Summary
Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.
Abstract
Apresentamos aqui um protocolo de descelularização para coração e pulmões de rato. Produz andaimes estruturais de ECM que podem ser usados para analisar topologia e composição de ECM. Baseia-se em um procedimento microcirúrgico projetado para cateterizar a traqueia e a aorta de um rato eutanizado para perfundir o coração e os pulmões com agentes descelularizantes. O complexo cardiopulmonar descelularizado pode, posteriormente, ser imunossuperado para revelar a localização de proteínas estruturais de ECM. Todo o procedimento pode ser concluído em 4 dias.
Os andaimes ECM resultantes deste protocolo estão livres de distorções dimensionais. A ausência de células permite o exame estrutural das estruturas de ECM até a resolução de submicron em 3D. Este protocolo pode ser aplicado a tecidos saudáveis e doentes de camundongos com até 4 semanas de idade, incluindo modelos de camundongos de fibrose e câncer, abrindo caminho para determinar a remodelação do ECM associada à doença cardiopulmonar.
Introduction
O ECM é uma rede tridimensional feita de proteínas e glicanos que acomoda todas as células em um organismo multicelular, dando aos órgãos sua forma e regulando o comportamento celular ao longo da vida1. A partir da fertilização dos óvulos em diante, as células constroem e remodelam o ECM, e por sua vez são estritamente controladas por ele. O objetivo deste protocolo é abrir uma maneira de analisar e mapear o ECM do rato, já que os camundongos são o organismo modelo mais utilizado na fisiopatologia mamífera.
O desenvolvimento deste método foi impulsionado pela necessidade de caracterizar e isolar o ECM2 nativo associado à metástase. Como os tumores não possuem vascularização anatômica adequada e os camundongos são organismos relativamente pequenos, procedimentos microcirúrgicos foram projetados para cateterizar retrogrademente a aorta, isolando a circulação do vaso principal que leva a um tumor (por exemplo, as veias pulmonares), focando assim o fluxo de reagentes e permitindo a descelularização tumoral. Este método produz andaimes ECM com uma estrutura conservada2 que podem ser imunossuídas e imagens, permitindo o mapeamento da estrutura ECM em detalhes de submicron. Para realizar esse protocolo, é necessário adquirir habilidades cirúrgicas e microcirúrgicas (dissecção, microsutura e cateterismo) que possam representar uma potencial limitação ao seu uso. Para nosso conhecimento, este método representa o estado da arte para análise de imagem de estrutura ecm nativa2,3.
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Protocol
Todos os procedimentos aqui incluídos foram revisados e aprovados pelo comitê de ética que regula a medicina experimental na Universidade de Copenhague e concordam com a legislação dinamarquesa e europeia. Para demonstrar este protocolo, usamos camundongos BALB/cJ fêmeas de 8-12 semanas de idade e um rato fêmea MMTV-PyMT de 11 semanas de idade.
NOTA: Evitar a contaminação bacteriana do andaime ECM descelularizado dá o melhor resultado de imagem e permite o armazenamento de amostras a longo prazo. Por isso, é importante manter todos os passos estéreis. Assim, todos os instrumentos e materiais cirúrgicos, incluindo sutura, microssutura, soluções, tubos, conectores Luer e cateteres, devem ser estéreis. As superfícies, incluindo uma bandeja de poliestireno, devem ser desinfetadas com 70% de etanol, e a perfusão deve ser realizada preferencialmente sob uma coifa de fluxo laminar. Todos os procedimentos ocorrem à temperatura ambiente, a menos que seja indicado de outra forma.
1. Microcirurgia pós-morte
- Eutanize o rato usando uma câmara de CO2 .
- Coloque o mouse em uma câmara de 4 L, e comece a encher com 100% de CO2, começando em 0,2 L/min por 2 min, aumentando até atingir um fluxo de 0,8 L/min após 3 min. O rato deve cair inconsciente durante os primeiros 2 minutos, e então a respiração deve cessar (geralmente em torno de 5 minutos, mas o fluxo pode ser mantido conforme necessário). Confirme a morte antes de prosseguir para o próximo passo.
- Raspe o tórax, o abdômen e a parte de trás do rato com o cortador de cabelo e desinfete com 70% de etanol. A depilação reduz consideravelmente o número de artefatos devido à presença de cabelos em amostras para análise de imagem ou bioquímica.
