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Biology

Membranas lipídicas bicapa atadas para monitorear la transferencia de calor entre las nanopartículas de oro y las membranas lipídicas

Published: December 8, 2020 doi: 10.3791/61851
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 1,2, 3, 2,4, 1,2,5
1School of Life Sciences, University of Technology Sydney, 2ARC Research Hub for Integrated Devices for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL), Faculty of Science, University of Technology Sydney, 3School of Mechanical and Manufacturing Engineering, The University of New South Wales, 4Surgical Diagnostics Pty Ltd., 5Institute for Biomedical Materials and Devices, University of Technology Sydney

Summary

Este trabajo describe un protocolo para lograr un monitoreo dinámico y no invasivo de la transferencia de calor de las nanopartículas de oro irradiadas por láser a las tBLM. El sistema combina la espectroscopia de impedancia para la medición en tiempo real de los cambios de conductancia a través de los tBLM, con un rayo láser enfocado horizontalmente que impulsa la iluminación de nanopartículas de oro, para la producción de calor.

Abstract

Aquí informamos de un protocolo para investigar la transferencia de calor entre las nanopartículas de oro irradiadas (GNPs) y las membranas lipídicas bicapa por electroquímica utilizando membranas lipídicas bicapa atadas (tBLMs) ensambladas en electrodos de oro. Los GNP modificados irradiados, como los GNP conjugados con estreptavidina, están incrustados en tBLM que contienen moléculas diana, como la biotina. Mediante el uso de este enfoque, los procesos de transferencia de calor entre los GNP irradiados y la membrana lipídica bicapa modelo con entidades de interés están mediados por un rayo láser enfocado horizontalmente. El modelo computacional predictivo térmico se utiliza para confirmar los cambios de conductancia inducidos electroquímicamente en los tBLM. Bajo las condiciones específicas utilizadas, la detección de pulsos de calor requirió la unión específica de las nanopartículas de oro a la superficie de la membrana, mientras que las nanopartículas de oro no unidas no lograron provocar una respuesta medible. Esta técnica sirve como un potente biosensor de detección que se puede utilizar directamente para el diseño y desarrollo de estrategias para terapias térmicas que permiten la optimización de los parámetros del láser, el tamaño de partícula, los recubrimientos de partículas y la composición.

Introduction

El rendimiento hipertérmico de los nanomateriales de oro irradiados ofrece una nueva clase de tratamiento mínimamente invasivo, selectivo y dirigido para infecciones y tumores1. El empleo de nanopartículas que pueden ser calentadas por un láser se ha utilizado para destruir selectivamente las células enfermas, así como para proporcionar un medio para la administración selectiva de fármacos2,3. Una consecuencia del fenómeno de fototermólisis de las nanopartículas plasmónicas calentadas es el daño a las membranas celulares. La membrana bicapa lipídica fluida se considera un sitio particularmente vulnerable para las células que se someten a tales tratamientos porque la desnaturalización de las proteínas intrínsecas de la membrana, así como el daño de la membrana también pueden conducir a la muerte celular4,ya que muchas proteínas están allí para mantener el gradiente de potencial iónico a través de las membranas celulares. Si bien la capacidad de determinar y monitorear la transferencia de calor a nanoescala es de interés clave para el estudio y la aplicación de los GNP irradiados1,5,6,7, la evaluación y comprensión de las interacciones moleculares entre los GNP y las biomembranas, así como las consecuencias directas de los fenómenos de calentamiento inducidos por láser de los GNP incrustados en los tejidos biológicos, aún no se han dilucidado completamente8. Por lo tanto, una comprensión profunda del proceso de hipertermia de los GNP irradiados sigue siendo un desafío. Como tal, el desarrollo de una interfaz nanomaterial-electrodo que imite el entorno natural de las células podría proporcionar un medio para llevar a cabo una investigación en profundidad de las características de transferencia de calor de las nanopartículas de oro irradiadas dentro de los sistemas biológicos.

