Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ثقافة اكسال من الخلايا العصبية الجرذ الشبكية جانجليون مع الشم Ensheathing غليا، كنموذج في المختبر من تجديد أكسونال الكبار

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 1, 3
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

Summary

نقدم نموذج في المختبر لتقييم القدرة العصبية في حاسة الشم (OEG) ، بعد الإصابة العصبية. وهو يستند إلى ثقافة ثنائية من الخلايا العصبية العقدية الشبكية البالغين (RGN) على الطبقات الأحادية OEG والدراسة اللاحقة لتجديد محور عصبي ، من خلال تحليل علامات RGN المحورية وstomodendritic.

Abstract

يتم ترجمة خلايا الغليا (OEG) الشمية على طول الطريق من الغشاء المخاطي الشمي إلى وإلى طبقة العصب الشمي (ONL) من لمبة الشم. طوال حياة الكبار، فهي المفتاح لنمو محور عصبي من الخلايا العصبية الشمية التي تم إنشاؤها حديثا، من بروبريا لامينا إلى ONL. بسبب خصائصها المؤيدة للتجديد، وقد استخدمت هذه الخلايا لتعزيز تجديد محور عصبي في الحبل الشوكي أو نماذج إصابات العصب البصري.

نقدم نموذج في المختبر إلى المقايسة وقياس القدرة العصبية OEG بعد الإصابة العصبية. في هذا النموذج، يتم استزراع OEG الإنسان المتخلّف بشكل عكسي (ihOEG) باعتباره أحادي الطبقات، يتم استخراج شبكية العين من الفئران البالغة والخلايا العصبية العقدية الشبكية (RGN) على الطبقة الأحادية OEG. بعد 96 ح، يتم تحليل علامات محور عصبي وsmatodendritic في RGNs بواسطة immunofluorescence وعدد من RGNs مع محور عصبي ومتوسط طول محور عصبي / الخلايا العصبية يتم تحديد كميا.

هذا البروتوكول لديه ميزة على غيرها من المختبرات في المختبر التي تعتمد على الخلايا العصبية الجنينية أو ما بعد الولادة, أنه يقيم خصائص OEG العصبية في الأنسجة البالغة. أيضا، فإنه ليس فقط مفيدة لتقييم إمكانات العصبية التنكسية من ihOEG ولكن يمكن أن تمتد إلى مصادر مختلفة من OEG أو الخلايا الدبقية الأخرى.

Introduction

لدى الخلايا العصبية للجهاز العصبي المركزي البالغ (CNS) قدرة تجديدية محدودة بعد الإصابة أو المرض. استراتيجية مشتركة لتعزيز تجديد الجهاز العصبي المركزي هي زرع، في موقع الإصابة، من أنواع الخلايا التي تحفز نمو عصبي مثل الخلايا الجذعية، والخلايا Schwann، الفلكيات أو حاسة الشم خلايا glia (OEG)1،2،3،5.

OEG مشتق من قمةالعصبية 6 ويقع في الغشاء المخاطي الشمي وفي لمبة الشم. في البالغين، تموت الخلايا العصبية الحسية الشمية بانتظام نتيجة للتعرض البيئي ويتم استبدالها بالخلايا العصبية المتمايزة حديثًا. OEG يحيط ويوجه هذه المحاور الشمية الجديدة لدخول لمبة الشم وإنشاء نقاط الاشتباك العصبي الجديدة مع أهدافها في CNS7. بسبب هذه السمات الفسيولوجية، وقد استخدمت OEG في نماذج من إصابة الجهاز العصبي المركزي مثل الحبل الشوكي أو إصابة العصب البصري وخصائصه العصبية العصبية تصبح ثبت8،9،10،11. وقد تم تحديد عدة عوامل باعتبارها مسؤولة عن الخصائص المؤيدة للتجديد لهذه الخلايا، بما في ذلك إنتاج المصفوفة خارج الخلية proteases أو إفراز عوامل النمو العصبية والمحاورية12،13،14.

ونظرا للقيود التقنية لتوسيع الخلايا الأولية OEG، أنشأنا سابقا وتميزت عكسها الخالدة الإنسان OEG (ihOEG) خطوط clonal، والتي توفر إمدادات غير محدودة من OEG متجانسة. وتستمد خلايا ihOEG هذه من الثقافات الأولية، التي أعدت من المصابيح الشمية التي تم الحصول عليها في عمليات التشريح. وقد خلدت من قبل transduction من الوحدة الفرعية الحفازة التيلوميراز (TERT) و oncogene Bmi-1 وتعديلها مع فيروس SV40 مستضد T كبيرة15,16,17,18. اثنان من هذه ihOEG هي Ts14 ، التي تحافظ على القدرة التجديدية للثقافات الأصلية و Ts12 ، وهو خط تجديدي منخفض يستخدم كتحكم منخفض في تجديد هذه التجارب18.

لتقييم قدرة OEG على تعزيز تجديد محور عصبي بعد الإصابة العصبية ، تم تنفيذ العديد من النماذج في المختبر. في هذه النماذج، يتم تطبيق OEG على الثقافات ذات الأصل العصبي المختلفة وتشكيل نيوريت وتوسيع — استجابة لزلال coculture — يتم فحصها. أمثلة من هذه المصادر العصبية هي الخلايا العصبية القشرية الفئران حديثي الولادة19, جروح الصفر التي أجريت على الخلايا العصبية الجنينية الجرذان من الأنسجة القشرية20, الفئران شبكية العين explants21, الفئران hypothalamic أو فرس النهر الخلايا العصبية بعد الولادة22,2 3, بعد الولادة الجرذ الظهرية جذر العصبونات العقدية24, بعد الولادة الماوس كورتيكوسبينال المسالك العصبية25, الخلايا العصبية NT2 الإنسان26, أو الخلايا العصبية القشرية الدماغية بعد الولادة على ردود الفعل astrocyte الثقافات ندبة مثل27.

في هذه النماذج، ومع ذلك، يعتمد فحص التجديد على الخلايا العصبية الجنينية أو ما بعد الولادة، والتي لديها اللدونة الجوهرية التي هي غائبة في الخلايا العصبية الكبار المصابين. للتغلب على هذا العيب، نقدم نموذجا لتجديد محور عصبي الكبار في الثقافات المشتركة من خطوط OEG مع الخلايا العصبية العقدية الشبكية الكبار (RGNs)، استنادا إلى واحد وضعت أصلا Wigleyوآخرون. 28،29،30،31 وتعديلها واستخدامها من قبل مجموعتنا12،13،14، 15،16،17،18،32،33. باختصار، يتم استخراج أنسجة الشبكية من الفئران البالغة وهضمها مع papain. ثم يتم مطلي تعليق خلية الشبكية على إما الأغطية المعالجة ببوليسين أو على Ts14 و Ts12 monolayers. يتم الحفاظ على الثقافات لمدة 96 ساعة قبل أن يتم إصلاحها ثم immunofluorescence لمحور (MAP1B وNF-H البروتينات)34 وsmatodendritic (MAP2A وباء) يتم تنفيذ35 علامات. يتم تحديد كمي تجديد أكسونال كنسبة مئوية من الخلايا العصبية مع محور عصبي، فيما يتعلق مجموع السكان من RGNs ويتم حساب مؤشر تجديد محور عصبي كما متوسط طول محور عصبي لكل خلية عصبية. وهذا البروتوكول ليس مفيداً فقط لتقييم الإمكانات العصبية التنكسية للـ ihOEG، بل يمكن توسيع نطاقه ليشمل مصادر مختلفة من الخلايا الدبقية أو الخلايا الدبقية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجان الوطنية والمؤسسية لأخلاقيات البيولوجيا.

1. ihOEG (Ts12 و Ts14) الثقافة

ملاحظة: يتم هذا الإجراء في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية لثقافة الأنسجة.

  1. إعداد 50 مل ME10 OEG ثقافة المتوسطة كما هو منصوص عليه في الجدول 1.
  2. إعداد 5 مل من DMEM/F12-FBS، كما هو منصوص عليه في الجدول 1،في أنبوب مخروطي 15 مل.
  3. دافئة على حد سواء وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية في حمام المياه النظيفة، لمدة 15 دقيقة.
  4. ذوبان Ts12 و Ts14 قوارير الخلايا في 37 درجة مئوية في حمام المياه النظيفة.
  5. إعادة بناء وإضافة خلايا إلى متوسط الثقافة DMEM/F12-FBS إعداد في الخطوة 2.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
  7. أسباير المُتفوّك.
  8. إضافة 500 μL من ME10 المتوسطة وإعادة تعليق بيليه.
  9. إعداد طبق ثقافة خلية p60 مع 3 مل من ME10 وإضافة تعليق الخلوية, قطرة.
  10. الانتقال لتوزيع الخلايا بشكل موحد عبر اللوحة.
  11. الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
    ملاحظة: بعد الوصول إلى التقاء، يجب القيام به على الأقل مرور آخر لتحسين الخلايا لزراعة تربية الأحياء. هناك حاجة إلى التقاء 90٪ قبل بذرها على الأغطية لزراعة الأزهار. A التقاء ف-60 لديه متوسط عدد الخلايا من 7 × 105 ل Ts14 و 2.5 × 106 للخطوط الخلية Ts12. يجب تمرير خطوط الخلايا Ts12 و Ts14 كل 2-3 أيام.

2. إعداد ihOEG (Ts12 و Ts14) للتشايس

ملاحظة: يجب أن يتم هذه الخطوة 24 ساعة قبل تشريح RGN وتربية الثقافات.

  1. علاج 12 مم Ø يغطي مع 10 ميكروغرام / مل بولي L-ليسين (PLL) لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: يمكن ترك الأغطية بين عشية وضحاها في حل PLL.
  2. غسل الأغطية مع 1x الفوسفات المالحة العازلة (PBS)، ثلاث مرات.
  3. فصل Ts12 و Ts14 ihOEG الخلايا من طبق ثقافة الخلايا p60.
    1. إضافة 4 مل من DMEM/F12-FBS ثقافة المتوسطة(الجدول 1)إلى أنبوب مخروطي 15 مل. دافئة عند 37 درجة مئوية في حمام مياه نظيف.
    2. إزالة المتوسطة من لوحات وغسل الخلايا مع 1 مل من 1X PBS-EDTA، مرة واحدة.
    3. إضافة 1 مل من التربسين-EDTA إلى الخلايا OEG واحتضان لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    4. جمع الخلايا مع ماصة p1000 ونقلها إلى متوسطة المعدة في الخطوة 3.1.
    5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
    6. أسباير المُتفوّك.
    7. إضافة 1 مل من ME10 المتوسطة وإعادة تعليق بيليه.
    8. عد رقم الخلية في مقياس الهيموسيت.
  4. بذور 80،000 Ts14 الخلايا أو 100،000 Ts12 الخلايا / جيدا على الأغطية في 24-آبار في 500 ميكرولتر من ME10 المتوسطة.
  5. الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2، ل 24 ساعة.

3. تشريح أنسجة الشبكية

ملاحظة: 2 أشهر الذكور الفئران Wistar تستخدم كمصدر RGN. اثنين من شبكية العين (فأر واحد) ل20 بئرا من طبق خلية 24 جيدا. المواد الجراحية الأوتوكلاف قبل الاستخدام. يتم شراء مجموعة Papain تفكك تجاريا (جدول المواد). اتبع تعليمات الموفر لإعادة التشكيل. إعادة D,L-2-amino-5-phosphonovaleric حمض (APV) في 5 mM الأسهم وإعداد aliquots.

  1. في يوم الفحص، قم بإعداد الوسائط التالية.
    1. إعداد طبق ثقافة خلية p60 مع 5 مل من EBSS الباردة (قارورة 1 من مجموعة فصّلات الباباين).
    2. إعداد طبق ثقافة خلية p60 مع قارورة إعادة تشكيلها 2 (papain) من طقم انفصال باباين بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من APV.  ثم، إضافة 250 ميكرولتر من قارورة 3 (DNase زائد 5 ميكرولتر من APV).
    3. في مزيج أنبوب معقمة 2.7 مل من 1 قارورة مع 300 ميكرولتر من قنينة 4 (البيلين-مثبطات البروتياز). أضف 150 ميكرولتر من القارورة 3 (DNase) بالإضافة إلى 30 ميكرولتر من APV.
    4. إعداد 20 مل من Neurobasal-B27 المتوسطة (NB-B27) كما هو منصوص عليه في الجدول 1.
  2. تضحية جرذ عن طريق الاختناق مع CO2.
  3. إزالة الرأس بقطع الرأس مع المقصلة; وضعه في طبق بيتري 100 مم ورش الرأس بالإيثانول 70٪ قبل وضعه في غطاء محرك تدفق لامينر.
  4. قطع شعيرات الفئران مع مقص حتى لا تتداخل مع التلاعب بالعين.
  5. قبضة العصب البصري مع ملقط لسحب مقلة العين بما فيه الكفاية لتكون قادرة على جعل شق عبر العين مع مشرط.
  6. إزالة العدسة والفكاهة الزجاجي وسحب شبكية العين (الأنسجة الشبيهة بالبرتقال)، في حين أن الطبقات المتبقية من العين البقاء في الداخل (بما في ذلك طبقة الظهارة الصباغية).
  7. ضع الشبكية في طبق ثقافة الخلايا p60 المعد في الخطوة 3.1.1.
  8. نقل شبكية العين إلى طبق ثقافة الخلية p60 المعدة في الخطوة 3.1.2 وقطع عليه مع مشرط في قطع صغيرة من حجم تقريبي < 1 ملم.
  9. نقل إلى أنبوب بلاستيكية 15 مل.
  10. احتضان الأنسجة لمدة 30 دقيقة، في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2، مع التحريض كل 10 دقيقة.
  11. فصل كتل الخلية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة باستور الزجاج.
  12. الطرد المركزي تعليق الخلية في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
  13. تجاهل supernatant و إلى إلغاء تنشيط papain، resuspend بيليه الخلية في الحل المعدة في الخطوة 3.1.3. (1.5 مل ل2 عيون).
  14. بعناية pipet هذا التعليق الخلية في 5 مل من قارورة المعاد تشكيلها 4.
  15. جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
  16. في حين الطرد المركزي، وإزالة تماما المتوسطة ME-10 من لوحة الخلية 24 OEG جيدا (أعدت سابقا في الخطوة 2) واستبدالها مع 500 ميكرولتر من 500 ميكرولتر من 27-NB المتوسطة في البئر.
  17. تجاهل افرا و resuspend الخلايا في 2 مل من بي بي 27 المتوسطة.
  18. لوحة 100 μL من تعليق خلية الشبكية، في بئر من لوحة m24، على PLL-المعالجة أو أوتيللايبس- أغطية OEG.
  19. الحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ل96 ح في متوسطة NB-B27.

