Decellularisering av Murine Cardiopulmonary Complex

Summary

Detta protokoll syftar till att decellularisera hjärtat och lungorna hos möss. De resulterande extracellulära matrisen (ECM) byggnadsställningar kan immunostained och avbildas för att kartlägga platsen och topologin för deras komponenter.

Abstract

Vi presenterar här ett decellulariseringsprotokoll för mushjärta och lungor. Den producerar strukturella ECM-byggnadsställningar som kan användas för att analysera ECM-topologi och komposition. Det är baserat på ett mikrokirurgiskt förfarande som är utformat för att kateterisera luftstrupen och aortan hos en avlivad mus för att perfusera hjärtat och lungorna med decellulariserande medel. Decellularized cardiopulmonary komplexet kan därefter immunostained att avslöja platsen för strukturella ECM proteiner. Hela proceduren kan slutföras på 4 dagar.

ECM-byggnadsställningarna som härrör från detta protokoll är fria från dimensionella snedvridningar. Frånvaron av celler möjliggör strukturell undersökning av ECM strukturer ner till submicron upplösning i 3D. Detta protokoll kan tillämpas på frisk och sjuk vävnad från möss så unga som 4 veckor gamla, inklusive musmodeller av fibros och cancer, vilket öppnar vägen för att bestämma ECM-ombyggnad i samband med kardiopulmonell sjukdom.

Introduction

ECM är ett tredimensionellt nätverk av proteiner och glykaner som rymmer alla celler i en multicellulär organism, vilket ger organ deras form och reglerar cellbeteende under hela ^livet1. Från äggbefruktning och framåt bygger och bygger celler ecm, och kontrolleras i sin tur strikt av den. Syftet med detta protokoll är att öppna ett sätt att analysera och kartlägga musen ECM, eftersom möss är den mest använda modellorganismen i däggdjurspatofysiologi.

Utvecklingen av denna metod drevs av behovet av att karakterisera och isolera metastasering-associerade inhemska ^ECM2. Eftersom tumörer saknar korrekt anatomisk vaskularisering och möss är relativt små organismer, var mikrokirurgiska förfaranden utformade för att bakåt catheterize aorta, samtidigt isolera cirkulationen av det stora kärlet som leder till en tumör (t.ex. pulmonell vener), således fokusera reagens flöde och tillåta tumör decellularization. Denna metod producerar ECM-byggnadsställningar med en bevarad ^struktur2 som kan immunostained och avbildas, vilket möjliggör ECM struktur mappning i submicron detalj. För att utföra detta protokoll är det nödvändigt att förvärva kirurgiska och mikrokirurgiska färdigheter (dissekering, mikrosutgning och kateterisering) som kan utgöra en potentiell begränsning av dess användning. Vår kännedom om detta är den senaste metoden för inbyggd ECM-struktur imaging ^analys2,3.

Protocol

Alla förfaranden som ingår här har granskats och godkänts av den etiska kommitté som reglerar experimentell medicin vid Köpenhamns universitet och instämmer i dansk och europeisk lagstiftning. För att demonstrera detta protokoll har vi använt kvinnliga BALB/cJ möss i åldern 8-12 veckor och en MMTV-PyMT kvinnlig mus på 11 veckors ålder.

OBS: Att undvika bakteriell förorening av den decellulära ECM-ställningen ger det bästa bildframställningsresultatet och möjliggör långsiktig provlagring. Det är därför viktigt att hålla alla steg sterila. Som sådan måste alla instrument och kirurgiskt material, inklusive sutur, mikrosyss, lösningar, slangar, Luer-kontakter och katetrar, vara sterila. Ytor, inklusive en polystyrenbricka, måste desinficeras med 70% etanol, och perfusionen bör helst utföras under en laminär flödeshuv. Alla procedurer sker i rumstemperatur om inget annat anges.

1. Mikrokirurgi efter slakt

1. Avliva musen med en _CO2-kammare .
   1. Placera musen i en 4 L-kammare och börja fylla med 100% _CO2, från 0,2 L/min i 2 minuter, öka tills den når ett flöde på 0,8 L/min efter 3 min. Musen ska falla medvetslös under de första 2 minuterna, och då bör andningen upphöra (vanligtvis cirka 5 min, men flödet kan bibehållas vid behov). Bekräfta dödsfallet innan du går vidare till nästa steg.
2. Raka bröstkorgen, buken och baksidan av musen med hårklipparen och desinficera med 70% etanol. Rakning minskar kraftigt antalet artefakter på grund av närvaron av hår antingen på prover för avbildning eller biokemisk analys.
3. Fäst musen på en polystyrenbricka, förlänger dess fram- och baklimbs, liksom huvudet och svansen. Placera den under mikrokirurgimikroskopet.
4. Med hjälp av en Mayo rak mönster sax upprätta kirurgisk tillgång med ett testning snitt som löper från regionen submandibular till underlivet och dissekera subkutant för att exponera bröstväggen och bukhinnan.
5. Med hjälp av mikrokirurgiska saxar, skär pectoralis major och pectoralis mindre muskler längs det sjätte interkostala utrymmet på båda sidor av bröstväggen.
6. Använd sax med rakt mönster, skär bröstbenet längs de tidigare snitten och slutför sedan en sternotomi genom att skära bröstbenet längs sin långa axel, lyft sedan och stifta båda sidor av bröstväggen för att exponera kardiopulmonellt komplexet.
7. Använd rundspetsade mikrotångar (eller Dumont-mikrotångar) och ta bort tymus och omgivande fettvävnad genom att försiktigt dra bort dem från sina tillbehör. Detta kommer att avslöja de stora fartygen.
8. Använd cautery, cauterize den fallande cava venen och, med hjälp av raka mönster sax, skära matstrupen.
9. Med hjälp av skarpa micro-tång, separera brachiocephalic vener och brachiocephalic, vänster gemensamma halsartären och vänster subclavian artärer från den underliggande vävnaden för att underlätta ligatur och cauterization.
10. Med hjälp av mikro-nålhållare, skarpa mikro-tång och 9-0 sutur placera stygn ovanför uppkomsten av brachiocephalic, vänster gemensamma halsartär och vänster subclavian artärer.
11. Kauterisera brachiocephalic vener.
12. Separera de submandibular salivkörtlarna längs mittlinjen för att exponera nackmusklerna och luftstrupen. Separera musklerna för att exponera cricothyroid ligament. Använd mikrosax, öppna en ingång genom att dela ligamentet.
13. För in en 27 G-kateter i luftstrupen och tryck försiktigt tills luftstrupen förgrenas in i bronkierna (dvs. tills motståndet mot katetern är uppfyllt och dra sedan tillbaka 3 mm). Var försiktig så att du inte stör bronkierna. Använd en 6-0 sutur, placera 3 stygn runt luftstrupen för att säkra katetern.
14. Dela upp musen på höjden av den 12: e bröstkotan. Den fallande aortan löper främre till ryggraden och bör delas upp här tillsammans med ryggraden. Ställ isär den nedre halvan.
15. Kateterisera aortan bakåt och tryck katetern tills den når aortabågen. Använd 9-0 sutur, placera 4 stygn runt aortan, med början 5 mm under kateterspetsen.

2. Decellularisering

1. Anslut musen till ett pumpsystem med silikonrör och Luer-kontakter. Perfusera med avjoniserat vatten vid 200 μL/min i 15 min. Behåll detta flödeshastighet under avcellulariseringen.
2. Byt perfusionsmedlet till 0,5% natriumdeoxikolat (DOC) utspädd i avjoniserat vatten och perfuse över natten.
3. Byt perfusionsmedlet till 0,1% natrium dodecylsulfat (SDS) utspädd i avjoniserat vatten och perfusera i 8 timmar.
4. Perfusera med avjoniserat vatten över natten för att tvätta bort SDS och DOC i 24 timmar.
5. Återförslut det decellulära hjärtat och lungorna genom att dela upp dess fästen på bröstkorgen med en krökt sax och förvara i ett sterilt kryorör med avjoniserat vatten med 1% (v/v) penicillin-streptomycin och 0,3 μM natriumazid vid 4 °C. ECM-byggnadsställningar kan lagras i minst 12 ^veckor1. Om ställningen kommer att användas för biokemisk analys (t.ex. masspektrometri), frysning av snäpp i flytande kväve.

3. Immunostaining

1. Planera avbildningen: bestäm primär antikropp (eller antikroppar) och kombinationen av fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar för att matcha varandra och passa laserlinjerna i fluorescensmikroskopet.
2. Blockera provet genom att nedsänka det i ett kryotube som innehåller 6% (v/v) åsneserum - 3% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) över natten.
3. Inkubera med primär antikropp (eller antikroppar) i 3% åsneserum i PBS i 24 timmar.
4. Tvätta 5 gånger i 1 h varje gång i 0,05% interpolering 20 i PBS (PBST).
5. Inkubera provet med fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar (eller antikroppar) i 3% åsneserum i PBS i 24 timmar.
6. Tvätta 5 gånger i 1 timme i 0,05% (PBST). Vänta 1 h mellan varje tvätt.
7. Tillsätt avjoniserat vatten och förvara vid 4 °C bort från direkt ljus. Vid denna tidpunkt är ställningen redo att avbildas.

4. Bildbehandling

1. Placera provet i en glasbottnad skål och fukta det med två droppar lagringslösning (PBS eller avjoniserat vatten).
2. Förbered målet. Vi rekommenderar att du använder ett vattensänkningsmål.
3. Inspektera provet med fluorescensljus.
4. Byt till datorkontroll. Slå på lasrar och justera laserintensitet, pinhole bländare, detektorer våglängder, förstärkning, upplösning och zoom. Ange nummer och stegstorlek för z-stack och börja förvärva. Vi rekommenderar att du använder multifoton laser excitation för att öka vävnadspenetration och för att minimera spridning av ljus, blekning och vävnadsskador.

5. Hematoxylin-eosin färgning

1. Punktskatt 1 lunglob från en avlivad mus.
2. Placera i en 10 mm x 10 mm x 5 mm cryomold och täck den med cirka 500 μL OCT-förening.
3. Frys på torris (-70 °C) och håll provet vid den temperaturen.
4. Punkt punkt en decellulariserad lunglob från en bearbetad mus enligt steg 2.5.
5. Placera i en cryomold med den största ytan ner och täck den med OCT-förening enligt vad som anges i steg 5.2.
6. Frys på torris (-70°C) och håll provet vid den temperaturen tills det annars krävs. Provet kan förvaras i minst 12 veckor.
7. Sektion frysta vävnadsblock vid -20 °C i en kryostat med 5 μm tjocklek och placera sektioner på självhäftande glasrutschbanor och förvara vid -80 °C.
8. Ta rutschkanorna till rumstemperatur tills luften torkas (ca 20 min).
9. Sänk kort ned i PBS och fixera genom att nedsänka bilderna i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min. Tvätta en gång i PBS i 5 min, sedan två gånger i destillerat vatten i 5 min.
10. Fördjupa dig i Mayers hematoxylinlösning i 10 min. Denna tid kan optimeras enligt vävnadskälla och fläckpreparat.
11. Tvätta i en Coplinburk under rinnande destillerat vatten i 10 min.
12. Fördjupa dig i eosinlösning i 7 min. Denna tid kan optimeras enligt vävnadskälla och fläckpreparat.
13. Doppa i 50% etanol för att avlägsna överskott av Eosin och dehydrera genom att snart doppa i 70% etanol och i 96% och 100% etanol i 30 sekunder. Doppa i xylen flera gånger.
14. Applicera några droppar DPX monteringsmedium och placera ett glasskyddsslip.
15. Låt rutschkanorna torka över natten under en kemisk huva.
16. Skanna bilder i en bildskanner.

Representative Results

Cardiopulmonary decellularization
Efter att framgångsrikt ha slutfört protokollet kommer hjärtat och lungorna, liksom annexvävnad som aortabågen, att vara fria från celler. Decellularisering kan valideras genom hematoxylin-eosinfärgning (figur 1) av ECM-byggnadsställningarna som visar avlägsnande av atomkärnorna jämfört med den inhemska vävnaden. Dessa byggnadsställningar behåller dimensionerna av färska organ och dess olösliga ECM-struktur är ^intakt2. Figur 2 visar en schematisk representation av de viktigaste kirurgiska steg som krävs för att framgångsrikt perfusera musen cardio-pulmonell komplex.

ECM-avbildning
I en standardinställning kan sekundära antikroppar användas i gröna, röda och långröda fluorescenskanaler (dvs. 488 nm, 555 nm/594 nm och 647 nm våglängdsdetektering). tillsats av andra övertoner generation (SHG) imaging med 2-foton excitation kommer att avslöja fibrillar kollagen. Laserexcitation kan framkalla vävnad autofluorescens och försiktighet måste iakttas vid användning av den med grön fluorescens, eftersom det kan förvirra bilddata. Ett enkelt sätt att validera automatisk fluorescens är att avbilda en oförstörd kontrollvävnad och ställa in laserintensitet och detektorökning i enlighet därmed och jämföra detta med antikroppsfärgningen. Emellertid, denna autofluorescens kan användas som en fördel, eftersom det kan exponera elastin i lungorna byggnadsställningar.

ECM byggnadsställningar visade ökad permeabilitet och lätt penetrability2. Genom att använda detta protokoll med ett motoriserat mikroskopsteg möjliggörs tredimensionell, kaklad avbildning av helmonterade) prover vid submicronupplösning (figur 3). Om det är nödvändigt att dela upp vävnaden (t.ex. för att avbilda hjärtväggar eller djup lungparenkym) ska vävnaden delas upp med en skarp skalpell innan färgning utförs.

Figur 1. Validera avcellularisering. Hematoxylin-Eosin färgning av snap frysta prover från inhemska och decellulariserade lungor och hjärta. Lägg märke till frånvaron av atomkärnor i decellulära prover. Alla skalor i mikron. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 2. Micro-kirurgi schematic visar de viktigaste stegen som krävs för att decellularisera cardio-pulmonell komplexet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 3. Representativa flera protein immunostaining av decellularized PyMT mus lungor från en 11 veckor gammal kvinnliga mus. Kakelmosaik som visar den maximala projektionen av en z-stack. Infälld 1 visar folkomröstningen. Infälld 2 visar normala parenkyma ECM. Infälld 3 visar en bronkiol. Färgerna har gjorts tillgängliga för färgblinda. Alla skalor i mikron. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Decellularisering tekniker baserat på vävnad agitation ändra ECM struktur, vilket gör dem olämpliga för ECM struktur ^analys4. Perfusion decellularization, med hjälp av en anatomisk väg som luftstrupens aorta, gör det möjligt att nå kapillärbädden eller terminalalveoler, och underlättar leveransen av decellulariserande medel i hela organet. Användning av zwitterionic, an joniska och icke-joniska tvättmedel för att decellularisera vävnad rapporteras4,5,6, men natrium dodecylsulfat (SDS, anjoniskt) linjäriserar fibrillärt kollagen i musfettkudden2 men inte i lungorna. Detta tyder på att valet av tvättmedel måste optimeras och anpassas till målvävnaden för att upprätthålla ECM-strukturen. Vävnadsrensningsmetoder kan tänkas användas för ECM-analys, även om de kräver kemikalier som kan ändra ECM-korslänkning och vävnadsdimensioner7,8,9. Medan förvärvad vävnad transparens tillåter förbättrad mikroskopisk avbildning, förekomsten av celler avsevärt förvärrar antikropp penetration och kan täcka ECM epitopes/proteiner. Isolerande och avbildning intakt ECM möjliggör kvantitativ analys av dess struktur med ^{analysverktyg2,10}, kartlägger dess ^{sammansättning2} och öppnar vägen för ytterligare ECM biokemisk undersökning.

Dissekering och ligatur av större fartyg och den därav följande isoleringen av födans och lungcirkulationen är nödvändig för att uppnå enhetligt tryck av perfuserade lösningar i hela vävnaderna. Därför är detta protokoll beroende av huvudoperatörens mikrokirurgiska expertis. Det är viktigt att arbeta med precision för att bevara kärl, lungor och hjärta intakta. Att utföra detta protokoll upprepade gånger för att förstå bröstkorgens tredimensionella anatomi är av största vikt för att uppnå konsekventa resultat.

Det kirurgiska ingreppet som visas här sammanfattar de grundläggande stegen för att komma åt musvaskulaturen1,2 och organen i dess territorium. Genom att ändra ligaturmönstret är det möjligt att komma åt huvud och nacke, framben och fettkuddar. Med samma färdigheter är det möjligt att decellularisera de submembermatiska organen.

Lika viktigt är den noggranna utformningen av immunstaining-installationen. Vi har tidigare sammanställt en katalog över validerade antikroppar mot strukturella ECM-proteiner3. Standardinställningen kan avslöja upp till tre proteiner och fibrillärt kollagen samtidigt, vilket möjliggör korsundersökning.

Betydelsen av denna metod ligger i möjligheten att erhålla strukturellt och dimensionsförstärliga ECM-byggnadsställningar. Dekonstruktionen av en komplex vävnad till diskreta komponenter är ett av de grundläggande målen för bioengineering; medan det är relativt enkelt att isolera celler, eller blod, från ett organ, det fanns inga metoder för att få dess ECM byggnadsställningar. Detta var särskilt sant för tumörer, men metoden som presenteras här öppnar vägen för ECM isolering i någon mus stam för anatomiska och biokemiska analys av ECM.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L