La complejidad de las membranas celulares nativas es uno de los desafíos significativos en la comprensión de las interacciones de los GNP irradiados en las células. Se han desarrollado varias plataformas de membrana artificial para proporcionar versiones bio-miméticas simples cercanas de la arquitectura y funcionalidad de la membrana lipídica natural, incluidas, entre otras, membranas lipídicas negras9,membranas bicapa planas compatibles10,membranas bicapa híbridas11,membranas bicapa lipídicas amortiguadas con polímeros12 y membranas lipídicas bicapa atadas13. Cada modelo de membrana lipídica artificial tiene claras ventajas y limitaciones con respecto a imitar las membranas lipídicas naturales14.

Este estudio describe el empleo de electrodos recubiertos de membrana lipídica como sensor para evaluar las interacciones de nanopartículas de oro y membrana lipídica, utilizando el modelo tBLM. El esquema de detección de biosensores basado en tBLM proporciona estabilidad y sensibilidad inherentes13 ya que las membranas atadas pueden autorrepararse, a diferencia de otros sistemas (como las membranas formadas por patch-clamp o liposomas) en los que solo una pequeña cantidad de daño a la membrana resulta en su colapso15,16,17,18. Además, debido a que los tBLM son de dimensiones mm2, la impedancia de fondo es órdenes de magnitud más baja que las técnicas de registro de pinza de parche, lo que permite un registro de los cambios en el flujo iónico de la membrana basal debido a las interacciones de nanopartículas. Como resultado de esto, el presente protocolo puede contrastar los cambios en la conductancia de la membrana por GNP unidos que son excitados por láseres cuyas potencias son tan bajas como 135 nW / μm2.

El sistema presentado aquí proporciona un método sensible y reproducible para determinar parámetros láser precisos, tamaño de partícula, recubrimientos de partículas y composición necesarios para diseñar y desarrollar terapias térmicas. Esto es fundamental para el refinamiento de las terapias fototérmicas emergentes, así como para ofrecer información valiosa para mecanismos detallados de transferencia de calor dentro de los sistemas biológicos. El protocolo presentado se basa en el trabajo publicado anteriormente19. Un esquema del protocolo es el siguiente: la primera sección define la formación de tBLM; la segunda sección describe cómo construir la configuración y alinear la fuente láser de excitación; la sección final ilustra cómo extraer información de los datos de espectroscopia de impedancia eléctrica.

