Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Herz und die Lunge von Mäusen zu dezellularisieren. Die resultierenden Gerüste der extrazellulären Matrix (ECM) können immungefärbt und abgebildet werden, um die Position und Topologie ihrer Komponenten abzubilden.
Abstract
Wir präsentieren hier ein Dezellularisierungsprotokoll für Mausherz und -lunge. Es produziert strukturelle ECM-Gerüste, die zur Analyse der ECM-Topologie und -Zusammensetzung verwendet werden können. Es basiert auf einem mikrochirurgischen Verfahren, das entwickelt wurde, um die Luftröhre und Aorta einer eingeschläferten Maus zu katheterisieren, um Herz und Lunge mit Dezellularisierungsmitteln zu durchdringen. Der dezellularisierte kardiopulmonale Komplex kann anschließend immungefärbt werden, um die Position struktureller ECM-Proteine aufzudecken. Das gesamte Verfahren kann in 4 Tagen abgeschlossen werden.
Die aus diesem Protokoll resultierenden ECM-Gerüste sind frei von Dimensionsverzerrungen. Das Fehlen von Zellen ermöglicht die strukturelle Untersuchung von ECM-Strukturen bis hin zur Submikronauflösung in 3D. Dieses Protokoll kann auf gesundes und krankes Gewebe von Mäusen im Alter von 4 Wochen angewendet werden, einschließlich Mausmodellen für Fibrose und Krebs, was den Weg zur Bestimmung des ECM-Remodelings im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen ebnet.
Introduction
Das ECM ist ein dreidimensionales Netzwerk aus Proteinen und Glykanen, das alle Zellen in einem vielzelligen Organismus beherbergt, Organen ihre Form verleiht und das Zellverhalten während des gesamten Lebens reguliert1. Ab der Eizellbefruchtung bauen und modellieren Zellen das ECM und werden wiederum streng von ihm kontrolliert. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine Möglichkeit zur Analyse und Kartierung von Maus-ECM zu eröffnen, da Mäuse der am häufigsten verwendete Modellorganismus in der Pathophysiologie von Säugetieren sind.
Die Entwicklung dieser Methode wurde durch die Notwendigkeit vorangetrieben, Metastasen-assoziiertes natives ECM2 zu charakterisieren und zu isolieren. Da Tumoren keine richtige anatomische Vaskularisierung fehlt und Mäuse relativ kleine Organismen sind, wurden mikrochirurgische Verfahren entwickelt, um die Aorta retrograd zu katheterisieren, während die Zirkulation des Hauptgefäßes, das zu einem Tumor führt (z. B. die Lungenvenen), isoliert wird, wodurch der Reagenzfluss fokussiert und die Tumordezellularisation ermöglicht wird. Diese Methode erzeugt ECM-Gerüste mit einer konservierten Struktur2, die immungefärbt und abgebildet werden können, was eine ECM-Strukturkartierung im Submikrometer-Detail ermöglicht. Um dieses Protokoll durchzuführen, ist es notwendig, chirurgische und mikrochirurgische Fähigkeiten (Dissektion, Mikroernährung und Katheterisierung) zu erwerben, die eine mögliche Einschränkung seiner Verwendung darstellen können. Unseres Wissens stellt diese Methode den Stand der Technik für die native ECM-Strukturbildgebung dar2,3.
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Protocol
Alle hier enthaltenen Verfahren wurden von der Ethikkommission zur Regulierung der experimentellen Medizin an der Universität Kopenhagen überprüft und genehmigt und stimmen mit der dänischen und europäischen Gesetzgebung überein. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, haben wir weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und eine MMTV-PyMT-Maus im Alter von 11 Wochen verwendet.
HINWEIS: Die Vermeidung einer bakteriellen Kontamination des dezellularisierten ECM-Gerüsts liefert das beste Bildgebungsergebnis und ermöglicht eine langfristige Probenlagerung. Es ist daher wichtig, alle Schritte steril zu halten. Daher müssen alle Instrumente und chirurgischen Materialien, einschließlich Naht, Mikronaht, Lösungen, Schläuche, Luer-Konnektoren und Katheter, steril sein. Oberflächen, einschließlich einer Polystyrolschale, müssen mit 70% Ethanol desinfiziert werden, und die Perfusion sollte vorzugsweise unter einer Laminar-Flow-Haube erfolgen. Alle Eingriffe finden bei Raumtemperatur statt, sofern nicht anders angegeben.
