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Biology

CRISPR/Cas9 का उपयोग कर प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के जीनोम इंजीनियरिंग

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61855
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Pediatrics, University of Minnesota, 2Center for Genomic Engineering, University of Minnesota, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

Summary

यहां हम बी कोशिकाओं में जीन के जैविक कार्यों और बी-सेल चिकित्सा के विकास का अध्ययन करने के लिए जीन नॉकआउट (KO) और नॉक-इन (KI) के लिए प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के CRISPR/Cas9-आधारित जीनोम इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

Abstract

बी कोशिकाएं हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त लिम्फोसाइट्स हैं और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के विनोदी हाथ का एक प्रमुख घटक हैं। वे परिधीय रक्त से अलगाव की आसानी, विट्रो में विस्तार करने की उनकी क्षमता, और वीवो में उनकी दीर्घायु के कारण सेल आधारित चिकित्सा के लिए आकर्षक उम्मीदवार बनाते हैं । इसके अतिरिक्त, उनके सामान्य जैविक कार्य- बड़ी मात्रा में एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए- बहुत बड़ी मात्रा में चिकित्सीय प्रोटीन व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि संक्रमण से लड़ने के लिए एक रीकॉम्बिनेंट एंटीबॉडी, या एंजाइमोपैथी के उपचार के लिए एक एंजाइम। यहां, हम प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं को परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से अलग करने और विट्रो में अलग-थलग बी कोशिकाओं को सक्रिय/विस्तारित करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं । हम तो बी कोशिकाओं में अंतर्जात जीन के साइट विशिष्ट KO के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करने में शामिल कदम प्रदर्शित करता है । यह विधि विभिन्न जीनों के कुशल KO के लिए अनुमति देती है, जिसका उपयोग ब्याज के जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके बाद हम बी कोशिकाओं में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति कैसेट के कुशल साइट-विशिष्ट एकीकरण के लिए एक रिकॉम्बिनेंट, एडेनो-संबद्ध, वायरल (आरएवी) वेक्टर के साथ CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए कदम प्रदर्शित करते हैं । साथ में, यह प्रोटोकॉल एक कदम-दर-कदम इंजीनियरिंग मंच प्रदान करता है जिसका उपयोग प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं में जीन के जैविक कार्यों के साथ-साथ बी-सेल चिकित्सा के विकास के लिए किया जा सकता है।

Introduction

बी कोशिकाएं हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल से प्राप्त लिम्फोसाइट वंश का एक उपसमूह हैं। वे प्रतिरक्षा चुनौतियों के प्रत्युत्तर में बड़ी मात्रा में एंटीबॉडी का उत्पादन करके अनुकूली ह्यूमरल इम्यून सिस्टम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। बी कोशिकाएं स्मृति बी कोशिकाओं और मरणासन्न विभेदित, लंबे समय तक रहने वाली प्लाज्मा कोशिकाओं के अग्रदूत भी हैं, जिससे स्थायी ह्यूमरल प्रतिरक्षा2प्रदान की जाती है। प्लाज्मा कोशिकाओं, विशेष रूप से, उनके लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने की क्षमता में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच अद्वितीय हैं, जबकि साल या दशकों के लिए जीवित3। इसके अतिरिक्त, परिधीय रक्त से अलगाव की आसानी बी-सेल वंश को उपन्यास सेल-आधारित चिकित्सा4के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाती है।

पहले, यादृच्छिक एकीकरण विधियों, जैसे लेंटीविराल वैक्टर या स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन का उपयोग करने वाले, ट्रांसजीन डिलीवरी और अभिव्यक्ति5,6,7,8के लिए बी कोशिकाओं को इंजीनियर करने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों की गैर-विशिष्ट प्रकृति बी कोशिकाओं में एक विशिष्ट जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करना मुश्किल बनाती है और इसमें सम्मिलनीय म्यूटेनेसिस और वेरिएबल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और/या चिकित्सीय सेटिंग में मुंह बंद होने का अंतर्निहित जोखिम होता है ।

CRISPR/Cas9 प्रणाली एक शक्तिशाली जीनोम इंजीनियरिंग उपकरण है जो शोधकर्ताओं को कई प्रजातियों में विभिन्न कोशिकाओं के जीनोम को ठीक से संपादित करने की अनुमति देता है । हाल ही में, हमारे अपने सहित दो समूहों ने प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं9,10के पूर्व वीवो विस्तार और लक्षित जीनोम इंजीनियरिंग के लिए सफलतापूर्वक तरीके विकसित किए हैं। हम एक ल्यूकाफोरसिस नमूने से प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं को शुद्ध करने की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे। उसके बाद, हम बी-सेल विस्तार और अलग बी कोशिकाओं की सक्रियता के लिए हमारे अद्यतन प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे। इसके बाद हम सक्रिय बी कोशिकाओं में CD19 sgRNA के साथ CRISPR/Cas9 mRNA को पेश करने के लिए इलेक्ट्रोपाउशन द्वारा भेदभाव 19 (सीडी 19), एक विशिष्ट बी-सेल रिसेप्टर और बी कोशिकाओं की एक बानगी के क्लस्टर को खटखटाने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करेंगे ।

Cas9 mRNA अनुवाद हो जाता है और CD19 sgRNA के लिए एक CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein परिसर (RNP) बनाने के लिए बांधता है । इसके बाद, परिसर में sgRNA Cas9 जीन के exon 2 पर लक्ष्य अनुक्रम पर डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) बनाने के लिए जाता है । कोशिकाएं न्यूक्लियोटिड्स को शुरू करने या हटाने के द्वारा डीएसबी की मरम्मत करेंगी, जिससे फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन हो जाएगा और जीन को खटखटाया जा सकेगा । हम तो प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा CD19 के नुकसान को मापने और अपघटन (ज्वार) विश्लेषण द्वारा indels की ट्रैकिंग द्वारा indel गठन का विश्लेषण करेंगे ।

