Summary
פרוטוקול זה נועד לבטל את הלב והריאות של עכברים. ניתן לחסן ולדמות את הפיגומים החוץ-תאיים (ECM) המתקבלים כדי למפות את המיקום והטופולוגיה של הרכיבים שלהם.
Abstract
אנו מציגים כאן פרוטוקול דפלולרציה ללב העכבר ולריאות. הוא מייצר פיגומי ECM מבניים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח טופולוגיה והרכב ECM. הוא מבוסס על הליך מיקרו-כירורגי שנועד לצנתר את קנה הנשימה ואת אב העורקים של עכבר מורדם כדי לשוטט בלב ובריאות עם חומרים מנטרלים. קומפלקס קרדיו-ריאות decellularized לאחר מכן ניתן לחסן כדי לחשוף את המיקום של חלבוני ECM מבניים. ניתן להשלים את כל ההליך ב-4 ימים.
פיגומי ECM הנובעים מפרוטוקול זה נקיים מעיוותים ממדיים. היעדר תאים מאפשר בדיקה מבנית של מבני ECM עד לרזולוציית תת-מיקרון בתלת-ממד. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רקמה בריאה וחולנית מעכברים בגיל 4 שבועות, כולל מודלים עכבר של פיברוזיס וסרטן, פתיחת הדרך כדי לקבוע ECM שיפוץ הקשורים למחלות לב ריאה.
Introduction
ה- ECM היא רשת תלת ממדית העשויה מחלבונים וגליקנים המתאימה לכל התאים באורגניזם רב-תאי, המעניקה לאיברים את צורתם ומווסתת את התנהגות התאים לאורך החיים1. מהפריית ביצית ואילך, תאים בונים ומשפצים את ה- ECM, והם נשלטים בקפדנות על ידי זה. מטרת פרוטוקול זה היא לפתוח דרך לנתח ולמפה את עכבר ECM, שכן עכברים הם האורגניזם המודל הנפוץ ביותר בפתופיזיולוגיה של יונקים.
ההתפתחות של שיטה זו הונעה על ידי הצורך לאפיין ולבודד ECM2 יליד גרורות הקשורים גרורות. כמו גידולים חסרים כלי דם אנטומיים נאותים ועכברים הם אורגניזמים קטנים יחסית, הליכים מיקרוכירורגיים תוכננו כדי להצטמצם בנסיגה של אב העורקים, תוך בידוד זרימת הכלי העיקרי המוביל לגידול (למשל, ורידים ריאתיים), ובכך למקד את זרימת ריאגנט ומאפשר דפלולרציה של הגידול. שיטה זו מייצרת פיגומי ECM עם מבנה שמור2 שניתן לחסן ולדמות, ומאפשרת מיפוי מבנה ECM בפירוט תת-מיקרון. כדי לבצע פרוטוקול זה, יש צורך לרכוש מיומנויות כירורגיות ומיקרוכירורגיות (ניתוח, מיקרו-uturing וצנתור) שעשויים לייצג מגבלה פוטנציאלית לשימוש בו. למיטב ידיעתנו, שיטה זו מייצגת את הארגון החדיש ביותר עבור ניתוח הדמיית מבנה ECM מקורי2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הכלולים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית המסדירה את הרפואה הניסיונית באוניברסיטת קופנהגן ומסכימה עם החקיקה הדנית והאירופאית. כדי להדגים פרוטוקול זה, השתמשנו בעכברים נקבות BALB / cJ של 8-12 שבועות של עכבר נקבה MMTV-PyMT של גיל 11 שבועות.
הערה: הימנעות מזיהום חיידקי של פיגום ECM המוקלר מעניקה את תוצאות ההדמיה הטובות ביותר ומאפשרת אחסון מדגם לטווח ארוך. לכן חשוב לשמור על כל הצעדים סטריליים. ככזה, כל המכשירים והחומר הכירורגי, כולל תפר, מיקרו-תפר, פתרונות, צינורות, מחברי Luer וצנתרים, חייבים להיות סטריליים. משטחים, כולל מגש פוליסטירן, חייבים להיות מחוטאים עם 70% אתנול, ואת זלוף רצוי להתבצע תחת מכסה המנוע זרימה למינאר. כל ההליכים מתקיימים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
1. מיקרוכירורגיה שלאחר המוות
- המתת חסד העכבר באמצעות תא CO2 .
