Summary
このプロトコルは、マウスの心臓と肺の細胞化を解除することを目的としています。得られた細胞外マトリックス(ECM)足場は、免疫染色され、それらの成分の位置およびトポロジーをマッピングするために画像化することができる。
Abstract
ここでは、マウスの心臓と肺の脱細胞化プロトコルを紹介します。それはECMのトポロジーおよび組成を分析するために使用することができる構造ECM足場を作り出す。これは、心と肺を脱細胞化剤で浸透させるために安楽死マウスの気管および大殿をカテーテルするように設計された微小外科的処置に基づいています。脱細胞化された心肺複合体は、その後、構造ECMタンパク質の位置を明らかにするために免疫染色することができる。全体の手順は、4日で完了することができます。
このプロトコルから生じる ECM スキャフォールドは、寸法の歪みのないものです。細胞の不在により、3Dでのサブミクロン分解能までECM構造の構造検査が可能になります。このプロトコルは、線維症および癌のマウスモデルを含む、生後4週の若いマウスから健康で病気の組織に適用することができ、心肺疾患に関連するECMリモデリングを決定する方法を開く。
Introduction
ECMは、タンパク質とグリカンで構成された3次元ネットワークであり、多細胞生物のすべての細胞を収容し、臓器に形状を与え、生涯を通じて細胞の挙動を調節します1。卵の受精から、細胞はECMを構築し、改造し、順番に厳密に制御されます。このプロトコルの目的は、マウスが哺乳類の病態生理学で最も使用されるモデル生物であるため、マウスECMを分析し、マッピングする方法を開くものです。
この方法の開発は、転移関連のネイティブECM2を特徴付け、分離する必要性によって推進されました。腫瘍は適切な解剖学的血管化を欠き、マウスは比較的小さな生物であるため、大動脈を逆行させるため、大動脈を逆行させるため、腫瘍につながる主要な血管(例えば肺静脈)の循環を単離し、試薬の流れを集中させ、腫瘍脱細胞化を可能にするマイクロ外科的処置を行った。この方法は、免疫染色および画像化することができる保存構造2を有するECM足場を生成し、サブミクロンの詳細でECM構造マッピングを可能にする。このプロトコルを実行するには、その使用に潜在的な制限を表す可能性のある外科的および微小外科的スキル(解剖、顕微鏡およびカテーテル化)を習得する必要があります。我々の知る限りでは、この方法は、ネイティブECM構造イメージング解析2,3の最先端を表しています。
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Protocol
ここに含まれるすべての手順は、コペンハーゲン大学の実験医学を規制する倫理委員会によって審査され、承認されており、デンマークとヨーロッパの法律に同意しています。このプロトコルを実証するために、8-12週齢の雌BALB/cJマウスと11週齢のMMTV-PyMT雌マウスを使用しました。
注:脱細胞化されたECM足場の細菌汚染を避けることは、最良のイメージング結果を与え、長期のサンプル保存を可能にします。したがって、すべてのステップを無菌にしておくことが重要です。したがって、縫合糸、マイクロ縫合、溶液、チューブ、ルアーコネクタ、カテーテルを含むすべての器具および外科材料は無菌でなければなりません。ポリスチレントレイを含む表面は、70%エタノールで消毒する必要があり、灌流は、好ましくは層流フードの下で行われるべきである。特に明記されていない限り、すべての手順は室温で行われます。
1. 事後マイクロサージャスト
- CO2チャンバーを使用してマウスを安楽死させる。
- マウスを4 Lチャンバーに入れ、100%CO2で満たし始め、0.2 L/分から2分間、3分後に0.8 L/分の流れに達するまで増加します。マウスは最初の2分の間に意識を失い、その後呼吸は停止する必要があります(通常は約5分ですが、必要に応じて流れを維持することができます)。次のステップに進む前に死亡を確認します。
- 毛のクリッパーで胸部、腹部、マウスの背中を剃り、70%エタノールで消毒します。シェービングは、画像処理または生化学的分析のためのサンプル上の毛髪の存在に起因するアーチファクトの数を大幅に減少させます。
- マウスをポリスチレントレイに固定し、前肢と後肢、頭と尾を伸ばします。マイクロサージャスト顕微鏡の下に置きます。