1. Postmortale Mikrochirurgie
- Die Maus wird mit einer CO2-Kammer eingeschläfert .
- Legen Sie die Maus in eine 4-Liter-Kammer und beginnen Sie, sich mit 100% CO2 zu füllen, beginnend bei 0,2 l / min für 2 minuten, bis sie nach 3 Minuten einen Durchfluss von 0,8 l / min erreicht. Die Maus sollte während der ersten 2 Minuten bewusstlos werden, und dann sollte die Atmung aufhören (normalerweise etwa 5 Minuten, aber der Fluss kann bei Bedarf aufrechterhalten werden). Bestätigen Sie den Tod, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Rasieren Sie Thorax, Bauch und Rücken der Maus mit der Haarschneidemaschine und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol. Die Rasur reduziert die Anzahl der Artefakte aufgrund des Vorhandenseins von Haaren entweder auf Proben zur Bildgebung oder zur biochemischen Analyse erheblich.
- Befestigen Sie die Maus an einer Styroporschale und strecken Sie ihre Vorder- und Hinterbeine sowie kopf- und schwanz aus. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop.
- Mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster stellen Sie einen chirurgischen Zugang mit einem Hautschnitt her, der von der submandibulären Region zum Unterbauch verläuft, und seziert subkutan, um die Brustwand und das Peritoneum freizulegen.
- Schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere die Muskeln Pectoralis major und Pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand ab.
- Schneiden Sie mit einer Schere mit geradem Muster das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte ab und vervollständigen Sie dann eine Sternotomie, indem Sie das Brustbein entlang seiner langen Achse schneiden, dann beide Seiten der Brustwand anheben und festnageln, um den Kardiopulmonalkomplex freizulegen.
- Entfernen Sie mit einer rundspitzigen Mikrozange (oder Dumont-Mikrozange) den Thymus und das umgebende Fettgewebe, indem Sie sie vorsichtig von ihren Anbauteilen abziehen. Dies wird die wichtigsten Schiffe enthüllen.
- Verwenden Sie die Kauterisation, kauterisieren Sie die absteigende Cava-Vene und schneiden Sie mit einer geraden Musterschere die Speiseröhre.
- Trennen Sie mit einer scharfen Mikrozange die brachiozephalen Venen und die brachiozephalen, linken gemeinsamen Halsschlagadern und linken Subclaviaarterien vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern.
- Mit einem Mikronadelhalter, einer scharfen Mikrozange und einer 9-0-Naht werden Die Stiche über die Entstehung der brachiozephalen, linken gemeinsamen Halsschlagader und der linken Arteria subclavia gelegt.
- Kauterisieren Sie die brachiozephalen Venen.
- Trennen Sie die submandibulären Speicheldrüsen entlang der Mittellinie, um die Nackenmuskulatur und die Luftröhre freizulegen. Trennen Sie die Muskeln, um das Cricothyroid-Band freizulegen. Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band schneiden.
- Führen Sie einen 27 G-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie vorsichtig, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt (d. H. Bis der Widerstand gegen den Katheter erreicht ist, und ziehen Sie sich dann 3 mm zurück). Achten Sie darauf, die Bronchien nicht zu stören. Legen Sie mit einer 6-0-Naht 3 Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.
- Schneiden Sie die Maus auf der Höhe des 12. Brustwirbels. Die absteigende Aorta verläuft anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule geschnitten werden. Setzen Sie die untere Hälfte auseinander.
- Katheterisieren Sie die Aorta retrograd und drücken Sie den Katheter, bis er den Aortenbogen erreicht. Legen Sie mit einer 9-0-Naht 4 Stiche um die Aorta, beginnend 5 mm unter der Katheterspitze.
2. Dezellularisierung
- Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und Luer-Anschlüsse an ein Pumpensystem an. 15 min lang mit entionisiertem Wasser bei 200 μL/min perfundieren. Behalten Sie diese Durchflussrate während der Dezellularisation bei.
- Ändern Sie das Perfusionsmittel auf 0,5% Natriumdesoxycholat (DOC), verdünnt in entionisiertem Wasser, und perfundieren Sie es über Nacht.
- Ändern Sie das Perfusionsmittel auf 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), das in deionisiertem Wasser verdünnt ist, und perfundieren Sie es 8 Stunden lang.
- Über Nacht mit entionisiertem Wasser perfundieren, um SDS und DOC für 24 h wegzuspülen.
- Resezieren Sie das dezellularisierte Herz und die Lunge, indem Sie seine Anhaftungen am Thorax mit einer gekrümmten Schere schneiden und in einem sterilen Kryorohr mit deionisiertem Wasser mit 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin und 0,3 μM Natriumazid bei 4 °C lagern. ECM-Gerüste können mindestens 12 Wochen gelagert werden1. Wenn das Gerüst für die biochemische Analyse (z. B. Massenspektrometrie) verwendet wird, schockieren Sie in flüssigem Stickstoff.
3. Immunfärbung
- Planen Sie die Bildgebung: Bestimmen Sie den primären Antikörper (oder die Antikörper) und die Kombination von fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern, um zueinander zu passen und die Laserlinien des Fluoreszenzmikroskops anzupassen.
- Blockieren Sie die Probe, indem Sie sie über Nacht in ein Kryotube mit 6% (v /v) Eselserum - 3% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) eintauchen.
- Inkubieren Sie mit primären Antikörpern (oder Antikörpern) in 3% Eselserum in PBS für 24 h.
- Waschen Sie 5 mal für 1 h jedes Mal in 0,05% Tween 20 in PBS (PBST).
- Inkubieren Sie die Probe mit fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern (oder Antikörpern) in 3% Eselserum in PBS für 24 h.
- Waschen Sie 5 mal für 1 Stunde in 0,05% (PBST). Warten Sie 1 h zwischen den einzelnen Wäschen.
- Entionisiertes Wasser hinzufügen und bei 4 °C vor direktem Licht geschützt lagern. An diesem Punkt ist das Gerüst bereit zum Abbild.
4. Bildgebung
- Legen Sie die Probe in eine Glasbodenschale und befeuchten Sie sie mit zwei Tröpfchen Speicherlösung (PBS oder entionisiertes Wasser).
- Bereiten Sie das Ziel vor. Wir empfehlen die Verwendung eines Wasserimmersionsobjektivs.
- Untersuchen Sie die Probe mit Fluoreszenzlicht.
- Wechseln Sie zur Computersteuerung. Schalten Sie Laser ein und passen Sie Laserintensität, Lochöffnung, Wellenlängen der Detektoren, Verstärkung, Auflösung und Zoom an. Legen Sie die Anzahl und Schrittweite für z-stack fest und beginnen Sie mit der Erfassung. Wir empfehlen die Verwendung von Multiphotonen-Laseranregung, um die Gewebepenetration zu erhöhen und lichtstreuung, Bleichmittel und Gewebeschäden zu minimieren.
5. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
- Entfernen Sie 1 Lungenlappen von einer eingeschläferten Maus.
- In eine 10 mm x 10 mm x 5 mm große Kryomform geben und mit ca. 500 μL OCT-Compound bedecken.
- Auf Trockeneis (-70 °C) einfrieren und die Probe auf dieser Temperatur halten.
- Schneiden Sie einen dezellularisierten Lungenlappen aus einer verarbeiteten Maus gemäß Schritt 2.5 aus.
- In eine Kryomol mit der größten Oberfläche nach unten geben und mit OCT-Verbindung gemäß Schritt 5.2 bedecken.
- Auf Trockeneis (-70 °C) einfrieren und die Probe auf dieser Temperatur halten, bis etwas anderes erforderlich ist. Die Probe kann mindestens 12 Wochen gelagert werden.
- Schneiden Sie gefrorene Gewebeblöcke bei -20 °C in einem Kryostaten mit 5 μm Dicke und legen Sie Abschnitte auf Objektträger aus Glas und lagern Sie sie bei -80 °C.
- Bringen Sie die Folien auf Raumtemperatur, bis sie an der Luft getrocknet sind (ca. 20 min).
- Tauchen Sie kurz in PBS ein und fixieren Sie es, indem Sie die Objektträger 15 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd in PBS tauchen. Einmal in PBS für 5 min waschen, dann zweimal in destilliertem Wasser für 5 min.
- 10 Min. in Mayers Hämatoxylinlösung eintauchen. Diese Zeit kann je nach Gewebequelle und Fleckenvorbereitung optimiert werden.
- In einem Coplin-Glas unter fließendem destilliertem Wasser für 10 Min. waschen.
- 7 Min. in Eosin-Lösung eintauchen. Diese Zeit kann je nach Gewebequelle und Fleckenvorbereitung optimiert werden.
- Tauchen Sie in 50% Ethanol, um überschüssiges Eosin zu entfernen und zu dehydrieren, indem Sie kurz in 70% Ethanol und in 96% und 100% Ethanol für 30 Sekunden eintauchen. Mehrmals in Xylol tauchen.
- Tragen Sie einige Tropfen DPX-Montagemedium auf und legen Sie einen Glasdeckglas auf.
- Lassen Sie die Folien über Nacht unter einer chemischen Haube trocknen.
- Scannen Sie Dias in einem Diascanner.
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Representative Results
Kardiopulmonale Dezellularisation
Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls werden Herz und Lunge sowie das Begleitgewebe wie der Aortenbogen frei von Zellen sein. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Abbildung 1) der ECM-Gerüste validiert werden, die die Entfernung der Kerne im Vergleich zum nativen Gewebe zeigen. Diese Gerüste behalten die Abmessungen frischer Organe bei und ihre unlösliche ECM-Struktur ist intakt2. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der wichtigsten chirurgischen Schritte, die erforderlich sind, um den Herz-Lungen-Komplex der Maus erfolgreich zu perfundieren.
ECM-Bildgebung
In einer Standardeinstellung können sekundäre Antikörper in grünen, roten und fernroten Fluoreszenzkanälen verwendet werden (d.h. 488 nm, 555nm/594 nm und 647 nm Wellenlängendetektion); Die Zugabe einer Bildgebung der zweiten Harmonischengeneration (SHG) unter Verwendung der 2-Photonenanregung zeigt fibrilläres Kollagen. Die Laseranregung kann die Autofluoreszenz des Gewebes anregen, und bei der Verwendung mit grüner Fluoreszenz ist Vorsicht geboten, da sie Bilddaten verfälschen kann. Eine einfache Möglichkeit, die Autofluoreszenz zu validieren, besteht darin, ein nicht gefärbtes Kontrollgewebe abzubilden und die Laserintensität und die Detektorverstärkung entsprechend einzustellen und mit der Antikörperfärbung zu vergleichen. Diese Autofluoreszenz kann jedoch als Vorteil genutzt werden, da sie Elastin in Lungengerüsten freilegen kann.
ECM-Gerüste zeigten eine erhöhte Durchlässigkeit und Lichtdurchlässigkeit2. Die Verwendung dieses Protokolls mit einem motorisierten Mikroskoptisch ermöglicht die dreidimensionale, gekachelte Abbildung von Proben der gesamten Montierung mit Submikronauflösung (Abbildung 3). Wenn eine Schnittung des Gewebes erforderlich ist (z. B. zur Abbildung von Herzwänden oder tiefem Lungenparenchym), sollte das Gewebe vor der Färbung mit einem scharfen Skalpell geschnitten werden.
Abbildung 1. Validierung der Dezellularisierung. Hämatoxylin-Eosin-Färbung von gefrorenen Snap-Proben aus nativen und dezellularisierten Lungen und Herzen. Beachten Sie das Fehlen von Kernen in dezellularisierten Proben. Alle Skalen in Mikrometern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Mikrochirurgischer Schaltplan, der die wichtigsten Schritte zeigt, die zur Dezellularisierung des kardiopulmonalen Komplexes erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative Multiple-Protein-Immunfärbung der dezellularisierten PyMT-Mauslunge einer 11 Wochen alten weiblichen Maus. Kachelmosaik mit der maximalen Projektion eines Z-Stacks. Einschub 1 zeigt die Pleura. Inset 2 zeigt normale Parenchym-ECM. Inset 3 zeigt eine Bronchiole. Die Farben wurden für Farbenblinde zugänglich gemacht. Alle Skalen in Mikrometern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dezellularisierungstechniken, die auf Gewebebewegung basieren, verändern die ECM-Struktur, wodurch sie für die ECM-Strukturanalyse ungeeignet sind4. Die Perfusionsdezellularisation unter Verwendung eines anatomischen Weges wie der Aorta der Luftröhre ermöglicht es, das Kapillarbett oder die terminalen Alveolen zu erreichen und erleichtert die Abgabe von Dezelluliermitteln im gesamten Organ. Die Verwendung von zwitterionischen, anionischen und nichtionischen Detergenzien zur Dezellularisierung von Gewebe wird berichtet4,5,6, natriumdodecylsulfat (SDS, anionisch) linearisiert jedoch fibrilläres Kollagen im Fettpolster der Maus2, aber nicht in der Lunge; Dies deutet darauf hin, dass die Wahl des Reinigungsmittels optimiert werden muss, wobei es sich an das Zielgewebe anpasst, um die ECM-Struktur aufrechtzuerhalten. Gewebereinigungsmethoden könnten für die ECM-Analyse verwendet werden, obwohl sie Chemikalien erfordern, die die ECM-Vernetzung und die Gewebeabmessungen verändern können7,8,9. Während die Transparenz des erworbenen Gewebes eine verbesserte mikroskopische Bildgebung ermöglicht, verschlechtert die Anwesenheit von Zellen die Antikörperpenetration signifikant und kann ECM-Epitope / Proteine abdecken. Die Isolierung und Bildgebung von intaktem ECM ermöglicht die quantitative Analyse seiner Struktur mit Analysewerkzeugen2,10, kartiert seine Zusammensetzung2 und ebnet den Weg für weitere biochemische ECM-Untersuchungen.
Die Dissektion und Ligatur der wichtigsten Gefäße und die daraus resultierende Isolierung der koronaren und pulmonalen Zirkulation ist notwendig, um einen gleichmäßigen Druck der durchbluteten Lösungen im gesamten Gewebe zu erreichen. Daher ist dieses Protokoll von der mikrochirurgischen Expertise des Hauptbetreibers abhängig. Es ist wichtig, mit Präzision zu arbeiten, um Gefäße, Lungen und Herz intakt zu erhalten. Die wiederholte Ausführung dieses Protokolls, um die dreidimensionale Anatomie des Thorax zu verstehen, ist von größter Bedeutung, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
Das hier gezeigte chirurgische Verfahren fasst die grundlegenden Schritte zum Zugang zum Mausgefäßsystem1,2 und den Organen in seinem Territorium zusammen. Durch Ändern des Ligaturmusters ist es möglich, auf Kopf und Hals, die Vordergliedmaßen und Fettpolster zuzugreifen. Mit den gleichen Fähigkeiten ist es möglich, die subdiaphragmatischen Organe zu dezellularisieren.
Ebenso wichtig ist das sorgfältige Design des Immunostaining-Setups. Wir haben bereits einen Katalog validierter Antikörper gegen strukturelle ECM-Proteine zusammengestellt3. Der Standardaufbau kann bis zu drei Proteine und fibrilläres Kollagen gleichzeitig aufdecken und so einen Kreuzverhör ermöglichen.
Die Bedeutung dieser Methode liegt in der Möglichkeit, strukturell und maßhaltig intakte ECM-Gerüste zu erhalten. Die Dekonstruktion eines komplexen Gewebes in diskrete Bestandteile ist eines der grundlegenden Ziele des Bioengineering; Während es relativ einfach ist, Zellen oder Blut aus einem Organ zu isolieren, gab es keine Methoden, um sein ECM-Gerüst zu erhalten. Dies galt insbesondere für Tumore, aber die hier vorgestellte Methode öffnet den Weg für die ECM-Isolierung in jedem Mausstamm für die anatomische und biochemische Analyse des ECM.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Prof. Ivana Novak und Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Universität Kopenhagen) für den Zugang zum Mikroskop. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat unterstützt (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR und JTE); ein Promotionsstipendium der Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); der Schwedische Forschungsrat (2017-03389; CDM); die Schwedische Krebsgesellschaft, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj und 190007; CDM); Deutsche Krebshilfe(dpa) RR); und die Dänische Krebsgesellschaft (R204-A12454; RR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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