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Protocol

1. Preparación de electrodos tBLM

  1. Preparación del primer recubrimiento monocapa
    1. Sumergir un portaobjetos de microscopio de electrodo con patrón de oro recién pulverizado en una solución etanólica compuesta por una proporción de 3 mM 1: 9 de moléculas "espaciadoras" de bencil-disulfuro-tetra-etilenglicol-OH (el disulfuro de bencilo comprendía un espaciador de cuatro oxígeno-etilenglicol, terminado con un grupo OH) y bencil-disulfuro (tetra-etilenglicol) n = 2 moléculas "atadas" de C20-fitetil. Esto crea el recubrimiento de la primera capa a la que se puede anclar una bicapa.
      NOTA: El electrodo de oro se fabrica evaporando 100 nm, 99.9995% de oro (5n5 de oro) en diapositivas de policarbonato personalizadas de 25 mm x 75 mm20.
    2. Incubar electrodos con la primera capa a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
    3. Enjuague los electrodos de oro sumergiéndose en copiosas cantidades de etanol puro durante 30 s.
    4. Use la corredera de electrodo de oro con la primera monocapa directamente para el siguiente paso o guárdelo en un frasco lleno de etanol puro.
    5. NOTA: Para garantizar la integridad de la primera capa, minimice cualquier contacto directo con las partes doradas de la diapositiva
  2. Montaje de la primera corredera recubierta monocapa
    1. Retire con cuidado un portaobjetos de electrodo de oro coplanar de su recipiente con pinzas, asegurándose de no hacer contacto con las áreas estampadas donde se formarán los tBLM.
      NOTA: Tenga en cuenta identificar el lado de la diapositiva en el que se deposita el oro.
    2. Deslizamiento seco al aire durante 1 - 2 minutos para eliminar cualquier etanol residual.
    3. Coloque el electrodo de oro sobre una superficie seca, asegúrese de que el electrodo de oro esté correctamente orientado con la superficie de oro estampada hacia arriba.
    4. Pelar la cubierta de la capa adhesiva transparente de un laminado delgado y colocar sobre los 6 canales para definir cada pozo.
    5. Utilice un rodillo de presión para liberar aire entre la corredera y la capa adhesiva transparente, como se muestra en la Figura 1A.
      NOTA: El tiempo requerido para este paso deberá ser optimizado por el investigador. En este protocolo, los tiempos oscilan entre 2-3 min.
    6. Introduzca tan pronto como sea posible (dentro de 1-2 minutos) la segunda bicapa lipídica en el primer electrodo recubierto monocapa ensamblado para autoensamblaje para evitar dañar la primera capa.
  3. Preparación de la segunda bicapa lipídica
    1. Agregue 6 μL de lípidos de 3 mM de interés al primer pozo de la diapositiva de seis pozos. No deje que el borde de la punta de la micropipeta toque la superficie de oro, lo que puede dañar las químicas atadas en el electrodo.
      NOTA: La mezcla lipídica utilizada en este trabajo consistió en 3 mM 70% de lípidos zwitteriónicos C20 difirtanil-éter-glicero-fosfatidilcolina (DPEPC) y 30% de lípidos éter de difitilicéridos C20 (GDPE) mezclados con 3 mM de colesterol-PEG-Biotina en proporción molar 50:1.
    2. Introducir 6 μL de la mezcla lipídica en los otros pozos con un espacio de 10 s entre cada adición.
    3. Incubar cada pozo durante exactamente 2 minutos a temperatura ambiente antes de intercambiar la mezcla de lípidos sobre los electrodos con un tampón como PBS. Espaciar los tiempos para la adición y el intercambio de tampón a 10 s de distancia para que cada pozo se incube con el lípido durante exactamente 2 minutos cada uno.
    4. Lavar 3 veces más con 50 μL de tampón PBS (pH 7.0). Asegúrese de dejar 50 μL de tampón sobre los electrodos en todo momento. No permita que los electrodos se sequen.
      NOTA: El desplazamiento del disolvente de etanol con la solución acuosa de esta manera (el método de intercambio de disolvente)permite la rápida formación de una sola bicapa lipídica anclada al electrodo de oro a través de las químicas atadas.
  4. Prueba de la formación de tBLM mediante mediciones de espectroscopia de impedancia eléctrica (EIS)
    1. Inserte la diapositiva de electrodo preparada en un espectrómetro de impedancia de CA (por ejemplo, Tethapod). Asegúrese de que el espectrómetro esté conectado a través de un puerto USB a una computadora que ejecute el software.
    2. Abra el software, haga clic en Configuración y abra Hardware.
    3. Establezca la configuración de hardware para usar la excitación de CA de pico a pico de 25 mV.
    4. Establezca frecuencias entre 0.1 y 10,000 Hz con dos pasos por década para medidas de impedancia rápida presione ok.
    5. Haga clic en el menú Configuración y abra Modelo.
    6. Utilice un modelo de circuito equivalente que describa el electrodo de oro de anclaje como un elemento de fase constante en serie con una resistencia que describa el tampón electrolítico y una red paralelo resistencia-condensador para describir la bicapa lipídica, y presione OK.
    7. Pulse el botón Inicio para iniciar una medición en tiempo real de la capacitancia de membrana (Cm)y la conducción de membrana (Gm). Los valores de Cm de los tBLM típicos deben estar en el rango de 12,5 nF a 15,5 nF para el 10% de químicas atadas21,22.
    8. Después de ejecutar el protocolo y finalizar el experimento, guarde los datos.
    9. Repita la medición con el siguiente pozo.