इसके बाद हम एडेनो से जुड़े वायरस इंटीग्रेशन साइट 1 (AAVS1) जीन में बढ़ी हुई ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन(ईजीएफपी) की साइट-विशिष्ट प्रविष्टि को मध्यस्थता करने के लिए एक रिकॉम्बिनेंट AAV6 वेक्टर (rAAV6, होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के लिए एक दाता टेम्पलेट के साथ CRISPR/Cas9 का उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे । AAVS1 जीन ज्ञात जैविक कार्यों और मानव जीनोम पर एक एएवी वायरल एकीकरण साइट के बिना एक सक्रिय लोकस है; इसलिए, इसे जीनोम इंजीनियरिंग के लिए "सुरक्षित बंदरगाह" माना जाता है। यहां, हम रिपोर्ट करते हैं कि बी कोशिकाओं के विस्तार और सक्रियण ने संस्कृति के 7 दिनों(चित्रा 1)में 44 गुना विस्तार की अनुमति दी। बी कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपाउशन ने 24 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन पर समग्र कोशिका स्वास्थ्य(चित्रा 2 ए)की थोड़ी कमी दिखाई । सीडी 19 मार्कर(चित्रा 2B)के स्कैटर प्लॉट विश्लेषण ने संपादित कोशिकाओं(चित्रा 2 सी)में 83% की कमी दिखाई।

क्रोमेटोग्राफ(चित्रा 3 ए)के ज्वार विश्लेषण से पता चला है कि% इनडेल फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 3B)द्वारा% प्रोटीन हानि के समान थे। केवाई प्रयोग के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि आरएनपी के साथ मिलकर एएवी वेक्टर(चित्रा 4)प्राप्त करने वाली कोशिकाओं ने 64% ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं(चित्रा 5A)को व्यक्त किया और बाद में जंक्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)(चित्रा 5B)द्वारा सफल एकीकरण प्रदर्शित किया। सेल की गिनती से पता चला है कि सभी नमूनों को जल्दी से 3 दिनों के भीतर बरामद के बाद इंजीनियरिंग(चित्रा 5C)।

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Protocol

एक स्थानीय ब्लड बैंक से स्वस्थ रक्तदाताओं से ल्यूकाफेरेसिस के नमूने प्राप्त किए गए । यहां वर्णित सभी प्रयोगों को संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुसंधान के लिए छूट देने की ठान ली गई थी और मिनेसोटा विश्वविद्यालय में संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

नोट: सभी प्रयोगों को रक्तजनित रोगजनकों के लिए सार्वभौमिक एहतियात के अनुपालन में किया गया था, बाँझ/aseptic तकनीकों और उचित जैवसेफ्टी स्तर-2 उपकरणों के साथ ।

1. बी-सेल विस्तार माध्यम के लिए पूरक तैयार करें

  1. 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के लिए सीपीजी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड का पुनर्गठन करें।
  2. 100 μg/mL की एकाग्रता के लिए सीडी 40 लिगांड (सीडी 40L) का पुनर्गठन करें।
  3. 50 μg/mL की एकाग्रता के लिए पुनर्गठन मानव आईएल-10 (rhIL-10) ।
  4. 10 μg/mL की एकाग्रता के लिए मानव आईएल-15 (rhIL-15) का पुनर्गठन करें ।
    नोट: प्रत्येक पूरक को 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस से -80 डिग्री सेल्सियस पर छोटे एलिकोट में रखें।

2. बेसल माध्यम तैयार करें

  1. इन विट्रो इम्यून सेल विस्तार (जैसे सीटीएस इम्यून सेल एसआर) और 1% (v/v) पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के लिए 5% (v/v) मीडिया सप्लीमेंट के साथ बी-सेल बेसल मीडियम को मिलाएं ।
  2. एक निष्फल बोतल में 0.22 माइक्रोन फिल्टर एडाप्टर का उपयोग करके बेसल माध्यम को फ़िल्टर-स्टरलाइज करें।
  3. बेसल मीडियम को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

3. बी-सेल विस्तार माध्यम तैयार करें

  1. बेसल माध्यम की आवश्यक राशि को बाँझ कंटेनर में स्थानांतरित करने के लिए 5 × 105 कोशिकाओं/एमएल पर बी कोशिकाओं संस्कृति ।
  2. बेसल मीडियम को 1 μg/mL CpG, १०० एनजी/एमएल सीडी40एल, ५० एनजी/एमएल आरएचआईएल-10, और 10 एनजी/एमएल आरआईएल-15 के साथ सप्लीमेंट करें ।
  3. 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके बी-सेल विस्तार माध्यम को फ़िल्टर करें।
  4. उपयोग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए आर्द्रता के साथ ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में बी-सेल विस्तार माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर बराबर करें।
    नोट: एक दिन के लिए उपयोग करने के लिए ताजा बी-सेल विस्तार माध्यम तैयार करें। बी-सेल विस्तार माध्यम को कई दिनों तक उपयोग करने के लिए तैयार न करें। यह मीडिया नुस्खा स्मृति बी कोशिकाओं और सक्रिय प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के प्रसार को प्रोत्साहित करती है।

4. मानव बी-सेल शुद्धि और विस्तार

नोट: निर्माता के निर्देश का पालन करते हुए तापमान नियंत्रित ठंड कंटेनर में 99-100% आइसोप्रोपिल अल्कोहल जोड़ें, और चरण 4.1 शुरू करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंड कंटेनर को ठंडा करें।

  1. एक ल्यूकाफोरसिस नमूने से पीबीएमसी को अलग करें
    1. एक ल्यूकाफोरसिस नमूना (लगभग 8-10 एमएल) को बाँझ 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    2. बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ 35 एमएल तक वॉल्यूम लाएं।
    3. ध्यान से घनत्व-ढाल माध्यम के 15 एमएल पर एक 35 एमएल ल्यूकाफोरसिस नमूना परत।
    4. ब्रेक के बिना 25 मिनट के लिए 500 × जी पर सेंट्रलाइज, बफी कोट (पीबीएमसी परत) को परेशान किए बिना प्लाज्मा परत को हटा दें, इंटरफ़ेस से पीबीएमसी एकत्र करें, और एक नई बाँझ 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    5. 1x पीबीएस के साथ 50 एमएल तक पीबीएमसी लाएं।
    6. 500 × जी पर सेंटीफ्यूज बिना ब्रेक के 5 मिनट के लिए। पीबीएमसी पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट निकालें, जो लाल दिखाई दे सकता है।
    7. अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम लाइसिस बफर का 7 एमएल, अच्छी तरह से मिलाने के लिए 3 बार पिपेट डालें, और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें।
    8. 1x पीबीएस के साथ 50 एमएल तक वॉल्यूम लाएं।
    9. कम प्रतिरोध ब्रेक के साथ 5 मिनट के लिए 400 × जी पर सेंट्रलाइज। पैलेट को परेशान किए बिना ही सुपरनेट निकाल दें। गोली गुलाबी या सफेद दिखनी चाहिए।
      नोट: हौसले से अलग बी कोशिकाओं संस्कृति जारी रखने के लिए, बी सेल अलगाव (चरण ४.२) शुरू करने से पहले बी सेल विस्तार माध्यम तैयार करते हैं ।
  2. मानव प्राथमिक बी-सेल नकारात्मक अलगाव किट का उपयोग कर पीबीएमसी से बी-सेल अलगाव
    1. 5 × 107 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए आइसोलेशन बफर में पीबीएमसी को फिर से रखना।
      नोट: यदि पीबीएमसी की कुल संख्या 5 × 107 कोशिकाओं से कम है, तो 5 × 107 कोशिकाओं/एमएल को बनाए रखने के लिए आइसोलेशन बफर की मात्रा को कम करें । सेल सस्पेंशन की न्यूनतम और अधिकतम मात्रा क्रमशः 0.25 एमएल और 8 एमएल है।
    2. कैप के साथ बाँझ, पॉलीप्रोपाइलीन, गोल-नीचे ट्यूब में 8 एमएल(5 × 10 7 कोशिकाओं/एमएल) तक स्थानांतरित करें।
    3. पीबीएमसी में कॉकटेल एन्हांसर का 50 μL/mL जोड़ें।
    4. पीबीएमसी में आइसोलेशन कॉकटेल के 50 μL/mL जोड़ें, ट्यूब को कैप करें, और मिश्रण करने के लिए 2-3 बार उलटा करें।
    5. 5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट; इनक्यूबेशन के4 वें मिनट में, कम से कम 30 एस के लिए भंवर चुंबकीय माइक्रोमोतियों।
    6. पीबीएमसीसी के 1 मिलीएल के अनुसार चुंबकीय माइक्रोमोतियों के 50 माइक्रोन ट्रांसफर करें, ट्यूब को कैप करें, और मिश्रण करने के लिए 2-3 बार उलटा करें।
    7. आइसोलेशन बफर के साथ 10 एमएल तक टॉप करें और धीरे-धीरे 2-3 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    8. ट्यूब को एक चुंबकीय स्टेशन में रखें और 3 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    9. चुंबक और ट्यूब को एक साथ रखें, और एक गति में, नई ट्यूब में सेल निलंबन डालने के लिए चुंबक और ट्यूब को एक साथ उलटा करें। पुरानी ट्यूब को छोड़ दें।
    10. चरण 4.2.8 दोहराएं (इनक्यूबेशन समय को 2 मिनट तक कम करें) और बी-सेल निलंबन को एक साफ शंकु नली में डालें।
    11. समृद्ध बी कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए तैयार हैं। यदि कोशिकाओं का तुरंत उपयोग किया जाएगा, तो धारा 4.3 (मानव बी-सेल विस्तार) जारी रखें। फ्लो साइटोमेट्री (वैकल्पिक) द्वारा अलग बी कोशिकाओं की शुद्धता की जांच करें। यदि कोशिकाओं को उपयोग से पहले जमे हुए हैं, तो 4.2.12 कदम जारी रखें।
    12. बी कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए, 5 मिनट के लिए 400 × जी पर अपकेंद्रित्र, और गोली परेशान किए बिना सुपरनैंट त्यागें।
    13. 107 कोशिकाओं/एमएल पर ठंड माध्यम में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और aliquot 1 mL/cryovial ।
    14. ठंडा ठंड कंटेनर में क्रायोवियल रखें, और रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; फिर, जमे हुए क्रायोवियल को तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें; जमे हुए कोशिकाओं को 1 साल तक रखें।
      नोट: पृथक बी कोशिकाओं की अपेक्षित उपज कुल पीबीएमसी का 2%-8% है, जिसमें 95%-99% व्यवहार्यता है।
  3. मानव बी-सेल विस्तार
    नोट: यदि हौसले से अलग बी कोशिकाओं का उपयोग कर, कदम 4.3.1-4.3.5 छोड़ दें । कोशिकाओं की गणना करें और कोशिकाओं की आवश्यक संख्या को बाँझ शंकु नली में स्थानांतरित करें और चरण 4.3.6 के साथ जारी रखें।
    1. बी कोशिकाओं को विगलन करने से पहले पानी के स्नान में पूर्व-गर्म भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) । बी-सेल विस्तार माध्यम के 20 एमएल तैयार करें, एक टी-25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें, और उपयोग से कम से कम 15 मिनट पहले ऊतक-संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,आर्द्रता के साथ) में माध्यम को पूर्व-संतुलन करें।
    2. गल बी कोशिकाओं में एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान। प्रतीक्षा करते समय, पूर्व-गर्म एफबीएस के 2 एमएल को बाँझ 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    3. बी कोशिकाओं को पूरी तरह से गल जाने के बाद, तुरंत नमूने में पूर्व-गर्म एफबीएस के 1 एमएल, ड्रॉप-वार जोड़ें। 1 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
    4. धीरे-धीरे नमूना को फिर से खर्च करने और पूरी मात्रा को स्थानांतरित करने के लिए, ड्रॉपवाइज, एक शंकु नली में, जिसमें पूर्व-गर्म एफबीएस के 2 एमएल होते हैं।
    5. बाँझ 1x पीबीएस, कैप के साथ 15 एमएल तक वॉल्यूम लाएं, और ट्यूब को धीरे-धीरे 2-3 बार उलटा करें।
    6. 5 मिनट के लिए 400 × जी पर सेंट्रलाइज।
    7. सेल पेलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्यागें, सेल पेलेट को प्री-समतुल्य बी-सेल विस्तार माध्यम के 1 एमएल के साथ फिर से खर्च करें, और कोशिकाओं की गिनती करें। कुल सेल संख्या लगभग 107 कोशिकाओं होनी चाहिए।
    8. कोशिकाओं को पूर्व-समतुल्य बी-सेल विस्तार माध्यम के 20 एमएल युक्त फ्लास्क में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता लगभग 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल होनी चाहिए ।
    9. एक ऊतक-संस्कृति इनक्यूबेटर में फ्लास्क को खड़ी रूप से इनक्यूबेट करें।
    10. बी कोशिकाओं की पूरी मात्रा को बाँझ शंकु नली में स्थानांतरित करके और 4.3.6-4.3.9 चरणों को दोहराने के द्वारा विस्तार माध्यम को पूरी तरह से हर 2 दिनों में ताज़ा करें।
      नोट: टी-25 फ्लास्क मध्यम के 10-20 एमएल पकड़ सकते हैं; T75 फ्लास्क मध्यम के 20-60 एमएल तक पकड़ कर सकते हैं।

5. प्राथमिक मानव बी-सेल इंजीनियरिंग

  1. इष्टतम परिणामों के लिए विस्तार/सक्रियण के बाद 48 ± 2 घंटे पर इंजीनियर बी कोशिकाएं। बी-सेल विस्तार माध्यम, एलिकोट 1 एमसीएम माध्यम को 48-अच्छी तरह से ऊतक-संस्कृति प्लेट में तैयार करें, और उपयोग से पहले कम से कम 15 मिनट ऊतक-संस्कृति इनक्यूबेटर में पूर्व-संतुलन तैयार करें।
    नोट: ब्याज के जीन के लिए एक CRISPR/Cas9 sgRNA डिजाइन करते समय, नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करें ।
    - ऑनलाइन टूल11का उपयोग करके डिजाइन एसजीआरएन ।
    - डिजाइन sgRNAs एक exon पर है कि प्रोटीन के सभी आइसोफॉर्म के लिए आम है।
    - सम्मानित कंपनियों से रासायनिक रूप से संशोधित sgRNA आदेश।
    - एसजीआरएनए आमतौर पर लियोफिलाइज्ड रूप में आता है; बाँझ DNase/RNase-मुक्त Tris-EDTA (TE) बफर में 1 μg/μL की एकाग्रता के लिए sgRNA का पुनर्गठन ।
  2. रासायनिक रूप से संशोधित स्ट्रेप्टोकोकस पाइजनोजिस कैस 9 (एसपी कैस 9) नाभिक पर ट्रांसफेक्शन रिएक्शन के 1.5 माइक्रोन (1 माइक्रोन/माइक्रोन) के साथ रासायनिक रूप से संशोधित एसजीएल (1 माइक्रोन/माइक्रोन) मिलाकर CRISPR/Cas9 ट्रांसेक्टिंग सब्सट्रेट तैयार करें । नियंत्रण के लिए, sgRNA के बजाय ते बफर के 1 μL का उपयोग करें।
    नोट: जब CD19 sgRNA एक जीन KO प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है, परिणाम के लिए चित्रा 2 देखें । जब AAVS1 sgRNA एक जीन KI प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है, परिणामों के लिए चित्रा 5 देखें ।
    • सभी घटकों को बर्फ पर रखें।
  3. धीरे-धीरे मिलाएं और 0.2 मिलील 8-ट्यूब स्ट्रिप की ट्यूब में प्रति प्रतिक्रिया के 2.5 माइक्रोन को स्थानांतरित करें; आरटी पर अलग सेट करें ।
  4. एक नाभिक (इलेक्ट्रोपोराटर) चालू करें, और तालिका 1में दिखाए गए ट्रांसफैक्शन रिएजेंट तैयार करें।
    नोट: यह एक ठहराव के लिए एक अच्छा कदम है, यदि आवश्यक हो, बर्फ पर सभी अभिकर्दक डाल कर । प्रयोग फिर से शुरू करने के लिए तैयार होने पर बर्फ से सभी अभिकर् ती निकालें। एसपी Cas9 प्रोटीन का उपयोग करते समय, अन्वेषक को पूर्व-जटिल CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein को 1 माइक्रोन sgRNA के साथ 5 माइक्रोन 1 प्रोटीन के साथ मिलाकर, किसी भी बुलबुले से बचना चाहिए, और इष्टतम परिणामों के लिए उपयोग से पहले कम से 20 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण को इनक्यूबेटिंग करना चाहिए ।
  5. गिनती और एक बाँझ शंकु ट्यूब में ट्रांसफेक्शन प्रतिक्रिया प्रति10 6 बी कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  6. बाँझ 1x पीबीएस के साथ 15 एमएल तक वॉल्यूम लाएं, और 5 मिनट के लिए 400 × जी पर अपकेंद्रित्र करें। प्रतीक्षा करते समय, प्राथमिक सेल ट्रांसफैक्शन रीएजेंट(टेबल 2)तैयार करें और आरटी पर अलग सेट करें।
  7. सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्याग दें।
  8. 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर बाँझ 1x पीबीएस और अपकेंद्रित्र के 10 एमएल के साथ सेल गोली को फिर से खर्च करें।
  9. सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को पूरी तरह से त्याग दें।
  10. प्रति 10 6 बी कोशिकाओं को प्रति 10 6 बी कोशिकाओं में रासायनिक रूप से संशोधित जीएफपी एमआरएनए (ट्रांसफैक्शन रिपोर्टर के रूप में) के0.5 माइक्रोन को सेल पेलेट (वैकल्पिक) में स्थानांतरित करें।
  11. 106 बी कोशिकाओं में 20 माइक्रोन प्राथमिक सेल ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के साथ सेल पेलेट को फिर से खर्च करें; 5-6 बार पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। CRISPR/Cas9 ट्रांसफेक्शन सब्सट्रेट के 2.5 माइक्रोन युक्त 8-ट्यूब स्ट्रिप की 0.2 एमएल ट्यूब में 20.5 माइक्रोन प्रति ट्रांसफेक्शन रिएक्शन ट्रांसफर करें।
  12. एक बार पूरे वॉल्यूम (23 माइक्रोन) को ट्रांसफेक्शन क्यूवेट में मिलाने और स्थानांतरित करने के लिए पिपेट अप और डाउन करें। कैप और बेंच पर क्यूवेट को धीरे-धीरे टैप करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि तरल क्यूवेट के नीचे को कवर करता है।
  13. ट्रांसफेक्शन के लिए न्यूक्लियोफेक्टर पर ह्यूमन प्राइमरी बी-सेल प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करें।
    नोट: नाभिक (इलेक्ट्रोपोरेटर) रखा जा सकता है और ऊतक संस्कृति हुड के बाहर इस्तेमाल किया जा सकता है । बंध्यता सुनिश्चित करने के लिए कुवेट को कैप करें।
  14. 15 मिनट के लिए आरटी में क्यूवेट में इलेक्ट्रोपोजेटेड कोशिकाओं को आराम दें।
  15. पूर्व-समतुल्य बी-सेल विस्तार माध्यम के 80 माइक्रोन को ऊतक संस्कृति प्लेट से क्यूवेट में ट्रांसफेक्शन रिएक्शन में स्थानांतरित करें। 30 मिनट के लिए टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में क्यूवेट रखें।
  16. धीरे-धीरे एक दो बार मिश्रण और एक 48 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति बी सेल विस्तार माध्यम के 1 मिलीएल युक्त प्लेट के एक उपयुक्त अच्छी तरह से करने के लिए क्यूवेट से नमूने की पूरी मात्रा हस्तांतरण करने के लिए पिपेट। कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता 106 कोशिकाओं/एमएल होनी चाहिए।
  17. यदि जीन केयू प्रयोग करते हैं, तो संक्रमण की 500,000 बहुलता पर rAAV6 वेक्टर को विद्युतीकृत कोशिकाओं (लगभग 45 मिनट के बाद इलेक्ट्रोपाउशन) में स्थानांतरित करें। देखें उदाहरण RAAV6 वेक्टर चित्रा 4Aमें निर्माण ।
    नोट: उदाहरण के लिए: एक नियंत्रण नमूना CRISPR/Cas9 या rAAV6 वेक्टर के बिना इलेक्ट्रोपेटेड किया जाएगा । एक वेक्टर-केवल नमूना CRISPR/Cas9 के बिना इलेक्ट्रोपेटेड किया जाएगा और फिर rAAV6 वेक्टर के साथ स्थानांतरित किया जाएगा । एक केवी नमूने को CRISPR/Cas9 के साथ इलेक्ट्रोपेटेड किया जाएगा और फिर RAAV6 वेक्टर के साथ स्थानांतरित किया जाएगा । RAAV6 में एचडीआर के लिए लक्षित डीएसबी साइट के ऊपर और डाउनस्ट्रीम होते हैं।
  18. थाली को एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता के साथ 5% सीओ2 रखें।
  19. 1 के बाद इंजीनियरिंग दिन में कोशिकाओं और रिकॉर्ड व्यवहार्यता गिनती ।
  20. कोशिकाओं की गिनती करके हर 2 दिन में बी-सेल विस्तार माध्यम को ताज़ा करें और फिर कोशिकाओं की पूरी मात्रा को एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 400 × जी पर सेंट्रलाइज, और गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्याग दें। ताजा बी-सेल विस्तार माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें। 5 × 105 कोशिकाओं/एमएल पर एक अंतिम सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मध्यम मात्रा में लाओ ।
    नोट: एक ४८ अच्छी तरह से थाली 1 एमएल माध्यम तक पकड़ कर सकते है/ एक 24 अच्छी तरह से थाली 2 एमएल मध्यम तक पकड़ कर सकते है/ एक 12 अच्छी तरह से थाली 4 एमएल मध्यम/अच्छी तरह से पकड़ कर सकते हैं, और एक 6 अच्छी तरह से थाली 8 एमएल मध्यम तक पकड़ कर सकते है/
  21. इंजीनियर कोशिकाओं को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करने से पहले कम से कम 5 दिनों तक विस्तार करने की अनुमति दें जैसे कि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण, ज्वार विश्लेषण और जंक्शन पीसीआर के लिए।

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Representative Results

अद्यतन विस्तार और सक्रियण प्रोटोकॉल ने 7 दिनों में 44 गुना तक बी कोशिकाओं के तेजी से विस्तार को सक्षम किया(चित्र 1,n =3 दाताओं)। KO प्रयोग में, ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके बी-सेल काउंट ने नियंत्रण और CD19 KO नमूनों में सेल रिकवरी में थोड़ी कमी के साथ 80% से अधिक व्यवहार्य कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद इलेक्ट्रोपंरेशन(चित्रा 2A;पी ≥ 0.05, एन = 3 दानदाताओं) में दिखाया। यह परिणाम इंगित करता है कि इलेक्ट्रोपाउशन ने समग्र बी-सेल स्वास्थ्य को थोड़ा प्रभावित किया। बी कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री और ज्वार विश्लेषण के लिए 5 पोस्ट-ट्रांसफेक्शन पर एकत्र किया गया था । नियंत्रण और KO नमूने के प्रतिनिधि तितर बितर भूखंडों क्रमशः 14% और ९५% सीडी 19-नकारात्मक कोशिकाओं,(चित्रा 2B) दिखाया। प्रवाह भूखंडों के क्वांटिटेशन ने नियंत्रण(चित्रा 2B;पी ≤ 0.0001, एन = 3 दानदाताओं) की तुलना में को नमूनों में CD19 अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी दिखाई। जीनोमिक अनुक्रमण के क्रोमेटोग्राम (टेबल 3में प्राइमर सीक्वेंस देखें) ने सीडी 19 को बी कोशिकाओं में दोहरी चोटियों को दिखाया, जो न्यूक्लियोटाइड्स के बाद CRISPR/Cas9-मध्यस्थता डीएसबी के सम्मिलन/विलोपन का संकेत देता है, जबकि नियंत्रण में एकल चोटियों को देखा गया, जो इसनमूने (चित्रा 3A)में कोई डीएसबी नहीं हुआ । क्रोमेग्राफ के इनडेल विश्लेषण (एक मुफ्त ऑनलाइन ज्वार विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर) KO नमूनों के उच्च% इंडेल गठन (>90%) CD19 लोकस में, जो प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 3B;पी ≥ 0.05, एन = 3 दाताओं) द्वारा पता लगाया गया % सीडी 19 प्रोटीन हानि के अनुरूप है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि CRISPR/Cas9 कुशलता से बी कोशिकाओं में एक CD19 KO उत्पन्न । केवाई प्रयोग से बी कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री और जंक्शन पीसीआर विश्लेषण(तालिका 4)के लिए 12 पोस्ट-इंजीनियरिंग पर एकत्र किया गया था । स्कैटर प्लॉट्स ने नमूने में 64% ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को दिखाया जो आरएनपी के साथ RAAV6 वेक्टर(चित्रा 4)प्राप्त हुआ, जबकि नियंत्रण में कोई ईजीएफपी-पॉजिटिव सेल नहीं देखा गया; केवल एएवी वेक्टर(चित्रा 5A)प्राप्त करने वाले नमूने में न्यूनतम ईजीएफपी-सकारात्मकता देखी गई। एक जंक्शन पीसीआर प्रवर्धन (टेबल 3में प्राइमर सीक्वेंस देखें) ने केवाई सैंपल(चित्रा 5B)में 1.5 केबीपीएस एम्पलिप्स दिखाए, जबकि नियंत्रण या वेक्टर-केवल नमूने में कोई पीसीआर उत्पाद नहीं देखा गया। सेल काउंट से पता चला है कि इंजीनियरिंग प्रक्रिया नियंत्रण या वेक्टर-केवल नमूनों(चित्रा 5B)से अधिक KI नमूने में सेल वसूली को प्रभावित करती है । हालांकि, इंजीनियरिंग(चित्रा 5B)के बाद 3 दिनों के भीतर सभी नमूने जल्दी से रिबाउंड हो गए। साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि AAVS1 लोकस में ईजीएफपी के सफल एकीकरण से इंजीनियरिंग के बाद कम से कम 12 दिन ईजीएफपी की स्थिर अभिव्यक्ति होती है।

Figure 1
चित्रा 1: बी सेल विस्तार इन विट्रो। बी कोशिकाओं को 1 × 106 कोशिकाओं पर 5 × 105 प्रति एमएल के घनत्व पर 0 (शून्य) पर वरीयता प्राप्त थी और 7 दिनों में 44 गुना (एन = 3 स्वतंत्र दानदाताओं) का विस्तार किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2A
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Figure 2B
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Figure 2C
चित्रा 2C: CRISPR/Cas9-मध्यस्थता CD19 नॉकआउट (KO) बी कोशिकाओं में । (A)बार ग्राफ से पता चलता है और 70% सेल रिकवरी (बाएं पैनल) और और और 80% व्यवहार्यता (सही पैनल) कोशिकाओं के बाद ट्रांसफैक्शन दोनों में 24 घंटे के बाद इलेक्ट्रोपाउशन के बाद 19 KO नमूनों में देखा गया। (ख)लाइव कोशिकाओं के सीडी19 गेटिंग के प्रतिनिधि प्रवाह भूखंडों में क्रमशः 84.3% और 3.43% सीडी 19-पॉजिटिव कोशिकाएं और सीडी 19 को नमूने में दिखाया गया है। (ग)बार ग्राफ CRISPR/Cas9-मध्यस्थता सीडी 19 KO समूह (पी ≤ ०.०००१) में CD19 की महत्वपूर्ण कमी से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3A
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Figure 3B
चित्रा 3B: CD19 प्रोटीन हानि बनाम इंडेल गठन। (A)क्रोमाटोग्राम नियंत्रण और सीडी 19 नॉकआउट (KO) नमूने की अनुक्रमण चोटियों को दर्शाती है। नियंत्रण चोटियों पर ग्रे बॉक्स एक तीर द्वारा इंगित भविष्यवाणी कट साइट के साथ CD19 gRNA के लक्ष्य अनुक्रम पर प्रकाश डाला गया । CD19 KO ने भविष्यवाणी की कटौती साइट के आसपास "डबल चोटियों" अनुक्रमण दिखाया, जो डबल-फंसे ब्रेक के बाद न्यूक्लियोटाइड्स के सम्मिलन/विलोपन का संकेत देता है । (ख)बार ग्राफ CD19 लोकस (पी ≥ ०.०५) में % CD19 प्रोटीन हानि और % इंडेल गठन के बीच लगातार परिणाम दिखा रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP वेक्टर निर्माण। अभिव्यक्ति कैसेट में एक मजबूत सिंथेटिक प्रमोटर (एमएनडी) अनुक्रम होता है, जिसके तुरंत बाद एक उन्नत हरी फ्लोरेसेंस प्रोटीन (ईजीएफपी) कोडिंग अनुक्रम और पॉली एडेनिलेशन (पॉली ए) अनुक्रम होता है। AAVS1 होमोलॉजी हथियार एमएनडी प्रमोटर के ऊपर और पॉली ए दृश्यों के डाउनस्ट्रीम को फ्लैंक करते हैं। एमएनडी प्रमोटर के रेगुलेशन के तहत ईजीएफपी व्यक्त किया जाएगा। निर्माण के प्रत्येक घटक के ऊपर अनुक्रम लंबाई इंगित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5A
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Figure 5B
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Figure 5C
चित्रा 5C: CRISPR/Cas9-और rAAV6-मध्यस्थता साइट-12 के बाद इंजीनियरिंग में बी कोशिकाओं में EGFP रिपोर्टर कैसेट के विशिष्ट एकीकरण । (ए)प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड में कोई ईजीएफपी-पॉजिटिव बी कोशिकाएं या तो नियंत्रण या वेक्टर-केवल नमूना बनाम 64.4% ईजीएफपी-पॉजिटिव बी कोशिकाओं को नॉकइन (के) नमूने से दिखाती हैं। (ख)केएचई नमूने की जंक्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन भविष्यवाणी 1.5 केबीपीएस बैंड से पता चलता है; नियंत्रण या वेक्टर-केवल नमूने में कोई बैंड नहीं पाया गया था। पीसीआर प्रक्रिया के दौरान कोई प्रदूषण सुनिश्चित करने के लिए पानी का उपयोग किया गया था। (ग)बार ग्राफ में इंजीनियरिंग के बाद 3 दिनों की अवधि में नियंत्रण की कोशिका वृद्धि, वेक्टर-केवल और ईजीएफपी-के नमूनों को दर्शाया गया है । टूटी हुई रेखा 1 × 106 सेल इनपुट इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नाम जीआरएनए अनुक्रम
सीडी19 5'-GCTGTGCTGCAGGCCTCAA-3'
AAVS1 5'-GTCACCAATCCTTTCCCTAG-3'

तालिका 1: gRNA दृश्यों।

अभिकर्मकों वॉल्यूम प्रति 1 प्रतिक्रिया
P3 प्राथमिक सेल समाधान 16.4 एमएल
पूरक 1 3.6 एमएल
कुल 20 एमएल

तालिका 2: न्यूक्लियोफेक्शन रीएजेंट मिक्स की तैयारी।

या क़िस्‍म अनुक्रम उद्देश्य
सीडी19 फॉरवर्ड प्राइमर 5'-AAATTCAGGAGGGGGAAG-3' इनडेल विश्लेषण के लिए CD19 लोकस को बढ़ाना
सीडी19 रिवर्स प्राइमर 5'-GCGGACCTCTCTCTCCATG-3' इनडेल विश्लेषण के लिए CD19 लोकस को बढ़ाना
जंक्शन पीसीआर फॉरवर्ड प्राइमर 5'-GGACGAGCTTACAAGTAACG-3' जंक्शन पीसीआर
जंक्शन पीसीआर रिवर्स प्राइमर 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 जंक्शन पीसीआर

तालिका 3: प्राइमर का उपयोग किया जाता है।

या क़िस्‍म फ्लोरोफोर क्लोन
मानव विरोधी सीडी 19 पर्सीपी एचआईबी19
व्यवहार्यता डाई ईफ्लोर 780 -

तालिका 4: फ्लो साइटोमेट्री एंटीबॉडी और व्यवहार्यता डाई।

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Discussion

प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं में सटीक जीनोम इंजीनियरिंग हाल ही में9,10तक चुनौतीपूर्ण रही है । हमने पहले प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं9को इंजीनियर करने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करके प्रोटोकॉल प्रकाशित किए थे । यहां, हम बी-सेल अलगाव, विस्तार और इंजीनियरिंग के लिए बेहतर प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं ताकि सीडी 19 के कुशल KO के लिए या दस्तक देने के लिए ईजीएफपीकी अनुमति दी जा सके।

यहां हम प्रदर्शित करते हैं कि हमारा विस्तार प्रोटोकॉल संस्कृति में बी कोशिकाओं के तेजी से विस्तार को 7 दिनों में 44 गुना विस्तार(चित्रा 1)तक की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल जॉनसन एट अलद्वारा रिपोर्ट उन लोगों की तुलना में एक तेजी से विस्तार दर दिखाया और त्रिशंकु एट अल10 प्राथमिक बी कोशिकाओं के स्वस्थ और तेजी से विस्तार सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हर दो दिनों में ताजा सक्रियण कारकों के साथ माध्यम की भरपाई कर रहे है और यह सुनिश्चित करना है कि संस्कृति में कुल बी कोशिकाओं की संख्या 2 × १०६ सेल/एमएल से अधिक नहीं है ।

हमने यह भी पाया कि सीडी 19 KO के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली को पार करने के लिए हमारे बेहतर प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप उच्च CD19 KO दक्षता(चित्रा 2 और चित्रा 3)हुई । पिछले अध्ययन9की तरह, हमने 24 घंटे में सेल रिकवरी और व्यवहार्यता के बाद इलेक्ट्रोपॉशन में थोड़ी कमी देखी । यह इंगित करता है कि इलेक्ट्रोपाउरेशन प्राथमिक बी कोशिकाओं के समग्र कोशिका स्वास्थ्य को प्रभावित करता है; हालांकि, कोशिकाओं को अंततः ४८ घंटे के भीतर खुशहाली लौटने लगी (डेटा नहीं दिखाया) ।

इस इलेक्ट्रोपोरेटर प्रोटोकॉल का उपयोग करने का लाभ यह है कि हम नमूनों को बहुत तेज दर (1 मिनट से कम समय में 16 प्रतिक्रियाओं) पर इलेक्ट्रोपोरेट कर सकतेहैं,जबकि पिछले प्रोटोकॉल9,10 16 प्रतिक्रियाओं के लिए लगभग 10-12 मिनट लेते हैं। इसके अलावा, यह ट्रांसफैक्शन सिस्टम पिछले अध्ययनों9,10में मनाए गए इलेक्ट्रोपोरेटर के संभावित विद्युत चाप को समाप्त करता है। इसके अलावा, इस इंजीनियरिंग विधि को बड़े, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्यूवेट (डेटा नहीं दिखाए गए) का उपयोग करके बी कोशिकाओं की बड़ी संख्या के लिए बढ़ाया जा सकता है।

इष्टतम समग्र सेल स्वास्थ्य और KO क्षमता सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम: सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि बी-सेल विस्तार माध्यम तैयार है और उपयोग से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए पूर्व-संतुलन है। दूसरा, ट्रांसफेक्शन सब्सट्रेट की कुल मात्रा न्यूकोफेक्शन रीएजेंट के 20% (v/v) से अधिक नहीं होनी चाहिए । तीसरा, कोशिकाओं का विस्तार/इष्टतम परिणामों के लिए ४८ ± 2 घंटे के लिए सक्रिय किया जाना चाहिए । चौथा, इलेक्ट्रोपोरेटर में रखने से पहले इलेक्ट्रोपॉजेशन क्यूवेट को धीरे से टैप करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ट्रांसफैक्शन रिएक्शन सॉल्यूशन क्यूवेट के नीचे को कवर करता है। पांचवां, आरटी में केवल 15 मिनट के लिए क्यूवेट में इलेक्ट्रोपोरेट कोशिकाओं को आराम करना सुनिश्चित करें; बहुत लंबे समय तक इलेक्ट्रोपाउरेशन के बाद नाभिक में कोशिकाओं को छोड़ना समग्र कोशिका अस्तित्व को नुकसान पहुंचा सकता है। छठा, 30 मिनट से अधिक समय तक क्यूवेट में मीडिया के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना सुनिश्चित करें। सातवां, पहले 48 घंटे के लिए 1 मिलीएल में 106 इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को रखने से कोशिकाओं को कम घनत्व (डेटा नहीं दिखाए गए) पर उन्हें खेती करने की तुलना में अधिक तेजी से ठीक होने में मदद मिलती है। अंत में, Cas9 mRNA या Cas9 प्रोटीन का उपयोग करने से समान संपादन क्षमता (डेटा नहीं दिखाया जाएगा); हालांकि, हमने सुविधा और लागत के लिए Cas9 mRNA का उपयोग किया।

CRISPR/Cas9 का उपयोग करते समय दो प्रमुख चिंताएं ऑफ-टारगेट इफेक्ट्स और क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन हैं । लक्ष्य अनुक्रम के लिए sgRNA के बेमेल आधार जोड़े की वजह से ऑफ लक्ष्य प्रभाव, जीनोम पर कई संभव बाध्यकारी साइटों के लिए नेतृत्व और कई, अवांछित जीन कोस बनाने के लिए । इसलिए, इस समस्या को कम करने के लिए ऑन-टारगेट स्कोर के साथ-साथ अनुमानित ऑफ-टारगेट स्कोर को ध्यान में रखा जाना चाहिए। क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन ऑफ-टारगेट प्रभावों के कारण या कई जीनों को खटखटाने के कारण हो सकता है। यह प्रयोगात्मक और चिकित्सकीय रूप से भयावह घटनाओं का कारण बन सकता है। बेस एडिटर12 एक न्यूक्लियोटाइड (दो वर्ग: साइटोसाइन बेस एडिटर और एडेनिन बेस एडिटर) को स्प्लिसिंग तत्व को बाधित करने, समय से पहले स्टॉप कोडन बनाने, या एक बिंदु उत्परिवर्तन बनाने के लिए बदलते हैं, जिससे डीएसबी के बिना जीन KO को लक्षित किया जाता है (कहीं और12की समीक्षा की जाती है)। इस प्रकार, आधार संपादन दृष्टिकोण का उपयोग क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन को दरकिनार करने के लिए एकल या बहु-जीन कोस के लिए किया जा सकता है।

हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि CRISPR/Cas9, RAAV6 के साथ मिलकर, AAVS1 लोकस में साइट-विशिष्ट KI और ईजीएफपी की अभिव्यक्ति में कुशलतापूर्वक मध्यस्थता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमने इंजीनियरिंग के बाद कम से कम 12 दिनों के लिए ईजीएफपी अभिव्यक्ति देखी। हमने दो ईजीएफपी-सकारात्मक आबादी को भी देखा: 12 दिन(चित्रा 5A)पर केवाई नमूने में एक उच्च और मध्यवर्ती-ईजीएफपी अभिव्यक्ति, जबकि वेक्टर-केवल नमूने ने मध्यवर्ती ईजीएफपी अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं का न्यूनतम प्रतिशत दिखाया। हम अटकलें लगाते हैं कि यह "उच्च और मध्यवर्ती आबादी" घटना वेक्टर के biallelic एकीकरण के कारण है। इस परिकल्पना की पुष्टि करने के लिए मध्यवर्ती और उच्च-ईजीएफपी कोशिकाओं की पीसीआर13 का उपयोग करके आगे की जांच की जा सकती है । एक वेक्टर के रूप में एएवी का उपयोग करने पर दो चेतावनी: सबसे पहले, AAV वैक्टर एक छोटे से कार्गो क्षमता है, ४.७ किलोबेस तक, मुद्दों के कारण जब एक बड़े जीन में दस्तक दे । होमोलॉजी हथियारों के आकार को कम करने से एक बड़े जीन के आवास की अनुमति मिलेगी, जो बदले में केआईआई दक्षता (डेटा नहीं दिखाया गया) को कम करेगा। वैकल्पिक रूप से, कई जीन-लोडिंग वैक्टर के एक साथ या अनुक्रमिक एकीकरण का उपयोग14,15किया जा सकता है। अध्ययनों ने इम्यूनोसैप्यूटेंट एनिमल मॉडल16,17में एएवी-ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और निकासी की सूचना दी है। वैकल्पिक रूप से, इस समस्या को दरकिनार करने के लिए एक गैर-वायरल-आधारित दाता एचडीआर टेम्पलेट का पता लगाया जा सकता है।

संक्षेप में, हमने बी कोशिकाओं के अलगाव, विस्तार और इंजीनियरिंग की व्यापक, कदम-दर-कदम प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया है जिसके परिणामस्वरूप उच्च जीन संशोधन क्षमता हुई है । इस इंजीनियरिंग विधि जीन KO के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और बी कोशिकाओं में जीन के कार्यों का अध्ययन करने के लिए । इसके अलावा, इस विधि का उपयोग संक्रमण के खिलाफ लड़ने के लिए एक पुनः संयोजन एंटीबॉडी व्यक्त करने के लिए बी कोशिकाओं को इंजीनियर करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, इस विधि को इंजीनियर बी कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है ताकि चिकित्सीय एंजाइमों को व्यक्त और स्रावित किया जा सके जिसे एंजायमोपैथी के इलाज के लिए ऑटोलॉगस सेल-आधारित चिकित्सा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

एक पेटेंट बनाने और जीनोम का उपयोग करने के तरीकों पर दायर किया गया है M.J.J.J., K.L., और बी एस.M के साथ बी कोशिकाओं को संपादित आविष्कारक के रूप में । बी एस.M के लिए एक सलाहकार है और Immusoft इंक Immusoft इंक में शेयर का मालिक है बी एस.M की प्रयोगशाला में अनुसंधान प्रायोजित किया है ।

Acknowledgments

इस काम को बच्चों के कैंसर अनुसंधान कोष (CCRF) और NIH R01 AI146009 से बी एस.M के लिए वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug IDT 1081059 smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer Quality Biological 118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA Trilink Biotechnology L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg Invivogen TLRL-2006-5 different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL STEMCELL Technology 7930
CTS Immune Cell SR Thermo Fisher Scientific A2596101
EasySep human B cells isolation kit STEMCELL Technology 17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780 eBiosciences 65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free R&D Systems CCM031 B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube Corning 352059
Fetal Bovine Serum (FBS) R&D Systems S11550 For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps BioExpress T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS GE lifesciences SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit Lonza AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit Lonza AAF-1002X
Mega CD40 Ligand Enzo Life Sciences ALX-522-110-C010
Mr. Frosty Sigma-Aldrich C1562-1EA For freezing cells
Pen/Strep 100X Sigma-Aldrich TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19 biolegend 302228 smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) Vigene Biosciences N/A large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug R&D Systems 217-IL-250 different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug R&D Systems 247-ILB-025 different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet STEMCELL Technology 18001 different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer Fisher Scientific BP2476100

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References

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CRISPR/Cas9 का उपयोग कर प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के जीनोम इंजीनियरिंग
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Laoharawee, K., Johnson, M. J., Lahr, W. S., Peterson, J. J., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (165), e61855, doi:10.3791/61855 (2020).

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