- Fixe o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus dentes e traseiros, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia.
- O uso de uma tesoura de padrão reto mayo estabelece o acesso cirúrgico com uma incisão cutânea que vai da região submandibular até o abdômen inferior e disseco subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio.
- Usando tesoura microcirúrgica, corte os músculos peitoralis maiores e peitoral ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica.
- Usando uma tesoura de padrão reto, corte o esterno ao longo das incisões anteriores e, em seguida, complete uma esterno cortando o esterno ao longo de seu eixo longo, em seguida, eleve e fixe ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
- Usando micro-fórceps de ponta redonda (ou micro-fórceps Dumont), extirpo o timo e o tecido adiposo circundante, retirando-os delicadamente de seus acessórios. Isso revelará as principais naves.
- Usando o cautery, cauterize a veia cava descendente e, usando uma tesoura de padrão reto, corte o esôfago.
- Usando micro-fórceps afiados, separe as veias braquiocefálicas e as braquiocefálicas, deixaram as artérias subcláusicas comuns e esquerda do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização.
- Utilizando suporte de micropeça, micro-fórceps afiados e pontos de sutura 9-0 acima do surgimento do braquiocefálico, deixado carótida comum e artérias subclávias esquerdas.
- Cauterize as veias braquiocefálicas.
- Separe as glândulas salivares submandibulares ao longo da linha média para expor os músculos do pescoço e a traqueia. Separe os músculos para expor o ligamento cricothiroide. Usando micro-tesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento.
- Introduza um cateter de 27 G na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se esque no brônquio (ou seja, até que a resistência ao cateter seja atendida, depois retire 3 mm). Tenha cuidado para não interromper os brônquios. Usando uma sutura 6-0, coloque 3 pontos ao redor da traqueia para fixar o cateter.
- Seção o rato na altura da 12ª vértebra torácica. A aorta descendente corre anteriormente até a coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna. Desmonte a metade inferior.
- Cateterize retrógradamente a aorta e empurre o cateterismo até atingir o arco aórtico. Com sutura 9-0, coloque 4 pontos ao redor da aorta, começando 5 mm abaixo da ponta do cateter.
2. Descelularização
- Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores Luer. Perfuuse com água deionizada a 200 μL/min por 15 min. Mantenha essa taxa de fluxo durante a descelularização.
- Mude o agente de perfusão para 0,5% de desoxicolato de sódio (DOC) diluído em água deionizada e perfuuse durante a noite.
- Mude o agente de perfusão para sulfato de dodecyl de sódio de 0,1% de sódio (SDS) diluído em água desionizada e perfuuse por 8 horas.
- Perfume com água desionizada durante a noite para lavar SDS e DOC por 24 horas.
- Ressecize o coração e os pulmões descelularizados, seccionando seus acessórios ao tórax usando uma tesoura curvada e armazenar em um tubo criogênico estéril com água desionizada com penicilina-estreptomicina de 1% (v/v) e 0,3 μM de azida de sódio a 4 °C. Os andaimes ECM podem ser armazenados por pelo menos por pelo menos 12 semanas1. Se o andaime for usado para análise bioquímica (por exemplo, espectrometria de massa), estote o congelamento em nitrogênio líquido.
3. Imunostaining
- Planeje a imagem: determinar anticorpos primários (ou anticorpos) e a combinação de anticorpos secundários fluorescentes conjugados para combinar uns com os outros e para se encaixar nas linhas laser do microscópio de fluorescência.
- Bloqueie a amostra imergindo-a em um criobotube contendo 6% (v/v) soro de burro - 3% (w/v) albumina de soro bovino (BSA) durante a noite.
- Incubar com anticorpos primários (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.
- Lave 5 vezes por 1h cada vez em 0,05% entre 20 em PBS (PBST).
- Incubar a amostra com anticorpo secundário fluorescente conjugado (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.
- Lave 5 vezes por 1 hora em 0,05% (PBST). Aguarde 1h entre cada lavagem.
- Adicione água deionizada e armazene a 4 °C de distância da luz direta. Neste ponto, o andaime está pronto para a imagem.
4. Imagem
- Coloque a amostra em um prato com fundo de vidro e umidize-a com duas gotículas de solução de armazenamento (PBS ou água deionizada).
- Prepare o objetivo. Recomendamos o uso de um objetivo de imersão em água.
- Inspecione a amostra usando luz de fluorescência.
- Mude para controle de computador. Ligue lasers e ajuste a intensidade do laser, abertura do pinhole, detectores de comprimentos de onda, ganho, resolução e zoom. Defina o número e o tamanho do passo para z-stack e comece a aquisição. Recomendamos o uso de excitação a laser multifotônio para aumentar a penetração tecidual e minimizar a dispersão de luz, branqueamento e danos teciduais.
5. Mancha de hematoxilina-eosina
- Exciso 1 lobo pulmonar de um rato eutanizado.
- Coloque em um criomold de 10 mm x 10 mm x 5 mm e cubra-o com aproximadamente 500 μL de composto OCT.
- Congele em gelo seco (-70 °C) e mantenha a amostra a essa temperatura.
- Exciso um lobo pulmonar descelularizado de um rato processado de acordo com a etapa 2.5.
- Coloque em um criomold com a maior área de superfície para baixo e cubra-a com composto OCT conforme especificado na etapa 5.2.
- Congele em gelo seco (-70°C) e mantenha a amostra a essa temperatura até que seja necessário. A amostra pode ser armazenada por pelo menos 12 semanas.
- Seção blocos de tecido congelado a -20 °C em um criostat com 5 μm de espessura e coloque seções em lâminas de vidro adesivos e armazene a -80 °C.
- Leve os slides à temperatura ambiente até que o ar seque (aproximadamente 20 min).
- Logo mergulhe no PBS e fixe imergindo os slides em 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos. Lave uma vez na PBS por 5 minutos, depois duas em água destilada por 5 minutos.
- Mergulhe na solução de hematoxilina de Mayer por 10 minutos. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.
- Lave em um frasco de Coplin sob água destilada por 10 minutos.
- Mergulhe na solução de eosin por 7 min. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.
- Queda de 50% de etanol para remover o excesso de Eosin e desidratar em pouco tempo em 70% de etanol, e em 96% e 100% etanol por 30 segundos. Mergulhe em xileno várias vezes.
- Aplique algumas gotas de meio de montagem DPX e coloque uma mancha de tampa de vidro.
- Deixe os slides secar durante a noite sob um capô químico.
- Digitalize slides em um scanner de slides.
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Representative Results
Descelularização cardiopulmonar
Após a conclusão do protocolo com sucesso, o coração e os pulmões, bem como o tecido anexo, como o arco aórtico, estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de hematoxilina-eosina (Figura 1) dos andaimes ECM mostrando a remoção dos núcleos comparando com o tecido nativo. Estes andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insolúvel está intacta2. A Figura 2 mostra uma representação esquemática das principais etapas cirúrgicas necessárias para perfundir com sucesso o complexo cardio-pulmonar do camundongo.
Imagem ECM
Em um ajuste padrão, anticorpos secundários podem ser usados em canais de fluorescência verde, vermelho e vermelho (ou seja, 488 nm, 555nm/594 nm e detecção de comprimento de onda de 647 nm); a adição de imagens de segunda geração harmônica (SHG) usando excitação de 2 fótons revelará colágeno fibrilar. A excitação a laser pode incitar a autofluorescência tecidual e a cautela deve ser aplicada ao usá-lo com fluorescência verde, pois pode confundir dados de imagem. Uma maneira simples de validar a auto-fluorescência é imaginar um tecido de controle não manchado e definir a intensidade do laser e o ganho do detector de acordo e compará-lo com a coloração do anticorpo. No entanto, essa autofluorescência pode ser usada como uma vantagem, pois pode expor a elastina nos andaimes pulmonares.
Os andaimes ECM apresentaram aumento da permeabilidade e penetrabilidade da luz2. O uso deste protocolo com um estágio de microscópio motorizado permite que amostras tridimensionais de azulejos de montagem total) a resolução de submicron (Figura 3). Caso a seção do tecido seja necessária (por exemplo, para imagem de paredes cardíacas ou parenchyma pulmonar profundo) o tecido deve ser seccionado com um bisturi afiado antes da coloração ser realizada.
Figura 1. Validando a descelularização. Hematoxylin-Eosin coloração de amostras congeladas de snap de pulmões nativos e descelularizados e coração. Observe a ausência de núcleos em amostras descelularizadas. Todas as escamas em mícrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Esquema de microcirurgia mostrando os principais passos necessários para descelularizar o complexo cardio-pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imunostenção de proteína múltipla representativa de pulmões de camundongos PyMT descelularizados de um rato fêmea de 11 semanas de idade. Mosaico de azulejo mostrando a projeção máxima de uma pilha de z. Inset 1 mostra a pleura. O inset 2 mostra ecm parenchyma normal. Inset 3 mostra um brônquio. As cores foram acessíveis para cegos de cor. Todas as escamas em mícrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Técnicas de descelularização baseadas na agitação tecidual alteram a estrutura do ECM, tornando-as inadequadas para análise da estrutura do ECM4. A descelularização da perfusão, utilizando uma rota anatômica como a aorta da traqueia, permite chegar ao leito capilar, ou alvéolo terminal, e facilita a entrega de agentes descelularizantes em todo o órgão. O uso de detergentes zwitterionic, aniônicos e não iônicos para descelularizar tecidos é relatado4,5,6, no entanto, sulfato de dodecílio de sódio (SDS, aniônico) lineariza colágeno fibrilar no bloco de gordura do rato2, mas não nos pulmões; isso sugere que a escolha do detergente deve ser otimizada, adaptando-se ao tecido alvo para manter a estrutura do ECM. Métodos de limpeza tecidual poderiam ser usados para análise de ECM, embora exijam produtos químicos que podem alterar a ligação cruzada do ECM e as dimensões teciduais7,8,9. Embora a transparência do tecido adquirido permita uma imagem microscópica aprimorada, a presença de células piora significativamente a penetração de anticorpos e pode cobrir epítopos/proteínas ECM. Isolar e imagem intacta O ECM permite a análise quantitativa de sua estrutura com ferramentas analíticas2,10, mapeando sua composição2 e abre caminho para um novo exame bioquímico ECM.
A dissecção e ligadura dos principais vasos e o consequente isolamento da circulação coronariana e pulmonar é necessário para alcançar a pressão uniforme de soluções perfumadas em todos os tecidos. Portanto, esse protocolo depende da expertise microcirúrgica do operador principal. É fundamental operar com precisão, de modo a preservar vasos, pulmões e coração intactos. Executar este protocolo repetidamente para entender a anatomia tridimensional do tórax é primordial para obter resultados consistentes.
O procedimento cirúrgico aqui mostrado soma as etapas básicas para acessar a vasculatura do camundongo1,2 e os órgãos em seu território. Ao alterar o padrão de ligadura, é possível acessar a cabeça e o pescoço, os membros da frente e as almofadas de gordura. Usando as mesmas habilidades, é possível descelularizar os órgãos sub-diafragmáticos.
Igualmente importante é o design cuidadoso da configuração imunostaining. Já compilamos anteriormente um catálogo de anticorpos validados contra proteínas estruturais ECM3. A configuração padrão pode revelar até três proteínas e colágeno fibrilar simultaneamente, permitindo o interrogatório.
O significado deste método reside na possibilidade de obter andaimes ECM estrutural e dimensionalmente intactos. A desconstrução de um tecido complexo em componentes discretos é um dos objetivos fundamentais da bioengenharia; embora seja relativamente simples isolar células, ou sangue, de um órgão, não havia métodos para obter seus andaimes ECM. Isso foi especialmente verdadeiro para tumores, mas o método aqui apresentado abre caminho para o isolamento do ECM em qualquer cepa de camundongos para análise anatômica e bioquímica do ECM.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos à Profª Ivana Novak e à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); bolsa de doutorado da Fundação Lundbeck (R286-2018-621; MR); o Conselho Sueco de Pesquisa (2017-03389; MDL); a Sociedade Sueca de Câncer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; MDL); Ajuda ao câncer alemão (Deutsche Krebshilfe; RR); e a Sociedade Dinamarquesa de Câncer (R204-A12454; RR).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MICROSURGERY | |||
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
IMMUNOSTAINING | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
IMAGING | |||
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
White-light laser (WLL) | Leica | ||
DECELLULARIZATION | |||
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
H&E STAINING | |||
4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
Cryostat | Leica | CM3050S | |
DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
OCT compound | VWR | 361603E | |
Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).