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Neuroscience

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 1, 3
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

Summary

Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.

Abstract

Le cellule olfattive di glia ensheathing (OEG) sono localizzate dalla mucosa olfattiva a e nello strato nervoso olfattivo (ONL) del bulbo olfattivo. Per tutta la vita adulta, sono fondamentali per la crescita assonale dei neuroni olfattivi appena generati, dalla lamina propria all'ONL. A causa delle loro proprietà pro-rigenerative, queste cellule sono state utilizzate per favorire la rigenerazione assonale nel midollo spinale o nei modelli di lesione del nervo ottico.

Presentiamo un modello in vitro per testare e misurare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neurale. In questo modello, l'OEG umano reversibilmente immortalato (ihOEG) è coltivato come monostrato, le retine vengono estratte da ratti adulti e i neuroni ganglionari retinali (RGN) sono coculati sul monostrato OEG. Dopo 96 ore, i marcatori assonali e somatodendritici nelle RGN vengono analizzati per immunofluorescenza e il numero di RGN con assone e la lunghezza assionale media / neurone vengono quantificati.

Questo protocollo ha il vantaggio rispetto ad altri saggi in vitro che si basano su neuroni embrionali o postnatali, che valuta le proprietà neuroregenerative OEG nel tessuto adulto. Inoltre, non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.

Introduction

I neuroni del sistema nervoso centrale adulto (SNC) hanno una capacità rigenerativa limitata dopo lesioni o malattie. Una strategia comune per promuovere la rigenerazione del SNC è il trapianto, nel sito delle lesioni, di tipi cellulari che inducono la crescita assonale come cellule staminali, cellule di Schwann, astrociti o cellule olfattive glia (OEG)1,2,3,4,5.

OEG deriva dalla cresta neurale6 e si trova nella mucosa olfattiva e nel bulbo olfattivo. Nell'adulto, i neuroni sensoriali olfattivi muoiono regolarmente a causa dell'esposizione ambientale e vengono sostituiti da neuroni appena differenziati. OEG circonda e guida questi nuovi assoni olfattivi per entrare nel bulbo olfattivo e stabilire nuove sinapsi con i loro obiettivi nel CNS7. A causa di questi attributi fisiologici, l'OEG è stato utilizzato in modelli di lesione del SNC come midollo spinale o lesione del nervo ottico e le sue proprietà neuroregenerative e neuroprotettivediventano dimostrate 8,9,10,11. Diversi fattori sono stati identificati come responsabili delle caratteristiche pro-rigenerative di queste cellule, tra cui la produzione o la secrezione di fattori di crescita neurotrofica e assonale12,13,14.

Date le limitazioni tecniche per espandere le cellule OEG primarie, abbiamo precedentemente stabilito e caratterizzato linee clonali OEG umane immortalate reversibili (ihOEG), che forniscono una fornitura illimitata di OEG omogeneo. Queste cellule ihOEG derivano da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie. Sono stati immortalati per trasduzione della subunità catalitica telomerasi (TERT) e dell'oncogene Bmi-1 e modificati con il virus SV40 grande antigene T15,16,17,18. Due di queste linee cellulari ihOEG sono Ts14, che mantiene la capacità rigenerativa delle colture originali e Ts12, una linea rigenerativa bassa che viene utilizzata come basso controllo di rigenerazione in questi esperimenti18.

Per valutare la capacità dell'OEG di favorire la rigenerazione assonale dopo la lesione neurale, sono stati implementati diversi modelli in vitro. In questi modelli, l'OEG viene applicato a colture di diversa origine neuronale e vengono saggiate la formazione e l'allungamento della neurite, in risposta alla cocoltura gliale. Esempi di tali fonti neuronali sono i neuroni corticali del ratto neonatale19, le ferite da graffio eseguite sui neuroni embrionali del ratto dal tessutocorticale 20,le espianto retinichedel ratto 21, i neuroni postnatali ipotalamici o ippocampali del ratto22,23, neuroni ganglionali della radice dorsale del ratto postnatale24, neuroni del tratto corticospinale del topo postnatale25,neuroni NT2umani 26o neuroni corticali cerebrali postnatali su colture reattive simili a cicatrici astrociti27.

