסה חסינת אור כדי למזער את הלייזר בצורה מסוכנת.
    2. השתמש בטבלת אופטיקה כדי להגדיר את הניסוי כדי להפחית תנודות לא רצויות.
    3. מניחים את קורא העכבות, היכן מחוברת שקופית הזהב, על במת XYZ ומרוממים כך שהיא יושבת בנתיב של מקור הלייזר.
    4. השתמש בהילוך מיקרוסקופי ממוקד גס כדי לשלוט בגובה מקור הלייזר כדי להשיג את הדיוק המתאים.
    5. כוון לנתיב הלייזר לאורך ציר האורך של שקופית האלקטרודה.
      אזהרה: יש להרכיב תמיד משקפי בטיחות לייזר מתאימים ולשמור על פרוטוקולי בטיחות לייזר טובים.
    6. אפשר ללייזר המכוון שנבחר להתייצב לפני תחילת הניסוי.
      הערה: תרשים של ההתקנה הניסיונית מומחש באיור 2A.
  2. יישור אלקטרודות לייזר וזהב
    הערה: לפני שתתחיל, תמיד להעריך את תפוקת כוח הלייזר באמצעות מד כוח כדי להבטיח רק וואט נמוך מאוד מועברים tBLMs.
    1. התאם את נתיב הלייזר או את זווית האלקטרודה כך שהלייזר יעבור דרך הנוזל המכסה את האלקטרודה והוא פשוט נראה, באופן שווה, על פני הזהב.
    2. התאם את מיקום האור של קרן הלייזר עבור כל ניסוי על ידי העלאת או הנמכה של מקור קרן הלייזר באמצעות ההתאמה העדינה תוך התבוננות בשינויים בהולכת הממברנה.
    3. נעל את הידית כדי לאבטח את המיקום של נתיב הלייזר כאשר אין שינויי מוליכות נצפים.
      הערה: ערכי מוליכות ממברנה מוגברת ייווצרו כאשר הלייזר אינטראקציה עם אלקטרודה הזהב הבסיסית. לכן חשוב להתאים את נתיב הלייזר כך שלא ניתן לקיים אינטראקציות כאלה.
  3. הכנת דוגמה
    1. הכן את יישור האור של קרן הלייזר (כאשר אין שינוי במוליכת הממברנה), כפי שמוצג באיור 2, מיקום 3.
    2. הוסף GNPs של עניין (פונקציונלי או חשוף) למאגר PBS שבו tBLMs שקועים בזמן שהלייזר כבוי.
    3. מערבבים את חיץ ה- PBS המקיף את ה- tBLMs בעדינות שלוש פעמים, ונזהרים שלא לגעת באלקטרודה.
    4. דגירה במשך 5 -10 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הפעל את הלייזר כדי להקרין דגימה, תוך שימוש במצב האור הנכון של קרן הלייזר, כפי שניתן לראות באיור 2, מיקום 3.
    6. השתמש בשילוב המתאים של GNPs גודל, צורה וריכוז עם אורך גל אור לייזר.
      הערה: קרן הלייזר של אורך גל מוגדר צריך זוג לתדר תהודה פלסמון GNP המתאים.
    7. רשומה נמדדת בזרם ברציפות (מדידות בזמן אמת).
    8. בצע שלבים 2.2.1 - 2.3.7, השמטת תוספת GNP לניסויי הבקרה.

3. ניתוח נתונים סטטיסטיים והצגתם

  1. יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
  2. לחלץ את פרמטר מוליכות הממברנה לעומת זמן.
  3. השתמש בנתונים המוקלטים לאחר הגדרת נורית קרן לייזר עם המיקום הנכון ולפני הצגת GNPs.
  4. לנרמל נתונים על ידי חלוקת מוליכות הממברנה הנמדדת על מוליכות הממברנה הבסיסית.
    הערה: זה מאשר כי שינויים יחסיים בערכי מוליכת הממברנה שהוכנסו על ידי GNPs מוקרן הציג.
  5. הצג נתונים כעלילות זמן (ציר x) לעומת מוליכת ממברנה מנורמלת (ציר y).

