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Biology

सोने के नैनोकणों और लिपिड झिल्ली के बीच हीट ट्रांसफर की निगरानी करने के लिए सीमित बाइलेयर लिपिड झिल्ली

Published: December 8, 2020 doi: 10.3791/61851
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 1,2, 3, 2,4, 1,2,5
1School of Life Sciences, University of Technology Sydney, 2ARC Research Hub for Integrated Devices for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL), Faculty of Science, University of Technology Sydney, 3School of Mechanical and Manufacturing Engineering, The University of New South Wales, 4Surgical Diagnostics Pty Ltd., 5Institute for Biomedical Materials and Devices, University of Technology Sydney

Summary

यह काम लेजर-विकिरणित सोने के नैनोकणों से टीबीएलएमएस तक हीट ट्रांसफर की गतिशील, गैर-आक्रामक निगरानी प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है। यह प्रणाली टीबीएलएमएस में आचरण परिवर्तनों के वास्तविक समय के माप के लिए बाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी को जोड़ती है, जिसमें एक क्षैतिज रूप से केंद्रित लेजर बीम है जो गर्मी उत्पादन के लिए सोने की नैनोपार्टिकल रोशनी को चलाता है।

Abstract

यहां हम सोने के इलेक्ट्रोड पर इकट्ठे हुए सीमित बाइलेयर लिपिड झिल्ली (टीबीएलएमएस) का उपयोग करके इलेक्ट्रोकेमिस्ट्री द्वारा विकिरणित सोने के नैनोकणों (जीएनपीएस) और बाइलेयर लिपिड झिल्ली के बीच गर्मी हस्तांतरण की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। विकिरणित संशोधित जीएनपीएस, जैसे स्ट्रेप्टाविडिन-कंजुगेट जीएनपी, टीबीएलएम में एम्बेडेड हैं, जिनमें लक्ष्य अणु, जैसे बायोटिन शामिल हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, विकिरणित जीएनपी और रुचि की संस्थाओं के साथ मॉडल बाइलेयर लिपिड झिल्ली के बीच गर्मी हस्तांतरण प्रक्रियाओं को क्षैतिज रूप से केंद्रित लेजर बीम द्वारा मध्यस्थता की जाती है। थर्मल भविष्य कहनेवाला कम्प्यूटेशनल मॉडल का उपयोग टीबीएलएमएस में इलेक्ट्रोकेमेमिक रूप से प्रेरित चालकता परिवर्तनों की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। उपयोग की जाने वाली विशिष्ट परिस्थितियों में, गर्मी दालों का पता लगाने के लिए झिल्ली की सतह पर सोने के नैनोकणों के विशिष्ट लगाव की आवश्यकता होती है, जबकि अनबाउंड गोल्ड नैनोकण एक औसत दर्जे की प्रतिक्रिया प्राप्त करने में विफल रहे । यह तकनीक एक शक्तिशाली डिटेक्शन बायोसेंसर के रूप में कार्य करती है जिसका उपयोग थर्मल उपचारों के लिए रणनीतियों के डिजाइन और विकास के लिए सीधे किया जा सकता है जो लेजर मापदंडों, कण आकार, कण कोटिंग्स और संरचना के अनुकूलन की अनुमति देता है।

Introduction

विकिरणित सोने के नैनोमैटेरियल्स का हाइपरथर्मिक प्रदर्शन संक्रमण और ट्यूमर1के लिए न्यूनतम आक्रामक, चयनात्मक, लक्षित उपचार का एक नया वर्ग प्रदान करता है। नैनोकणों के रोजगार जिन्हें लेजर द्वारा गर्म किया जा सकता है , का उपयोग रोगग्रस्त कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से नष्ट करने के साथ - साथ चुनिंदा दवा वितरणकेलिए एक साधन प्रदान करने के लिए किया गयाहै। गर्म प्लाज्मोनिक नैनोकणों की फोटोथर्मोलिसिस घटना का परिणाम कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचाता है। तरल लिपिड बाइलेयर झिल्ली को इस तरह के उपचारों से गुजरने वाली कोशिकाओं के लिए एक विशेष रूप से कमजोर साइट माना जाता है क्योंकि आंतरिक झिल्ली प्रोटीन के साथ-साथ झिल्ली क्षति का विकृति भी कोशिका मृत्यु4का कारण बन सकता है, क्योंकि कोशिका झिल्ली में आयनिक संभावित ढाल को बनाए रखने के लिए कई प्रोटीन हैं। जबकि नैनोस्केल पर हीट ट्रांसफर को निर्धारित करने और निगरानी करने की क्षमता विकिरणित जीएनपीएस1,5,6,7के अध्ययन और अनुप्रयोग के लिए महत्वपूर्ण रुचि है, जीएनपी और जैव-झिल्ली के बीच आणविक बातचीत का आकलन और समझ, साथ ही जैविक ऊतकों में एम्बेडेड जीएनपी की लेजर-प्रेरित हीटिंग घटना के प्रत्यक्ष परिणाम, अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट हो रहे हैं8. इसलिए, विकिरणित जीएनपी की हाइपरथर्मिया प्रक्रिया की पूरी तरह से समझ एक चुनौती बनी हुई है। इस प्रकार, कोशिकाओं के प्राकृतिक परिवेश की नकल करने वाले नैनोमैटेरियल-इलेक्ट्रोड इंटरफ़ेस का विकास एक साधन प्रदान कर सकता है जिसके द्वारा जैविक प्रणालियों के भीतर विकिरणित सोने के नैनोकणों की गर्मी हस्तांतरण विशेषताओं की गहराई से जांच की जा सकती है।

