Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى تداعي قلب ورئتي الفئران. يمكن أن تكون سقالات المصفوفة خارج الخلية الناتجة (ECM) ملطخة بالمناعة ومصورة لرسم خريطة لموقع وتضاريم مكوناتها.
Abstract
نقدم هنا بروتوكول التفكيك لقلب الفأر والرئتين. وتنتج سقالات ECM الهيكلية التي يمكن استخدامها لتحليل طوبولوجيا ECM وتكوينها. وهو يقوم على إجراء جراحي دقيق مصمم لقسطرة القصبة الهوائية والأورطة من فأر القتل الرحيم لتشويش القلب والرئتين مع عوامل التفكيك. يمكن أن يكون مجمع القلب الرئوي الديسيلي في وقت لاحق ملطخا بالمناعة للكشف عن موقع بروتينات ECM الهيكلية. يمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في 4 أيام.
سقالات ECM الناتجة عن هذا البروتوكول خالية من التشوهات الأبعاد. غياب الخلايا يتيح الفحص الهيكلي للهياكل ECM وصولا الى قرار submicron في 3D. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الأنسجة السليمة والمرضية من الفئران التي لا تتجاوز أعمارهم 4 أسابيع ، بما في ذلك نماذج الماوس من التليف والسرطان ، مما يفتح الطريق لتحديد إعادة عرض ECM المرتبطة بمرض القلب والكون.
Introduction
و ECM هي شبكة ثلاثية الأبعاد مصنوعة من البروتينات والجلوكان التي تستوعب جميع الخلايا في كائن متعدد الخلايا، وإعطاء الأعضاء شكلها وتنظيم سلوك الخلية طوال الحياة1. من تخصيب البويضة فصاعدا، تقوم الخلايا ببناء وإعادة تشكيل ECM، وبالتالي يتم التحكم فيها بدقة من قبلها. الغرض من هذا البروتوكول هو فتح طريقة لتحليل خريطة الفأر ECM ، حيث أن الفئران هي الكائن الحي النموذجي الأكثر استخداما في الفيزيولوجيا المرضية للثدييات.
وكان الدافع وراء تطوير هذه الطريقة هو الحاجة إلى توصيف وعزل ECM2 الأصلي المرتبط بالنقائل. نظرا لأن الأورام تفتقر إلى الأوعية الدموية التشريحية المناسبة والفئران هي كائنات صغيرة نسبيا ، فقد تم تصميم الإجراءات الجراحية الدقيقة لقسطرة الشريان الأورطي إلى الوراء ، مع عزل دوران الأوعية الرئيسية المؤدية إلى الورم (على سبيل المثال ، الأوردة الرئوية) ، وبالتالي تركيز تدفق الكاشف والسماح بإزالة الورم. تنتج هذه الطريقة سقالات ECM مع هيكل محفوظ2 يمكن أن يكون ملطخا بالمناعة ومصورا ، مما يسمح برسم خرائط بنية ECM بتفاصيل submicron. لتنفيذ هذا البروتوكول، من الضروري اكتساب المهارات الجراحية والجراحية الدقيقة (تشريح، والتسوية الدقيقة والقسطرة) التي قد تمثل قيدا محتملا على استخدامه. على حد علمنا، تمثل هذه الطريقة أحدث ما في تحليل تصوير بنية ECM الأصلي2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم استعراض جميع الإجراءات المدرجة هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية التي تنظم الطب التجريبي في جامعة كوبنهاغن وتتفق مع التشريعات الدنماركية والأوروبية. لإثبات هذا البروتوكول ، استخدمنا فئران BALB / cJ الأنثوية من عمر 8-12 أسبوعا وفأرة أنثى MMTV-PyMT تبلغ من العمر 11 أسبوعا.
ملاحظة: تجنب التلوث البكتيري سقالة ECM decellularized يعطي أفضل نتيجة التصوير ويسمح تخزين عينة على المدى الطويل. ولذلك فمن المهم للحفاظ على جميع الخطوات عقيمة. على هذا النحو، يجب أن تكون جميع الأدوات والمواد الجراحية، بما في ذلك خياطة، خياطة صغيرة، والحلول، والأنابيب، موصلات لوير والقسطرة، عقيمة. يجب تطهير الأسطح ، بما في ذلك صينية البوليسترين ، بالإيثانول بنسبة 70٪ ، ويفضل أن يتم التشوه تحت غطاء تدفق صفح. جميع الإجراءات تتم في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. الجراحة المجهرية بعد الوفاة
- قتل الفأر باستخدام غرفة ثاني أكسيد الكربون.