4. לחזות את כמות החום המקומי שנוצר ב- tBLMs מננו-חלקיקים מוקרן (מודל ניבוי תרמי)

  1. לפתור את בעיית העברת הקרינה על פי דומברובסקי23, על מנת לחשב כוח קרינה נספג בפתרונות ננו חלקיקים מוקרן.
  2. חשב את ייצור החום על ידי שילוב מקור החום עקב קרינה נספגת במשוואת האנרגיה.
    הערה: להסבר מפורט על הניתוח המספרי של ייצור חום ב- tBLMs מננו-חלקיקים מוקרן וממשק ננו-חומרים-אלקטרודה, עיין ב - 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מצע הזהב שעליו ניתן ליצור tBLMs מוצג באיור 1. תרשים של ההתקנה הניסיונית מוצג באיור 2.

אלקטרודות זהב קופלנאר, כפי שמוצג באיור 1A,עשויות ממצע בסיס פוליקרבונט 25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ עם מערכי זהב בדוגמת דפוס. שכבת דבק שקופה מגדירה את ששת תאי המדידה הבודדים. אלקטרודה זהב coplanar מאפשר חשיפה ישירה של אור הלייזר לקרום tBLMs. כל באר של מערך האלקטרודה מכילה אלקטרודה עובדת בצורת עיגול (שטח: 0.707 ס"מ2)ואלקטרודה נגד בצורת חצי עיגול או אלקטרודה קופלנארית (שטח: ~ 0.725 ס"מ2), המופרדים על ידי פער של ~ 2 מ"מ. שכבת הדבק השקופה מבודדת את שאר הזהב שהופקד מהאלקטרולית בתפזורת. לעומת זאת, פריסת הזהב הבסיסית מחברת את האלקטרודות העובדות כדי ליצור קשר עם אזורים מחוץ לתאי המדידה כדי לספק את החיבור החשמלי לקורא ה- EIS ללא צורך באלקטרודה ייחוסית.

נתיב הלייזר מיושר באופן שבו הוא מקיים אינטראקציה עם tBLMs והוא מפוזר דרך המאגר הנוזלי המקיף אותו, אך לא כזה שהוא יכול לקיים אינטראקציה עם מצע הזהב הבסיסי. זה נקבע בקלות באמצעות העלאות אופקיות והורדה של הלייזר עד למיקום הנכון הוקמה. עמדה זו היא רק בנקודה שבה לא ניתן לראות שינויים בהולכת הממברנה. בהתחשב בכך ש- tBLMs נוצרים על ידי התקשרות לשכבת מצע של זהב בתפזורת, סביר להניח שהשינויים בהולכת הממברנה במיקום 1 ו-2 באיור 2 הם כתוצאה מחום מאינטראקציות של הלייזר עם ננו-מבנים בתוך שכבת הזהב בתפזורת המקרטעת. לכן, באמצעות המיקום המדויק של יישור קרן אור אופקית המתמקדת בחיסול האינטראקציה בין אור הלייזר לבין מצע הזהב בתפזורת שנמצא מתחת ל- tBLMs.

