Decellularisering af Murine Cardiopulmonal Complex

Summary

Denne protokol har til formål at decellularisere hjertet og lungerne af mus. Den resulterende ekstracellulære matrix (ECM) stilladser kan immunstained og afbildet til at kortlægge placeringen og topologi af deres komponenter.

Abstract

Vi præsenterer her en decellularisering protokol for mus hjerte og lunger. Det producerer strukturelle ECM stilladser, der kan bruges til at analysere ECM topologi og sammensætning. Det er baseret på en mikrokirurgisk procedure designet til at kateterisere luftrøret og aorta af en aflivet mus til at gennemtrænge hjerte og lunger med decellulariserende midler. Det decellulære kardiopulmonalkompleks kan efterfølgende immunplettet for at afsløre placeringen af strukturelle ECM-proteiner. Hele proceduren kan afsluttes om 4 dage.

ECM-stilladserne som følge af denne protokol er fri for dimensionelle forvrængninger. Fraværet af celler muliggør strukturel undersøgelse af ECM-strukturer ned til submicronopløsning i 3D. Denne protokol kan anvendes på sundt og sygt væv fra mus så unge som 4 uger gamle, herunder musemodeller af fibrose og kræft, åbner vejen for at bestemme ECM remodeling forbundet med kardiopulmonal sygdom.

Introduction

ECM er et tredimensionelt netværk lavet af proteiner og glycaner, der rummer alle celler i en flercellet organisme, hvilket giver organer deres form og regulerer celleadfærd gennem hele ^livet1. Fra ægbefrugtning og fremefter bygger og ombygger cellerne ECM og kontrolleres igen strengt af den. Formålet med denne protokol er at åbne en måde at analysere og kortlægge mus ECM, da mus er den mest anvendte modelorganisme i pattedyrs patofysiologi.

Udviklingen af denne metode var drevet af behovet for at karakterisere og isolere metastaser-associerede indfødte ^ECM2. Da tumorer mangler korrekt anatomisk vascularization og mus er relativt små organismer, mikrokirurgiske procedurer blev designet til retrogradely kateterisere aorta, samtidig med at cirkulationen af de store fartøj, der fører til en tumor (f.eks lungevener), således at fokus reagens flow og tillader tumor decellularisering. Denne metode producerer ECM stilladser med en bevaret ^struktur2, der kan immun farves og afbildes, så ECM struktur kortlægning i submicron detaljer. For at udføre denne protokol er det nødvendigt at erhverve kirurgiske og mikrokirurgiske færdigheder (dissektion, mikrosuturing og kateterisering), der kan udgøre en potentiel begrænsning af dets anvendelse. Så vidt vi ved, repræsenterer denne metode den nyeste teknologi til native ECM struktur imaging ^analysis2,3.

Protocol

Alle procedurer, der indgår her, er gennemgået og godkendt af det etiske udvalg, der regulerer eksperimentel medicin på Københavns Universitet og er enige i dansk og europæisk lovgivning. For at demonstrere denne protokol har vi brugt kvindelige BALB / cJ-mus på 8-12 uger og en MMTV-PyMT kvindelig mus på 11 uger.

BEMÆRK: Undgå bakteriel forurening af det decellulære ECM-stillads giver det bedste billeddannelsesresultat og giver mulighed for langtidsprøveopbevaring. Det er derfor vigtigt at holde alle trin sterile. Som sådan skal alle instrumenter og kirurgisk materiale, herunder sutur, mikro sutur, opløsninger, slanger, Luer-stik og katetre, være sterile. Overflader, herunder en polystyrenbakke, skal desinficeres med 70% ethanol, og perfusionen skal helst udføres under en laminar flowhætte. Alle procedurer finder sted ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