- ضع الماوس في غرفة 4 لتر، وابدأ في ملء مع CO2 100٪، بدءا من 0.2 لتر / دقيقة لمدة 2 دقيقة، وزيادة حتى تصل إلى تدفق 0.8 لتر / دقيقة بعد 3 دقائق. يجب أن يسقط الماوس فاقدا للوعي خلال أول دقيقتين ، ثم يجب أن يتوقف التنفس (عادة حوالي 5 دقائق ، ولكن يمكن الحفاظ على التدفق حسب الضرورة). تأكيد الوفاة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- حلق الصدر والبطن وظهر الماوس مع مقص الشعر وتطهير مع الإيثانول 70٪. الحلاقة يقلل كثيرا من عدد القطع الأثرية بسبب وجود الشعر إما على عينات للتصوير أو التحليل الكيميائي الحيوي.
- دبوس الماوس إلى صينية البوليسترين، وتمديد المصابيح الأمامية و hindlimbs، فضلا عن رأسه والذيل. ضعه تحت مجهر الجراحة المجهرية.
- باستخدام مقص نمط مستقيم مايو إنشاء الوصول الجراحي مع شق جلدي يمتد من المنطقة تحت الفك السفلي إلى أسفل البطن وتشريح تحت الجلد لفضح جدار الصدر والحمور.
- باستخدام مقص جراحي دقيق، وقطع العضلات الصدرية الرئيسية والصدرية طفيفة على طول الفضاء الوربي السادس على جانبي الجدار الصدري.
- باستخدام مقص نمط مستقيم، وقطع القص على طول الشقوق السابقة، ومن ثم إكمال استئصال القص عن طريق قطع القص على طول محورها الطويل، ثم رفع ودبوس كلا الجانبين من الجدار الصدري لفضح مجمع القلب والعظمة.
- باستخدام ملقط صغير مستدير الرؤوس (أو ملقط صغير من Dumont) ، اقتطع الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية المحيطة بها عن طريق سحبها بدقة من ملحقاتها. هذا سيكشف عن السفن الرئيسية.
- باستخدام الكي، الكي الوريد كافا تنازلي و، وذلك باستخدام مقص نمط مستقيم، وقطع المريء.
- باستخدام ملقط صغير حاد ، افصل الأوردة البراتشيوسيفية والبراتشيوسيفال ، وترك الشرايين السباتية الشائعة واليسارية من الأنسجة الأساسية لتسهيل الربط والكي.
- باستخدام حامل الإبرة الدقيقة ، ملقط صغير حاد و 9-0 غرز خياطة مكان فوق ظهور brachiocephalic ، تركت الشرايين السباتية الشائعة واليسارية تحت الترقوة.
- كي الأوردة العضدية.
- فصل الغدد اللعابية تحت الفك السفلي على طول خط الوسط لفضح عضلات الرقبة والرغامى. فصل العضلات لفضح الرباط الكريكوثيرويد. باستخدام مقص صغير، افتح مدخلا عن طريق تقسيم الرباط.
- إدخال قسطرة 27 G في القصبة الهوائية ودفع بدقة حتى فروع القصبة الهوائية في القصبات الهوائية (أي، حتى يتم الوفاء بمقاومة القسطرة، ثم تراجع 3 ملم). كن حذرا من تعطيل الشعب الهوائية. باستخدام خياطة 6-0، ضع 3 غرز حول القصبة الهوائية لتأمين القسطرة.
- قسم الماوس في ذروة الفقرة الصدرية 12th. الشريان الأورطي التنازلي يمتد بشكل مسبق إلى العمود الفقري وينبغي تقسيمه هنا جنبا إلى جنب مع العمود الفقري. تعيين النصف السفلي بعيدا.
- القسطرة إلى الوراء الشريان الأورطي ودفع القسطرة حتى تصل إلى القوس الأبهري. باستخدام خياطة 9-0، ضع 4 غرز حول الشريان الأورطي، بداية من 5 مم تحت طرف القسطرة.
2. التفكيك
- قم بتوصيل الماوس بنظام مضخة باستخدام أنابيب السيليكون وموصلات Luer. Perfuse مع الماء deionized في 200 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة. الاحتفاظ بمعدل التدفق هذا أثناء التفكيك.