In questi modelli, tuttavia, il test di rigenerazione si basa su neuroni embrionali o postnatali, che hanno una plasticità intrinseca che è assente nei neuroni adulti feriti. Per superare questo inconveniente, presentiamo un modello di rigenerazione assonale adulta in coculture di linee OEG con neuroni ganglionali retini adulti (RGN), basato su quello originariamente sviluppatoda Wigley etal. In breve, il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti e digerito con papaina. La sospensione cellulare retinica viene quindi placcata su coverlips trattate con polilisina o su monostrati Ts14 e Ts12. Le colture vengono mantenute per 96 ore prima di essere fissate e quindi viene eseguita l'immunofluorescenza per i marcatori assonale (proteine MAP1B e NF-H)34 e somatodendritica (MAP2A e B)35 marcatori. La rigenerazione assonale è quantificata come percentuale di neuroni con assone, rispetto alla popolazione totale di RGN e l'indice di rigenerazione assonale è calcolato come lunghezza assonale media per neurone. Questo protocollo non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.

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Protocol

NOTA: La sperimentazione animale è stata approvata dai comitati nazionali e istituzionali di bioetica.

1. cultura ihOEG (Ts12 e Ts14)

NOTA: Questa procedura viene eseguita in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza per la coltura tissutale.

  1. Preparare un supporto di coltura OEG ME10 da 50 mL come previsto nella tabella 1.
  2. Preparare 5 ml di DMEM/F12-FBS, come previsto nella tabella 1, in un tubo conico da 15 ml.
  3. Riscaldare entrambi i supporti a 37 °C in un bagno d'acqua pulita, per 15 minuti.
  4. Scongelare le fiale delle cellule Ts12 e Ts14 a 37 °C in un bagno d'acqua pulita.
  5. Resuspend e aggiungere celle al supporto di coltura DMEM/F12-FBS preparato nel passaggio 2.
  6. Centrifuga per 5 min a 200 x g.
  7. Aspira al supernatante.
  8. Aggiungere 500 μL di mezzo ME10 e rimosogliere il pellet.
  9. Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con 3 mL di ME10 e aggiungere la sospensione cellulare, dropwise.
  10. Spostarsi per distribuire le celle in modo uniforme sulla piastra.
  11. Cellule di coltura a 37 °C nel 5% di CO2.
    NOTA: Dopo aver raggiunto la confluenza, deve essere fatto almeno un altro passaggio per ottimizzare le cellule per la cocoltura. È necessaria una confluenza del 90% prima di seminarli sulle copertine per la cocoltura. Un p-60 confluente ha un numero di cella medio di 7 x 105 per Ts14 e 2,5 x 106 per le linee cellulari Ts12. Le linee cellulari Ts12 e Ts14 devono essere passaggio ogni 2-3 giorni.

2. Preparazione di ihOEG (Ts12 e Ts14) per il saggio

NOTA: Questo passaggio deve essere fatto 24 ore prima della dissezione rgn e della cocoltura.

  1. Trattare 12 mm Ø coprelips con 10 μg/mL poli-L-lisina (PLL) per 1 h.
    NOTA: Le coverlips possono essere lasciate durante la notte in soluzione PLL.
  2. Lavare i copripelli con 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS), tre volte.
  3. Staccare le cellule Ts12 e Ts14 ihOEG dal piatto di coltura cellulare p60.
    1. Aggiungere 4 ml di mezzo di coltura DMEM/F12-FBS(tabella 1)a un tubo conico da 15 ml. Riscaldare a 37 °C in un bagno d'acqua pulito.
    2. Rimuovere il mezzo dalle piastre e lavare le celle con 1 mL di 1x PBS-EDTA, una volta.
    3. Aggiungere 1 mL di tripside-EDTA alle cellule OEG e incubare per 3-5 min a 37 °C, 5% CO2.
    4. Raccogliere le celle con una pipetta p1000 e trasferirle su un supporto preparato nel passaggio 3.1.
    5. Centrifuga per 5 min a 200 x g.
    6. Aspira al supernatante.
    7. Aggiungere 1 mL di mezzo ME10 e rimospend il pellet.
    8. Contare il numero di cellulare in un emocitometro.
  4. Semina 80.000 cellule Ts14 o 100.000 cellule Ts12/pozzo sui copripasci in piastre da 24 pozzi in 500 μL di mezzo ME10.
  5. Cellule di coltura a 37 °C nel 5% di CO2, per 24 h.