מיקוד אור הלייזר האופקי ישירות לכיוון האלקטרודה המוזהב גורם לעלייה במוליכת הממברנה, כפי שמוצג באיור 2, מיקום 1 ו-2. מיקום הלייזר המדויק חשף שונות זניחה להקלטות המוליכה של הממברנה בשתי התקופות של לייזר ON ולייזר OFF(איור 2B,מיקום 3). דגימת GNP נוספה לאחר קביעת הקלטות בסיסיות, כפי שמוצג באיור 2, מיקום 3. התוספת של חלקיקי זהב 30 ננומטר מצומדים ל-tBLMs שהכילו כולסטרול ביו-טינילי הראתה הבדל ברור בין תקופות הלייזר ON ו-OFF, כמו גם בהשוואה למיקום 3, עם עלייה ברורה במשרעת מוליכות במהלך שלב הלייזר ON (איור 2B, מיקום 4).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של מודל קרום השומנים הדו-שכבתי (tBLM) קשור על מצע זהב. (A) שקופית אלקטרודה מזהב קופלנאר עם שש בארות, המוגדרת בסופו של דבר על ידי תוספת של שכבת דבק שקופה דקה. (B) דגם ה-tBLM כולל שרשראות ספייסר (שרשראות אתילן גליקול שהסתיימו בקבוצת הידרוקסיל) ומולקולות קשורות (קבוצות אתילן גליקול שהסתיימו בשרשרת פיטניל הידרופובית) המשתטחות אל משטח המצע של הזהב כדי ליצור את השכבה הראשונה. השכבה השנייה כוללת את השומנים שאינם קשורים. הנתון שהשתנה התבסס על קורנל ואח'24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: איור של מערך ההולכה של ה- Assay ליישור ושינויי מוליכות קרום המדידה המתאימים על פני tBLMs הנובעים מהארה בלייזר ( λ = 530 ננומטר). (א) נציג סכמטי של העמדות השונות של יישור לייזר אופקי; כאשר מיקום 1: קרן אור לייזר מיושרת עם מצע הזהב (כאשר הלייזר הופעל מצוין באדום); מיקום 2 אור הלייזר האופקי מעורבב עם מצע ממברנה וזהב; מיקום 3 אור לייזר ממוקד לתוך הנוזל בתפזורת המקיף tBLMs; מיקום 4 אור קרן לייזר התמקד בנוזל המקיף את tBLMs בנוכחות Streptavidin-מצומד 30 ננומטר GNPs כדורי. (B) הקלטות מוליכות מנורמל לאורך זמן תואמות את עמדות היישור השונות. מיקומים 1, 2 ו -3 מדידות של מוליכות tBLMs בהיעדר GNPs, בעוד עמדה 4 היא מדידה של מוליכות tBLMs בנוכחות GNPs כדורי 30 ננומטר מצומדים סטרפטווידין. ערכי ההולכת הממברנה נוטרמו לערך הראשוני של מוליכת הממברנה עם היווצרות tBLMs. התוצאות מייצגות לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במודל tBLM עם מצע אלקטרודה קופלנאר בשילוב עם יישור לייזר אופקי שהוקם המאפשר הקלטת עבלה חשמלית בזמן אמת בתגובה להקרנת לייזר של חלקיקי זהב. השיטה של הקלטת EIS המוצגת כאן בונה רשימה מינימלית של ניסויים הדרושים כדי לספק הקלטה של שינויים זרם יון על פני הממברנה, אשר תואם את החום שנוצר על ידי אינטראקציה לייזר מצמיד ננו-חלקיקים זהב. יש צעד קריטי בפרוטוקול זה, שהוא היישור הזהיר והמדויק של נתיב הלייזר לכיוון המאגר המקיף את קרום השומנים הדו-שכבתי.

השימוש במודל tBLM מציע תכונות איטום חשמליות ברורות המחקות מאפייני קרומי שומנים טבעיים24. tBLMs מספקים גם אזור מאגר יוני מימי בין מצע הזהב לבין הממברנה שנוצרה לאחר מכן, שם המולקולות קשורות ומולקולת spacer היה עובי של 11 Å25, ואת עובי קרום השומנים bilayer היה סביב 6.5 ננומטר19. זה יכול להציע מקום לשלב חלבונים ממברנה, ערוצי יונים או מולקולות פונקציונליות ספציפיות אחרות13,22. הבחירה של 70% DPEPC ו 30% שומנים GDPE מספק איטום אופטימלי של קרום השומנים bilayer כדי לבחון את המאפיינים החשמליים של tBLMs באמצעות מערכת EIS24. כמו כן, כניסתו של כולסטרול בתוך ממברנות השומנים bilayer מחקה מקרוב ממברנות מודל ביומימטי מקורי. moieties כולסטרול לשפר את יציבות קרום השומנים bilayer, כמו גם מזעור חדירות הממברנה ליונים על ידי מתן אריזה גבוהה של bilayer פוספוליפיד26,27. שילוב tBLMs עם מערכת EIS מספק מדידה עקיפה של העברת חום בין GNPs מוקרן וממברנות שומנים דו שכבתיים. יתר על כן, השימוש באלקטרודות זהב coplanar בפרוטוקול זה מאפשר מדידות EIS בזמן אמת ללא כל הפרעה של אלקטרודות התייחסות או נגד.