2. Irradiación láser

  1. Configuración experimental
    NOTA: El sistema a medida está configurado para cada pozo tBLM individualmente.
    1. Realice experimentos en una caja a prueba de luz para minimizar el láser peligrosamente.
    2. Utilice una mesa de óptica para configurar el experimento para reducir las vibraciones no deseadas.
    3. Coloque el lector de impedancia, donde está conectada la diapositiva de oro, en un escenario XYZ y eléblelo de tal manera que se asiente en el camino de la fuente láser.
    4. Utilice engranajes microscópicos de enfoque grueso y fino para controlar la altura de la fuente láser para lograr la precisión adecuada.
    5. Apunte a la trayectoria del láser a lo largo del eje longitudinal de la corredera del electrodo.
      PRECAUCIÓN: Siempre use gafas de seguridad láser adecuadas y mantenga buenos protocolos de seguridad láser.
    6. Permita que el láser sintonizado seleccionado se estabilice antes de comenzar el experimento.
      NOTA: En la figura 2Ase ilustra un esquema de la configuración experimental.
  2. Alineación de electrodos láser y oro
    NOTA: Antes de comenzar, siempre evalúe la potencia de salida del láser utilizando un medidor de potencia para asegurarse de que solo se entreguen vatios muy bajos a los tBLM.
    1. Ajuste la trayectoria del láser o el ángulo del electrodo de modo que el láser pase a través del líquido que cubre el electrodo y sea visible, de manera uniforme, en la superficie de oro.
    2. Ajuste la posición de la luz del rayo láser para cada experimento elevando o bajando la fuente del rayo láser utilizando el ajuste fino mientras observa los cambios en la conductancia de la membrana.
    3. Bloquee la perilla para asegurar la posición de la trayectoria del láser cuando no se observen cambios de conductancia.
      NOTA: Se generarán valores de conductancia de membrana aumentados cuando el láser interactúe con el electrodo de oro subyacente. Por lo tanto, es importante ajustar la ruta del láser de tal manera que no sean posibles tales interacciones.
  3. Preparación de muestras
    1. Prepare la alineación de la luz del rayo láser (donde no haya cambios en la conductancia de la membrana), como se muestra en la Figura 2,posición 3.
    2. Agregue GNP de interés (funcionalizados o desnudos) al búfer PBS en el que se sumergen los tBLM mientras el láser está apagado.
    3. Mezcle el tampón PBS que rodea los tBLM suavemente tres veces, teniendo cuidado de no tocar el electrodo.
    4. Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.
    5. Encienda el láser para irradiar la muestra, utilizando la posición correcta de la luz de rayo láser alineada como se ve en la Figura 2,posición 3.
    6. Utilice la combinación adecuada de tamaño, forma y concentración de GNP con la longitud de onda de la luz láser.
      NOTA: El rayo láser de longitud de onda establecida debe acoplarse a la frecuencia de resonancia de plasmón GNP correspondiente.
    7. Registre la corriente medida continuamente (mediciones en tiempo real).
    8. Realice los pasos 2.2.1 a 2.3.7, omitiendo la adición de PNB para los experimentos de control.

3. Análisis y presentación de datos estadísticos

  1. Exporta los datos a una hoja de cálculo.
  2. Extraiga el parámetro de conductancia de la membrana frente al tiempo.
  3. Utilice los datos grabados después de configurar una luz de rayo láser con la posición correcta y antes de la introducción de GNP.
  4. Normalice los datos dividiendo la conductancia de membrana medida sobre la conductancia de membrana basal.
    NOTA: Esto confirma que los cambios relativos en los valores de conducción de la membrana provocados por los GNP irradiados introducidos.
  5. Presentar los datos como gráficos de tiempo (eje x) versus conducción de membrana normalizada (eje y).

4. Predecir la cantidad de calor localizado generado en los tBLMs a partir de nanopartículas irradiadas (modelo predictivo térmico)

  1. Resolver el problema de la transferencia de radiación de acuerdo con Dombrovsky23, con el fin de calcular la potencia de radiación absorbida en soluciones de nanopartículas irradiadas.
  2. Calcule la generación de calor incorporando la fuente de calor debida a la radiación absorbida en la ecuación de energía.
    NOTA: Para una explicación detallada del análisis numérico de la generación de calor en los tBLM a partir de nanopartículas irradiadas y la interfaz nanomaterial-electrodo, consulte 19.

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Representative Results

El sustrato de oro sobre el que se pueden crear tBLM se muestra en la Figura 1. En la Figura 2se presenta un esquema de la configuración experimental.

Los electrodos de oro coplanar, como se muestra en la Figura 1A,están hechos de sustrato base de policarbonato de 25 mm x 75 mm x 1 mm con matrices de oro estampadas. Una capa adhesiva transparente define las seis cámaras de medición individuales. El electrodo de oro coplanar permite la exposición directa de la luz láser a la membrana de tBLMs. Cada pozo de la matriz de electrodos contiene un electrodo de trabajo en forma de círculo (área: 0.707 cm2) y un contraelectrodo en forma de semicírculo o electrodo coplanar (área: ~ 0.725 cm2), que están separados por un espacio de ~ 2 mm. La capa adhesiva transparente aísla el resto del oro depositado del electrolito a granel. Por el contrario, el diseño de oro subyacente conecta los electrodos de trabajo a las áreas de contacto fuera de las cámaras de medición para proporcionar la conexión eléctrica al lector EIS sin la necesidad de un electrodo de referencia.

La trayectoria del láser está alineada de una manera en la que interactúa con los tBLM y se dispersa a través del tampón líquido que lo rodea, pero no de tal manera que pueda interactuar con el sustrato de oro subyacente. Esto se determina fácilmente a través de la elevación y bajada horizontal del láser hasta que se establece la posición correcta. Esta posición está justo en el punto donde no se pueden observar cambios en la conductancia de la membrana. Dado que los tBLM se forman por unión a una capa de sustrato de oro a granel, parece probable que los cambios en la conductancia de la membrana en las posiciones 1 y 2 de la Figura 2 sean el resultado del calor de las interacciones del láser con las nanoestructuras dentro de la capa de oro a granel pulverizada. Por lo tanto, utilizando la posición precisa de la alineación horizontal del haz de luz centrándose en eliminar la interacción entre la luz láser y el sustrato de oro a granel que se encuentra debajo de los tBLM.

Enfocar la luz láser horizontal directamente hacia el electrodo de oro causa un aumento en la conductancia de la membrana, como se presenta en la Figura 2,posición 1 y 2. La posición precisa del láser reveló una variación insignificante en los registros de conductancia de la membrana durante los períodos de encendido y apagado del láser(Figura 2B,posición 3). La muestra del PNB se añadió después de establecer los registros de referencia, como se muestra en la Figura 2,posición 3. La adición de nanopartículas de oro de 30 nm conjugadas con estreptavidina a tBLM que contenían colesterol biotinilado mostró una clara diferencia entre los períodos ON y OFF del láser, así como en comparación con la posición 3, con distintos aumentos en la amplitud de conductancia durante la fase ON del láser(Figura 2B,posición 4).