- تغيير عامل التغلغل إلى 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم (DOC) المخفف في الماء deionized وتغلغل بين عشية وضحاها.
- تغيير عامل التشوه إلى 0.1٪ من كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) المخفف في الماء التأين والتشويش لمدة 8 ساعات.
- Perfuse مع المياه deionized بين عشية وضحاها لغسل SDS وDOC لمدة 24 ساعة.
- إعادة استئصال القلب والرئتين decellularized عن طريق تقسيم ملحقاتها إلى الصدر باستخدام مقص منحني وتخزينها في أنبوب التبريد العقيم مع الماء deionized مع 1٪ (v/v) البنسلين-streptomycin و 0.3 ميكرومتر الصوديوم azide في 4 درجة مئوية يمكن تخزين سقالات ECM لمدة 12 أسبوعا على الأقل. إذا كان سيتم استخدام السقالة للتحليل الكيميائي الحيوي (على سبيل المثال، قياس الطيف الكتلي)، تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل.
3. التثبيط المناعي
- تخطيط التصوير: تحديد الأجسام المضادة الأولية (أو الأجسام المضادة) والجمع بين الأجسام المضادة الثانوية المترافقة الفلورية لتتناسب مع بعضها البعض وتتناسب مع خطوط الليزر من المجهر الفلوري.
- منع العينة عن طريق غمرها في cryotube تحتوي على 6٪ (v/v) مصل حمار - 3٪ (ث / v) ألبوم مصل البقر (BSA) بين عشية وضحاها.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (أو الأجسام المضادة) في مصل الحمير 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.
- غسل 5 مرات لمدة 1 ساعة في كل مرة في 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني (PBST).
- احتضان العينة مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة الفلورية (أو الأجسام المضادة) في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.
- غسل 5 مرات لمدة ساعة واحدة في 0.05٪ (PBST). انتظر 1 ساعة بين كل غسل.
- أضف الماء المؤين واحفظه على بعد 4 درجات مئوية من الضوء المباشر. عند هذه النقطة ، سقالة على استعداد للصورة.
4. التصوير
- ضع العينة في طبق ذو قاع زجاجي وترطيبها بقطرات من محلول التخزين (PBS أو الماء المؤين).
- إعداد الهدف. نوصي باستخدام هدف غمر المياه.
- فحص العينة باستخدام ضوء مضان.
- التبديل إلى التحكم في الكمبيوتر. قم بتشغيل الليزر وضبط كثافة الليزر وفتحة الثقب والأطوال الموجية للكاشفات والكسب والدقة والتكبير. تعيين رقم وحجم الخطوة ل z-المكدس وبدء الاستحواذ. نوصي باستخدام الإثارة بالليزر متعددة الفوتون لزيادة اختراق الأنسجة وتقليل تشتت الضوء والتبييض وتلف الأنسجة.
5. تلطيخ هيماتوكسيلين إيوزين
- استئصال 1 فص الرئة من فأر القتل الرحيم.
- ضعه في 10 مم × 10 مم × 5 مم كريومولد وغطيه بما يقرب من 500 ميكرولتر من مركب OCT.
- تجميد على الجليد الجاف (-70 درجة مئوية) والحفاظ على العينة في تلك الدرجة حرارة.
- استئصال واحد فص الرئة decellularized من الماوس المعالجة وفقا للخطوة 2.5.
- ضعه في cryomold مع أكبر مساحة سطحية لأسفل وغطيه بمجمع OCT كما هو محدد في الخطوة 5.2.
- تجميد على الجليد الجاف (-70 درجة مئوية) والحفاظ على العينة في تلك الدرجة الحرارة حتى المطلوبة خلاف ذلك. يمكن تخزين العينة لمدة 12 أسبوعا على الأقل.
- كتل الأنسجة المجمدة القسم في -20 درجة مئوية في cryostat مع سمك 5 ميكرومتر ووضع أقسام على الشرائح الزجاجية اللاصقة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- خذ الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة حتى يجف الهواء (حوالي 20 دقيقة).
- تزج قريبا في برنامج تلفزيوني وإصلاح عن طريق غمر الشرائح في 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم مرتين في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
- تزج في محلول الهيماتوكسيلين ماير لمدة 10 دقيقة. هذه المرة يمكن تحسين وفقا لمصدر الأنسجة وإعداد وصمة عار.