- מניחים את העכבר לתוך תא 4 ליטר, ולהתחיל למלא עם 100% CO2, החל מ 0.2 L / min במשך 2 דקות, הגדלת עד להגיע לזרימה של 0.8 L / min לאחר 3 דקות. העכבר צריך ליפול מחוסר הכרה במהלך 2 הדקות הראשונות, ולאחר מכן הנשימה צריכה להיפסק (בדרך כלל סביב 5 דקות, אבל הזרימה יכולה להישמר לפי הצורך). אשר את המוות לפני שתמשיך לשלב הבא.
- לגלח את בית החזה, הבטן ואת הגב של העכבר עם קוצץ השיער ולחטא עם 70% אתנול. גילוח מפחית מאוד את מספר הממצאים בשל נוכחות של שיער או על דגימות עבור הדמיה או ניתוח ביוכימי.
- הצמד את העכבר למגש פוליסטירן, המרחיב את חזיתו ואת אחוריו, כמו גם את ראשו וזנבו. מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ המיקרו-כירורגיה.
- באמצעות מספריים דפוס ישר מאיו ליצור גישה כירורגית עם חתך עורי פועל מהאזור התת-קרקעי לבטן התחתונה ולניתח תת עורית כדי לחשוף את דופן בית החזה ואת הצפק.
- באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים, חתכו את שרירי החזה העיקריים ואת שרירי החזה הקטנים לאורך החלל הבין-קוסטלי השישי משני צידי דופן בית החזה.
- באמצעות מספריים בדפוס ישר, לחתוך את החזה לאורך החתכים הקודמים, ולאחר מכן להשלים כריתת חזה על ידי חיתוך ציר החזה לאורך הציר הארוך שלה, ולאחר מכן לרומם ולהצמיד את שני הצדדים של דופן בית החזה כדי לחשוף את קומפלקס הלבו-ריולאומי.
- באמצעות מלקחיים זעירים עגולים (או מלקחיים זעירים של דומונט), מוציאים את התימוס ורקמת השומן שמסביב על ידי משיכתם בעדינות מההחזקות שלהם. זה יחשוף את כלי השיט העיקריים.
- באמצעות cautery, לצרוב את וריד קאווה היורד, באמצעות מספריים דפוס ישר, לחתוך את הוושט.
- באמצעות מלקחיים זעירים חדים, להפריד את הוורידים brachiocephalic ואת brachiocephalic, השאיר עורקים עורקים תת-בריקליים נפוצים מן הרקמה הבסיסית כדי להקל על קשירה וצרוב.
- באמצעות מחזיק מחט מיקרו, מיקרו-מלקחיים חדים ותפרים במקום תפר 9-0 מעל הופעתו של brachiocephalic, השאיר עורקים עורקים נפוצים והעורקים התת-בריחיים השמאליים.
- לצרוב את הוורידים brachiocephalic.
- להפריד את בלוטות הרוק submandibular לאורך קו האמצע כדי לחשוף את שרירי הצוואר ואת קנה הנשימה. להפריד את השרירים כדי לחשוף את הרצועה cricothyroid. באמצעות מיקרו מספריים, לפתוח כניסה על ידי חתך הרצועה.
- הציגו קטטר 27 גרם קנה הנשימה ולדחוף בעדינות עד קנה הנשימה מסתעף לתוך הסימפונות (כלומר, עד ההתנגדות לצנתר נפגש, ולאחר מכן לסגת 3 מ"מ). תיזהר לא לשבש את הסימפונות. בעזרת תפר 6-0, מניחים 3 תפרים סביב קנה הנשימה כדי לאבטח את הצנתר.
- תחלק את העכבר בגובה החוליה ה-12 של בית החזה. באבי העורקים היורד פועל באופן הקדמי לעמוד השדרה ויש לחלק אותו כאן יחד עם עמוד השדרה. תבדיל את החצי התחתון.
- מצטבטים בדיעבד את העורקים ודוחפים את הצנתר עד שהוא מגיע לקשת של בירי העורקים. בעזרת תפר 9-0, מניחים 4 תפרים סביב העורקים, החל מ-5 מ"מ מתחת לקצה הצנתר.
