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Cancer Research

Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/61854

Summary

Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.

Abstract

Apresentamos aqui um protocolo de descelularização para coração e pulmões de rato. Produz andaimes estruturais de ECM que podem ser usados para analisar topologia e composição de ECM. Baseia-se em um procedimento microcirúrgico projetado para cateterizar a traqueia e a aorta de um rato eutanizado para perfundir o coração e os pulmões com agentes descelularizantes. O complexo cardiopulmonar descelularizado pode, posteriormente, ser imunossuperado para revelar a localização de proteínas estruturais de ECM. Todo o procedimento pode ser concluído em 4 dias.

Os andaimes ECM resultantes deste protocolo estão livres de distorções dimensionais. A ausência de células permite o exame estrutural das estruturas de ECM até a resolução de submicron em 3D. Este protocolo pode ser aplicado a tecidos saudáveis e doentes de camundongos com até 4 semanas de idade, incluindo modelos de camundongos de fibrose e câncer, abrindo caminho para determinar a remodelação do ECM associada à doença cardiopulmonar.

Introduction

O ECM é uma rede tridimensional feita de proteínas e glicanos que acomoda todas as células em um organismo multicelular, dando aos órgãos sua forma e regulando o comportamento celular ao longo da vida1. A partir da fertilização dos óvulos em diante, as células constroem e remodelam o ECM, e por sua vez são estritamente controladas por ele. O objetivo deste protocolo é abrir uma maneira de analisar e mapear o ECM do rato, já que os camundongos são o organismo modelo mais utilizado na fisiopatologia mamífera.

O desenvolvimento deste método foi impulsionado pela necessidade de caracterizar e isolar o ECM2 nativo associado à metástase. Como os tumores não possuem vascularização anatômica adequada e os camundongos são organismos relativamente pequenos, procedimentos microcirúrgicos foram projetados para cateterizar retrogrademente a aorta, isolando a circulação do vaso principal que leva a um tumor (por exemplo, as veias pulmonares), focando assim o fluxo de reagentes e permitindo a descelularização tumoral. Este método produz andaimes ECM com uma estrutura conservada2 que podem ser imunossuídas e imagens, permitindo o mapeamento da estrutura ECM em detalhes de submicron. Para realizar esse protocolo, é necessário adquirir habilidades cirúrgicas e microcirúrgicas (dissecção, microsutura e cateterismo) que possam representar uma potencial limitação ao seu uso. Para nosso conhecimento, este método representa o estado da arte para análise de imagem de estrutura ecm nativa2,3.

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Protocol

Todos os procedimentos aqui incluídos foram revisados e aprovados pelo comitê de ética que regula a medicina experimental na Universidade de Copenhague e concordam com a legislação dinamarquesa e europeia. Para demonstrar este protocolo, usamos camundongos BALB/cJ fêmeas de 8-12 semanas de idade e um rato fêmea MMTV-PyMT de 11 semanas de idade.

NOTA: Evitar a contaminação bacteriana do andaime ECM descelularizado dá o melhor resultado de imagem e permite o armazenamento de amostras a longo prazo. Por isso, é importante manter todos os passos estéreis. Assim, todos os instrumentos e materiais cirúrgicos, incluindo sutura, microssutura, soluções, tubos, conectores Luer e cateteres, devem ser estéreis. As superfícies, incluindo uma bandeja de poliestireno, devem ser desinfetadas com 70% de etanol, e a perfusão deve ser realizada preferencialmente sob uma coifa de fluxo laminar. Todos os procedimentos ocorrem à temperatura ambiente, a menos que seja indicado de outra forma.