- マヨストレートパターンハサミを使用すると、下顎領域から下腹部に行く皮切開で外科的アクセスを確立し、胸壁と腹膜を露出させるために皮下に解剖する。
- 微小手術ハサミを使用して、胸部壁の両側の6番目の肋間空間に沿って大胸筋と小胸筋を切断する。
- ストレートパターンはさみを使用して、前の切開に沿って胸骨を切断し、その長い軸に沿って胸骨を切断することによって、ステノトミーを完了し、その後、高くし、心肺複合体を露出する胸壁の両側を固定します。
- 丸い先端のマイクロ鉗子(またはデュモンマイクロ鉗子)を使用して、胸腺および周囲の脂肪組織を繊細に引き離すことによって、その付着物を引き離すことによって切除する。これは主要な容器を明らかにします。
- 焼灼器を使用して、下降するカヴァ静脈を焼灼し、まっすぐなパターンはさみを使用して食道を切断します。
- 鋭利なマイクロ鉗子を使用して、腕頭蓋静脈と腕頭蓋を分離し、共通の頸動脈および左鎖骨下動脈を下層組織から分離し、結紮および焼灼を促進する。
- マイクロニードルホルダーを使用して、鋭いマイクロ鉗子と9-0縫合は、腕頭蓋、左一般的な頸動脈および左鎖骨動脈の出現の上にステッチを置く。
- ブラキオセファリック静脈を焼灼する。
- 正中線に沿って下顎下唾液腺を分離し、首の筋肉と気管を露出させます。筋肉を分離して、コリコ甲状腺靭帯を露出させます。マイクロハサミを使用して、靭帯を切開して入り口を開きます。
- 気管に27Gカテーテルを導入し、気管が気管支に分岐するまで繊細に押し込みます(すなわち、カテーテルに対する抵抗が満たされるまで、3mm後退します)。気管支を乱さないで注意してください。6-0縫合を使用して、気管の周りに3ステッチを置き、カテーテルを固定します。
- 12番目の胸椎の高さでマウスを切り離します。下降大動脈は脊柱に対して前もって走り、脊椎と一緒にここで切り離す必要があります。下半分を離します。
- 逆行的に大動脈をカテーテルし、大動脈弧に到達するまでカテーテルを押す。9-0縫合を使用して、カテーテル先端の下に5mmを開始して、大オルタの周りに4針を置きます。
2. 脱細胞化
- シリコンチューブとLuerコネクタを使用して、マウスをポンプシステムに接続します。200 μL/min で 15 分間、脱イオン水を使用します。脱細胞化中にこの流量を維持する。
- 灌流剤をデオキシコール酸ナトリウム(DOC)に変え、脱イオン水で希釈し、一晩浸透させます。
- 灌流剤を、脱イオン水で希釈して8時間パーフューズした0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に変更します。
- 脱イオン水を一晩浸透させ、SDSとDOCを24時間洗い流します。
- 湾曲したはさみを使用して胸郭に付着物を切り離して脱細胞化した心臓と肺を切除し、1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシンと0.3 μMナトリウムアジドを4°Cで除イオン水で滅菌クライオチューブに保存します。足場が生化学的分析(例えば質量分析法)に使用される場合は、液体窒素中で凍結します。
3. 免疫染色
- イメージングを計画する:一次抗体(または抗体)と蛍光結合二次抗体の組み合わせを決定し、互いに一致し、蛍光顕微鏡のレーザーラインに適合するようにします。
- サンプルを6%(v/v)ロバ血清-3%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を一晩含むクライオチューブに浸漬してブロックする。
- PBSで3%ロバ血清中の一次抗体(または抗体)を24時間インキュベートする。
- PBS(PBST)で0.05%トゥイーン20で1時間洗浄します。
- サンプルを蛍光結合二次抗体(または抗体)を3%ロバ血清で24時間PBSでインキュベートします。
- 0.05%(PBST)で1時間5回洗浄してください。各洗浄の間に1時間待ちます。
- 脱イオン水を加え、直接光から離れた4°Cで保管します。この時点で、スキャフォールドはイメージを作成する準備が整いました。
4. イメージング
- サンプルをガラス底の皿に入れ、2滴の貯蔵溶液(PBSまたは脱イオン水)で加湿します。
- 目的を準備します。水浸しの目的を使用することをお勧めします。
- 蛍光灯を用いてサンプルを検査します。