1. Post mortem mikrokirurgi

1. Aflive musen ved hjælp af et _CO2-kammer .
   1. Placer musen i et 4 L kammer, og begynd at fylde med 100% _CO2, startende ved 0,2 L/min i 2 min, stigende indtil de når en strøm på 0,8 L/min efter 3 min. Musen skal falde bevidstløs i løbet af de første 2 minutter, og derefter skal åndedrættet ophøre (normalt omkring 5 minutter, men strømmen kan opretholdes efter behov). Bekræft dødsfaldet, før du går videre til næste trin.
2. Barber brystkassen, maven og bagsiden af musen med hårklipperen og desinficer med 70% ethanol. Barbering reducerer i høj grad antallet af artefakter på grund af tilstedeværelsen af hår enten på prøver til billeddannelse eller biokemisk analyse.
3. Pin musen til en polystyren bakke, udvide sin for- og hindlimbs, samt dens hoved og hale. Placer det under mikrokirurgi mikroskop.
4. Ved hjælp af en Mayo lige mønster saks etablere kirurgisk adgang med en kutan snit løber fra den submandibulære region til underlivet og dissekere subkutant at udsætte brystvæggen og bughinden.
5. Ved hjælp af mikrokirurgisk saks skæres pectoralis store og pectoralis mindre muskler langs det sjette interkostalrum på begge sider af brystvæggen.
6. Ved hjælp af lige mønster saks, skære brystbenet langs de tidligere snit, og derefter fuldføre en sternotomi ved at skære brystbenet langs sin lange akse, derefter hæve og pin begge sider af brystvæggen til at udsætte kardiopulmonal kompleks.
7. Ved hjælp af runde tippede mikro-sammentrækninger (eller Dumont mikro-kraft), punktafgifter thymus og omgivende fedtvæv ved forsigtigt at trække dem ud af deres vedhæftede filer. Dette vil afsløre de store fartøjer.
8. Ved hjælp af cautery, cauterize den faldende cava vene og ved hjælp af lige mønster saks, skære spiserøret.
9. Ved hjælp af skarpe mikro-sammenkævninger, adskille brachiocephalic vener og brachiocephalic, venstre fælles halspulsåren og venstre subclavian arterier fra det underliggende væv for at lette ligation og cauterization.
10. Ved hjælp af mikronålholder, skarpe mikro-sammenkævninger og 9-0 sutur placere sting over fremkomsten af brachiocephalic, venstre fælles halspulsåren og venstre subclavian arterier.
11. Cauterize brachiocephalic vener.
12. Adskil de submandibulære spytkirtler langs midterlinjen for at udsætte nakkemusklerne og luftrøret. Adskil musklerne for at eksponere cricothyroid ledbånd. Ved hjælp af mikro-saks, åbne en indgang ved at dele ledbåndet.
13. Indfør et 27 G kateter i luftrøret og skub forsigtigt, indtil luftrøret grene ind i bronkierne (dvs. indtil modstanden mod kateteret er opfyldt, derefter trække sig tilbage 3 mm). Pas på ikke at forstyrre bronkierne. Brug en 6-0 sutur, placere 3 masker omkring luftrøret for at sikre kateteret.
14. Del musen i højden af den 12. brysthvirvel. Den faldende aorta løber forreste til rygsøjlen og bør være opdelt her sammen med rygsøjlen. Sæt den nederste halvdel fra hinanden.
15. Retrogradely kateterisere aorta og skubbe kateteret, indtil det når aortabuen. Brug 9-0 sutur, læg 4 masker omkring aortaen, der begynder 5 mm under kateteret.

2. Decellularisering

1. Tilslut musen til et pumpesystem ved hjælp af silikonerør og Luer-stik. Gennemtræng med deioniseret vand ved 200 μL/min i 15 min. Vedligehold denne strømningshastighed under decellularisering.
2. Skift perfusionsmidlet til 0,5% natriumdeoxycholat (DOC), fortyndet i deioniseret vand og gennemtræng natten over.
3. Skift perfusionsmidlet til 0,1% natrium dodecylsulfat (SDS), der fortyndes i deioniseret vand og gennemsyres i 8 timer.
4. Gennemgå med deioniseret vand natten over for at vaske SDS og DOC væk i 24 timer.
5. Resect det decellulære hjerte og lunger ved at dele dets fastgørelser til brystkassen ved hjælp af en buet saks og opbevares i et sterilt kryorør med deioniseret vand med 1% (v/v) penicillin-streptomycin og 0,3 μM natriumzid ved 4 °C. ECM stilladser kan opbevares i mindst 12 ^uger1. Hvis stilladset vil blive brugt til biokemisk analyse (f.eks. massespektrometri), skal snapfryses i flydende nitrogen.

3. Immunstaining

1. Planlæg billeddannelsen: Fastgør primær antistof (eller antistoffer) og kombinationen af fluorescerende konjugeret sekundære antistoffer til at matche hinanden og til at passe laser linjer fluorescens mikroskop.
2. Bloker prøven ved at nedsænke den i en cryotube indeholdende 6% (v/v) æselserum - 3% (w/v) kvæg serum albumin (BSA) natten over.
3. Inkuberes med primært antistof (eller antistoffer) i 3% æselserum i PBS i 24 timer.
4. Vask 5 gange i 1 time hver gang i 0,05% mellem 20 i PBS (PBST).
5. Inkuberes prøven med fluorescerende konjugeret sekundært antistof (eller antistoffer) i 3% æselserum i PBS i 24 timer.
6. Vask 5 gange i 1 time i 0,05% (PBST). Vent 1 time mellem hver vask.
7. Tilsæt deioniseret vand og opbevar ved 4 °C væk fra direkte lys. På dette tidspunkt er stilladset klar til at blive billedet.