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del modelo de membrana lipídica bicapa atada (tBLM) sobre un sustrato de oro. (A) Deslizamiento de electrodo de oro coplanar con seis pozos, definidos en última instancia por la adición de una fina capa adhesiva transparente. (B) El modelo tBLM comprende espaciadores (cadenas de etilenglicol terminadas con un grupo hidroxilo) y moléculas atadas (grupos etilenglicol terminados con cadena de fitanilo hidrófobo) atadas a la superficie del sustrato de oro para formar la primera capa. La segunda capa incluye los lípidos no atados. La figura modificada se basó en Cornell et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustración de la configuración del ensayo para la alineación y los correspondientes cambios de conductancia de la membrana de medición a través de tBLM que surgen de la iluminación láser ( λ = 530 nm). (A) Representante esquemático de las diferentes posiciones de alineación láser horizontal; donde Posición 1: rayo de luz láser alineado con el sustrato de oro (cuando el láser se encendió se indica en rojo); posición 2 la luz láser horizontal mezclada con membrana y sustrato de oro; posición 3 luz láser enfocada en el fluido a granel que rodea a los tBLM; Luz de haz láser de posición 4 enfocada en el fluido que rodea los tBLM en presencia de GNP esféricos de 30 nm conjugados con estreptavidina. (B) Los registros de conductancia normalizados a lo largo del tiempo corresponden a las diferentes posiciones de alineación. Las posiciones 1, 2 y 3 miden la conductancia de los tBLM en ausencia de GNP, mientras que la posición 4 es una medida de la conductancia de tBLM en presencia de GNP esféricos conjugados con estreptavidina de 30 nm. Los valores de conducción de membrana se normalizaron al valor inicial de conducción de membrana en la formación de tBLM. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe el uso del modelo tBLM con un sustrato de electrodo coplanar junto con una configuración de alineación láser horizontal que permite el registro de impedancia eléctrica en tiempo real en respuesta a la irradiación láser de nanopartículas de oro. El método de registro EIS presentado aquí construye una lista mínima de experimentos necesarios para proporcionar el registro de los cambios de corriente iónica a través de la membrana, que corresponde al calor generado por la interacción de láser acoplado y nanopartículas de oro. Hay un paso crítico en este protocolo, que es la alineación cuidadosa y precisa de la trayectoria del láser hacia el tampón que rodea la membrana lipídica bicapa.

El uso del modelo tBLM ofrece distintas propiedades de sellado eléctrico que imitan las características de las membranas lipídicas naturales24. Los tBLM también proporcionan una región de reservorio iónico acuoso entre el sustrato de oro y la membrana formada posteriormente, donde las moléculas atadas y la molécula espaciadora tenían un espesor de 11 Å25, y el espesor de la membrana lipídica bicapa era de alrededor de 6,5 nm19. Esto puede ofrecer espacio para incorporar proteínas de membrana, canales iónicos u otras moléculas funcionalizadas específicas13,22. La selección de 70% de lípidos DPEPC y 30% de LÍPIDOS GDPE proporciona un sellado óptimo de la membrana lipídica bicapa para examinar las características eléctricas de los tBLM utilizando el sistema EIS24. Del mismo modo, la introducción de colesterol dentro de las membranas lipídicas bicapa imita de cerca las membranas modelo biomiméticas nativas. Las mitades del colesterol mejoran la estabilidad de la membrana lipídica bicapa, además de minimizar la permeabilidad de la membrana a los iones al proporcionar un alto empaquetamiento de la bicapa de fosfolípidos26,27. La combinación de tBLM con el sistema EIS proporciona una medición indirecta de la transferencia de calor entre los GNP irradiados y las membranas lipídicas bicapa. Además, el uso de electrodos de oro coplanar en este protocolo permite las mediciones EIS en tiempo real sin ninguna interferencia de electrodos de referencia o contadores.

El oro en la escala de nanopartículas tiene características físicas y ópticas diferentes a los agregados de oro más grandes. El tamaño y la forma de las nanopartículas acceden a su biodisposición, vida útil de circulación y captación celular, donde las nanopartículas de tamaños intermedios (20-60 nm) exhiben una máxima absorción celular y ofrecen una alta relación superficie/volumen, lo que permite la posterior funcionalización28,29. El tamaño de PNB de 30 nm implementado en este estudio representó tamaños de GNP intermedios, mientras que la selección de la longitud de onda del láser fue de acuerdo con el pico de absorción de los GNP para producir la excitación más eficiente, lo que en consecuencia conduce al calentamiento. La iluminación láser de las superficies de oro de tBLM eleva los picos de conducción de la membrana en la fase ON del láser. Se propone que esto sea como resultado de nanoestructuras de superficie de oro a granel que interactúan con el láser, lo que enmascararía los fenómenos de producción de calor después de la adición de los GNP30. Para superar esto, el enfoque desarrollado aquí GNPs se ilumina mediante el uso de la alineación láser horizontal a través de la interfaz lípido-tampón, como se ilustra en la Figura 2,posiciones 3 y 4.