לזהב בסולם הננו-חלקיקים מאפיינים פיזיים ואופטיים שונים לאגרפי זהב גדולים יותר. הגודל והצורה של ננו-חלקיקים ניגשים להפצה הביולוגית שלהם, לאורך מחזור הדם ולספיגת התאים, שם חלקיקים בגדלים בינוניים (20-60 ננומטר) מציגים ספיגת תאים מקסימלית וכן מציעים שטח פנים גבוה ליחס נפח, המאפשר פונקציונליזציה עוקבת28,29. גודל GNP 30 ננומטר מיושם במחקר זה ייצג גדלי GNPs ביניים, בעוד בחירת אורך הגל לייזר היה על פי שיא הספיגה של GNPs כדי להניב את העירור היעיל ביותר, אשר כתוצאה מכך מוביל לחימום. תאורת הלייזר של משטחי זהב tBLMs מעלה פסגות מוליכת ממברנה בשלב הלייזר ON. זה מוצע להיות כתוצאה של ננו-מבנים משטח זהב בתפזורת אינטראקציה עם לייזר, אשר היה להסוות תופעות ייצור חום בעקבות תוספת של GNPs30. כדי להתגבר על כך, הגישה המפותחת כאן GNPs מוארת באמצעות יישור לייזר אופקי על פני ממשק חיץ השומנים, כפי שמודגם באיור 2, מיקום 3 ו-4.

הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן לשנות בקלות על ידי שינוי הרכב השומנים של הממברנה כדי לחקות סוגי תאים טבעיים שונים, או על ידי שינוי גודל GNPs הציג וצורה כגון 100 ננואורכינים זהב 100 ננואורכינים עם אור קרן הלייזר המתאים19. לאחר מכן ניתן להשתמש בזה כדי לקבוע את ההשפעה של קרינה הנגרמת על סוגי תאים ספציפיים.