4. Billeddannelse

1. Prøven anbringes i en glasbundet skål, og befugt den med to dråber opbevaringsopløsning (PBS eller deioniseret vand).
2. Forbered målet. Vi anbefaler at bruge et vand nedsænkningsmål.
3. Undersøg prøven ved hjælp af fluorescenslys.
4. Skift til computerkontrol. Tænd lasere og justere laser intensitet, pinhole blænde, detektorer bølgelængder, gain, opløsning og zoom. Angiv antallet og trinstørrelsen for z-stack, og begynd anskaffelsen. Vi anbefaler at bruge multiphoton laser excitation at øge væv penetration og for at minimere spredning af lys, blegning og væv skader.

5. Hæmatoxylin-eosin farvning

1. Punktafgifter 1 lunge lap fra en aflivet mus.
2. Placer i en 10 mm x 10 mm x 5 mm cryomold og dække det med ca 500 μL af OCT sammensatte.
3. Fryses på tøris (-70 °C), og prøven skal vedligeholdes ved denne temperatur.
4. Punktafgifter en decellulær lungelap fra en forarbejdet mus i henhold til trin 2.5.
5. Placer i en cryomold med det største overfladeareal ned og dække det med OCT sammensatte som angivet i trin 5.2.
6. Fryses på tøris (-70 °C), og prøven skal vedligeholdes ved denne temperatur, indtil andet er nødvendigt. Prøven kan opbevares i mindst 12 uger.
7. Sektion frosne vævsblokke ved -20 °C i en kryostat med 5 μm tykkelse og læg sektioner på klæbende glasrutschebaner og opbevares ved -80 °C.
8. Tag dias til stuetemperatur, indtil luften tørret (ca. 20 min).
9. Kort fordybe sig i PBS og fix ved at nedsænke dias i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min. Vask en gang i PBS i 5 min, derefter to gange i destilleret vand i 5 min.
10. Fordyb i Mayers hæmatoxylinopløsning i 10 min. Denne gang kan optimeres i henhold til vævskilde og pletforberedelse.
11. Vask i en Coplin krukke under rindende destilleret vand i 10 min.
12. Fordyb i eosinopløsning i 7 min. Denne gang kan optimeres i henhold til vævskilde og pletforberedelse.
13. Dyk i 50% ethanol for at fjerne overskydende eosin og dehydrat ved kort dypning i 70% ethanol, og i 96% og 100% ethanol i 30 sekunder. Dyp i xylen flere gange.
14. Påfør nogle dråber DPX montering medium og placere et glas coverlip.
15. Lad rutsjebaner tørre natten over under en kemisk hætte.
16. Scan dias i en diasscanner.

Representative Results

Kardiopulmonal decellularisering
Efter en vellykket fuldførelse af protokollen, hjerte og lunger, samt bilag væv såsom aorta bue, vil være fri for celler. Decellularisering kan valideres ved hæmatoxylin-eosin farvning (figur 1) af ECM stilladser viser fjernelse af kerner sammenligne med det indfødte væv. Disse stilladser bevarer dimensionerne af friske organer og dens uopløselige ECM struktur er ^intakt2. Figur 2 viser en skematisk repræsentation af de vigtigste kirurgiske trin, der kræves for at gennemgå musen cardio-lungekompleks.

ECM Imaging
I en standardindstilling kan sekundære antistoffer anvendes i grønne, røde og rød fluorescenskanaler (dvs. 488 nm, 555nm/594 nm og 647 nm bølgelængdedetektering); tilføjelsen af anden harmoniske generation (SHG) billeddannelse ved hjælp af 2-foton excitation vil afsløre fibrillar kollagen. Laser excitation kan tilskynde væv autofluorescence og forsigtighed skal anvendes, når du bruger det med grøn fluorescens, da det kan forvirre billeddannelse data. En enkel måde at validere auto-fluorescens er at billedet en unstained kontrolvæv og indstille laser intensitet og detektor gevinst i overensstemmelse hermed og sammenligne dette med antistof farvning. Men, denne autofluorescence kan bruges som en fordel, da det kan udsætte elastin i lungerne stilladser.