Los protocolos descritos aquí pueden modificarse fácilmente alterando la composición lipídica de la membrana para imitar varios tipos de células naturales, o alterando el tamaño y la forma de los GNP introducidos, como las nanourquinas de oro de 100 nm con la luz de rayo láser correspondiente19. Esto se puede utilizar para determinar el impacto de la radiación inducida por GNP localizados en tipos específicos de células.

En resumen, este protocolo sirve como un biosensor de detección robusto para estudiar las interacciones de los GNP irradiados in situ con entidades modelo de membrana lipídica bicapa de interés para responder preguntas sobre fenómenos de transferencia de calor. Esto ayudará a desarrollar terapias fototérmicas más eficientes, así como a proporcionar información valiosa para mecanismos detallados de transferencia de calor dentro de los sistemas biológicos. Este enfoque se puede utilizar como una herramienta para la predicción del nivel de destrucción de la membrana celular que pueden experimentar estas nanopartículas calentadas.

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Disclosures

Los autores declaran los siguientes intereses financieros / relaciones personales, que pueden considerarse como posibles intereses en competencia: El profesor Bruce Cornell es Director de Ciencia y Tecnología en Surgical Diagnostics SDx membranas atadas Pty. Ltd.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Descubrimiento del Consejo Australiano de Investigación (ARC) (DP150101065) y el Centro de Investigación ARC para Dispositivos Integrados para análisis de usuario final en niveles bajos (IDEAL) (IH150100028).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles Cytodiagnostics AC-30-04-05 This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles Sigma-Aldrich 753629 This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) NANOCS PG2-BNCS-10k Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S1 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl  SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Tethered molecules
532 nm green laser continuous light OBIS LS/OBIS CORE LS, China ND-1000 The power of this laser was ~135 mW 
tethaPod EIS reader SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-R1 A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-BG Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-A1 Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-T10 Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% 
tethaQuick software SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-B1 Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
 99.9% Pure ethanol Sigma-Aldrich  34963 Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 pH 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Her, S., Jaffray, D. A., Allen, C. Gold nanoparticles for applications in cancer radiotherapy: Mechanisms and recent advancements. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 84-101 (2017).
  2. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. Journal of Nanoparticle Research. 9 (6), 1109-1124 (2007).
  3. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Miller, C. M., Cortie, M. B. A golden bullet? Selective targeting of Toxoplasma gondii tachyzoites using antibody-functionalized gold nanorods. Nano Letters. 7 (12), 3808-3812 (2007).
  4. Zhang, H. -G., Mehta, K., Cohen, P., Guha, C. Hyperthermia on immune regulation: a temperature's story. Cancer Letters. 271 (2), 191-204 (2008).
  5. Gobin, A. M., et al. Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy. Nano Letters. 7 (7), 1929-1934 (2007).
  6. Jackson, J. B., Halas, N. J. Surface-enhanced Raman scattering on tunable plasmonic nanoparticle substrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (52), 17930-17935 (2004).
  7. Emelianov, S. Y., Li, P. -C., O'Donnell, M. Photoacoustics for molecular imaging and therapy. Physics Today. 62 (8), 34 (2009).
  8. Dimitriou, N. M., et al. Gold nanoparticles, radiations and the immune system: Current insights into the physical mechanisms and the biological interactions of this new alliance towards cancer therapy. Pharmacology & Therapeutics. 178, 1-17 (2017).