देशी कोशिका झिल्ली की जटिलता कोशिकाओं में विकिरणित जीएनपी इंटरैक्शन को समझने में महत्वपूर्ण चुनौतियों में से एक है। प्राकृतिक लिपिड झिल्ली वास्तुकला और कार्यक्षमता के करीब सरल जैव-मिमेटिक संस्करण प्रदान करने के लिए विकसित विभिन्न कृत्रिम झिल्ली प्लेटफॉर्म हैं, जिनमें काले लिपिड झिल्ली9,समर्थित प्लानर बाइलेयर झिल्ली10,हाइब्रिड बाइलेयर झिल्ली11,पॉलीमर-कुशन लिपिड बाइलेयर झिल्ली12 और सीमित बाइलेयर लिपिड झिल्लीझिल्ली 13शामिल हैं। प्रत्येक कृत्रिम लिपिड झिल्ली मॉडल के प्राकृतिक लिपिड झिल्ली14की नकल करने के संबंध में अलग - अलग फायदे और सीमाएं होती हैं ।

इस अध्ययन में टीबीएम मॉडल का उपयोग करते हुए सोने के नैनोपार्टिकल और लिपिड झिल्ली इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए एक सेंसर के रूप में लिपिड झिल्ली-लेपित इलेक्ट्रोड के रोजगार का वर्णन किया गया है । टीबीएलएम आधारित बायोसेंसर डिटेक्शन योजना अंतर्निहित स्थिरता और संवेदनशीलता प्रदान करती है13 क्योंकि सीमित झिल्ली स्वयं-मरम्मत कर सकती हैं, अन्य प्रणालियों (जैसे पैच-क्लैंप या लिपोसोम्स द्वारा गठित झिल्ली) के विपरीत, जिसमें केवल थोड़ी मात्रा में झिल्ली क्षति के परिणामस्वरूप उनके पतन15,16,17, 18होते हैं। इसके अलावा, क्योंकि टीबीएलएमएसमिमी 2 आयामों के हैं, पृष्ठभूमि बाधा पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग तकनीकों की तुलना में कम परिमाण के आदेश हैं, जो नैनोपार्टिकल इंटरैक्शन के कारण बेसल झिल्ली आयनिक प्रवाह में परिवर्तनों की रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। इसके परिणामस्वरूप, वर्तमान प्रोटोकॉल बाध्य जीएनपीएस द्वारा झिल्ली आचरण में परिवर्तनों के विपरीत हो सकता है जो लेजर से उत्साहित हैं जिनकी शक्तियां 135 एनडब्ल्यू/माइक्रोन2के रूप में कम हैं।

यहां प्रस्तुत प्रणाली सटीक लेजर मापदंडों, कण आकार, कण कोटिंग्स और थर्मल चिकित्सा डिजाइन और विकसित करने के लिए आवश्यक संरचना का निर्धारण करने के लिए एक संवेदनशील और प्रजनन विधि प्रदान करता है । यह उभरते फोटोथर्मल उपचारों के शोधन के साथ-साथ जैविक प्रणालियों के भीतर गर्मी हस्तांतरण के विस्तृत तंत्र के लिए मूल्यवान जानकारी प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित कार्य19पर आधारित है । प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा इस प्रकार है: पहला खंड टीबीएलएम गठन को परिभाषित करता है; दूसरा खंड सेटअप का निर्माण करने और उत्तेजन लेजर स्रोत को संरेखित करने के तरीके को रेखांकित करता है; अंतिम खंड दिखाता है कि विद्युत बाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा से जानकारी कैसे निकाला जाए।