- コンピュータ制御に切り替えます。レーザーをオンにし、レーザー強度、ピンホール開口、検出器の波長、ゲイン、解像度、ズームを調整します。z スタックの数とステップサイズを設定し、取得を開始します。多光子レーザー励起を使用して、組織の浸透を増加させ、光の散乱、漂白、組織損傷を最小限に抑えることをお勧めします。
5. ヘマトキシリン-エオジン染色
- 安楽死させたマウスから1つの肺葉を切り物にする。
- 10 mm x 10 mm x 5 mm のクライオムオールに入れ、約 500 μL の OCT 化合物で覆います。
- ドライアイス(-70°C)で凍結し、その温度でサンプルを維持します。
- ステップ2.5に従って処理されたマウスから1つの脱細胞化された肺葉を物品切りする。
- 最大の表面積を下にしたクライオムドに配置し、ステップ5.2で指定されているようにOCT化合物で覆います。
- ドライアイス(-70°C)で凍結し、必要になるまでその温度でサンプルを維持します。サンプルは、少なくとも12週間保存することができます。
- 5 μmの厚さのクライオスタットで-20 °Cの凍結組織ブロックを切り離し、粘着ガラススライドに切片を置き、-80°Cで保管します。
- スライドを室温まで取り、空気が乾くまで(約20分)
- PBSに浸し、15分間PBSに4%パラホルムアルデヒドにスライドを浸して固定します。PBSで1回5分間洗浄し、蒸留水で5分間2回洗浄します。
- マイヤーのヘマトキシリン溶液に10分間浸漬します。この時間は、組織源および染色剤調製に従って最適化することができる。
- 蒸留水の下で10分間コプリン瓶で洗います。
- 7分間、エオシン溶液に浸します。この時間は、組織源および染色剤調製に従って最適化することができる。
- 50%エタノールに浸して、70%エタノールに、96%と100%エタノールで30秒間、すぐに浸漬して余分なエオシンを除去し、脱水する。キシレンに数回浸します。
- DPX取付媒体を少し滴下し、ガラスカバースリップを入れます。
- 化学フードの下で一晩乾燥するようにスライドを残します。
- スライド スキャナーでスライドをスキャンします。
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Representative Results
心肺脱細胞化
プロトコルを正常に完了した後、心臓と肺、ならびに大動脈弧のような別館組織は、細胞から解放される。脱細胞化は、天然組織と比較して核の除去を示すECM足場のヘマトキシリン-エオシン染色(図1)によって検証することができる。これらの足場は新鮮な器官の寸法を保持し、不溶性ECM構造はそのままである2。 図2 は、マウス心肺複合体を正常に浸透させるために必要な主要な外科的ステップの概略図を示す。
ECMイメージング
標準設定では、二次抗体は緑、赤色、遠赤色蛍光チャネル(すなわち、488 nm、555nm/594 nmおよび647 nm波長検出)で使用することができます。2光子励起を用いた第2高調波発生(SHG)画像の付加は、フィブリルコラーゲンを明らかにする。レーザー励起は、組織の自己蛍光を刺激することができ、それは画像データを交わす可能性があるため、緑色蛍光でそれを使用する場合は注意が必要です。自動蛍光を検証する簡単な方法は、染色されていない対照組織を画像化し、レーザー強度と検出器のゲインをそれに応じて設定し、これを抗体染色と比較することです。しかし、この自己蛍光は、肺の足場にエラスチンを露出させることができるので、利点として使用することができる。
ECM足場は透過性および光浸透性2を示した。このプロトコルを電動顕微鏡ステージで使用することで、サブミクロン分解能で、全マウントの3次元のタイルイメージングを可能にします(図3)。組織を切り離す必要がある場合(例えば、心臓壁または深部肺パレンチマを画像化する)組織は、染色が行われる前に鋭いメスで切除されるべきである。
図 1.脱細胞化の検証。 ネイティブおよび脱細胞化された肺および心臓からの凍結サンプルを凍結したヘマトキシリン-エオシン染色。脱細胞化サンプルに核がないことに注意してください。ミクロンですべてのスケール。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.心肺複合体の脱細胞化に必要な重要なステップを示すマイクロ手術の概略図。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.11週齢の雌マウス由来の脱細胞化PyMTマウス肺の多重タンパク質免疫染色を代表する。 Z スタックの最大投影を示すタイル モザイク。インセット1は胸膜を示す。インセット2は、正常なパレンチマECMを示す。インセット3は気管支を示す。色は、色盲のためにアクセス可能にされています。ミクロンですべてのスケール。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