  9. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979 (1962).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47 (1), 105-113 (1985).
  11. Plant, A. L. Supported hybrid bilayer membranes as rugged cell membrane mimics. Langmuir. 15 (15), 5128-5135 (1999).
  12. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  13. Alghalayini, A., Garcia, A., Berry, T., Cranfield, C. G. The Use of Tethered Bilayer Lipid Membranes to Identify the Mechanisms of Antimicrobial Peptide Interactions with Lipid Bilayers. Antibiotics. 8 (1), 12 (2019).
  14. Khan, M. S., Dosoky, N. S., Williams, J. D. Engineering lipid bilayer membranes for protein studies. International Journal of Molecular Sciences. 14 (11), 21561-21597 (2013).
  15. Urban, P., Kirchner, S. R., Mühlbauer, C., Lohmüller, T., Feldmann, J. Reversible control of current across lipid membranes by local heating. Scientific Reports. 6, 22686 (2016).
  16. Palankar, R., et al. Nanoplasmonically-induced defects in lipid membrane monitored by ion current: transient nanopores versus membrane rupture. Nano Letters. 14 (8), 4273-4279 (2014).
  17. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  18. Plaksin, M., Shapira, E., Kimmel, E., Shoham, S. Thermal transients excite neurons through universal intramembrane mechanoelectrical effects. Physical Review X. 8 (1), 011043 (2018).
  19. Alghalayini, A., et al. Real-time monitoring of heat transfer between gold nanoparticles and tethered bilayer lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 183334 (2020).
  20. Moradi-Monfared, S., Krishnamurthy, V., Cornell, B. A molecular machine biosensor: construction, predictive models and experimental studies. Biosensors and Bioelectronics. 34 (1), 261-266 (2012).
  21. Hoiles, W., Gupta, R., Cornell, B., Cranfield, C., Krishnamurthy, V. The effect of tethers on artificial cell membranes: A coarse-grained molecular dynamics study. PloS One. 11 (10), 0162790 (2016).
  22. Cranfield, C. G., et al. Transient potential gradients and impedance measures of tethered bilayer lipid membranes: pore-forming peptide insertion and the effect of electroporation. Biophysical Journal. 106 (1), 182-189 (2014).
  23. Dombrovsky, L. A. Radiation heat transfer in disperse systems. , Begell House. (1996).
  24. Cornell, B. A., Braach-Maksvytis, V., King, L., Osman, P. A biosensor that uses ion-channel switches. Nature. 387 (6633), 580 (1997).
  25. Maccarini, M., et al. Nanostructural determination of a lipid bilayer tethered to a gold substrate. The European Physical Journal E. 39 (12), 123 (2016).
  26. Beugin-Deroo, S., Ollivon, M., Lesieur, S. Bilayer stability and impermeability of nonionic surfactant vesicles sterically stabilized by PEG-cholesterol conjugates. Journal of Colloid and Interface Science. 202 (2), 324-333 (1998).
  27. Kendall, J. K., et al. Effect of the Structure of Cholesterol-Based Tethered Bilayer Lipid Membranes on Ionophore Activity. ChemPhysChem. 11 (10), 2191-2198 (2010).
  28. Jiang, W., Kim, B. Y., Rutka, J. T., Chan, W. C. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent. Nature Nanotechnology. 3 (3), 145 (2008).
  29. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  30. Wang, F. X., et al. Surface and bulk contributions to the second-order nonlinear optical response of a gold film. Physical Review B. 80 (23), 233402 (2009).

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Biología Número 166 Membranas lipídicas bicapa atadas (tBLMs) Biosensor Nanopartículas de oro Láser Transferencia de calor Dinámica de membranas
Membranas lipídicas bicapa atadas para monitorear la transferencia de calor entre las nanopartículas de oro y las membranas lipídicas
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Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X., Yeoh, G. H., Cranfield, C. G., Timchenko, V., Cornell, B. A., Valenzuela, S. M. Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (166), e61851, doi:10.3791/61851 (2020).

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