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Protocol

1. टीबीएलएमएस इलेक्ट्रोड तैयारी

  1. पहले मोनोलेयर कोटिंग की तैयारी
    1. एक इथेनॉलिक समाधान में एक हौसले से स्पंदित सोने के पैटर्न वाले इलेक्ट्रोड माइक्रोस्कोप स्लाइड को विसर्जित करें जिसमें 3 एमएमएल 1:9 बेंजाइल-डिसल्फाइड-टेट्रा-एथिलेंगलिकोल-ओह "स्पेसर" अणुओं का अनुपात शामिल है (बेंजाइल डिफाइड में चार ऑक्सीजन-एथिलीन ग्लाइकोल स्पेसर शामिल थे, एक ओह समूह के साथ समाप्त) और बेंजाइल-डिसल्फाइड (टेट्रा-एथिलीनग्लाइलोल) एन = 2 C20-फाइटानिल "सीमित" अणु। यह पहली परत कोटिंग बनाता है जिसमें एक बाइलेयर को लंगर डाला जा सकता है।
      नोट: सोने के इलेक्ट्रोड 100 एनएम वाष्पीकरण द्वारा किया जाता है, 99.9995% सोना (5n5 सोना) फिल्म कस्टम 25 मिमी x 75 मिमी पॉली कार्बोनेट स्लाइड20पर।
    2. कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पहली परत के साथ इलेक्ट्रोड इनक्यूबेट।
    3. 30 एस से अधिक शुद्ध इथेनॉल की प्रचुर मात्रा में विसर्जित करके सोने के इलेक्ट्रोड कुल्ला।
    4. अगले चरण के लिए सीधे पहले मोनोलेयर के साथ गोल्ड इलेक्ट्रोड स्लाइड का उपयोग करें या शुद्ध इथेनॉल से भरे जार में स्टोर करें।
    5. नोट: पहली परत की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए, स्लाइड के सोने के भागों के लिए किसी भी सीधे संपर्क को कम
  2. पहले मोनोलेयर कोटेड स्लाइड कोडांतरण
    1. चिमटी का उपयोग करके अपने कंटेनर से एक सहप्लानर गोल्ड इलेक्ट्रोड स्लाइड को ध्यान से उतारें, यह सुनिश्चित किया जा रहा है कि उन पैटर्न वाले क्षेत्रों के साथ संपर्क न करें जहां टीबीएलएमएस बनेगी।
      नोट: स्लाइड के पक्ष की पहचान करने के लिए ध्यान रखें कि सोना किस पर जमा किया गया है।
    2. किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए 1 - 2 मिनट के लिए एयर ड्राई स्लाइड।
    3. सोने के इलेक्ट्रोड को एक सूखी सतह पर रखें, सुनिश्चित करें कि सोने का इलेक्ट्रोड पैटर्न वाले सोने की सतह के साथ सही ढंग से उन्मुख है।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से परिभाषित करने के लिए एक पतली टुकड़े टुकड़े से पारदर्शी चिपकने वाली परत कवर छील और 6 चैनलों पर जगह है ।
    5. स्लाइड और पारदर्शी चिपकने वाली परत के बीच किसी भी हवा को छोड़ने के लिए एक दबाव रोलर का उपयोग करें, जैसा कि चित्र 1 एमें दिखाया गया है।
      नोट: इस कदम के लिए आवश्यक समय शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी । इस प्रोटोकॉल में, समय 2-3 मिनट से लेकर होते हैं।
    6. पहली परत को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए स्वयं-असेंबली के लिए इकट्ठे पहले मोनोलेयर कोटेड इलेक्ट्रोड के लिए व्यावहारिक (1-2 मिनट के भीतर) के रूप में जल्द ही परिचय दें।
  3. दूसरे लिपिड बाइलेयर की तैयारी
    1. छह कुओं स्लाइड के पहले कुएं के लिए ब्याज की 3 mm लिपिड के 6 μL जोड़ें । माइक्रोपिपेट टिप के किनारे को सोने की सतह को छूने न दें, जो इलेक्ट्रोड पर सीमित रसायनों को नुकसान पहुंचा सकता है।
      नोट: इस काम में उपयोग किए जाने वाले लिपिड मिश्रण में 3 एमएमएम 70% zwitterionic C20 डिफिटानिल-ईथर-ग्लाइसेरो-फॉस्फेटिडिलकोलिन (डीपीईपीसी) और 30% C20 डिफिटानिल्डिगलाइजर एथर लिपिड (जीडीपीई) शामिल थे जो 50:1 मोलर अनुपात में 3 m कोलेस्ट्रॉल-पेग-बायोटिन के साथ मिश्रित थे।
    2. प्रत्येक अतिरिक्त के बीच 10 एस अंतर के साथ अन्य कुओं के लिए लिपिड मिश्रण के 6 μL परिचय।
    3. पीबीएस जैसे बफर के साथ इलेक्ट्रोड पर लिपिड मिश्रण का आदान-प्रदान करने से पहले कमरे के तापमान पर ठीक से 2 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से इनक्यूबेट करें। अंतरिक्ष के अलावा और बफर एक्सचेंज के लिए समय 10 एस के अलावा तो प्रत्येक अच्छी तरह से ठीक 2 मिनट प्रत्येक के लिए लिपिड के साथ इनक्यूबेटेड है ।
    4. पीबीएस बफर (पीएच 7.0) के 50 माइक्रोन के साथ 3 बार और धोएं। हर समय इलेक्ट्रोड पर बफर के 50 माइक्रोन छोड़ना सुनिश्चित करें। इलेक्ट्रोड को सूखने न दें।
      नोट: इस तरह से जलीय समाधान के साथ इथेनॉल सॉल्वेंट विस्थापित (विलायक विनिमय विधि)सीमित रसायनों के माध्यम से सोने के इलेक्ट्रोड के लिए लंगर डाले एक लिपिड बाइलेयर के तेजी से गठन में सक्षम बनाता है ।
  4. विद्युत बाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईआईएस) माप का उपयोग करके टीबीएलएम गठन का परीक्षण
    1. तैयार इलेक्ट्रोड स्लाइड को एसी इम्पेंस स्पेक्ट्रोमीटर (जैसे, टेथापॉड) में डालें। सुनिश्चित करें कि स्पेक्ट्रोमीटर एक यूएसबी पोर्ट के माध्यम से सॉफ्टवेयर चलाने वाले कंप्यूटर से जुड़ा हुआ है।
    2. सॉफ्टवेयर खोलें, सेटअप और ओपन हार्डवेयरपर क्लिक करें।
    3. 25 एमवी पीक-टू-पीक एसी एक्सटिटेशन का उपयोग करने के लिए हार्डवेयर सेटिंग्स सेट करें।
    4. तेजी से बाधा उपायों के लिए प्रति दशक दो कदम के साथ 0.1 और 10,000 हर्ट्ज के बीच आवृत्तियों सेट ठीक प्रेस।
    5. सेटअप मेनू और ओपन मॉडलपर क्लिक करें ।
    6. एक समकक्ष सर्किट मॉडल का उपयोग करें जो टेदरिंग गोल्ड इलेक्ट्रोड को श्रृंखला में एक निरंतर चरण तत्व के रूप में वर्णन करता है जिसमें इलेक्ट्रोलाइट बफर और लिपिड बाइलेयर का वर्णन करने के लिए एक समानांतर प्रतिरोधक-कैपेसिटर नेटवर्क का वर्णन किया जाता है, और ठीक प्रेस करता है।
    7. झिल्ली क्षमता (सीएम)और झिल्ली चालन (जी एम) का वास्तविक समय माप शुरू करने के लिए स्टार्ट बटनदबाएं। विशिष्ट टीबीएलएमएस के सीएम मूल्य 12.5 एनएफ से 15.5 एनएफ की सीमा में होने चाहिए 10% सीमित रसायन21,22के लिए।
    8. प्रोटोकॉल चलाने और प्रयोग खत्म करने के बाद, डेटा को सेव करें।
    9. माप को अगले कुएं से दोहराएं।