3. Dissezione del tessuto retinale

NOTA: i ratti Wistar maschi di 2 mesi sono usati come fonte RGN. Due retine (un topo) per 20 pozzi di un piatto cellulare da 24 po '. Materiale chirurgico autoclave prima dell'uso. Il kit di dissociazione papaina viene acquistato commercialmente(Tavolo dei Materiali). Seguire le istruzioni del provider per la ricostituzione. Ricostituire L,L-2-ammino-5-acido fosfonovalerico (APV) in 5 mM e preparare le aliquote.

  1. Il giorno del saggio, preparare i seguenti media.
    1. Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con 5 mL di EBSS freddo (fiala 1 del kit di dissociazione della papaina).
    2. Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con fiala ricostituita 2 (papaina) del kit di dissociazione della papaina più 50 μL di APV.  Aggiungere quindi 250 μL di flaconcino ricostituito 3 (DNasi più 5 μL di APV).
    3. In un mix di tubi sterili 2,7 ml di flaconcino 1 con 300 μL di flaconcino 4 (inibitore della proteasi albumina-ovomucoide). Aggiungere 150 μL di flaconcino 3 (DNasi) più 30 μL di APV.
    4. Preparare 20 mL di mezzo Neurobasal-B27 (NB-B27) come previsto nella tabella 1.
  2. Sacrificare un topo per asfissia con CO2.
  3. Rimuovere la testa per decapitazione con ghigliottina; posizionarlo in una piastra di Petri da 100 mm e spruzzare la testa con etanolo al 70% prima di posizionare in una cappa di flusso laminare.
  4. Tagliare i baffi del topo con le forbici in modo che non interferiscano con la manipolazione degli occhi.
  5. Afferrare il nervo ottico con pinze per estrarre il bulbo oculare abbastanza da poter fare un'incisione sull'occhio con un bisturi.
  6. Rimuovere la lente e l'umorismo vitreo ed estrarre la retina (tessuto arancione), mentre gli strati rimanenti dell'occhio rimangono all'interno (incluso lo strato epiteliale del pigmento).
  7. Posizionare la retina nel piatto di coltura cellulare p60 preparato al passaggio 3.1.1.
  8. Trasferire la retina nel piatto di coltura cellulare p60 preparato al passaggio 3.1.2 e tagliarla con il bisturi in piccoli pezzi di dimensioni approssimative < 1 mm.
  9. Trasferimento in un tubo di plastica da 15 ml.
  10. Incubare il tessuto per 30 min, in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO2, con agitazione ogni 10 min.
  11. Dissociare i ciuffi cellulari tubazioni su e giù con una pipetta Pasteur in vetro.
  12. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min.
  13. Scartare il supernatante e inattivare la papaina, rimescolare il pellet cellulare nella soluzione preparata al passaggio 3.1.3. (1,5 mL per 2 occhi).
  14. Pipettare con cura questa sospensione cellulare in 5 mL di flaconcino ricostituito 4.
  15. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
  16. Durante la centrifugazione, rimuovere completamente il mezzo ME-10 dalla piastra cellulare del pozzo OEG 24 (precedentemente preparata nel passaggio 2) e sostituirlo con 500 μL di mezzo NB-B27 per pozzo.
  17. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 2 mL di mezzo NB-B27.
  18. Piastra 100 μL di sospensione cellulare retinica, per pozzo della piastra m24, su coprispalla monostrati OEG trattati con PLL.
  19. Mantenere le colture a 37 °C con il 5% di CO2 per 96 h in mezzo NB-B27.