- يغسل في جرة كوبلين تحت الماء المقطر الجاري لمدة 10 دقائق.
- تزج في حل إيوسين لمدة 7 دقائق. هذه المرة يمكن تحسين وفقا لمصدر الأنسجة وإعداد وصمة عار.
- تراجع في الإيثانول 50٪ لإزالة اليوسين الزائد والجفاف عن طريق الانخفاض قريبا في الإيثانول 70٪، وفي 96٪ و 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. تراجع في الزيلين عدة مرات.
- تطبيق بضع قطرات من DPX تصاعد المتوسطة ووضع غطاء الزجاج.
- اترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي.
- مسح الشرائح ضوئيا في ماسح ضوئي للشرائح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الديسيلولارات القلبية الرئوية
بعد الانتهاء بنجاح من البروتوكول، والقلب والرئتين، فضلا عن الأنسجة الملحقة مثل القوس الأبهري، وسوف تكون خالية من الخلايا. يمكن التحقق من صحة Decellularization عن طريق تلطيخ hematoxylin-eosin (الشكل 1) من سقالات ECM التي تظهر إزالة النواة مقارنة بالأنسجة الأصلية. تحتفظ هذه السقالات بأبعاد الأعضاء الطازجة وهيكل ECM غير القابل للذوبان سليم2. يظهر الشكل 2 تمثيلا تخطيطيا للخطوات الجراحية الرئيسية المطلوبة لتشويش مجمع القلب والرئة الماوس بنجاح.
تصوير ECM
في وضع قياسي، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية في قنوات الفلورسينس الخضراء والحمراء والحمراء البعيدة (أي 488 نانومتر، 555 نانومتر/594 نانومتر و647 نانومتر الكشف عن الطول الموجي)؛ إضافة الجيل التوافقي الثاني (SHG) التصوير باستخدام 2 الفوتون الإثارة سوف تكشف الكولاجين الرجفان. يمكن أن يحرض الإثارة بالليزر على الفلورة الذاتية للأنسجة ويجب تطبيق الحذر عند استخدامه مع الفلورسينس الأخضر ، لأنه قد يربك بيانات التصوير. وهناك طريقة مباشرة للتحقق من صحة السيارات الفلورسينس هو صورة أنسجة التحكم غير الملطخة وتعيين كثافة الليزر وكسب كاشف وفقا لذلك ومقارنة هذا مع تلطيخ الأجسام المضادة. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا autofluorescence كميزة، كما أنه يمكن أن يعرض الإيلاستين في سقالات الرئتين.
وأظهرت سقالات ECM زيادة نفاذية وpenetrability الخفيفة2. باستخدام هذا البروتوكول مع مرحلة المجهر الآلي يسمح للتصوير ثلاثي الأبعاد، والبلاط من جبل كامل) عينات في دقة submicron (الشكل 3). في حالة تقسيم الأنسجة ضروري (على سبيل المثال، لتصوير جدران القلب أو parenchyma الرئوية العميقة) يجب تقسيم الأنسجة مع مشرط حاد قبل إجراء تلطيخ.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 التحقق من صحة التفكيك. Hematoxylin-Eosin تلطيخ العينات المجمدة المفاجئة من الرئتين الأصلية وdeellularized والقلب. لاحظ عدم وجود نواة في عينات ديسيلولايري. جميع المقاييس في ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تخطيطي للجراحة الدقيقة يظهر الخطوات الرئيسية المطلوبة لتفكيك مجمع القلب والرئة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن ممثل متعددة البروتين المناعي من الرئتين الماوس PyMT decellularized من فأر أنثى 11 أسبوعا. بلاط الفسيفساء التي تبين الإسقاط الأقصى من z-كومة. يظهر Inset 1 الجنبة. Inset 2 يظهر العادي parenchyma ECM. Inset 3 يظهر القصبات الهوائية. وقد جعلت الألوان في متناول المكفوفين اللون. جميع المقاييس في ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنيات إزالة الخلايا على أساس هياج الأنسجة تغيير هيكل ECM، مما يجعلها غير مناسبة لتحليل هيكل