2. लेजर विकिरण

  1. प्रायोगिक सेटअप
    नोट: कस्टम-निर्मित प्रणाली प्रत्येक टीबीएलएम के लिए व्यक्तिगत रूप से अच्छी तरह से स्थापित की गई है।
    1. लेजर को खतरनाक ढंग से कम करने के लिए एक लाइट प्रूफ बॉक्स में प्रयोग करें।
    2. अवांछित कंपन को कम करने के लिए प्रयोग स्थापित करने के लिए एक प्रकाशिकी तालिका का उपयोग करें।
    3. बाधा पाठक रखें, जहां सोने की स्लाइड जुड़ा हुआ है, एक XYZ मंच पर और इस तरह तरक्की है कि यह लेजर स्रोत के रास्ते में बैठता है ।
    4. उचित परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए लेजर स्रोत की ऊंचाई को नियंत्रित करने के लिए मोटे-ठीक फोकसिंग माइक्रोस्कोपिक गियरिंग का उपयोग करें।
    5. इलेक्ट्रोड स्लाइड की देशांतर धुरी के साथ लेजर पथ को निशाना बनाते हैं।
      सावधानी: हमेशा उपयुक्त लेजर सुरक्षा चश्मा पहनें और अच्छे लेजर सुरक्षा प्रोटोकॉल बनाए रखें।
    6. प्रयोग शुरू करने से पहले चयनित देखते लेजर को स्थिर करने की अनुमति दें।
      नोट: प्रायोगिक सेटअप का एक योजनाबद्ध चित्रा 2Aमें सचित्र है ।
  2. लेजर और गोल्ड इलेक्ट्रोड का संरेखण
    नोट: शुरुआत से पहले, हमेशा एक बिजली मीटर का उपयोग कर लेजर बिजली उत्पादन का आकलन करने के लिए सुनिश्चित करें कि केवल बहुत कम वाट tBLMs को दिया जाता है ।
    1. या तो लेजर पथ या इलेक्ट्रोड के कोण को समायोजित करें ताकि लेजर इलेक्ट्रोड को कवर करने वाले तरल से गुजरता है और सोने की सतह पर समान रूप से दिखाई देता है।
    2. झिल्ली आचरण में परिवर्तन देखते हुए ठीक समायोजन का उपयोग कर लेजर बीम स्रोत को बढ़ाकर या कम करके प्रत्येक प्रयोग के लिए लेजर बीम प्रकाश स्थिति को समायोजित करें।
    3. जब कोई आचरण परिवर्तन नहीं होते हैं तो लेजर पथ की स्थिति को सुरक्षित करने के लिए घुंडी को लॉक करें।
      नोट: जब लेजर अंतर्निहित सोने के इलेक्ट्रोड के साथ बातचीत करता है तो बढ़ी हुई झिल्ली चालन मूल्य उत्पन्न होंगे। इसलिए लेजर पाथ को एडजस्ट करना जरूरी है, ताकि ऐसी कोई बातचीत संभव न हो।
  3. नमूना तैयार करना
    1. लेजर बीम लाइट अलाइनमेंट (जहां झिल्ली चालन में कोई परिवर्तन नहीं है) तैयार करें, जैसा कि चित्र 2,स्थिति 3 में दिखाया गया है।
    2. पीबीएस बफर में ब्याज (कार्यात्मक या नंगे) के जीएनपी जोड़ें जिसमें लेजर बंद होने के दौरान टीबीएलएमएस डूब जाता है।
    3. टीबीएलएमएस के आसपास के पीबीएस बफर को धीरे से तीन बार मिलाएं, इलेक्ट्रोड को छूने के लिए सावधान रहें।
    4. कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    5. लेजर को विकिरणित नमूने पर चालू करें, सही गठबंधन लेजर बीम लाइट पोजीशन का उपयोग करके जैसा कि चित्र 2,स्थिति 3 में देखा गया है।
    6. लेजर लाइट वेवलेंथ के साथ जीएनपी आकार, आकार और एकाग्रता के उपयुक्त संयोजन का उपयोग करें।
      नोट: सेट तरंगदैर्ध्य के लेजर बीम इसी GNP प्लाज्मन अनुनाद आवृत्ति के लिए कुछ करना चाहिए ।
    7. रिकॉर्ड वर्तमान लगातार मापा (वास्तविक समय माप) ।
    8. नियंत्रण प्रयोगों के लिए जीएनपी अतिरिक्त को छोड़ते हुए चरण 2.2.1 - 2.3.7 करें।

3. सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति

  1. डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
  2. समय बनाम झिल्ली आचरण पैरामीटर निकालें।
  3. सही स्थिति के साथ और जीएनपी परिचय से पहले लेजर बीम लाइट सेट करने के बाद रिकॉर्ड किए गए डेटा का उपयोग करें।
  4. बेसलाइन झिल्ली चालन पर मापा झिल्ली आचरण को विभाजित करके डेटा को सामान्य करें।
    नोट: यह इस बात की पुष्टि करता है कि शुरू किए गए विकिरणित जीएनपी द्वारा प्राप्त झिल्ली चालन मूल्यों में सापेक्ष परिवर्तन।
  5. समय के भूखंडों (एक्स-एक्सिस) बनाम सामान्यीकृत झिल्ली चालन (वाई-एक्सिस) के रूप में वर्तमान डेटा।

4. किरणित नैनोकणों (थर्मल भविष्य कहनेवाला मॉडल) से टीबीएलएमएस में उत्पन्न स्थानीयकृत गर्मी की मात्रा की भविष्यवाणी करें

  1. डोंब्रोवस्की23के अनुसार विकिरण हस्तांतरण समस्या का समाधान, विकिरणित नैनोपार्टिकल समाधानों में अवशोषित विकिरण शक्ति की गणना करने के लिए।
  2. ऊर्जा समीकरण में अवशोषित विकिरण के कारण गर्मी स्रोत को शामिल करके गर्मी उत्पादन की गणना करें।
    नोट: किरणित नैनोकणों और नैनोमटेरियल-इलेक्ट्रोड इंटरफेस से टीबीएलएमएस में गर्मी उत्पादन के संख्यात्मक विश्लेषण के विस्तृत विवरण के लिए, 19को देखें ।

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Representative Results

सोने की सब्सट्रेट जिस पर टीबीएलएमएस बनाया जा सकता है , उसे चित्र 1में दिखाया गया है । प्रायोगिक सेटअप की एक योजनाबद्ध चित्रा 2में प्रस्तुत की गई है ।