1. Microcirurgia pós-morte

  1. Eutanize o rato usando uma câmara de CO2 .
    1. Coloque o mouse em uma câmara de 4 L, e comece a encher com 100% de CO2, começando em 0,2 L/min por 2 min, aumentando até atingir um fluxo de 0,8 L/min após 3 min. O rato deve cair inconsciente durante os primeiros 2 minutos, e então a respiração deve cessar (geralmente em torno de 5 minutos, mas o fluxo pode ser mantido conforme necessário). Confirme a morte antes de prosseguir para o próximo passo.
  2. Raspe o tórax, o abdômen e a parte de trás do rato com o cortador de cabelo e desinfete com 70% de etanol. A depilação reduz consideravelmente o número de artefatos devido à presença de cabelos em amostras para análise de imagem ou bioquímica.
  3. Fixe o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus dentes e traseiros, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia.
  4. O uso de uma tesoura de padrão reto mayo estabelece o acesso cirúrgico com uma incisão cutânea que vai da região submandibular até o abdômen inferior e disseco subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio.
  5. Usando tesoura microcirúrgica, corte os músculos peitoralis maiores e peitoral ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica.
  6. Usando uma tesoura de padrão reto, corte o esterno ao longo das incisões anteriores e, em seguida, complete uma esterno cortando o esterno ao longo de seu eixo longo, em seguida, eleve e fixe ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
  7. Usando micro-fórceps de ponta redonda (ou micro-fórceps Dumont), extirpo o timo e o tecido adiposo circundante, retirando-os delicadamente de seus acessórios. Isso revelará as principais naves.
  8. Usando o cautery, cauterize a veia cava descendente e, usando uma tesoura de padrão reto, corte o esôfago.
  9. Usando micro-fórceps afiados, separe as veias braquiocefálicas e as braquiocefálicas, deixaram as artérias subcláusicas comuns e esquerda do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização.
  10. Utilizando suporte de micropeça, micro-fórceps afiados e pontos de sutura 9-0 acima do surgimento do braquiocefálico, deixado carótida comum e artérias subclávias esquerdas.
  11. Cauterize as veias braquiocefálicas.
  12. Separe as glândulas salivares submandibulares ao longo da linha média para expor os músculos do pescoço e a traqueia. Separe os músculos para expor o ligamento cricothiroide. Usando micro-tesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento.
  13. Introduza um cateter de 27 G na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se esque no brônquio (ou seja, até que a resistência ao cateter seja atendida, depois retire 3 mm). Tenha cuidado para não interromper os brônquios. Usando uma sutura 6-0, coloque 3 pontos ao redor da traqueia para fixar o cateter.
  14. Seção o rato na altura da 12ª vértebra torácica. A aorta descendente corre anteriormente até a coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna. Desmonte a metade inferior.
  15. Cateterize retrógradamente a aorta e empurre o cateterismo até atingir o arco aórtico. Com sutura 9-0, coloque 4 pontos ao redor da aorta, começando 5 mm abaixo da ponta do cateter.

2. Descelularização

  1. Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores Luer. Perfuuse com água deionizada a 200 μL/min por 15 min. Mantenha essa taxa de fluxo durante a descelularização.
  2. Mude o agente de perfusão para 0,5% de desoxicolato de sódio (DOC) diluído em água deionizada e perfuuse durante a noite.
  3. Mude o agente de perfusão para sulfato de dodecyl de sódio de 0,1% de sódio (SDS) diluído em água desionizada e perfuuse por 8 horas.
  4. Perfume com água desionizada durante a noite para lavar SDS e DOC por 24 horas.
  5. Ressecize o coração e os pulmões descelularizados, seccionando seus acessórios ao tórax usando uma tesoura curvada e armazenar em um tubo criogênico estéril com água desionizada com penicilina-estreptomicina de 1% (v/v) e 0,3 μM de azida de sódio a 4 °C. Os andaimes ECM podem ser armazenados por pelo menos por pelo menos 12 semanas1. Se o andaime for usado para análise bioquímica (por exemplo, espectrometria de massa), estote o congelamento em nitrogênio líquido.

3. Imunostaining

  1. Planeje a imagem: determinar anticorpos primários (ou anticorpos) e a combinação de anticorpos secundários fluorescentes conjugados para combinar uns com os outros e para se encaixar nas linhas laser do microscópio de fluorescência.
  2. Bloqueie a amostra imergindo-a em um criobotube contendo 6% (v/v) soro de burro - 3% (w/v) albumina de soro bovino (BSA) durante a noite.
  3. Incubar com anticorpos primários (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.
  4. Lave 5 vezes por 1h cada vez em 0,05% entre 20 em PBS (PBST).
  5. Incubar a amostra com anticorpo secundário fluorescente conjugado (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.
  6. Lave 5 vezes por 1 hora em 0,05% (PBST). Aguarde 1h entre cada lavagem.
  7. Adicione água deionizada e armazene a 4 °C de distância da luz direta. Neste ponto, o andaime está pronto para a imagem.

4. Imagem

  1. Coloque a amostra em um prato com fundo de vidro e umidize-a com duas gotículas de solução de armazenamento (PBS ou água deionizada).
  2. Prepare o objetivo. Recomendamos o uso de um objetivo de imersão em água.
  3. Inspecione a amostra usando luz de fluorescência.
  4. Mude para controle de computador. Ligue lasers e ajuste a intensidade do laser, abertura do pinhole, detectores de comprimentos de onda, ganho, resolução e zoom. Defina o número e o tamanho do passo para z-stack e comece a aquisição. Recomendamos o uso de excitação a laser multifotônio para aumentar a penetração tecidual e minimizar a dispersão de luz, branqueamento e danos teciduais.

5. Mancha de hematoxilina-eosina

  1. Exciso 1 lobo pulmonar de um rato eutanizado.
  2. Coloque em um criomold de 10 mm x 10 mm x 5 mm e cubra-o com aproximadamente 500 μL de composto OCT.
  3. Congele em gelo seco (-70 °C) e mantenha a amostra a essa temperatura.
  4. Exciso um lobo pulmonar descelularizado de um rato processado de acordo com a etapa 2.5.
  5. Coloque em um criomold com a maior área de superfície para baixo e cubra-a com composto OCT conforme especificado na etapa 5.2.
  6. Congele em gelo seco (-70°C) e mantenha a amostra a essa temperatura até que seja necessário. A amostra pode ser armazenada por pelo menos 12 semanas.
  7. Seção blocos de tecido congelado a -20 °C em um criostat com 5 μm de espessura e coloque seções em lâminas de vidro adesivos e armazene a -80 °C.
  8. Leve os slides à temperatura ambiente até que o ar seque (aproximadamente 20 min).
  9. Logo mergulhe no PBS e fixe imergindo os slides em 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos. Lave uma vez na PBS por 5 minutos, depois duas em água destilada por 5 minutos.
  10. Mergulhe na solução de hematoxilina de Mayer por 10 minutos. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.
  11. Lave em um frasco de Coplin sob água destilada por 10 minutos.
  12. Mergulhe na solução de eosin por 7 min. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.
  13. Queda de 50% de etanol para remover o excesso de Eosin e desidratar em pouco tempo em 70% de etanol, e em 96% e 100% etanol por 30 segundos. Mergulhe em xileno várias vezes.
  14. Aplique algumas gotas de meio de montagem DPX e coloque uma mancha de tampa de vidro.
  15. Deixe os slides secar durante a noite sob um capô químico.
  16. Digitalize slides em um scanner de slides.

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Representative Results

Descelularização cardiopulmonar
Após a conclusão do protocolo com sucesso, o coração e os pulmões, bem como o tecido anexo, como o arco aórtico, estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de hematoxilina-eosina (Figura 1) dos andaimes ECM mostrando a remoção dos núcleos comparando com o tecido nativo. Estes andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insolúvel está intacta2. A Figura 2 mostra uma representação esquemática das principais etapas cirúrgicas necessárias para perfundir com sucesso o complexo cardio-pulmonar do camundongo.

Imagem ECM
Em um ajuste padrão, anticorpos secundários podem ser usados em canais de fluorescência verde, vermelho e vermelho (ou seja, 488 nm, 555nm/594 nm e detecção de comprimento de onda de 647 nm); a adição de imagens de segunda geração harmônica (SHG) usando excitação de 2 fótons revelará colágeno fibrilar. A excitação a laser pode incitar a autofluorescência tecidual e a cautela deve ser aplicada ao usá-lo com fluorescência verde, pois pode confundir dados de imagem. Uma maneira simples de validar a auto-fluorescência é imaginar um tecido de controle não manchado e definir a intensidade do laser e o ganho do detector de acordo e compará-lo com a coloração do anticorpo. No entanto, essa autofluorescência pode ser usada como uma vantagem, pois pode expor a elastina nos andaimes pulmonares.

Os andaimes ECM apresentaram aumento da permeabilidade e penetrabilidade da luz2. O uso deste protocolo com um estágio de microscópio motorizado permite que amostras tridimensionais de azulejos de montagem total) a resolução de submicron (Figura 3). Caso a seção do tecido seja necessária (por exemplo, para imagem de paredes cardíacas ou parenchyma pulmonar profundo) o tecido deve ser seccionado com um bisturi afiado antes da coloração ser realizada.

Figure 1
Figura 1. Validando a descelularização. Hematoxylin-Eosin coloração de amostras congeladas de snap de pulmões nativos e descelularizados e coração. Observe a ausência de núcleos em amostras descelularizadas. Todas as escamas em mícrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Esquema de microcirurgia mostrando os principais passos necessários para descelularizar o complexo cardio-pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Imunostenção de proteína múltipla representativa de pulmões de camundongos PyMT descelularizados de um rato fêmea de 11 semanas de idade. Mosaico de azulejo mostrando a projeção máxima de uma pilha de z. Inset 1 mostra a pleura. O inset 2 mostra ecm parenchyma normal. Inset 3 mostra um brônquio. As cores foram acessíveis para cegos de cor. Todas as escamas em mícrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Técnicas de descelularização baseadas na agitação tecidual alteram a estrutura do ECM, tornando-as inadequadas para análise da estrutura do ECM4. A descelularização da perfusão, utilizando uma rota anatômica como a aorta da traqueia, permite chegar ao leito capilar, ou alvéolo terminal, e facilita a entrega de agentes descelularizantes em todo o órgão. O uso de detergentes zwitterionic, aniônicos e não iônicos para descelularizar tecidos é relatado4,5,6, no entanto, sulfato de dodecílio de sódio (SDS, aniônico) lineariza colágeno fibrilar no bloco de gordura do rato2, mas não nos pulmões; isso sugere que a escolha do detergente deve ser otimizada, adaptando-se ao tecido alvo para manter a estrutura do ECM. Métodos de limpeza tecidual poderiam ser usados para análise de ECM, embora exijam produtos químicos que podem alterar a ligação cruzada do ECM e as dimensões teciduais7,8,9. Embora a transparência do tecido adquirido permita uma imagem microscópica aprimorada, a presença de células piora significativamente a penetração de anticorpos e pode cobrir epítopos/proteínas ECM. Isolar e imagem intacta O ECM permite a análise quantitativa de sua estrutura com ferramentas analíticas2,10, mapeando sua composição2 e abre caminho para um novo exame bioquímico ECM.

A dissecção e ligadura dos principais vasos e o consequente isolamento da circulação coronariana e pulmonar é necessário para alcançar a pressão uniforme de soluções perfumadas em todos os tecidos. Portanto, esse protocolo depende da expertise microcirúrgica do operador principal. É fundamental operar com precisão, de modo a preservar vasos, pulmões e coração intactos. Executar este protocolo repetidamente para entender a anatomia tridimensional do tórax é primordial para obter resultados consistentes.

O procedimento cirúrgico aqui mostrado soma as etapas básicas para acessar a vasculatura do camundongo1,2 e os órgãos em seu território. Ao alterar o padrão de ligadura, é possível acessar a cabeça e o pescoço, os membros da frente e as almofadas de gordura. Usando as mesmas habilidades, é possível descelularizar os órgãos sub-diafragmáticos.

Igualmente importante é o design cuidadoso da configuração imunostaining. Já compilamos anteriormente um catálogo de anticorpos validados contra proteínas estruturais ECM3. A configuração padrão pode revelar até três proteínas e colágeno fibrilar simultaneamente, permitindo o interrogatório.

O significado deste método reside na possibilidade de obter andaimes ECM estrutural e dimensionalmente intactos. A desconstrução de um tecido complexo em componentes discretos é um dos objetivos fundamentais da bioengenharia; embora seja relativamente simples isolar células, ou sangue, de um órgão, não havia métodos para obter seus andaimes ECM. Isso foi especialmente verdadeiro para tumores, mas o método aqui apresentado abre caminho para o isolamento do ECM em qualquer cepa de camundongos para análise anatômica e bioquímica do ECM.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos à Profª Ivana Novak e à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); bolsa de doutorado da Fundação Lundbeck (R286-2018-621; MR); o Conselho Sueco de Pesquisa (2017-03389; MDL); a Sociedade Sueca de Câncer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; MDL); Ajuda ao câncer alemão (Deutsche Krebshilfe; RR); e a Sociedade Dinamarquesa de Câncer (R204-A12454; RR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) Ethicon 6301124
9-0 micro-suture (Safil) B Braun G1048611
Adson forceps Fine Science Tools 11006-12
Adson forceps with teeth Fine Science Tools 11027-12
Castroviejo microneedle holder Fine Science Tools no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) Leica S6 D
Double-ended microspatula Fine Science Tools 10091-12
Dumont microforceps (two) Fine Science Tools 11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two) Fine Science Tools 11251-35
Hair clippers Oster 76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) Fine Science Tools 12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) BD 381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) Surflo-W SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight) Fine Science Tools 14110-15
Microforceps with ringed tips (two) Aesculap FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved) Fine Science Tools 15001-08
Minicutter KLS Martin 80-008-03-04
Molt Periostotome Aesculap D0543R
Needles (27 gauge; Microlance) BD 21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin 
Serrated scissors (CeramaCut, straight) Fine Science Tools 14958-09
Spatula (Freer-Yasargil) Aesculap OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak) BD 3021001
Syringes (10 mL; Plastipak) BD 3021110
Tendon scissors (Walton) Fine Science Tools 14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG Thermo Fisher Scientific A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)  Serva 11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)  Millipore AB756P Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044 Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) VWR 233-5364)
Serum (normal donkey serum)  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
IMAGING
 Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )  Leica
 Fluorescence light source  Leica EL6000
 Microscope (inverted multiphoton microscope)  Leica SP5-X MP
 Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)  Leica HCX PL APO
 Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) 
 White-light laser (WLL)  Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water  Plum 1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)  Merck ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) World Precision Instruments 13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)  Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Peristaltic pump (with 12 channels) Ole Dich 110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) Ole Dich 31399
Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate Sigma-Aldrich L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA Fisher Scientific 15434389
96% Ethanol Plum 201446-5L
Absolute ethanol Plum 201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) Hounisen 422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) Tissue-Tek 4566
Cryostat Leica CM3050S
DPX mounting medium Hounisen 1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5% Sigma 1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) Pfm medical 207500003

Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)
Thermofisher 6319483
Mayers hematoxylin Sigma MHS32-1L
OCT compound VWR 361603E
Slide scanner (Nanozoomer) Hamamatsu Photonics
Xylene Sigma 534056-4L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
  2. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
  3. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
  4. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  6. Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  8. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).

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Pesquisa do Câncer Edição 171 Descelularização Pulmões Coração Matriz Extracelular
Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine
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Mayorca-Guiliani, A. E., Rafaeva, M., Willacy, O., Madsen, C. D., Reuten, R., Erler, J. T. Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex. J. Vis. Exp. (171), e61854, doi:10.3791/61854 (2021).

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