Summary

הכנת פיגומים בכליות Decellularized בחולדות

Published: March 18, 2021
doi:

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה לפיתוח פיגום באמצעות כליות חולדה decellularized. הפרוטוקול כולל תהליכי דקלולריזציה ורסקולריזציה כדי לאשר זמינות ביולוגית. Decellularization מבוצעת באמצעות טריטון X-100 ונתרן דודקיל סולפט.

Abstract

הנדסת רקמות היא משמעת חדשנית בביו-רפואה. טכניקות תרבות התא ניתן ליישם עבור התחדשות של רקמות ואיברים תפקודיים להחליף איברים חולים או פגומים. פיגומים נדרשים כדי להקל על הדור של איברים תלת מימדיים או רקמות באמצעות תאי גזע מובחנים vivo. בדו”ח זה, אנו מתארים שיטה חדשנית לפיתוח פיגומים וסקולריים באמצעות כליות חולדה decellularized. במחקר זה נעשה שימוש בחולדות ספראג-דולי בנות שמונה שבועות, והפרין הוזרק ללב כדי להקל על הזרימה לכלי הכליה, מה שאיפשר להפרין לחלחל לכלי הכליה. חלל הבטן נפתח והכליה השמאלית נאספה. הכליות שנאספו היו perfused במשך 9 שעות באמצעות חומרי ניקוי, כגון טריטון X-100 ונתרן דודקיל סולפט, כדי decellularize את הרקמה. פיגומים בכליות Decellularized נשטפו בעדינות עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין והפרין כדי להסיר פסולת הסלולר ושאריות כימיות. השתלת תאי גזע עם פיגומי כלי דם decellularized צפוי להקל על הדור של איברים חדשים. לכן, פיגומים vascularized עשוי לספק בסיס להנדסת רקמות של שתלי איברים בעתיד.

Introduction

טכניקות תרבית תאים מיושמות עבור התחדשות של רקמות ואיברים תפקודיים להחליף איברים חולים או פגומים. השתלת איברים אלוגנית היא כיום הטיפול הנפוץ ביותר לנזק בלתי הפיך לאיברים; עם זאת, גישה זו דורשת שימוש בדיכוי המערכת החיסונית כדי למנוע דחייה של האיבר המושתל. יתר על כן, למרות ההתקדמות באימונולוגיה של ההשתלה, 20% ממקבלי ההשתלה עלולים לחוות דחייה חריפה בתוך 5 שנים, ובתוך 10 שנים לאחר ההשתלה, 40% מהמטופלים עלולים לאבד את השתל המושתל שלהם או למות1.

ההתקדמות בטכנולוגיות להנדסת רקמות הניבה פרדיגמה חדשה להשתלת איברים חדשים ללא דחייה חיסונית באמצעות תאי גזע מובחנים. לאחר בידול תאי גזע, יש צורך בפיגום, הנקרא מטריצה חוץ-תאית סינתטית, כדי להקל על יצירת איברים תלת מימדיים ולאפשר לרקמה החדשה לשגשג בתוך המטופל. פיגומים מאיברים מקומיים decellularized יש יתרונות, כולל סביבה יעילה יותר להקמת תאים ושיפור התפשטות תאי גזע, אם כי מנגנונים אלה לא הובהרו במלואם2. בפרט, הכליה היא איבר מתאים לייצור פיגומים כי יש לה זרימת דם בשפע נישה להקמת תאי גזע. בנוסף, בגלל המבנה המורכב של הכליה, קשה לחדש באופן מלאכותי כליות להשתלת איברים.

בדו”ח זה, אנו מציגים שיטה של פיתוח פיגומים vascularized באמצעות איברים decellularized במודל חולדה כדי להקל על מחקרים עתידיים בבעלי חיים למטרות הנדסת רקמות.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי הנהלת האוניברסיטה הלאומית לרפואה של פוסאן ונערך בהתאם להנחיות אתיות לשימוש ולטיפול בבעלי חיים. (תעודה מס’ 2017-119). לפני כל מחקר בבעלי חיים, יש לקבל אישור מוסדי.הערה: כל המכשירים/ציוד/ציוד/ריאגנטים הכירורגיים וההרדמה המומלצים להצגה כירורגית מוצלחת והדמיה של איברי בטן מפו…

Representative Results

המורפולוגיה הגולמית של כליות חולדה הייתה אדומה כהה (איור 1A). לאחר דקלולריזציה, הכליה הפכה חיוורת ושקוף (איור 1D). שאריות DNA גנומי הוערך עם ערכה מסחרית על פי הוראות היצרן, בפיגומים כליות decellularized לעומת זה בכליות מקומיות (שליטה). ניתוח כמותי אישר כי DNA גנומי רקמה כ?…

Discussion

פרוטוקולים שונים שימשו decellularization של איברים ורקמות אחרות. פרוטוקול decellularization האופטימלי צריך לשמר את הארכיטקטורה התלת מימדית של המטריצה החוץ תאית (ECM). באופן כללי, פרוטוקולים כאלה מורכבים lysing קרום התא על ידי עיבוד פיזי או פתרונות יוניים, ניתוק הציטופלסמה והגרעין מן ECM על ידי עיבוד אנזימטי או ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק מכון מחקר ביו-רפואי מבית החולים האוניברסיטאי הלאומי פוסאן.

Materials

1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions Becton Dickinson 305217
10-0 ethilon for vessel anastomosis Ethicon 9032G
25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) Becton Dickinson 305145
3-0 PDS incision closure rat Ethicon Z316H
3-0 Prolene incision closure rat Ethicon 8832H
3-0 silk spool vascular access/ligation in rat Braintree Scientific SUT-S 110
4-0 PDS incision closure mouse Ethicon Z773D
4-0 Prolene incision closure mouse Ethicon 8831H
5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse Braintree Scientific SUT-S 106
Fine Scissors to cut fascia/connective tissue Fine Science Tools 14058-09
Halsey needle holder Fine Science Tools 12001-13
Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut Fine Science Tools 13018-14
Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft Braintree Scientific .023" × .038”
Schwartz microserrefine vascular clamps Fine Science Tools 18052-01 (straight)
18052-03 (curved)
Surgical Scissors to cut skin Fine Science Tools 14002-12
Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy Fine Science Tools 15003-08

References

  1. Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
  2. Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
  3. Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
  4. Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
  5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
  6. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  7. Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
  8. Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
  9. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  10. Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
  11. Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  12. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kim, E. H., Kim, S. S., Kim, J. I., Cheon, J. M., Kim, J. H., Lee, J. C., Wang, S. G., Choi, K. U. Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats. J. Vis. Exp. (169), e61856, doi:10.3791/61856 (2021).

View Video