2. דפלולריזציה
- חבר את העכבר למערכת משאבה באמצעות צינורות סיליקון ומחברי Luer. לטבול עם מים deionized ב 200 μL / דקה במשך 15 דקות. שמור על קצב זרימה זה במהלך הפחתה.
- שנה את חומר הזילוף ל-0.5% נתרן דאוקסיכולאט (DOC) מדולל במים דה-יון ולפרוף בן לילה.
- שנה את חומר זלוף ל 0.1% נתרן דודסיל סולפט (SDS) מדולל במים deionized ו perfuse במשך 8 שעות.
- יש לטפטף מים דה-יונים למשך הלילה כדי לשטוף את ה-SDS וה-DOC למשך 24 שעות.
- יש לכרות את הלב והריאות המנושלים על ידי חתך את זיקותיו לבית החזה באמצעות מספריים מעוקלות ולאחסן בצינור קריו סטרילי עם מים דה-יונים עם 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין ו 0.3 מיקרומטר נתרן אזיד ב 4 °C. פיגומי ECM ניתן לאחסן לפחות במשך 12 שבועות1. אם הפיגומים ישמשו לניתוח ביוכימי (למשל, ספקטרומטריית מסה), הצמדה להקפאה בחנקן נוזלי.
3. חיסונים
- תכנן את ההדמיה: קבע נוגדנים ראשוניים (או נוגדנים) ואת השילוב של נוגדנים משניים מצומדים פלואורסצנטית כדי להתאים זה לזה ולהתאים את קווי הלייזר של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.
- לחסום את המדגם על ידי טבילה אותו cryotube המכיל 6% (v / v) סרום חמור - 3% (w / v) אלבומין סרום בקר (BSA) לילה.
- דגירה עם נוגדן ראשוני (או נוגדנים) בסרום חמור 3% ב- PBS למשך 24 שעות.
- לשטוף 5 פעמים במשך 1 שעות בכל פעם ב 0.05% tween 20 ב PBS (PBST).
- לדגור את המדגם עם נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי (או נוגדנים) בסרום חמור 3% ב- PBS למשך 24 שעות.
- לשטוף 5 פעמים במשך שעה אחת ב 0.05% (PBST). המתן שעה בין כל שטיפה.
- מוסיפים מים דה-יוניזציה ומאחסנים במרחק של 4 מעלות צלזיוס מאור ישיר. בשלב זה, הפיגומים מוכנים לתמונה.
4. הדמיה
- מניחים את המדגם בצלחת עם תחתית זכוכית ולחים אותה עם שתי טיפות של פתרון אחסון (PBS או מים דה-יוניים).
- הכן את המטרה. אנו ממליצים להשתמש במטרה טבילת מים.
- בדוק את המדגם באמצעות אור פלואורסצנטיות.
- עבור לבקרת מחשב. הפעל לייזרים ולהתאים את עוצמת הלייזר, צמצם חור הסיכה, גלאים אורכי גל, רווח, רזולוציה וזום. הגדר את המספר ואת גודל השלב עבור z-stack ולהתחיל רכישה. אנו ממליצים להשתמש עירור לייזר מולטי פוטוני כדי להגביר את חדירת הרקמות ולמזער את פיזור האור, ההלבנה ונזק לרקמות.
5. הכתמת המטוקסילין-אאוזין
- Excise 1 אונת ריאות מעכבר מורדם.
- מניחים ב 10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ cryomold לכסות אותו עם כ 500 μL של תרכובת OCT.
- להקפיא על קרח יבש (-70 °C (70 °F) ולשמור על המדגם בטמפרטורה זו.
- Excise אונה אחת ריאה decellularized מעכבר מעובד על פי שלב 2.5.
- מניחים בקריומולד עם שטח הפנים הגדול ביותר למטה ולכסות אותו עם תרכובת OCT כפי שצוין בשלב 5.2.
- יש להקפיא על קרח יבש (-70 מעלות צלזיוס) ולשמור על הדגימה בטמפרטורה זו עד שיידרש אחרת. ניתן לאחסן את הדגימה למשך 12 שבועות לפחות.
- בלוקים רקמה קפואה סעיף ב -20 °C בקריוסטט עם עובי 5 מיקרומטר ומניחים חלקים על שקופיות זכוכית דבק ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
- יש ליטול את השקופיות לטמפרטורת החדר עד לייבוש האוויר (כ-20 דקות).