कोप्लैनर गोल्ड इलेक्ट्रोड, जैसा कि चित्र 1 एमें दिखाया गया है, पैटर्न वाले सोने के सरणी के साथ 25 मिमी x 75 मिमी x 1 मिमी पॉली कार्बोनेट बेस सब्सट्रेट से बने होते हैं। एक पारदर्शी चिपकने वाली परत छह व्यक्तिगत मापने वाले कक्षों को परिभाषित करती है। कोप्लैनर गोल्ड इलेक्ट्रोड टीबीएलएमएस झिल्ली को लेजर लाइट के सीधे एक्सपोजर की अनुमति देता है। इलेक्ट्रोड सरणी के प्रत्येक कुएं में एक सर्कल के आकार का काम करने वाला इलेक्ट्रोड (क्षेत्र: 0.707 सेमी2)और आधा-सर्कल आकार का काउंटर इलेक्ट्रोड या कोप्लैनर इलेक्ट्रोड (क्षेत्र: ~ 0.725 सेमी2),जो ~ 2 मिमी के अंतर से अलग होते हैं। पारदर्शी चिपकने वाली परत बाकी जमा सोने को थोक इलेक्ट्रोलाइट से बचाती है। इसके विपरीत, अंतर्निहित सोने का लेआउट एक संदर्भ इलेक्ट्रोड की आवश्यकता के बिना ईआईएस रीडर को विद्युत कनेक्शन प्रदान करने के लिए मापने वाले कक्षों के बाहर के क्षेत्रों से संपर्क करने के लिए काम करने वाले इलेक्ट्रोड को जोड़ता है।

लेजर पथ एक तरह से गठबंधन किया है जहां यह टीबीएलएमएस के साथ बातचीत कर रहा है और इसके आसपास तरल बफर के माध्यम से बिखरा हुआ है, लेकिन ऐसा नहीं है कि यह अंतर्निहित सोने के सब्सट्रेट के साथ बातचीत कर सकता है। यह आसानी से क्षैतिज स्थापना और लेजर को कम करने के माध्यम से निर्धारित किया जाता है जब तक सही स्थिति स्थापित नहीं होती है। यह स्थिति सिर्फ उस बिंदु पर है जहां झिल्ली संचालन में कोई परिवर्तन नहीं देखा जा सकता है। यह देखते हुए कि टीबीएलएमएस थोक सोने की एक सब्सट्रेट परत के लगाव से बनते हैं, यह संभावना है कि चित्रा 2 में स्थिति 1 और 2 पर झिल्ली आचरण में परिवर्तन स्पंदित थोक सोने की परत के भीतर नैनोस्ट्रक्चर के साथ लेजर की बातचीत से गर्मी का परिणाम है। इस प्रकार, क्षैतिज प्रकाश बीम संरेखण की सटीक स्थिति का उपयोग लेजर प्रकाश और थोक सोने के सब्सट्रेट के बीच बातचीत को नष्ट करने पर ध्यान केंद्रित टीबी के नीचे पाया ।

क्षैतिज लेजर प्रकाश को सीधे सोने के इलेक्ट्रोड की ओर ध्यान केंद्रित करने से झिल्ली संचालन में वृद्धि होती है, जैसा कि चित्र 2,स्थिति 1 और 2 में प्रस्तुत किया गया है। सटीक लेजर स्थिति लेजर पर और लेजर बंद(चित्रा 2B,स्थिति 3) की दोनों अवधियों के दौरान झिल्ली चालन रिकॉर्डिंग के लिए नगण्य भिन्नता का पता चला । जीएनपी नमूना बेसलाइन रिकॉर्डिंग स्थापित करने के बाद जोड़ा गया था, जैसा कि चित्रा 2,स्थिति 3 में दिखाया गया है। स्ट्रेप्टाविडिन-कंजूसेड 30 एनएम सोने के नैनोकणों के अलावा टीबीएलएम में जिसमें बायोटिनाइलेटेड कोलेस्ट्रॉल होता था, लेजर ऑन और ऑफ पीरियड के बीच स्पष्ट अंतर दिखाता है, साथ ही स्थिति 3 की तुलना में, लेजर ऑन फेज(चित्रा 2 बी,स्थिति 4) के दौरान आचरण आयाम में विशिष्ट वृद्धि के साथ।