לסיכום, פרוטוקול זה משמש biosensor גילוי חזק כדי ללמוד אינטראקציות של GNPs מוקרן במקום עם מודל bilayer קרום השומנים ישויות עניין לענות על שאלות על תופעות העברת חום. זה יסייע בפיתוח טיפולים פוטותרמיים יעילים יותר, כמו גם מתן מידע בעל ערך למנגנונים מפורטים של העברת חום בתוך מערכות ביולוגיות. גישה זו יכולה לשמש ככלי לחיזוי רמת הרס קרום התא שניתן לחוות על ידי חלקיקים מחוממים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על האינטרסים הפיננסיים הבאים / יחסים אישיים, אשר עשוי להיחשב אינטרסים מתחרים פוטנציאליים: פרופ ברוס קורנל הוא מנהל - מדע וטכנולוגיה באבחון כירורגי SDx ממברנות קשורות Pty. בע"מ.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית הגילוי של מועצת המחקר האוסטרלית (DP150101065) ומרכז המחקר ARC לניתוח משתמש קצה ברמות נמוכות (IDEAL) (IH150100028).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles Cytodiagnostics AC-30-04-05 This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles Sigma-Aldrich 753629 This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) NANOCS PG2-BNCS-10k Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S1 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl  SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Tethered molecules
532 nm green laser continuous light OBIS LS/OBIS CORE LS, China ND-1000 The power of this laser was ~135 mW 
tethaPod EIS reader SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-R1 A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-BG Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-A1 Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-T10 Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% 
tethaQuick software SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-B1 Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
 99.9% Pure ethanol Sigma-Aldrich  34963 Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 pH 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Her, S., Jaffray, D. A., Allen, C. Gold nanoparticles for applications in cancer radiotherapy: Mechanisms and recent advancements. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 84-101 (2017).
  2. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. Journal of Nanoparticle Research. 9 (6), 1109-1124 (2007).
  3. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Miller, C. M., Cortie, M. B. A golden bullet? Selective targeting of Toxoplasma gondii tachyzoites using antibody-functionalized gold nanorods. Nano Letters. 7 (12), 3808-3812 (2007).
  4. Zhang, H. -G., Mehta, K., Cohen, P., Guha, C. Hyperthermia on immune regulation: a temperature's story. Cancer Letters. 271 (2), 191-204 (2008).
  5. Gobin, A. M., et al. Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy. Nano Letters. 7 (7), 1929-1934 (2007).
  6. Jackson, J. B., Halas, N. J. Surface-enhanced Raman scattering on tunable plasmonic nanoparticle substrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (52), 17930-17935 (2004).
  7. Emelianov, S. Y., Li, P. -C., O'Donnell, M. Photoacoustics for molecular imaging and therapy. Physics Today. 62 (8), 34 (2009).
  8. Dimitriou, N. M., et al. Gold nanoparticles, radiations and the immune system: Current insights into the physical mechanisms and the biological interactions of this new alliance towards cancer therapy. Pharmacology & Therapeutics. 178, 1-17 (2017).
  9. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979 (1962).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47 (1), 105-113 (1985).
  11. Plant, A. L. Supported hybrid bilayer membranes as rugged cell membrane mimics. Langmuir. 15 (15), 5128-5135 (1999).
  12. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  13. Alghalayini, A., Garcia, A., Berry, T., Cranfield, C. G. The Use of Tethered Bilayer Lipid Membranes to Identify the Mechanisms of Antimicrobial Peptide Interactions with Lipid Bilayers. Antibiotics. 8 (1), 12 (2019).
  14. Khan, M. S., Dosoky, N. S., Williams, J. D. Engineering lipid bilayer membranes for protein studies. International Journal of Molecular Sciences. 14 (11), 21561-21597 (2013).
  15. Urban, P., Kirchner, S. R., Mühlbauer, C., Lohmüller, T., Feldmann, J. Reversible control of current across lipid membranes by local heating. Scientific Reports. 6, 22686 (2016).
  16. Palankar, R., et al. Nanoplasmonically-induced defects in lipid membrane monitored by ion current: transient nanopores versus membrane rupture. Nano Letters. 14 (8), 4273-4279 (2014).
  17. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  18. Plaksin, M., Shapira, E., Kimmel, E., Shoham, S. Thermal transients excite neurons through universal intramembrane mechanoelectrical effects. Physical Review X. 8 (1), 011043 (2018).
  19. Alghalayini, A., et al. Real-time monitoring of heat transfer between gold nanoparticles and tethered bilayer lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 183334 (2020).
  20. Moradi-Monfared, S., Krishnamurthy, V., Cornell, B. A molecular machine biosensor: construction, predictive models and experimental studies. Biosensors and Bioelectronics. 34 (1), 261-266 (2012).
  21. Hoiles, W., Gupta, R., Cornell, B., Cranfield, C., Krishnamurthy, V. The effect of tethers on artificial cell membranes: A coarse-grained molecular dynamics study. PloS One. 11 (10), 0162790 (2016).
  22. Cranfield, C. G., et al. Transient potential gradients and impedance measures of tethered bilayer lipid membranes: pore-forming peptide insertion and the effect of electroporation. Biophysical Journal. 106 (1), 182-189 (2014).
  23. Dombrovsky, L. A. Radiation heat transfer in disperse systems. , Begell House. (1996).
  24. Cornell, B. A., Braach-Maksvytis, V., King, L., Osman, P. A biosensor that uses ion-channel switches. Nature. 387 (6633), 580 (1997).
  25. Maccarini, M., et al. Nanostructural determination of a lipid bilayer tethered to a gold substrate. The European Physical Journal E. 39 (12), 123 (2016).
  26. Beugin-Deroo, S., Ollivon, M., Lesieur, S. Bilayer stability and impermeability of nonionic surfactant vesicles sterically stabilized by PEG-cholesterol conjugates. Journal of Colloid and Interface Science. 202 (2), 324-333 (1998).
  27. Kendall, J. K., et al. Effect of the Structure of Cholesterol-Based Tethered Bilayer Lipid Membranes on Ionophore Activity. ChemPhysChem. 11 (10), 2191-2198 (2010).
  28. Jiang, W., Kim, B. Y., Rutka, J. T., Chan, W. C. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent. Nature Nanotechnology. 3 (3), 145 (2008).
  29. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  30. Wang, F. X., et al. Surface and bulk contributions to the second-order nonlinear optical response of a gold film. Physical Review B. 80 (23), 233402 (2009).

Tags

ביולוגיה גיליון 166 ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות (tBLMs) ביו-סנסור חלקיקי זהב לייזר העברת חום דינמיקה של ממברנה
ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X.,… More

Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X., Yeoh, G. H., Cranfield, C. G., Timchenko, V., Cornell, B. A., Valenzuela, S. M. Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (166), e61851, doi:10.3791/61851 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter