Summary
Ce protocole vise à décellulariser le cœur et les poumons des souris. Les échafaudages de matrice extracellulaire (ECM) qui en résultent peuvent être immunocolorés et imagés pour cartographier l’emplacement et la topologie de leurs composants.
Abstract
Nous présentons ici un protocole de décellularisation pour le cœur et les poumons des souris. Il produit des échafaudages ECM structurels qui peuvent être utilisés pour analyser la topologie et la composition ECM. Il est basé sur une procédure microchirurgicale conçue pour cathétériser la trachée et l’aorte d’une souris euthanasiée afin de perfuser le cœur et les poumons avec des agents décellularisants. Le complexe cardiopulmonaire décellularisé peut ensuite être immunocoloré pour révéler l’emplacement des protéines ECM structurelles. L’ensemble de la procédure peut être complété en 4 jours.
Les échafaudages ECM résultant de ce protocole sont exempts de distorsions dimensionnelles. L’absence de cellules permet l’examen structurel des structures ECM jusqu’à une résolution submicronique en 3D. Ce protocole peut être appliqué aux tissus sains et malades de souris aussi jeunes que 4 semaines, y compris des modèles murins de fibrose et de cancer, ouvrant la voie à la détermination du remodelage ECM associé à la maladie cardiopulmonaire.
Introduction
L’ECM est un réseau tridimensionnel composé de protéines et de glycanes qui accueille toutes les cellules d’un organisme multicellulaire, donnant aux organes leur forme et régulant le comportement cellulaire tout au long de la vie1. À partir de la fécondation des ovules, les cellules construisent et remodèlent l’ECM, et sont à leur tour strictement contrôlées par celui-ci. Le but de ce protocole est d’ouvrir la voie à l’analyse et à la cartographie de l’ECM de la souris, car les souris sont l’organisme modèle le plus utilisé en physiopathologie des mammifères.
Le développement de cette méthode a été motivé par la nécessité de caractériser et d’isoler l’ECM2 natif associé aux métastases. Comme les tumeurs manquent de vascularisation anatomique appropriée et que les souris sont des organismes relativement petits, les procédures microchirurgicales ont été conçues pour cathétériser rétrogradement l’aorte, tout en isolant la circulation du vaisseau majeur menant à une tumeur (par exemple, les veines pulmonaires), concentrant ainsi le flux de réactif et permettant la décellularisation tumorale. Cette méthode produit des échafaudages ECM avec une structure conservée2 qui peut être immunocolorée et imagée, permettant une cartographie de la structure ECM dans des détails submicroniques. Pour réaliser ce protocole, il est nécessaire d’acquérir des compétences chirurgicales et microchirurgicales (dissection, microsuturing et cathétérisme) qui peuvent représenter une limitation potentielle à son utilisation. À notre connaissance, cette méthode représente l’état de l’art pour l’analyse d’imagerie de structure ECM native2,3.
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Protocol
Toutes les procédures incluses ici ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique réglementant la médecine expérimentale de l’Université de Copenhague et sont conformes à la législation danoise et européenne. Pour démontrer ce protocole, nous avons utilisé des souris femelles BALB/cJ âgées de 8 à 12 semaines et une souris femelle MMTV-PyMT âgée de 11 semaines.
REMARQUE: Éviter la contamination bactérienne de l’échafaudage ECM décellularisé donne le meilleur résultat d’imagerie et permet le stockage à long terme des échantillons. Il est donc important de garder toutes les étapes stériles. En tant que tels, tous les instruments et le matériel chirurgical, y compris la suture, la micro-suture, les solutions, les tubes, les connecteurs Luer et les cathéters, doivent être stériles. Les surfaces, y compris un plateau en polystyrène, doivent être désinfectées avec de l’éthanol à 70% et la perfusion doit de préférence être effectuée sous une hotte à écoulement laminaire. Toutes les procédures ont lieu à température ambiante, sauf indication contraire.
1. Microchirurgie post-mortem
- Euthanasier la souris à l’aide d’une chambre à CO2 .
- Placez la souris dans une chambre de 4 L et commencez à remplir avec 100% de CO2, en commençant à 0,2 L / min pendant 2 min, en augmentant jusqu’à atteindre un débit de 0,8 L / min après 3 min. La souris devrait tomber inconsciente pendant les 2 premières minutes, puis la respiration devrait cesser (généralement autour de 5 minutes, mais le flux peut être maintenu si nécessaire). Confirmez le décès avant de passer à l’étape suivante.
- Rasez le thorax, l’abdomen et le dos de la souris avec la tondeuse à cheveux et désinfectez avec de l’éthanol à 70%. Le rasage réduit considérablement le nombre d’artefacts en raison de la présence de poils sur des échantillons pour l’imagerie ou l’analyse biochimique.
- Épinglez la souris à un plateau en polystyrène, en étendant ses membres antérieurs et postérieurs, ainsi que sa tête et sa queue. Placez-le sous le microscope de microchirurgie.
- À l’aide d’un motif droit Mayo, les ciseaux établissent un accès chirurgical avec une incision cutanée allant de la région sous-maxillaire au bas-ventre et dissèquent par voie sous-cutanée pour exposer la paroi thoracique et le péritoine.
- À l’aide de ciseaux microchirurgicaux, coupez les muscles pectoraux majeurs et pectoraux mineurs le long du sixième espace intercostal des deux côtés de la paroi thoracique.
- À l’aide de ciseaux à motif droit, coupez le sternum le long des incisions précédentes, puis complétez une sternotomie en coupant le sternum le long de son long axe, puis élevez et épinglez les deux côtés de la paroi thoracique pour exposer le complexe cardiopulmonaire.
- À l’aide de micro-pinces à pointe ronde (ou micro-pinces Demont), excisez le thymus et le tissu adipeux environnant en les retirant délicatement de leurs attaches. Cela révélera les principaux navires.
- À l’aide de la cautérisation, cautériser la veine cava descendante et, à l’aide de ciseaux à motif droit, couper l’œsophage.
- À l’aide de micro-pinces pointues, séparez les veines brachiocéphales et les artères carotides communes gauches et sous-clavières brachiocéphales du tissu sous-jacent pour faciliter la ligature et la cautérisation.
- À l’aide d’un porte-micro-aiguille, de micro-pinces pointues et d’une suture 9-0 placent les points de suture au-dessus de l’émergence des artères brachiocéphales, carotides communes gauches et sous-clavières gauches.
- Cautériser les veines brachiocéphales.
- Séparez les glandes salivaires sous-maxillaires le long de la ligne médiane pour exposer les muscles du cou et la trachée. Séparez les muscles pour exposer le ligament cricothyroïdien. À l’aide de micro-ciseaux, ouvrez une entrée en sectionnant le ligament.
- Introduire un cathéter de 27 G dans la trachée et pousser délicatement jusqu’à ce que la trachée se ramifie dans les bronches (c.-à-d. jusqu’à ce que la résistance au cathéter soit rencontrée, puis reculez de 3 mm). Attention à ne pas perturber les bronches. À l’aide d’une suture 6-0, placez 3 points de suture autour de la trachée pour fixer le cathéter.
- Sectionnez la souris à la hauteur de la 12e vertèbre thoracique. L’aorte descendante s’étend antérieurement à la colonne vertébrale et doit être sectionnée ici avec la colonne vertébrale. Séparez la moitié inférieure.
- Cathétériser rétrogradement l’aorte et pousser le cathéter jusqu’à ce qu’il atteigne l’arc aortique. À l’aide d’une suture 9-0, placez 4 points de suture autour de l’aorte, en commençant à 5 mm sous la pointe du cathéter.
2. Décellularisation
- Connectez la souris à un système de pompe à l’aide de tubes en silicone et de connecteurs Luer. Perfuser avec de l’eau désionisée à 200 μL/min pendant 15 min. Maintenir ce débit pendant la décellularisation.
- Changer l’agent de perfusion à 0,5% de désoxycholate de sodium (DOC) dilué dans de l’eau désionisée et perfuser pendant la nuit.
- Changer l’agent de perfusion en sulfate de dodécyle de sodium (SDS) à 0,1% dilué dans de l’eau désionisée et perfuser pendant 8 heures.
- Perfuser avec de l’eau désionisée pendant la nuit pour laver les FDS et les DOC pendant 24 h.
- Réséquez le cœur et les poumons décellularisés en sectionnant ses attaches au thorax à l’aide d’un ciseau incurvé et stockez-le dans un cryotube stérile avec de l’eau désionisée contenant 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine et 0,3 μM d’azoture de sodium à 4 °C. Les échafaudages ECM peuvent être conservés pendant au moins 12 semaines1. Si l’échafaudage est utilisé pour l’analyse biochimique (p. ex., spectrométrie de masse), congelez-le dans de l’azote liquide.
3. Immunocoloration
- Planifiez l’imagerie : déterminez l’anticorps primaire (ou les anticorps) et la combinaison d’anticorps secondaires conjugués par fluorescence pour qu’ils correspondent les uns aux autres et s’adaptent aux lignes laser du microscope à fluorescence.
- Bloquez l’échantillon en l’immergeant dans un cryotube contenant 6% (v/v) de sérum d’âne - 3% (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) pendant la nuit.
- Incuber avec des anticorps primaires (ou des anticorps) dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 h.
- Laver 5 fois pendant 1 h à chaque fois à 0,05% entre 20 dans PBS (PBST).
- Incuber l’échantillon avec des anticorps secondaires (ou anticorps) conjugués par fluorescence dans du sérum d’âne à 3% dans du PBS pendant 24 h.
- Laver 5 fois pendant 1 heure à 0,05% (PBST). Attendez 1 h entre chaque lavage.
- Ajouter l’eau désionisée et conserver à 4 °C à l’abri de la lumière directe. À ce stade, l’échafaudage est prêt à imager.
4. Imagerie
- Placez l’échantillon dans un plat à fond de verre et humidifiez-le avec deux gouttelettes de solution de stockage (PBS ou eau désionisée).
- Préparez l’objectif. Nous vous recommandons d’utiliser un objectif d’immersion dans l’eau.
- Inspectez l’échantillon à l’aide d’une lumière de fluorescence.
- Passez au contrôle de l’ordinateur. Allumez les lasers et ajustez l’intensité du laser, l’ouverture du sténopé, les longueurs d’onde des détecteurs, le gain, la résolution et le zoom. Définissez le nombre et la taille de l’étape pour z-stack et commencez l’acquisition. Nous recommandons d’utiliser l’excitation laser multiphotonique pour augmenter la pénétration des tissus et minimiser la diffusion de la lumière, le blanchiment et les dommages tissulaires.
5. Coloration à l’hématoxyline-éosine
- Excise 1 lobe pulmonaire d’une souris euthanasiée.
- Placer dans un cryomoulage de 10 mm x 10 mm x 5 mm et le recouvrir d’environ 500 μL de composé OCT.
- Congeler sur de la glace carbonique (-70 °C) et maintenir l’échantillon à cette température.
- Exciser un lobe pulmonaire décellularisé d’une souris traitée conformément à l’étape 2.5.
- Placez dans un cryomoulage avec la plus grande surface vers le bas et recouvrez-le de composé OCT comme spécifié à l’étape 5.2.
- Lyophiliser sur de la glace carbonique (-70 °C) et maintenir l’échantillon à cette température jusqu’à ce qu’il en soit autrement. L’échantillon peut être conservé pendant au moins 12 semaines.
- Couper les blocs de tissu congelé à -20 °C dans un cryostat de 5 μm d’épaisseur et placer des sections sur des lames de verre adhésif et les stocker à -80 °C.
- Porter les lames à température ambiante jusqu’à séchage à l’air (environ 20 min).
- Immergez-vous rapidement dans pbS et fixez en immergeant les lames dans 4% de paraformaldéhyde dans pbS pendant 15 min. Laver une fois dans du PBS pendant 5 min, puis deux fois dans de l’eau distillée pendant 5 min.
- Plonger dans la solution d’hématoxyline de Mayer pendant 10 min. Ce temps peut être optimisé en fonction de la source tissulaire et de la préparation des taches.
- Laver dans un pot Coplin sous eau distillée courante pendant 10 min.
- Immerger dans une solution d’éosine pendant 7 min. Ce temps peut être optimisé en fonction de la source tissulaire et de la préparation des taches.
- Tremper dans 50% d’éthanol pour éliminer l’excès d’éosine et déshydrater en trempant rapidement dans 70% d’éthanol, et dans 96% et 100% d’éthanol pendant 30 secondes. Tremper dans le xylène plusieurs fois.
- Appliquez quelques gouttes de support de montage DPX et placez un couvercle en verre.
- Laissez sécher les lames pendant la nuit sous une hotte chimique.
- Numérisez des diapositives dans un scanner de diapositives.
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Representative Results
Décellularisation cardiopulmonaire
Après avoir terminé avec succès le protocole, le cœur et les poumons, ainsi que le tissu annexe tel que l’arc aortique, seront exempts de cellules. La décellularisation peut être validée par coloration à l’hématoxyline-éosine (Figure 1) des échafaudages ECM montrant l’élimination des noyaux par rapport au tissu natif. Ces échafaudages conservent les dimensions des organes frais et sa structure ECM insoluble est intacte2. La figure 2 montre une représentation schématique des principales étapes chirurgicales nécessaires pour perfuser avec succès le complexe cardio-pulmonaire de la souris.
Imagerie ECM
Dans un contexte standard, les anticorps secondaires peuvent être utilisés dans les canaux de fluorescence vert, rouge et rouge lointain (c.-à-d. détection de longueur d’onde de 488 nm, 555 nm / 594 nm et 647 nm); l’ajout de l’imagerie de génération de secondes harmoniques (SHG) utilisant l’excitation à 2 photons révélera le collagène fibrillaire. L’excitation laser peut inciter à l’autofluorescence tissulaire et la prudence doit être appliquée lors de son utilisation avec une fluorescence verte, car elle peut confondre les données d’imagerie. Un moyen simple de valider l’auto-fluorescence consiste à imager un tissu témoin non coloré et à régler l’intensité laser et le gain du détecteur en conséquence et à les comparer à la coloration des anticorps. Cependant, cette autofluorescence peut être utilisée comme un avantage, car elle peut exposer l’élastine dans les échafaudages pulmonaires.
Les échafaudages ECM ont montré une perméabilité accrue et une pénétrabilité légère2. L’utilisation de ce protocole avec un étage de microscope motorisé permet une imagerie tridimensionnelle et carrelée d’échantillons à monture entière à une résolution submicronique (Figure 3). Dans le cas où la section du tissu est nécessaire (par exemple, pour imager les parois cardiaques ou le parenchyme pulmonaire profond), le tissu doit être sectionné avec un scalpel pointu avant que la coloration ne soit effectuée.
Graphique 1. Validation de la décellularisation. Coloration à l’hématoxyline-éosine d’échantillons congelés instantanés provenant de poumons et de cœurs natifs et décellularisés. Remarquez l’absence de noyaux dans les échantillons décellularisés. Toutes les écailles en microns. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Schéma de microchirurgie montrant les étapes clés nécessaires à la décellularisation du complexe cardio-pulmonaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Immunocoloration protéique multiple représentative des poumons de souris PyMT décellularisés d’une souris femelle de 11 semaines. Mosaïque de tuiles montrant la projection maximale d’une pile z. L’encadré 1 montre la plèvre. L’encadré 2 montre un ECM normal du parenchyme. L’encadré 3 montre une bronchiole. Les couleurs ont été rendues accessibles aux daltoniens. Toutes les écailles en microns. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les techniques de décellularisation basées sur l’agitation tissulaire modifient la structure de l’ECM, ce qui les rend impropres à l’analyse de la structure de l’ECM4. La décellularisation par perfusion, utilisant une voie anatomique telle que l’aorte de la trachée, permet d’atteindre le lit capillaire, ou alvéole terminale, et facilite l’administration d’agents décellularisants dans tout l’organe. L’utilisation de détergents zwittérioniques, anioniques et non ioniques pour décellulariser les tissus est rapportée4,5,6, cependant, le sulfate de dodécyle de sodium (SDS, anionique) linéarise le collagène fibrillaire dans le coussinet adipeux de la souris2 mais pas dans les poumons; cela suggère que le choix du détergent doit être optimisé, en s’adaptant au tissu cible pour maintenir la structure ECM. Les méthodes de nettoyage des tissus pourraient être utilisées pour l’analyse ECM, bien qu’elles nécessitent des produits chimiques pouvant modifier la réticulation ECM et les dimensions des tissus7,8,9. Alors que la transparence tissulaire acquise permet une imagerie microscopique améliorée, la présence de cellules aggrave considérablement la pénétration des anticorps et peut couvrir les épitopes/protéines ECM. L’isolation et l’imagerie de l’ECM intact permettent une analyse quantitative de sa structure avec des outils analytiques2,10, cartographier sa composition2 et ouvre la voie à un examen biochimique ECM plus poussé.
La dissection et la ligature des principaux vaisseaux et l’isolement conséquent de la circulation coronaire et pulmonaire sont nécessaires pour obtenir une pression uniforme de solutions perfusées dans tous les tissus. Par conséquent, ce protocole dépend de l’expertise microchirurgicale de l’opérateur principal. Il est essentiel d’opérer avec précision, afin de préserver intacts les vaisseaux, les poumons et le cœur. L’exécution répétée de ce protocole pour comprendre l’anatomie tridimensionnelle du thorax est primordiale pour obtenir des résultats cohérents.
L’intervention chirurgicale présentée ici résume les étapes de base pour accéder au système vasculaire de la souris1,2 et aux organes de son territoire. En changeant le motif de ligature, il est possible d’accéder à la tête et au cou, aux membres antérieurs et aux coussinets graisseux. En utilisant les mêmes compétences, il est possible de décellulariser les organes sous-diaphragmatiques.
Tout aussi important est la conception minutieuse de la configuration immunocolorante. Nous avons déjà compilé un catalogue d’anticorps validés contre les protéines ECM structurelles3. La configuration standard peut révéler jusqu’à trois protéines et du collagène fibrillaire simultanément, ce qui permet un contre-interrogatoire.
L’importance de cette méthode réside dans la possibilité d’obtenir des échafaudages ECM structurellement et dimensionnellement intacts. La déconstruction d’un tissu complexe en composants discrets est l’un des objectifs fondamentaux de la bio-ingénierie; Bien qu’il soit relativement simple d’isoler des cellules, ou du sang, d’un organe, il n’existait aucune méthode pour obtenir son échafaudage ECM. Cela était particulièrement vrai pour les tumeurs, mais la méthode présentée ici ouvre la voie à l’isolement ECM dans n’importe quelle souche de souris pour l’analyse anatomique et biochimique de l’ECM.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les professeurs Ivana Novak et Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Université de Copenhague) d’avoir fourni un accès au microscope. Ces travaux ont été soutenus par le Conseil européen de la recherche (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR et JTE); une bourse de doctorat de la Fondation Lundbeck (R286-2018-621; MR); le Conseil suédois de la recherche (2017-03389; MDP); la Société suédoise du cancer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, et 190007; MDP); Aide allemande contre le cancer (Deutsche Krebshilfe; RR); et la Société danoise du cancer (R204-A12454; RR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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