Figure 1
चित्रा 1:सोने के सब्सट्रेट पर सीमित बाइलेयर लिपिड झिल्ली (टीबीएलएम) मॉडल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (क) छह कुओं के साथ कोप्लैनर गोल्ड इलेक्ट्रोड स्लाइड, अंततः एक पतली पारदर्शी चिपकने वाली परत के अलावा द्वारा परिभाषित किया गया । (ख) टीबीएलएम मॉडल में पहली परत बनाने के लिए सोने की सब्सट्रेट सतह पर हाइड्रोफोबिक फाइटानाइल चेन के साथ समाप्त होने वाले स्पेसर (एथिलीन ग्लाइकोल चेन) और टेथिलीन ग्लाइकोल समूह शामिल हैं । दूसरी परत में गैर-सीमित लिपिड शामिल हैं। संशोधित आंकड़ा कॉर्नेल एट अल24पर आधारित था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:लेजर रोशनी (λ = 530 एनएम) से उत्पन्न होने वाले टीबीएलएम में संरेखण और इसी मापने वाली झिल्ली संचालन परिवर्तनों के लिए परख सेट-अप का चित्रण। (क) क्षैतिज लेजर संरेखण के विभिन्न पदों का योजनाबद्ध प्रतिनिधि; जहां स्थिति 1: लेजर लाइट बीम सोने के सब्सट्रेट के साथ गठबंधन (जब लेजर चालू किया गया था लाल रंग में इंगित किया जाता है); स्थिति 2 क्षैतिज लेजर प्रकाश झिल्ली और सोने के सब्सट्रेट के साथ मिश्रित; स्थिति 3 लेजर प्रकाश थोक तरल पदार्थ आसपास के टीबीएलएमएस में केंद्रित; स्थिति 4 लेजर बीम प्रकाश स्ट्रेप्टाविडिन-कंजूसी 30 एनएम गोलाकार जीएनपी की उपस्थिति में टीबीएलएम के आसपास के तरल पदार्थ में केंद्रित है। (बी) समय के साथ सामान्यीकृत आचरण रिकॉर्डिंग विभिन्न संरेखण स्थितियों के अनुरूप है। जीएनपी की अनुपस्थिति में टीबीएलएम के 1, 2 और 3 माप, जबकि स्थिति 4 स्ट्रेप्टाविडिन-कंफर्म 30 एनएम गोलाकार जीएनपी की उपस्थिति में टीबीएलएम चालन का माप है। झिल्ली चालन मूल्यों को टीबीएलएमएस गठन पर झिल्ली चालन के प्रारंभिक मूल्य के लिए सामान्यीकृत किया गया था। परिणाम कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल एक क्षैतिज लेजर संरेखण स्थापित करने के साथ संयोजन इलेक्ट्रोड सब्सट्रेट के साथ टीबीएलएम मॉडल के उपयोग का वर्णन करता है जो सोने के नैनोकणों के लेजर विकिरण के जवाब में वास्तविक समय विद्युत बाधा रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। यहां प्रस्तुत ईआईएस रिकॉर्डिंग की विधि झिल्ली में आयन वर्तमान परिवर्तनों की रिकॉर्डिंग प्रदान करने के लिए आवश्यक प्रयोगों की एक न्यूनतम सूची का निर्माण करती है, जो युग्मित लेजर और सोने के नैनोपार्टिकल इंटरैक्शन द्वारा उत्पन्न गर्मी से मेल खाती है। इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है, जो बाइलेयर लिपिड झिल्ली के आसपास के बफर की ओर लेजर पथ का सावधान और सटीक संरेखण है।

टीबीएलएम मॉडल का उपयोग अलग विद्युत सीलिंग गुण प्रदान करता है जो प्राकृतिक लिपिड झिल्ली की विशेषताओं की नकल करता है24. टीबीएलएम सोने के सब्सट्रेट और बाद में गठित झिल्ली के बीच एक जलीय आयनिक जलाशय क्षेत्र भी प्रदान करता है, जहां सीमित अणुओं और स्पेसर अणु में 11 Å25की मोटाई थी, और बिलेयर लिपिड झिल्ली की मोटाई लगभग 6.5 एनएम19थी। यह झिल्ली प्रोटीन, आयन चैनल या अन्य विशिष्ट कार्यात्मक अणुओं13,22को शामिल करने के लिए जगह प्रदान कर सकता है। 70% डीपीईपीसी और 30% जीडीपीई लिपिड का चयन ईआईएस सिस्टम24का उपयोग करके टीबीएलएमएस की विद्युत विशेषताओं की जांच करने के लिए बाइलेयर लिपिड झिल्ली की इष्टतम सीलिंग प्रदान करता है। इसी तरह, बाइलेयर लिपिड झिल्ली के भीतर कोलेस्ट्रॉल की शुरूआत देशी बायोमिमेटिक मॉडल झिल्ली की बारीकी से नकल करती है। कोलेस्ट्रॉल मोइलिएटीज बाइलेयर लिपिड झिल्ली स्थिरता में सुधार करते हैं, साथ ही फॉस्फोलिपिड बाइलेयर26, 27की उच्च पैकिंग प्रदान करके आयनों की झिल्ली पारग्लीक्षता को कमकरतेहैं। ईआईएस प्रणाली के साथ टीबीएलएमएस का संयोजन विकिरणित जीएनपी और बाइलेयर लिपिड झिल्ली के बीच गर्मी हस्तांतरण का अप्रत्यक्ष माप प्रदान करता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में कोप्लैनर गोल्ड इलेक्ट्रोड का उपयोग संदर्भ या काउंटर इलेक्ट्रोड से किसी भी हस्तक्षेप के बिना वास्तविक समय ईआईएस माप को सक्षम बनाता है।

नैनोपार्टिकल स्केल में सोने में बड़े सोने के समुच्चय के लिए विभिन्न भौतिक और ऑप्टिकल विशेषताएं होती हैं। नैनोपार्टिकल का आकार और आकार उनके जैव-वितरण, परिसंचरण जीवनकाल और सेल तेज तक पहुंचता है, जहां मध्यवर्ती आकार (20-60 एनएम) के नैनोकण अधिकतम सेल तेज प्रदर्शित करते हैं और साथ ही मात्रा अनुपात में उच्च सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं, जिससे बाद में कार्यात्मकता28, 29की अनुमति होती है। इस अध्ययन में लागू 30 एनएम जीएनपी आकार मध्यवर्ती जीएनपी आकार का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि लेजर तरंगदैर्ध्य चयन जीएनपी के अवशोषण शिखर के अनुसार सबसे कुशल उत्तेजन पैदा करने के लिए था, जिसके परिणामस्वरूप हीटिंग होती है। टीबीएलएमएस सोने की सतहों की लेजर रोशनी चरण पर लेजर पर झिल्ली चालन चोटियों उठ । यह थोक सोने की सतह नैनोस्ट्रक्चर के परिणामस्वरूप प्रस्तावित है जो लेजर के साथ बातचीत करते हैं, जो जीएनपीएस30के अलावा गर्मी उत्पादन घटनाओं को मुखौटा करेगा। इसे दूर करने के लिए, यहां विकसित दृष्टिकोण जीएनपी लिपिड-बफर इंटरफेस में क्षैतिज लेजर संरेखण का उपयोग करके प्रकाशित किया जाता है, जैसा कि चित्र 2,स्थिति 3 और 4 में दर्शाया गया है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को विभिन्न प्राकृतिक कोशिका प्रकारों की नकल करने के लिए झिल्ली की लिपिड संरचना में फेरबदल करके या पेश किए गए जीएनपी आकार और आकार जैसे 100 एनएम सोने के नैनोचुरीश को इसी लेजर बीम लाइट19के साथ बदलकर आसानी से संशोधित किया जा सकता है। इसके बाद इसका उपयोग विशिष्ट सेल प्रकारों पर स्थानीयकृत जीएनपी प्रेरित विकिरण के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल हीट ट्रांसफर घटनाओं पर सवालों के जवाब देने के लिए रुचि के मॉडल बाइलेयर लिपिड झिल्ली संस्थाओं के साथ सीटू किरणित जीएनपी में बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत पहचान बायोसेंसर के रूप में कार्य करता है। यह अधिक कुशल फोटोथर्मल उपचार विकसित करने में सहायता करेगा, साथ ही जैविक प्रणालियों के भीतर गर्मी हस्तांतरण के विस्तृत तंत्र के लिए मूल्यवान जानकारी प्रदान करेगा। इस दृष्टिकोण का उपयोग कोशिका झिल्ली विनाश के स्तर की भविष्यवाणी के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है जिसे इन गर्म नैनोकणों द्वारा अनुभव किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक निम्नलिखित वित्तीय हितों/व्यक्तिगत संबंधों की घोषणा करते हैं, जिन्हें संभावित प्रतिस्पर्धी हितों के रूप में माना जा सकता है: प्रो ब्रूस कॉर्नेल सर्जिकल डायग्नोस्टिक्स एसडीएक्स सीमित झिल्ली Pty. लिमिटेड में निदेशक-विज्ञान और प्रौद्योगिकी है ।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल (एआरसी) डिस्कवरी प्रोग्राम (DP150101065) और एआरसी रिसर्च हब फॉर इंटीग्रेटेड डिवाइस फॉर एंड-यूजर एनालिसिस एट लो-लेवल्स (आदर्श) (IH150100028) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles Cytodiagnostics AC-30-04-05 This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles Sigma-Aldrich 753629 This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) NANOCS PG2-BNCS-10k Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S1 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl  SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Tethered molecules
532 nm green laser continuous light OBIS LS/OBIS CORE LS, China ND-1000 The power of this laser was ~135 mW 
tethaPod EIS reader SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-R1 A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-BG Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-A1 Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-T10 Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% 
tethaQuick software SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-B1 Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
 99.9% Pure ethanol Sigma-Aldrich  34963 Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 pH 7

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References

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जीव विज्ञान अंक 166 टेथेर्ड बाइलेयर लिपिड झिल्ली (टीबीएलएम) बायोसेंसर गोल्ड नैनोकण लेजर हीट ट्रांसफर झिल्ली गतिशीलता
सोने के नैनोकणों और लिपिड झिल्ली के बीच हीट ट्रांसफर की निगरानी करने के लिए सीमित बाइलेयर लिपिड झिल्ली
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Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X., Yeoh, G. H., Cranfield, C. G., Timchenko, V., Cornell, B. A., Valenzuela, S. M. Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (166), e61851, doi:10.3791/61851 (2020).

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