組織撹拌に基づく脱細胞化技術はECM構造を変化させ、ECM構造解析4に不適当にする。輸液脱細胞化は、気管の大器官のような解剖学的経路を用いて、毛細血管床、または末期のアルベオリに到達することを可能にし、器官全体の脱細胞化剤の送達を促進する。ジウテリオニック、アニオン性、非イオン性洗剤を使用して組織を脱細胞化すると報告されています4,5,6ですが、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS、アニオン)はマウス脂肪パッド2では線維細胞性コラーゲンを直線化します。これは、ECM構造を維持するためにターゲット組織に適応して、洗剤の選択を最適化しなければならないことを示唆している。組織の清算方法は、ECM架橋を変更できる化学物質、および組織寸法7,8,9を必要とするが、ECM分析に使用できると考えられる。獲得した組織の透明性は、微細イメージングを強化することができますが、細胞の存在は、抗体の浸透を著しく悪化させ、ECMエピトープ/タンパク質をカバーする可能性があります。インタクトECMを分離してイメージングすることで、その構造を分析ツール2,10で定量分析し、その組成2をマッピングし、さらなるECM生化学検査への道を開きます。
主要な血管の解剖と結紮とそれに伴う冠状動脈および肺循環の分離は、組織全体に浸透した溶液の均一な圧力を達成するために必要である。したがって、このプロトコルは、主要なオペレータのマイクロ外科的専門知識に依存しています。血管、肺、心臓をそのまま維持するために、正確に操作することが重要です。胸郭の三次元解剖学を理解するためにこのプロトコルを繰り返し実行することは、一貫した結果を得るために最も重要である。
ここに示す外科的処置は、マウスの脈管構造1,2とその領土内の器官にアクセスするための基本的なステップを合計する。合字パターンを変更することにより、頭頸部、前肢及び脂肪パッドにアクセスすることができる。同じスキルを使用して、横隔膜下器官を脱細胞化することが可能である。
同様に重要なのは、免疫染色設定の慎重な設計です。我々は、構造ECMタンパク質3に対する検証された抗体のカタログを以前にまとめた。標準的なセットアップは3つまでの蛋白質およびフィブリラーコラーゲンを同時に明らかにすることができ、相互検査を可能にする。
この方法の重要性は、構造的および寸法的に無傷のECM足場を得る可能性にあります。複雑な組織を慎重なコンポーネントに分解することは、バイオエンジニアリングの基本的な目標の1つです。臓器から細胞、または血液を単離することは比較的簡単ですが、そのECM足場を得る方法はありませんでした。これは特に腫瘍に当てはまるが、ここで提示される方法は、ECMの解剖学的および生化学的分析のための任意のマウス株におけるECM単離の道を開く。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、イヴァナ・ノバク教授とニン・メイ・クリステンセン博士(コペンハーゲン大学高度バイオイメージングセンター)に感謝します。この研究は、欧州研究評議会(ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN)によって支援されました。AEM-G、OW、RR、および JTE);ルンドベック財団(R286-2018-621;R286-621)の博士課程のフェローシップMR);スウェーデン研究評議会 (2017-03389;CDM);スウェーデン癌学会, がんフォンデン (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, そして190007;CDM);ドイツ癌援助(ドイツ・クレブシルフェ;RR);デンマーク癌学会 (R204-A12454;RR)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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