Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Altın Nanopartiküller ve Lipid Membranları Arasındaki Isı Transferini İzlemek için Bağlı Bilayer Lipid Membranları

Published: December 8, 2020 doi: 10.3791/61851
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 1,2, 3, 2,4, 1,2,5
1School of Life Sciences, University of Technology Sydney, 2ARC Research Hub for Integrated Devices for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL), Faculty of Science, University of Technology Sydney, 3School of Mechanical and Manufacturing Engineering, The University of New South Wales, 4Surgical Diagnostics Pty Ltd., 5Institute for Biomedical Materials and Devices, University of Technology Sydney

Summary

Bu çalışma, lazer ışınlanmış altın nanopartiküllerden tBLM'lere ısı transferinin dinamik, invaziv olmayan izlenmesini sağlamak için bir protokolü özetlemektedir. Sistem, tBLM'lerdeki iletkenlik değişikliklerinin gerçek zamanlı ölçümü için empedans spektroskopisini, ısı üretimi için altın nanopartikül aydınlatmasını yönlendiren yatay odaklı bir lazer ışını ile birleştirir.

Abstract

Burada, altın elektrotlar üzerine monte edilmiş bağlı bilayer lipid membranları (tBLM' ler) kullanılarak elektrokimya ile ışınlanmış altın nanopartiküller (GNP'ler) ve bilayer lipid membranları arasındaki ısı transferini araştırmak için bir protokol bildiriyoruz. Streptavidin konjuge GNP'ler gibi ışınlanmış modifiye EDILMIŞ GNP'ler, biotin gibi hedef molekülleri içeren tBLM'lere gömülür. Bu yaklaşım kullanılarak, ışınlanmış GNP'ler ile ilgi çekici varlıklara sahip model bilayer lipid membran arasındaki ısı transfer işlemleri yatay odaklı bir lazer ışını ile aracılık eder. Termal tahmine dayalı hesaplama modeli, tBLM'lerdeki elektrokimyasal olarak indüklenen iletim değişikliklerini doğrulamak için kullanılır. Kullanılan özel koşullar altında, ısı darbelerinin algılanarak altın nanopartiküllerin membran yüzeyine özel olarak bağlanması gerekirken, ilişkisiz altın nanopartiküller ölçülebilir bir yanıt veremedi. Bu teknik, lazer parametrelerinin, partikül boyutunun, parçacık kaplamalarının ve bileşimin optimizasyonuna izin veren termal tedaviler için stratejilerin tasarımı ve geliştirilmesi için doğrudan kullanılabilecek güçlü bir algılama biyosensörü olarak hizmet eder.

Introduction

Işınlanmış altın nanomalzemelerin hipertermik performansı, enfeksiyonlar ve tümörler için minimal invaziv, seçici, hedefe yönelik yeni bir tedavi sınıfı sunar1. Bir lazer ile ısıtılabilen nanopartiküllerin istihdamı, hastalıklı hücreleri seçici olarak yok etmek ve seçici ilaç dağıtımı için bir araç sağlamak için kullanılmıştır2,3. Isıtılmış plazmonik nanopartiküllerin fototermoliz olgusunun bir sonucu hücre zarlarına zarar vermektir. Sıvı lipid bilayer membran, bu tür tedavilerden geçen hücreler için özellikle savunmasız bir bölge olarak kabul edilir, çünkü iç zar proteinlerinin deytürasyonu ve membran hasarı hücre ölümüne de yol açabilir4Hücre zarlarında iyonik potansiyel gradyanını korumak için birçok protein vardır. Nano ölçekte ısı transferini belirleme ve izleme yeteneği, ışınlanmış GNP'lerin1, 5,6,7,GNP'ler ve biyo-membranlar arasındaki moleküler etkileşimlerin değerlendirilmesi ve anlaşılmasının yanı sıra, gömülü GNP'lerin lazer kaynaklı ısıtma olaylarının biyolojik dokularda doğrudan sonuçlarının incelenmesi ve uygulanması için kilit öneme sahiptir, henüz tam olarakaydınlatılmamıştır 8. Bu nedenle, ışınlanmış GNP'lerin hipertermi sürecinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, hücrelerin doğal çevresini taklit eden bir nanomalzeme elektrot arayüzünün geliştirilmesi, biyolojik sistemler içindeki ışınlanmış altın nanopartiküllerin ısı transfer özelliklerinin derinlemesine araştırılması için bir araç sağlayabilir.

Yerel hücre zarlarının karmaşıklığı, hücrelerdeki ışınlanmış GNP etkileşimlerini anlamada önemli zorluklardan biridir. Doğal lipid membran mimarisinin ve işlevselliğinin yakın basit biyo-mimetik versiyonlarını sağlamak için geliştirilen çeşitli yapay membran platformları olmuştur, dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, siyah lipid membranlar9, desteklenen düzlemsel bilayer membranlar10,hibrid bilayer membranlar11,polimer yastıklı lipid bilayer membranlar12 ve bağlı bilayer lipid membranlar13. Her yapay lipid membran modeli, doğal lipid zarlarını taklit etme konusunda farklı avantajlara ve sınırlamalara sahiptir14.

Bu çalışmada, tBLM modelini kullanarak altın nanopartikül ve lipid membran etkileşimlerini değerlendirmek için bir sensör olarak lipid membran kaplı elektrotların istihdamı açıklanmaktadır. TBLM tabanlı biyosensör algılama şeması, bağlı membranların kendi kendini onarabildiği için doğal stabilite ve hassasiyet13 sağlar, diğer sistemlerin aksine (yama kelepçesi veya lipozomlar tarafından oluşturulan membranlar gibi) sadece az miktarda membran hasarı çökmelerine neden olur15,16,17,18. Ayrıca, tBLM'ler mm2 boyutlarında olduğundan, arka plan empedansı, nanopartikül etkileşimleri nedeniyle bazal membran iyonik akıdaki değişikliklerin kaydedilmesine olanak sağlayan yama kelepçesi kayıt tekniklerinden daha düşük büyüklükteki siparişlerdir. Bunun bir sonucu olarak, mevcut protokol, güçleri 135 nW / μm2kadar düşük lazerler tarafından heyecanlanan bağlı GNP'ler tarafından membran iletiminde yapılan değişiklikleri karşıtlayabilir.

Burada sunulan sistem, termal tedavilerin tasarlanması ve geliştirilmesi için gereken hassas lazer parametrelerinin, partikül boyutunun, partikül kaplamalarının ve bileşimin belirlenmesi için hassas ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. Bu, ortaya çıkan fototermal tedavilerin iyileştirilmesi ve biyolojik sistemler içinde ayrıntılı ısı transferi mekanizmaları için değerli bilgiler sunmak için kritik öneme sahiptir. Sunulan protokol daha önce yayınlanan19. Protokolün ana hatları aşağıdaki gibidir: ilk bölüm tBLM oluşumunu tanımlar; ikinci bölümde kurulumun nasıl oluşturulanın ve heyecan lazer kaynağının nasıl hizalanması; son bölümde elektrik empedansı spektroskopisi verilerinden nasıl bilgi çıkarılacağı gösterilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tBLM'ler elektrotların hazırlanması

  1. İlk monolayer kaplamanın hazırlanması
    1. Benzil-disülfit-tetra-etilenglikkol-OH "aralayıcı" moleküllerinin 3 mM 1:9 oranından oluşan etanolik bir çözeltiye yeni serpiştirilmiş altın desenli elektrot mikroskop kaydırağını daldırın (benzil disülfit dört oksijen etilen glikol aralayıcıdan oluşur, bir OH grubu ile sonlandırıldı) ve benzil-disülfit (tetra-etilenglikol) n=2 C20-fitanil "bağlı" moleküller. Bu, bir bilayer'in tutturulabileceği ilk katman kaplamasını oluşturur.
      NOT: Altın elektrot, 100 nm, %99,9995 altın (5n5 altın) filmin özel 25 mm x 75 mm polikarbonat slaytlara buharlaştırılmasıyla yapılır20.
    2. Elektrotları oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca ilk katmanla kuluçkaya yatırın.
    3. Altın elektrotları 30 sn'nin üzerinde bol miktarda saf etanol içine daldırarak durulayın.
    4. Altın elektrot kaydırağını ilk monolayer ile doğrudan bir sonraki adım için kullanın veya saf etanol dolu bir kavanozda saklayın.
    5. NOT: İlk katmanın bütünlüğünü sağlamak için slaydın altın kısımlarına doğrudan teması en aza indirin
  2. İlk monolayer kaplamalı slaydı birleştirme
    1. TBLM'lerin oluşacağı desenli alanlarla temas etmediklerinden emin olarak, cımbız kullanarak kabından bir coplanar altın elektrot kaydırağını dikkatlice çıkar.
      NOT: Altının yatırıldığı slaydın tarafını tanımlamak için dikkatli olun.
    2. Herhangi bir artık etanol kaldırmak için 1 - 2 dakika boyunca hava kuru slayt.
    3. Altın elektrotu kuru bir yüzeyin üzerine yerleştirin, altın elektrotun desenli altın yüzey yukarı bakacak şekilde doğru yönlendirildiğine emin olun.
    4. Şeffaf yapışkan tabaka kapağını ince bir laminattan soyun ve her bir kuyuyu tanımlamak için 6 kanalın üzerine yerleştirin.
    5. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, slayt ve şeffaf yapışkan tabaka arasındaki herhangi bir havayı serbest bırakmak için bir basınç silindiri kullanın.
      NOT: Bu adım için gereken sürenin araştırmacı tarafından optimize edilmesi gerekecektir. Bu protokolde süreler 2-3 dk arasında değişiyor.
    6. mümkün olan en kısa sürede (1-2 dakika içinde) ikinci lipid bilayer'i, ilk katmana zarar vermemek için kendi kendine montaj için monte edilmiş ilk monolayer kaplamalı elektroda tanıtın.
  3. İkinci lipid bilayer hazırlanması
    1. Altı kuyu kaydırağının ilk kuyusuna 6 μL 3 mM'lik ilgi lipitleri ekleyin. Mikropipette ucun kenarının altın yüzeye temas ederek elektrot üzerindeki bağlı kimyalara zarar verelim.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan lipid karışımı 50:1 molar oranında 3 mM kolesterol-PEG-Biotin ile karıştırılmış 3 mM %70 zwitteriyonik C20 difitanil-eter-glisero-fosfatidilkolin (DPEPC) ve %30 C20 diphytanyldiglyceride eter lipitlerinden (GDPE) oluşuyordu.
    2. Lipid karışımının 6 μL'sini her ilave arasında 10 s boşluk olan diğer kuyulara tanıtın.
    3. Lipid karışımını PBS gibi bir tamponla elektrotlar üzerinde değiştirmeden önce her kuyuyu oda sıcaklığında tam 2 dakika kuluçkaya yatırın. Ekleme ve tampon değişimi için zamanları 10 s birbirinden ayırın, böylece her kuyu lipid ile tam olarak 2 dakika boyunca inkübe edilir.
    4. 50 μL PBS tampon (pH 7.0) ile 3 kez daha yıkayın. Elektrotların üzerinde her zaman 50 μL tampon bıraktığından emin olun. Elektrotların kurumasına izin vermeyin.
      NOT: Etanol çözücünün sulu çözelti ile bu şekilde (solvent değişim yöntemi)dağıtılması, bağlı kimyalar aracılığıyla altın elektrota tutturulmuş tek bir lipid bilayerinin hızlı bir şekilde oluşmasını sağlar.
  4. Elektrik empedans spektroskopisi (EIS) ölçümleri kullanılarak tBLM oluşumunun test ediliyor
    1. Hazırlanan elektrot kaydırağını ac empedans spektrometresine (örneğin, Tethapod) yerleştirin. Spektrometrenin bir USB bağlantı noktası üzerinden yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlandığından emin olun.
    2. Yazılımı açın, Kur 'u tıklatın ve Donanım 'ıaçın.
    3. Donanım ayarlarını 25 mV'den en tepeye AC excitation kullanacak şekilde ayarlayın.
    4. Hızlı empedans önlemleri için on yılda iki adımla 0,1 ile 10.000 Hz arasında frekanslar ayarlayın.
    5. Kurulum menüsünü tıklatın ve Model 'iaçın.
    6. Lipid bilayer tanımlamak için elektrolit tamponunu tanımlayan bir direnç ve paralel bir direnç-kapasitör ağı ile bağlı altın elektrodu seri olarak sabit faz elemanı olarak tanımlayan eşdeğer bir devre modeli kullanın ve Tamam'a basın.
    7. Membran kapasitansı (Cm)ve membran iletiminin(Gm) gerçek zamanlı ölçümünü başlatmak için Başlat düğmesine basın. Tipik tBLM'lerin Cm değerleri% 10 bağlı kimyalar için 12,5 nF ila 15,5 nF aralığında olmalıdır21,22.
    8. Protokolü çalıştırıp denemeyi bitirdikten sonra verileri kaydedin.
    9. Ölçümü bir sonraki kuyuyla tekrarlayın.

2. Lazer ışınlama

  1. Deneysel kurulum
    NOT: Özel yapım sistem her tBLM için ayrı ayrı iyi ayarlanmıştır.
    1. Lazeri tehlikeli bir şekilde en aza indirmek için ışık geçirmez bir kutuda denemeler yapın.
    2. İstenmeyen titreşimleri azaltmak için deneyi ayarlamak için bir optik tablo kullanın.
    3. Empedans okuyucuyu, altın slaytın bağlı olduğu yere, bir XYZ aşamasına yerleştirin ve lazer kaynağının yoluna oturt olacak şekilde yükseltin.
    4. Uygun hassasiyeti elde etmek için lazer kaynağının yüksekliğini kontrol etmek için kaba ince odaklama mikroskobik dişli kullanın.
    5. Elektrot kaydırağı uzunlamasına ekseni boyunca lazer yolunu hedefleyin.
      DİkKAT: Her zaman uygun lazer güvenlik gözlükleri takın ve iyi lazer güvenlik protokollerini koruyun.
    6. Denemeye başlamadan önce seçilen ayarlanmış lazerin stabilize etmesine izin verin.
      NOT: Deneysel kurulumun şeması Şekil 2A'dagösterilmiştir.
  2. Lazer ve altın elektrotların hizalanması
    NOT: Başlamadan önce, tBLM'lere yalnızca çok düşük wattların teslim edildiğinden emin olmak için lazer güç çıkışını her zaman bir güç ölçer kullanarak değerlendirin.
    1. Lazer yolunu veya elektrodun açısını, lazerin elektrodu kaplayan sıvıdan geçecek ve altın yüzeyde eşit olarak görülebilecek şekilde ayarlayın.
    2. Membran iletimindeki değişiklikleri gözlemlerken ince ayarı kullanarak lazer ışını kaynağını yükselterek veya indirerek her deney için lazer ışını ışık konumunu ayarlayın.
    3. Herhangi bir iletim değişikliği gözlenmediğinde lazer yolunun konumunu sabitlemek için düğmeyi kilitleyin.
      NOT: Lazer alttaki altın elektrotla etkileşime girdiğinde artan membran iletim değerleri üretilecektir. Bu nedenle, lazer yolunu bu tür etkileşimlerin mümkün olmayacağı şekilde ayarlamak önemlidir.
  3. Numune hazırlama
    1. Şekil 2,konum 3'te gösterildiği gibi lazer ışını ışık hizalamasını (membran iletiminde bir değişiklik olmadığı yerlerde) hazırlayın.
    2. Lazer KAPATILIRken tBLM'lerin batırıldığı PBS arabelleğine ilgi çekici GNP'ler (işlevselleştirilmiş veya çıplak) ekleyin.
    3. TBLM'leri çevreleyen PBS tamponunu elektrota dokunmamaya dikkat ingerek üç kez hafifçe karıştırın.
    4. Oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkaya yatır.
    5. Şekil 2,konum 3'te görüldüğü gibi doğru hizalanmış lazer ışını ışık konumunu kullanarak numuneyi ışınlamak için lazeri AÇIN.
    6. Lazer ışık dalga boyu ile GNP boyutu, şekli ve konsantrasyonunun uygun kombinasyonunu kullanın.
      NOT: Set dalga boyunun lazer ışını, ilgili GNP plazmon rezonans frekansı ile birleşmelidir.
    7. Ölçülen akımı sürekli olarak kaydedin (gerçek zamanlı ölçümler).
    8. Kontrol denemeleri için GNP eklemesini atlayarak 2.2.1 - 2.3.7 adımlarını gerçekleştirin.

3. İstatistiksel veri analizi ve sunumu

  1. Verileri bir elektronik tabloya verin.
  2. Zamana karşı membran iletim parametresini çıkarın.
  3. Doğru konuma sahip bir lazer ışını ışığı ayarladıktan sonra ve GNPs tanıtımından önce kaydedilen verileri kullanın.
  4. Ölçülen membran iletkenliğini temel membran iletkenliği üzerine bölerek verileri normalleştirin.
    NOT: Bu, membran iletim değerlerindeki göreceli değişikliklerin ışınlanmış GNP'ler tarafından ortaya çıkartılması olduğunu doğrular.
  5. Verileri normalleştirilmiş membran iletimine (y ekseni) karşı zamanın çizimleri (x ekseni) olarak sunun.

4. Işınlanmış nanopartiküllerden tBLM'lerde üretilen lokalize ısı miktarını tahmin edin (termal tahmine dayalı model)

  1. Radyasyon transferi sorununu çözün Dombrovsky23, ışınlanmış nanopartikül çözeltilerinde emilen radyasyon gücünü hesaplamak için.
  2. Emilen radyasyon nedeniyle ısı kaynağını enerji denklemine dahil ederek ısı üretimi hesaplamak.
    NOT: Işınlanmış nanopartiküllerden ve nanomalzeme elektrot arayüzünden tBLM'lerdeki ısı üretimi sayısal analizinin ayrıntılı bir açıklaması için 19'a bakın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TBLM'lerin oluşturulabileceği altın substrat Şekil 1'degösterilmiştir. Deneysel kurulumun şeması Şekil 2'de sunulmuştur.

Şekil 1A'dagösterildiği gibi komanar altın elektrotlar, desenli altın dizili 25 mm x 75 mm x 1 mm polikarbonat taban substratından yapılmıştır. Şeffaf bir yapışkan tabaka altı ayrı ölçüm odasını tanımlar. Coplanar altın elektrot, lazer ışığının tBLMs membranına doğrudan maruz kalmasını sağlar. Elektrot dizisinin her kuyusu, ~2 mm'lik bir boşlukla ayrılan daire şeklinde çalışan bir elektrot (alan:0,707 cm 2)ve yarım daire şeklindeki karşı elektrot veya coplanar elektrot (alan: ~ 0,725 cm2)içerir. Şeffaf yapışkan tabaka, biriken altının geri kalanını dökme elektrolitten yalıtır. Buna karşılık, alttaki altın düzeni, çalışan elektrotları ölçüm odalarının dışındaki temas alanlarına bağlayarak EIS okuyucuya referans elektrota ihtiyaç duymadan elektrik bağlantısını sağlar.

Lazer yolu, tBLM'lerle etkileşime girdiği ve onu çevreleyen sıvı tampondan saçıldığı bir şekilde hizalanır, ancak alttaki altın substratla etkileşime girebilecek şekilde değil. Bu, doğru konum kurulana kadar lazerin yatay olarak yükseltilmesi ve indirilmesi ile kolayca belirlenir. Bu pozisyon, membran iletiminde herhangi bir değişikliğin gözlenemeyeceği noktadadır. TBLM'lerin dökme altının bir substrat tabakasına bağlanmasıyla oluştuğu göz önüne alındığında, Şekil 2'deki 1 ve 2 pozisyonundaki membran iletiminde meydana gelen değişikliklerin, lazerin dağınık dökme altın tabakası içindeki nanoyapılarla etkileşimlerinden kaynaklanan ısıdan kaynaklanan bir sonuç olması muhtemel görünmektedir. Böylece, lazer ışığı ile tBLM'lerin altında bulunan dökme altın substrat arasındaki etkileşimi ortadan kaldırmaya odaklanan yatay ışık ışını hizalamasının doğru konumunu kullanarak.

Yatay lazer ışığının doğrudan altın elektrota doğru odaklanması, Şekil 2,pozisyon 1 ve 2'de sunulduğu gibi membran iletiminde bir artışa neden olur. Hassas lazer pozisyonu, her iki lazer AÇIK ve lazer KAPSAması döneminde membran iletim kayıtlarında ihmal edilebilir varyasyonu ortaya çıkardı(Şekil 2B, konum 3). GNP örneği, Şekil 2, konum 3'te gösterildiği gibi temel kayıtlar oluşturulduktan sonra eklendi. Biyotinillenmiş kolesterol içeren tBLM'lere streptavidin konjuge 30 nm altın nanopartiküllerin eklenmesi, lazer AÇIK ve KAPSA DÖNEMLerİ arasında ve pozisyon 3'e kıyasla, lazer ON fazı sırasında iletkenlik genliğinde belirgin artışlar olduğunu göstermiştir (Şekil 2B, pozisyon 4).

Figure 1
Şekil 1: Altın bir substrat üzerinde bağlı bilayer lipid membran (tBLM) modelinin şematik gösterimi. (A) Altı kuyulu coplanar altın elektrot slayt, sonuçta ince şeffaf yapışkan tabaka ilavesi ile tanımlanır. (B) TBLM modeli, ilk tabakayı oluşturmak için altın substrat yüzeyine bağlı aralayıcı (etilen glikol zincirleri bir hidroksil grubu ile sona erdi) ve bağlı moleküllerden (etilen glikol grupları hidrofobik fitanil zinciri ile sona erer) oluşur. İkinci katman bağlı olmayan lipitleri içerir. Değiştirilen rakam Cornell ve ark.24'e dayanıyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Lazer aydınlatmadan kaynaklanan tBLM'lerde hizalama ve ilgili ölçüm zarı iletim değişiklikleri için test kurulumunun illüstrasyonu ( φ = 530 nm). (A) Yatay lazer hizalamasının farklı konumlarının şematik temsilcisi; konum 1: altın substrat ile hizalanmış lazer ışık ışını (lazer YANTIĞInda kırmızı ile gösterilir); pozisyon 2 membran ve altın substrat ile karıştırılır yatay lazer ışığı; tBLM'leri çevreleyen dökme sıvıya odaklanan 3 lazer ışığı; Streptavidin konjuge 30 nm küresel GNP'lerin varlığında tBLM'leri çevreleyen sıvıya odaklanan Pozisyon 4 lazer ışını ışığı. (B) Zaman içinde normalleştirilmiş iletim kayıtları farklı hizalama konumlarına karşılık gelir. GNP'lerin yokluğunda tBLM'lerin iletiminin 1, 2 ve 3 ölçümlerini konumlandırırken, pozisyon 4, streptavidin konjuge 30 nm küresel GNP'lerin varlığında tBLM'lerin iletiminin bir ölçümüdür. Membran iletim değerleri tBLM oluşumunda membran iletiminin başlangıç değerine normalleştirildi. Sonuçlar en az üç bağımsız deneyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, altın nanopartiküllerin lazer ışınlanmasına yanıt olarak gerçek zamanlı elektrik empedansı kaydını sağlayan yatay lazer hizalama ile birlikte komanar elektrot substratlı tBLM modelinin kullanımını açıklar. Burada sunulan EIS kayıt yöntemi, membran boyunca iyon akım değişikliklerinin kaydedilmesini sağlamak için gerekli olan ve birleştirilmiş lazer ve altın nanopartikül etkileşiminin ürettiği ısıya karşılık gelen minimum bir deney listesi oluşturur. Lazer yolunun bilayer lipid zarını çevreleyen tampona doğru dikkatli ve hassas bir şekilde hizalanması olan bu protokolde kritik bir adım vardır.

TBLM modelinin kullanımı, doğal lipid membran özelliklerini taklit eden farklı elektrik sızdırmazlık özellikleri sunar24. tBLM'ler ayrıca altın substrat ile daha sonra oluşan membran arasında, bağlı moleküllerin ve ara molekülün kalınlığının 11 ş25olduğu ve bilayer lipid membran kalınlığının 6,5 nm19civarında olduğu sulu bir iyonik rezervuar bölgesi sağlar. Bu, membran proteinlerini, iyon kanallarını veya diğer spesifik işlevselleştirilmiş molekülleri dahil etmek için alan sunabilir13,22. %70 DPEPC ve %30 GDPE lipit seçimi, EIS sistemi24kullanarak tBLM'lerin elektriksel özelliklerini incelemek için bilayer lipid membranının optimum sızdırmazlık sağlar. Aynı şekilde, kolesterolün bilayer lipid zarlarına girmesi, lokal biyomimetik model membranlarını yakından taklit eder. Kolesterol moieties, bilayer lipid membran stabilitesini artırır ve fosfolipid bilayer26,27'ninyüksek ambalajını sağlayarak iyonlara membran geçirgenliğini en aza indirir. TBLM'lerin EIS sistemi ile birleştirilmesi, ışınlanmış GNP'ler ve bilayer lipid membranları arasındaki ısı transferinin dolaylı olarak ölçülmesini sağlar. Ayrıca, bu protokolde coplanar altın elektrotların kullanılması, referans veya karşı elektrotlardan herhangi bir parazit olmadan gerçek zamanlı EIS ölçümlerini sağlar.

Nanopartikül ölçeğindeki altın, daha büyük altın agregalarına farklı fiziksel ve optik özelliklere sahiptir. Nanopartikülün boyutu ve şekli, orta büyüklükteki (20-60 nm) nanopartiküllerin maksimum hücre alımı sergilediği ve daha sonra işlevselleştirmeye izin veren yüksek bir yüzey alanı ile hacim oranı sunduğu biyo-dağılımına, dolaşım ömrüne ve hücre alımınaerişmektedir. Bu çalışmada uygulanan 30 nm GNP boyutu orta GNP boyutlarını temsil ederken, lazer dalga boyu seçimi, en verimli ekscitasyonu sağlamak için GNP'lerin emilim zirvesine göre yapıldı ve bu da sonuçta ısınmaya yol açtı. TBLM'lerin altın yüzeylerinin lazer aydınlatması, lazer ON fazında membran iletim zirvelerini yükseltir. Bunun, GNPs30'uneklenmesinden sonra ısı üretim olaylarını maskeleyen lazerle etkileşime giren dökme altın yüzey nanoyapılarının bir sonucu olduğu önermektedir. Bunun üstesinden gelmek için, buradaki geliştirilen GNP'ler, Şekil 2, konum 3 ve 4'te gösterildiği gibi lipid tampon arayüzü boyunca yatay lazer hizalaması kullanılarak aydınlatılmıştır.

Burada açıklanan protokoller, çeşitli doğal hücre tiplerini taklit etmek için zarın lipit bileşimini değiştirerek veya 100 nm altın nanourchins gibi tanıtılan GNP boyutunu ve şeklini ilgili lazer ışın ışığı19ile değiştirerek kolayca değiştirilebilir. Bu daha sonra lokalize GSMR'ların indüklenen radyasyonun belirli hücre tipleri üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılabilir.

Özetle, bu protokol, ısı transferi olaylarıyla ilgili soruları yanıtlamak için ilgi çekici model bilayer lipid membran varlıklarıyla yerinde ışınlanmış GP'lerin etkileşimlerini incelemek için sağlam bir algılama biyosensörü görevi görür. Bu, daha verimli fototermal tedavilerin geliştirilmesine ve biyolojik sistemlerde ayrıntılı ısı transferi mekanizmaları için değerli bilgiler sağlanmasına yardımcı olacaktır. Bu yaklaşım, bu ısıtılmış nanopartiküllerin yaşayabileceği hücre zarı yıkım seviyesinin tahmini için bir araç olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, potansiyel rakip çıkarlar olarak kabul edilebilecek aşağıdaki finansal çıkarları / kişisel ilişkileri beyan eder: Prof Bruce Cornell Direktördür - Surgical Diagnostics SDx'te Bilim ve Teknoloji bağlı membranlar Pty. Ltd.

Acknowledgments

Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) Keşif Programı (DP150101065) ve Düşük Seviyelerde (IDEAL) Son Kullanıcı Analizi için Entegre Cihaz için ARC Araştırma Merkezi (IH150100028) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles Cytodiagnostics AC-30-04-05 This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles Sigma-Aldrich 753629 This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) NANOCS PG2-BNCS-10k Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S1 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl  SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Tethered molecules
532 nm green laser continuous light OBIS LS/OBIS CORE LS, China ND-1000 The power of this laser was ~135 mW 
tethaPod EIS reader SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-R1 A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-BG Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-A1 Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-T10 Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% 
tethaQuick software SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-B1 Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
 99.9% Pure ethanol Sigma-Aldrich  34963 Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 pH 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Her, S., Jaffray, D. A., Allen, C. Gold nanoparticles for applications in cancer radiotherapy: Mechanisms and recent advancements. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 84-101 (2017).
  2. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. Journal of Nanoparticle Research. 9 (6), 1109-1124 (2007).
  3. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Miller, C. M., Cortie, M. B. A golden bullet? Selective targeting of Toxoplasma gondii tachyzoites using antibody-functionalized gold nanorods. Nano Letters. 7 (12), 3808-3812 (2007).
  4. Zhang, H. -G., Mehta, K., Cohen, P., Guha, C. Hyperthermia on immune regulation: a temperature's story. Cancer Letters. 271 (2), 191-204 (2008).
  5. Gobin, A. M., et al. Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy. Nano Letters. 7 (7), 1929-1934 (2007).
  6. Jackson, J. B., Halas, N. J. Surface-enhanced Raman scattering on tunable plasmonic nanoparticle substrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (52), 17930-17935 (2004).
  7. Emelianov, S. Y., Li, P. -C., O'Donnell, M. Photoacoustics for molecular imaging and therapy. Physics Today. 62 (8), 34 (2009).
  8. Dimitriou, N. M., et al. Gold nanoparticles, radiations and the immune system: Current insights into the physical mechanisms and the biological interactions of this new alliance towards cancer therapy. Pharmacology & Therapeutics. 178, 1-17 (2017).
  9. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979 (1962).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47 (1), 105-113 (1985).
  11. Plant, A. L. Supported hybrid bilayer membranes as rugged cell membrane mimics. Langmuir. 15 (15), 5128-5135 (1999).
  12. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  13. Alghalayini, A., Garcia, A., Berry, T., Cranfield, C. G. The Use of Tethered Bilayer Lipid Membranes to Identify the Mechanisms of Antimicrobial Peptide Interactions with Lipid Bilayers. Antibiotics. 8 (1), 12 (2019).
  14. Khan, M. S., Dosoky, N. S., Williams, J. D. Engineering lipid bilayer membranes for protein studies. International Journal of Molecular Sciences. 14 (11), 21561-21597 (2013).
  15. Urban, P., Kirchner, S. R., Mühlbauer, C., Lohmüller, T., Feldmann, J. Reversible control of current across lipid membranes by local heating. Scientific Reports. 6, 22686 (2016).
  16. Palankar, R., et al. Nanoplasmonically-induced defects in lipid membrane monitored by ion current: transient nanopores versus membrane rupture. Nano Letters. 14 (8), 4273-4279 (2014).
  17. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  18. Plaksin, M., Shapira, E., Kimmel, E., Shoham, S. Thermal transients excite neurons through universal intramembrane mechanoelectrical effects. Physical Review X. 8 (1), 011043 (2018).
  19. Alghalayini, A., et al. Real-time monitoring of heat transfer between gold nanoparticles and tethered bilayer lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 183334 (2020).
  20. Moradi-Monfared, S., Krishnamurthy, V., Cornell, B. A molecular machine biosensor: construction, predictive models and experimental studies. Biosensors and Bioelectronics. 34 (1), 261-266 (2012).
  21. Hoiles, W., Gupta, R., Cornell, B., Cranfield, C., Krishnamurthy, V. The effect of tethers on artificial cell membranes: A coarse-grained molecular dynamics study. PloS One. 11 (10), 0162790 (2016).
  22. Cranfield, C. G., et al. Transient potential gradients and impedance measures of tethered bilayer lipid membranes: pore-forming peptide insertion and the effect of electroporation. Biophysical Journal. 106 (1), 182-189 (2014).
  23. Dombrovsky, L. A. Radiation heat transfer in disperse systems. , Begell House. (1996).
  24. Cornell, B. A., Braach-Maksvytis, V., King, L., Osman, P. A biosensor that uses ion-channel switches. Nature. 387 (6633), 580 (1997).
  25. Maccarini, M., et al. Nanostructural determination of a lipid bilayer tethered to a gold substrate. The European Physical Journal E. 39 (12), 123 (2016).
  26. Beugin-Deroo, S., Ollivon, M., Lesieur, S. Bilayer stability and impermeability of nonionic surfactant vesicles sterically stabilized by PEG-cholesterol conjugates. Journal of Colloid and Interface Science. 202 (2), 324-333 (1998).
  27. Kendall, J. K., et al. Effect of the Structure of Cholesterol-Based Tethered Bilayer Lipid Membranes on Ionophore Activity. ChemPhysChem. 11 (10), 2191-2198 (2010).
  28. Jiang, W., Kim, B. Y., Rutka, J. T., Chan, W. C. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent. Nature Nanotechnology. 3 (3), 145 (2008).
  29. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  30. Wang, F. X., et al. Surface and bulk contributions to the second-order nonlinear optical response of a gold film. Physical Review B. 80 (23), 233402 (2009).

Tags

Biyoloji Sayı 166 Bağlı bilayer lipid membranları (tBLM'ler) Biyosensör Altın nanopartiküller Lazer Isı transferi Membran dinamiği
Altın Nanopartiküller ve Lipid Membranları Arasındaki Isı Transferini İzlemek için Bağlı Bilayer Lipid Membranları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X.,… More

Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X., Yeoh, G. H., Cranfield, C. G., Timchenko, V., Cornell, B. A., Valenzuela, S. M. Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (166), e61851, doi:10.3791/61851 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter