Summary

Подготовка децеллюляризованных каркасов почек у крыс

Published: March 18, 2021
doi:

Summary

Этот протокол вводит метод разработки каркаса с использованием децеллюляризированных почек крыс. Протокол включает процессы децеллюляризации и рецеллюляризации для подтверждения биодоступности. Децеллюляризацию проводят с использованием Тритона Х-100 и додецилсульфата натрия.

Abstract

Тканевая инженерия является передовой дисциплиной в биомедицине. Методы культивирования клеток могут применяться для регенерации функциональных тканей и органов для замены больных или поврежденных органов. Каркасы необходимы для облегчения генерации трехмерных органов или тканей с использованием дифференцированных стволовых клеток in vivo. В этом отчете мы описываем новый метод разработки васкуляризированных каркасов с использованием децеллюляризованных почек крыс. В этом исследовании использовались восьминедельные крысы Sprague-Dawley, и гепарин вводили в сердце, чтобы облегчить поступление в почечные сосуды, позволяя гепарину перфузировать в почечные сосуды. Брюшную полость открыли, а левую почку собрали. Собранные почки перфузили в течение 9 ч с использованием моющих средств, таких как Triton X-100 и додецилсульфат натрия, для децеллюляризации ткани. Затем децеллюляризованные каркасы почек осторожно промывали 1% пенициллином /стрептомицином и гепарином для удаления клеточного мусора и химических остатков. Ожидается, что трансплантация стволовых клеток с децеллюляризованными сосудистыми каркасами облегчит генерацию новых органов. Таким образом, васкуляризированные каркасы могут обеспечить основу для тканевой инженерии трансплантатов органов в будущем.

Introduction

Методы культивирования клеток применяются для регенерации функциональных тканей и органов для замены больных или поврежденных органов. Аллогенная трансплантация органов в настоящее время является наиболее распространенным методом лечения необратимых повреждений органов; однако такой подход требует использования иммуносупрессии для предотвращения отторжения трансплантированного органа. Более того, несмотря на достижения в иммунологии трансплантата, 20% реципиентов трансплантата могут испытывать острое отторжение в течение 5 лет, а в течение 10 лет после трансплантации 40% реципиентов могут потерять свой пересаженный трансплантат или умереть1.

Достижения в технологиях тканевой инженерии привели к новой парадигме трансплантации новых органов без иммунного отторжения с использованием дифференцированных стволовых клеток. После дифференцировки стволовых клеток каркас, называемый синтетическим внеклеточным матриксом, необходим для облегчения генерации трехмерных органов и обеспечения процветания новой ткани в реципиенте. Каркасы из децеллюляризованных нативных органов имеют преимущества, в том числе более эффективную среду для созданияклеток и усиления пролиферации стволовых клеток, хотя эти механизмы не были полностью выяснены2. В частности, почка является подходящим органом для генерации каркасов, поскольку она имеет обильную циркуляцию и нишу для создания стволовых клеток. Кроме того, из-за сложной структуры почки трудно искусственно регенерировать почки для трансплантации органов.

В этом отчете мы представляем метод разработки васкуляризированных каркасов с использованием децеллюляризованных органов в модели крысы для облегчения будущих исследований на животных в целях тканевой инженерии.

Protocol

Данное исследование было одобрено администрацией Пусанского национального медицинского университета и проводилось в соответствии с этическими рекомендациями по использованию и уходу за животными. (свидетельство No 2017-119). Перед любыми исследованиями на животных должно быть получено ?…

Representative Results

Грубая морфология почек крыс была темно-красной(рисунок 1А). После децеллюляризации почка стала бледной и полупрозрачной(рисунок 1D). Остаточную геномную ДНК оценивали с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя, в децеллю…

Discussion

Для децеллюляризации органов и других тканей использовались различные протоколы. Оптимальный протокол децеллюляризации должен сохранять трехмерную архитектуру внеклеточного матрикса (ECM). В общем, такие протоколы состоят из лизирования клеточной мембраны путем физической обработки…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантом Института биомедицинских исследований от больницы Пусанского национального университета.

Materials

1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions Becton Dickinson 305217
10-0 ethilon for vessel anastomosis Ethicon 9032G
25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) Becton Dickinson 305145
3-0 PDS incision closure rat Ethicon Z316H
3-0 Prolene incision closure rat Ethicon 8832H
3-0 silk spool vascular access/ligation in rat Braintree Scientific SUT-S 110
4-0 PDS incision closure mouse Ethicon Z773D
4-0 Prolene incision closure mouse Ethicon 8831H
5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse Braintree Scientific SUT-S 106
Fine Scissors to cut fascia/connective tissue Fine Science Tools 14058-09
Halsey needle holder Fine Science Tools 12001-13
Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut Fine Science Tools 13018-14
Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft Braintree Scientific .023" × .038”
Schwartz microserrefine vascular clamps Fine Science Tools 18052-01 (straight)
18052-03 (curved)
Surgical Scissors to cut skin Fine Science Tools 14002-12
Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy Fine Science Tools 15003-08

References

  1. Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
  2. Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
  3. Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
  4. Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
  5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
  6. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  7. Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
  8. Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
  9. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  10. Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
  11. Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  12. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kim, E. H., Kim, S. S., Kim, J. I., Cheon, J. M., Kim, J. H., Lee, J. C., Wang, S. G., Choi, K. U. Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats. J. Vis. Exp. (169), e61856, doi:10.3791/61856 (2021).

View Video