- זמן קצר לטבול PBS ולתקן על ידי טבילת השקופיות ב 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 15 דקות. לשטוף פעם אחת PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן פעמיים במים מזוקקים במשך 5 דקות.
- תוכלו לטבול בתמיסת המטוקסילין של מאייר למשך 10 דקות. הפעם ניתן אופטימיזציה על פי מקור רקמה והכנת כתמים.
- לשטוף בצנצנת קופלין מתחת מים מזוקקים זורמים במשך 10 דקות.
- לטבול בפתרון אאוזין במשך 7 דקות. הפעם ניתן אופטימיזציה על פי מקור רקמה והכנת כתמים.
- טובלים ב-50% אתנול כדי להסיר עודף אאוזין ומתייבשים תוך זמן קצר בטבילה ב-70% אתנול, וב-96% וב-100% אתנול למשך 30 שניות. טובלים בקסילן מספר פעמים.
- יש למרוח כמה טיפות של הרכיבה על DPX בינונית ומניחים כיסוי זכוכית.
- השאר שקופיות להתייבש לילה מתחת למכסה המנוע הכימי.
- סרוק שקופיות בסורק שקופיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דפלולרציה לב-ריאה
לאחר השלמת הפרוטוקול בהצלחה, הלב והריאות, כמו גם רקמת נספח כגון קשת העורקים, יהיו נקיים מתאים. ניתן לאמת את ההקטוקסילין-אאוזין (איור 1) של פיגומי ECM המראים הסרה של הגרעינים בהשוואה לרקמה המקורית. פיגומים אלה שומרים על מידותיהם של איברים טריים ומבנה ECM המסיס שלו שלם2. איור 2 מציג ייצוג סכמטי של השלבים הכירורגיים העיקריים הנדרשים כדי לתבל בהצלחה את קומפלקס הלבו-ריאתי של העכבר.
הדמיית ECM
בסביבה סטנדרטית, נוגדנים משניים יכולים לשמש בערוצי פלואורסצנטיות ירוקים, אדומים ואדומים (כלומר, 488 ננומטר, 555nm /594 ננומטר וזיהוי אורך גל של 647 ננומטר); התוספת של דימות דור ההרמוניות השני (SHG) באמצעות עירור 2 פוטון תחשוף קולגן פיברילר. עירור לייזר יכול להסית autofluorescence רקמות ויש להפעיל זהירות בעת שימוש בו עם פלואורסצנטיות ירוקה, כפי שהוא עלול לבלבל נתוני הדמיה. דרך פשוטה לאמת פלואורסצנטיות אוטומטית היא לדמיין רקמת בקרה לא מזוהמת ולהגדיר את עוצמת הלייזר ואת רווח הגלאי בהתאם ולהשוות את זה עם כתמי הנוגדנים. עם זאת, אוטופלואורסצנטיות זו יכולה לשמש כיתרון, שכן היא יכולה לחשוף אלסטין בפיגומי ריאות.
פיגומי ECM הראו חמיאות מוגברת וחבילות קלה2. שימוש בפרוטוקול זה עם שלב מיקרוסקופ ממונע מאפשר הדמיה תלת-ממדית עם אריחים של דגימות של הרכבה מלאה ברזולוציית תת-מיקרון (איור 3). במקרה חלוקת הרקמה יש צורך (למשל, כדי תמונה קירות לב או parenchyma ריאות עמוק) רקמה צריך להיות חתך עם אזמל חד לפני הכתמים מתבצע.