ECM stilladser viste øget gennemtrængelighed og let ^{penetrability2}. Brug af denne protokol med et motoriseret mikroskopstadium giver mulighed for tredimensionel, flisebelagt billeddannelse af helmonterede) prøver ved submikroopløsning (figur 3). Hvis det er nødvendigt at dele vævet (f.eks. for at afbilde hjertevægge eller dybt lungeparenkym), skal vævenesektiones med en skarp skalpel, før farvningen udføres.

Figur 1. Validerer decellularisering. Hæmatoxylin-Eosin farvning af snap frosne prøver fra indfødte og decellulære lunger og hjerte. Bemærk fraværet af kerner i decellulære prøver. Alle skalaer i mikron. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Mikrokirurgi skematisk viser de vigtigste skridt, der kræves for at decellularisere cardio-lungekompleks. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Repræsentativ multiproteinimmunstaining af decellulerede PyMT-muse lunger fra en 11 uger gammel hunmus. Flise mosaik viser den maksimale projektion af en z-stack. Indsat 1 viser pleuraen. Indsat 2 viser normal parenchyma ECM. Indsat 3 viser en bronkier. Farverne er blevet gjort tilgængelige for farveblinde. Alle skalaer i mikron. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Decellulariseringsteknikker baseret på vævs agitation ændrer ECM-strukturen, hvilket gør dem uegnede til ECM-strukturanalyse4. Perfusion decellularisering, ved hjælp af en anatomisk rute som aorta af luftrøret, gør det muligt at nå kapillær seng, eller terminal alveol, og letter leveringen af decellulariserende midler i hele organet. Brugen af zwitterioniske, anioniske og ikke-ioniske rengøringsmidler til at decellulisere væv er rapporteret4,5,6, dog, natrium dodecyl sulfat (SDS, anionisk) linearizes fibrillar kollagen i musen fedt ^pad2 men ikke i lungerne; Dette tyder på, at valget af vaskemiddel skal optimeres, tilpasse sig målvævet for at opretholde ECM-strukturen. Væv clearing metoder kunne tænkes at blive brugt til ECM analyse, selv om de kræver kemikalier, der kan ændre ECM krydsbinding, og væv ^{dimensioner7,8,9}. Mens erhvervet væv gennemsigtighed tillader forbedret mikroskopisk billeddannelse, tilstedeværelsen af celler væsentligt forværrer antistof penetration og kan dække ECM epitoper / proteiner. Isolering og billeddannelse intakt ECM tillader kvantitativ analyse af sin struktur med analytiske ^{værktøjer2,10}, kortlægning af dens ^{sammensætning2} og åbner vejen for yderligere ECM biokemisk undersøgelse.

Dissektion og ligation af større fartøjer og den deraf følgende isolering af koronar og lungecirkulation er nødvendig for at opnå et ensartet tryk af perfunderede opløsninger i hele vævene. Derfor er denne protokol afhængig af den mikrokirurgiske ekspertise hos hovedoperatøren. Det er vigtigt at operere med præcision, for at bevare fartøjer, lunger og hjerte intakt. Udførelse af denne protokol gentagne gange for at forstå thoraxens tredimensionelle anatomi er afgørende for at opnå ensartede resultater.

Den kirurgiske procedure, der vises her, opsummerer de grundlæggende trin for at få adgang til musens ^{vaskulatur1,2} og organerne på dens område. Ved at ændre ligaturmønsteret er det muligt at få adgang til hoved og hals, forbenene og fedtpuderne. Ved hjælp af de samme færdigheder er det muligt at decellulisere de submembrantiske organer.

Lige så vigtigt er det omhyggelige design af immunstaining setup. Vi har tidligere udarbejdet et katalog over validerede antistoffer mod strukturelle ECM-proteiner3. Standardopsætningen kan afsløre op til tre proteiner og fibrillar kollagen samtidigt, hvilket muliggør krydsforhør.

Betydningen af denne metode ligger i muligheden for at opnå strukturelt og dimensionelt intakte ECM stilladser. Dekonstruktionen af et komplekst væv i diskrete komponenter er et af de grundlæggende mål for bioengineering; mens det er relativt ligetil at isolere celler, eller blod, fra et organ, var der ingen metoder til at opnå sin ECM stilladser. Dette var især tilfældet med tumorer, men den metode, der præsenteres her, åbner vejen for ECM-isolering i enhver musestamme til anatomisk og biokemisk analyse af ECM.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L