ECM4. الارتهاق الارتخائي ، باستخدام مسار تشريحي مثل الشريان الأورطي للرغامى ، يسمح بالوصول إلى السرير الشعري ، أو الحويصلات الهوائية الطرفية ، ويسهل تسليم عوامل التفكيك في جميع أنحاء الجهاز. استخدام المنظفات zwitterionic، أنيوني وغير أيونية لdeellularize الأنسجة هو المبلغ عنها4،5،6، ومع ذلك، الصوديوم دودسيل كبريتات (SDS، أنيوني) linearizes الكولاجين الرجفان في لوحة الدهون الماوس2 ولكن ليس في الرئتين؛ وهذا يشير إلى أن اختيار المنظفات يجب أن يكون الأمثل، والتكيف مع الأنسجة المستهدفة للحفاظ على هيكل ECM. ويمكن تصور استخدام أساليب تطهير الأنسجة لتحليل تخطيط القلب، على الرغم من أنها تتطلب مواد كيميائية يمكن أن تغير الربط عبر تخطيط القلب، وأبعاد الأنسجة7،8،9. في حين أن شفافية الأنسجة المكتسبة تسمح بالتصوير المجهري المعزز ، فإن وجود الخلايا يزيد من تفاقم اختراق الأجسام المضادة بشكل كبير وقد يغطي أسطح /بروتينات ECM. عزل وتصوير ECM سليمة يسمح التحليل الكمي لهيكلها مع الأدوات التحليلية2،10، ورسم خرائط تكوينها2 ويفتح الطريق لمزيد من الفحص الكيميائي الحيوي ECM.
تشريح وربط الأوعية الرئيسية وما يترتب على ذلك من عزل الدورة الدموية التاجية والرئية ضروري لتحقيق ضغط موحد من الحلول التي غرست في جميع أنحاء الأنسجة. لذلك، يعتمد هذا البروتوكول على الخبرة المجهرية للمشغل الرئيسي. من المهم أن تعمل بدقة، وذلك للحفاظ على الأوعية والرئتين والقلب سليمة. تنفيذ هذا البروتوكول مرارا وتكرارا لفهم التشريح ثلاثي الأبعاد من الصدر أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج متسقة.
العملية الجراحية المبينة هنا يلخص الخطوات الأساسية للوصول إلى vasculature1 الماوس،2 والأعضاء في أراضيها. عن طريق تغيير نمط الرباط، فمن الممكن للوصول إلى الرأس والرقبة، وأطرافه في المقدمة ومنصات الدهون. باستخدام نفس المهارات ، من الممكن تفكيك الأعضاء تحت الحجاب الحاجز.
بنفس القدر من الأهمية هو التصميم الدقيق لإعداد المناعة. لقد قمنا سابقا بتجميع كتالوج للأجسام المضادة المعتمدة ضد بروتينات ECM الهيكلية3. يمكن أن يكشف الإعداد القياسي عن ما يصل إلى ثلاثة بروتينات وكولاجين الرجفان في وقت واحد ، مما يتيح استجواب الشهود.
تكمن أهمية هذه الطريقة في إمكانية الحصول على سقالات ECM سليمة هيكليا وببعد. تفكيك الأنسجة المعقدة إلى مكونات سرية هو واحد من الأهداف الأساسية للهندسة الحيوية. في حين أنه من السهل نسبيا عزل الخلايا ، أو الدم ، من جهاز ، لم تكن هناك طرق للحصول على سقالات ECM. وكان هذا ينطبق بشكل خاص على الأورام ، ولكن الطريقة المعروضة هنا تفتح الطريق لعزل ECM في أي سلالة فأر للتحليل التشريحي والكيميائي الحيوي ل ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر البروفيسور إيفانا نوفاك والدكتورة نين مين كريستنسن (مركز التصوير الحيوي المتقدم (CAB)، جامعة كوبنهاغن) على توفير الوصول إلى المجهر. وقد دعم هذا العمل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN؛ AEM-G، OW، RR و JTE)؛ منحة دكتوراه من مؤسسة لوندبيك (R286-2018-621؛ MR)؛ مجلس البحوث السويدي (2017-03389؛ آلية التنمية النظيفة)؛ الجمعية السويدية للسرطان، Cancerfonden (CAN 2016/783، 19 0632 Pj، 190007؛ آلية التنمية النظيفة)؛ المعونة الألمانية لمكافحة السرطان (دويتشه كريبشيلفي؛ RR)؛ وجمعية السرطان الدنماركية (R204-A12454; RR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