איור 1. מאמת דפלולריזציה. המטוקסילין-אאוזין מכתים של דגימות קפואות מריאות ולב מקומיים ומורידים. שימו לב להיעדר גרעינים בדגימות מומדמות. כל המאזניים במיקרונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. סכמטי מיקרו-ניתוח המציג את הצעדים העיקריים הנדרשים כדי לבטל את קומפלקס הריאה הקרדיו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. מייצג חיסון חלבון מרובה של ריאות עכבר PyMT decellularized מעכבר נקבה בת 11 שבועות. פסיפס אריחים המציג את ההקרנה המרבית של ערימת z. Inset 1 מראה את הפלורה. Inset 2 מראה פרנצ'ימה ECM נורמלי. Inset 3 מראה סימפונות. הצבעים הפכו לנגישים לעיוור הצבעים. כל המאזניים במיקרונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקות Decellularization המבוססות על תסיסה רקמה לשנות מבנה ECM, מה שהופך אותם לא מתאים לניתוח מבנה ECM4. דטרמינוליזציה זלוף, באמצעות מסלול אנטומי כגון אב העורקים של קנה הנשימה, מאפשר להגיע למיטה נימי, או alveoli סופני, ומאפשר את המסירה של סוכנים decellularizing ברחבי האיבר. השימוש zwitterionic, אניוני ולא יוני דטרגנטים כדי decellularize רקמה מדווח4,5,6, עם זאת, נתרן דודציל סולפט (SDS, אניוני) ליניארי קולגן פיברילר כרית שומן העכבר2 אבל לא בריאות; זה מרמז על הבחירה של חומר ניקוי חייב להיות אופטימיזציה, הסתגלות לרקמת היעד כדי לשמור על מבנה ECM. שיטות ניקוי רקמות יכול לשמש לניתוח ECM, למרות שהם דורשים כימיקלים שיכולים לשנות ECM הצלב קישור, ומידות רקמות7,8,9. בעוד ששקיפות רקמות נרכשת מאפשרת הדמיה מיקרוסקופית משופרת, נוכחות התאים מחמירה באופן משמעותי את חדירת הנוגדנים ועשויה לכסות אפיטופים/חלבונים של ECM. בידוד והדמיה שלם ECM מאפשר ניתוח כמותי של המבנה שלה עם כלים אנליטיים2,10, מיפוי הרכבו2 ופותח את הדרך לבדיקה ביוכימית ECM נוספת.
ניתוח וקשירה של כלי דם גדולים ואת הבידוד כתוצאה מכך של מחזור כלילי וריאות יש צורך להשיג לחץ אחיד של פתרונות perfused בכל הרקמות. לכן, פרוטוקול זה תלוי במומחיות המיקרו-כירורגית של המפעיל הראשי. זה קריטי לפעול בדיוק, כדי לשמר את כלי הדם, הריאות והלב ללא פגע. ביצוע פרוטוקול זה שוב ושוב כדי להבין את האנטומיה התלת מימדית של בית החזה הוא בעל חשיבות עליונה כדי להשיג תוצאות עקביות.
ההליך הכירורגי המוצג כאן מסכם את השלבים הבסיסיים כדי לגשת vasculature העכבר1,2 ואת האיברים בשטחו. על ידי שינוי דפוס הקשירה, ניתן לגשת לראש ולצוואר, לגפיים ולכריות השומן. באמצעות אותם כישורים, ניתן לבטל את ההפלה של האיברים התת-דיאפרגמטיים.
חשוב לא פחות הוא העיצוב הקפדני של ההתקנה החיסונית. ריכזנו בעבר קטלוג של נוגדנים מאומתים נגד חלבוני ECM מבניים3. ההתקנה הסטנדרטית יכולה לחשוף עד שלושה חלבונים וקולגן פיברילר בו זמנית, ומאפשרת חקירה נגדית.
המשמעות של שיטה זו טמונה באפשרות להשיג פיגומי ECM שלמים מבחינה מבנית וממדית. פירוק של רקמה מורכבת לרכיבים דיסקרטיים הוא אחת המטרות הבסיסיות של ביו-הנדסה; בעוד שזה פשוט יחסית לבודד תאים, או דם, מאיבר, לא היו שיטות להשיג פיגומי ECM שלה. זה היה נכון במיוחד לגבי גידולים, אבל השיטה המוצגת כאן פותחת את הדרך לבידוד ECM בכל זן עכבר לניתוח אנטומי וביוכימי של ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לפרופ' איוונה נובאק וד"ר נין מיין כריסטנסן (המרכז להנפשה ביולוגית מתקדמת (CAB), אוניברסיטת קופנהגן) על מתן גישה למיקרוסקופ. עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ו- JTE); מלגת דוקטורט מקרן לונדבק (R286-2018-621; מר); מועצת המחקר השוודית (2017-03389; CDM); האגודה השבדית לסרטן, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, ו- 190007; CDM); סיוע גרמני לסרטן (דויטשה קרבשילפה; RR); והאגודה הדנית לסרטן (R204-A12454; ר.ר).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