4. Immunostaining

  1. Dopo 96 ore, fissare le cellule per 10 minuti aggiungendo lo stesso volume del 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS al mezzo di coltura (600 μL) (concentrazione finale PFA 2%).
  2. Rimuovere il supporto e il PFA dalla piastra a 24 poliwell e aggiungere ancora una volta 500 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x PBS. Incubare per 10 minuti.
  3. Scartare il fissatore e lavare 3 volte con 1x PBS per 5 minuti.
  4. Blocco con 0,1% Tritone X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) per 30-40 min.
  5. Preparare gli anticorpi primari nel tampone PBS-TS come segue: SMI31 (contro le proteine MAP1B e NF-H) anticorpo monoclonale (1:500). 514 (riconosce le proteine MAP2A e B) antisiero policlonale coniglio (1:400).
  6. Aggiungere anticorpi primari alle coculture e incubare durante la notte a 4 °C.
  7. Il giorno dopo, scartare gli anticorpi e lavare le coverlips con 1x PBS, 3 volte, per 5 minuti.
  8. Preparare gli anticorpi secondari nel tampone PBS-TS come segue: Per SMI-31, anti-mouse Alexa Fluor 488 (1:500). Per 514, anti-coniglio Alexa-594 (1:500).
  9. Incubare le cellule con i corrispondenti anticorpi secondari fluorescenti per 1 h, a RT, al buio.
  10. Lavare i copripavimenti con 1x PBS, 3 volte, per 5 minuti, al buio.
  11. Infine, montare i copripasto con supporto di montaggio(Tavolo deiMateriali) e mantenere a 4 °C.
    NOTA: Quando necessario, possono essere eseguiti nuclei fluorescenti contenenti DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindolo). Prima del montaggio, incubare le cellule per 10 minuti al buio con DAPI (10 μg/mL in 1x PBS). Lavare le coverlips 3 volte con 1x PBS e infine montare i copripavimenti con il supporto di montaggio.

5. Quantificazione della rigenerazione assionale

NOTA: I campioni sono quantificati nell'obiettivo 40x di un microscopio a epifluorescenza. Un minimo di 30 immagini dovrebbero essere scattate su campi casuali, con almeno 200 neuroni, da quantificare per ogni trattamento. Ogni esperimento deve essere ripetuto almeno tre volte.

  1. Quantificare la percentuale di neuroni con assone (neurite positiva SMI31) rispetto alla popolazione totale di RGN (identificata con MAP2A/B 514 immunostaining positivo del corpo neuronale e dei dendriti).
  2. Quantificare l'indice di rigenerazione assonale o la lunghezza assionale media (μm/neurone). Questo parametro è definito come la somma delle lunghezze (in μm) di tutti gli assoni identificati, divisi per il numero totale di neuroni contati, indipendentemente dal fatto che presentavano o meno un assone. La lunghezza assonale è determinata utilizzando il plugin NeuronJ del software di immagini ImageJ (NIH-USA).
  3. Calcola la media, la deviazione standard e la significatività statistica utilizzando il software appropriato.

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Representative Results

In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro per testare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neuronale. Come mostrato nella Figura 1, la sorgente OEG è una linea cellulare clonale OEG immortalata reversibile -Ts14 e Ts12-, che deriva da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie15,17,18. Il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti, digerito e la sospensione dei neuroni ganglionari retini (RGN) viene placcata su coverlips trattati con PLL o su monostrati ihOEG, Ts14 o Ts12. Le colture vengono mantenute per 96 ore prima di essere fissate. I marcatori assonali e somatodendritici vengono analizzati mediante immunofluorescenza e viene quantificata la rigenerazione assonale.

Ts14 L'identità OEG è valutata mediante immunodeficienza con marcatori descritti come espressi in glia ensheathing (Figura 2), come S100 β (Figura 2A) e vimentina (Figura 2B); L'espressione GFAP è stata analizzata anche per eliminare la contaminazione da astrociti (Figura 2C). Come mostrato, Ts14 ha espresso S100 β e vimentin ma non GFAP.

Nel saggio di rigenerazione assionale, la capacità rigenerativa di Ts14 viene confrontata con Ts12 nelle coculture RGN-OEG, utilizzando il substrato PLL come controllo negativo (Figura 3). Sia la percentuale di cellule con assoni che la lunghezza media degli assoni rigenerati erano significativamente più alte nei neuroni coculati sui monostrati Ts14, rispetto ai neuroni placcati su cellule Ts12 o PLL (Figura 3D,E). Le immagini rappresentative mostrano una mancanza di capacità di RGN di rigenerare i propri assoni su celle PLL o Ts12 (Figura 3A,B), mentre Ts14 stimola la crescita degli assoni in RGN (3C).

Figure 1
Figura 1: Diagramma dei neuroni ganglionali retinali del ratto con cocultura delle cellule glia olfattive ensheathing, come modello di rigenerazione assonale adulta. Linee cellulari clonali OEG (ihOEG) umane immortalate -Ts12 e Ts14- derivate da colture primarie da bulbi olfattivi. I neuroni ganglionali retini di ratti adulti sono placcati su coverlips trattati con PLL (controllo negativo) o su monostrati Ts14 o Ts12. Le colture vengono mantenute per 96 ore prima che siano fisse e i marcatori assonali e somatodendritici vengono analizzati per immunofluorescenza. La percentuale di neuroni con assone e lunghezza/neurone assonale media è quantificata per il saggio RGN rigenerazione assonale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Identità della linea cellulare ihOEG Ts14. Immagini di immunofluorescenza di Ts14 in coltura, etichettate con β anti-S100 (pannello A, verde) e vimentina (pannello B, rosso). L'espressione GFAP (pannello C, rosso) è stata analizzata anche per eliminare la contaminazione da astrociti. I nuclei sono macchiati di DAPI (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Saggio per la rigenerazione assonale nelle coculture di linee OEG con neuroni ganglionali retini adulti (RGN). (A–C) Immagini di immunofluorescenza che mostrano l'etichettatura somatodendritica con 514 anticorpi, che riconosce le proteine associate ai microtubuli MAP2A e B, in rosso, e con anticorpo SMI31 specifico per axon in verde, contro le proteine MAP1B e NF-H. Le frecce verdi indicano assoni RGN (SMI31-positivi: verdi) e le frecce gialle indicano corpi neuronali e dendriti (514 positivi: rosso e giallo). (D,E) I grafici mostrano la deviazione media e standard della percentuale di neuroni che mostrano assoni e l'indice di rigenerazione assonale, un parametro che riflette la lunghezza assionale media (μm) degli assoni per neurone. Un minimo di 30 immagini (40x) sono state scattate su campi casuali e quantificate per ogni campione di cella. Sono stati eseguiti esperimenti in triplice copia, da tre ratti diversi (N = 3), tessuto retinale raggruppato da entrambi gli occhi, con duplicati per ogni condizione sperimentale (ogni popolazione di glia testata). Gli asterischi indicano la significatività statistica: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, NS: non significatività (confronti di test Tukey ANOVA e post hoc tra parametri quantificati per Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL e Ts12 vs PLL). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il trapianto OEG nei siti di lesione del SNC è considerato una terapia promettente per la lesione del SNC a causa delle sue proprietà pro-neuroregenerative costitutive7,8,9. Tuttavia, a seconda della sorgente tissutale — mucosa olfattiva (OM-OEG) rispetto al bulbo olfattivo (OB-OEG) — o dell'età del donatore, esistono notevoli variazioni in talecapacità 26,31,33,36. Pertanto, è importante avere un modello in vitro facile e riproducibile per saggiare la capacità neuroregenerativa di un dato campione OEG, prima di iniziare studi in vivo. In questo protocollo, l'RGN assiotomizzato dei ratti adulti viene cocolturato su un monostrato dell'OEG per il test. L'analisi successiva dei marcatori assonali e somatodendritici RGN mediante immunofluorescenza viene eseguita per valutare la rigenerazione assonale RGN.

Una difficoltà iniziale del saggio è la fonte di OEG. In questo lavoro, utilizziamo linee clonali oeg umane immortalate reversibili (ihOEG), precedentemente stabilite e caratterizzate dalnostro gruppo 15,16,17,18,che forniscono una fornitura illimitata di OEG omogeneo. Due di queste linee cellulari ihOEG sono Ts14, che mantiene la capacità rigenerativa delle colture originali e Ts12, una linea rigenerativa bassa che viene utilizzata come basso controllo di rigenerazione in questi esperimenti 18 Tuttavia,sebbene esistano limitazioni tecniche per espandere le cellule OEG primarie umane, possono anche essere ottenute da biopsie endoscopiche nasali - OM - o, in caso di OB-OEG, da donatori di cadaveri.

La preparazione di colture OEG monostrato è una procedura cruciale, poiché troppe cellule potrebbero causare il distacco della cocoltura dalla piastra. Pertanto, prima della preparazione OEG per il saggio, si raccomanda all'utente di determinare il numero ottimale di celle da placcare, a seconda delle dimensioni e della velocità di divisione.

Un altro problema critico è la dissociazione del tessuto retinica, dopo la dissezione della retina. È necessario rompere i frammenti di tessuto, dopo l'incubazione nel mix di dissociazione. Se fatto troppo vigorosamente, le cellule saranno distrutte, ma i frammenti di tessuto saranno lasciati intatti se fatti troppo debolmente. Per ottenere una sospensione cellulare omogenea, si consiglia di riempire e svuotare una pipetta Pasteur 10-15 volte, con una punta di diametro intermedio, evitando il gorgogliamento. Le pipette Pasteur con punte larghe possono essere ristrette utilizzando un bruciatore Bunsen.

Per valutare la capacità delle diverse popolazioni gliali di favorire la rigenerazione assonale dei neuroni adulti, abbiamo determinato che 96 h è l'intervallo di tempo più adatto allo scopo perché: 1) è il tempo più lungo per mantenere viva la cultura senza disturbare il monostrato OEG; e 2) è il tempo necessario affinché i neuroni crescano assoni abbastanza a lungo da rivelare differenze tra le capacità rigenerative di diverse popolazioni OEG o altre cellule non rigenerative (cioè fibroblasti12,13,14,15,16,17,18,32,33). Sarebbe certamente interessante determinare il corso del tempo del processo di rigenerazione, in quanto potrebbe fornire informazioni sulle proprietà rigenerative differenziali delle diverse popolazioni gliali, in momenti più brevi della co-coltura. Nelle nostre mani, per glia rigenerativa, il corso di tempo compreso tra 72 e 96 h è abbastanza simile per tutte le linee cellulari, anche se gli assoni sono più corti a 72 h (dati inediti). Inoltre, 96 ore di co-coltura, consente di studiare meccanismi dipendenti da OEG di rigenerazione assonaleadulta 12,14.

Durante la quantificazione della rigenerazione assonale, è importante scattare un minimo di 30 immagini a 400 potenziamenti (obiettivo 40x), in diverse aree casuali del coverslip, ma seguendo gli assoni completi dei neuroni fotografati. Pertanto, lo sperimentatore deve scattare foto seriali nelle aree scelte per misurare le lunghezze assonali reali.

Sono stati sviluppati anche altri approcci in vitro per valutare le funzioni rigenerative OEG. In questi modelli, l'OEG viene applicato a colture di diversa origine neuronale e, in risposta alla cocultura gliale, la formazione di neurite el'allungamento vengono saggiati 19,20,21,22,23,24,25,26,27. Tuttavia, il test di rigenerazione si basa su neuroni embrionali o postnatali, che hanno una plasticità intrinseca assente dai neuroni adulti feriti. Questo modello costituito dalla rigenerazione assonale adulta nelle coculture di linee OEG con neuroni ganglionali retini adulti (RGN) supera questo inconveniente. Inoltre, stiamo sezionando retine adulte, e poiché tagliamo il nervo ottico e gli assoni si ritraggono nel processo di dissezione, otteniamo corpi neuronali puliti dalla mielina, per eseguire la cocoltura. Questa è la differenza con altre parti del SNC adulto, dove la mielina può ostacolare molto con la dissezione per ottenere neuroni puliti per la cocoltura.

Sulla base di quello originariamente sviluppato daWigleyet al. In primo luogo, l'uso di mezzo neurobasale integrato con B27 come mezzo di cocultura OEG-RGN, che consente la crescita delle cellule neuronali e influisce positivamente sulla riproducibilità dell'esperimento. In secondo luogo, caratterizziamo e quantifichiamo la rigenerazione assonale utilizzando uno specifico marcatore del compartimento assonale; e terzo, usiamo un parametro diretto aggiuntivo, la lunghezza/neurone assonale media, che valuta il potenziale rigenerativo di crescita assonale di OEG.

In sintesi, consideriamo che questo è un saggio semplice, riproducibile, che fa risparmiare tempo e a medio costo, non solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma anche perché può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali. Inoltre, potrebbe essere utilizzato come preziosa prova del concetto del potenziale neuroregenerativo di un campione OEG o gliale, prima della traduzione in studi in vivo o clinici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto SAF2017-82736-C2-1-R dal Ministerio de Ciencia e Innovación al MTM-F e dalla Fundación Universidad Francisco de Vitoria a JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuroscienze Numero 165 glia olfattiva ensheathing (OEG) rigenerazione assonale adulta saggio in vitro neuroni ganglionari retinali (RGN) cocultura assotomia
Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta
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Portela-Lomba, M., Simón, D.,… More

Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

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