4- المناعة

  1. بعد 96 ساعة، قم بإصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق بإضافة نفس حجم 4٪ شبه شكلي (PFA) في PBS 1x إلى الوسط الثقافي (600 ميكرولتر) (التركيز النهائي PFA 2٪).
  2. إزالة وسائل الإعلام وPFA من لوحة 24-multiwell ومرة أخرى إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ شبهفورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني 1x. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  3. تجاهل المثبت وغسل 3 مرات مع 1X برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  4. كتلة مع 0.1٪ تريتون X-100/1٪ FBS في برنامج تلفزيوني (PBS-TS) لمدة 30-40 دقيقة.
  5. تحضير الأجسام المضادة الأولية في العازلة PBS-TS على النحو التالي: SMI31 (ضد بروتينات MAP1B وNF-H) الأجسام المضادة أحادية النسيلة (1:500). 514 (يتعرف MAP2A و B البروتينات) الأرانب بوليكلينال antiserum (1:400).
  6. إضافة الأجسام المضادة الأولية إلى الثقافات المشتركة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
  7. في اليوم التالي، تخلص من الأجسام المضادة واغسل الأغطية بـ 1x PBS، 3 مرات، لمدة 5 دقائق.
  8. تحضير الأجسام المضادة الثانوية في مخزن PBS-TS على النحو التالي: بالنسبة لSMI-31، مكافحة الماوس اليكسا فلور 488 (1:500). ل514، المضادة للأرنب اليكسا-594 (1:500).
  9. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الفلورسنت الثانوية المقابلة ل 1 ساعة، في RT، في الظلام.
  10. غسل الأغطية مع 1X PBS، 3 مرات، لمدة 5 دقائق، في الظلام.
  11. وأخيرا، جبل يغطي مع متوسطة متزايدة(جدول المواد)والحفاظ على 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: عند الضرورة، قد يتم تنفيذ النوى الفلورية الملطخة بـ DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). قبل التركيب، احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في الظلام مع DAPI (10 ميكروغرام / مل في 1X PBS). غسل الأغطية 3 مرات مع 1X PBS وأخيرا، جبل الأغطية مع المتوسطة المتصاعدة.

5- القياس الكمي لتجديد أكسونال

ملاحظة: يتم تحديد العينات كمياً في إطار الهدف 40x من مجهر epifluorescence. وينبغي أن يتم التقاط ما لا يقل عن 30 صورة على حقول عشوائية، مع ما لا يقل عن 200 الخلايا العصبية، ليتم تحديدها كميا لكل علاج. يجب تكرار كل تجربة ثلاث مرات كحد أدنى.

  1. كمي النسبة المئوية للخلايا العصبية مع محور عصبي (SMI31 النورية الإيجابية) بالنسبة إلى مجموع السكان من RGNs (محددة مع MAP2A/B 514 الايجابية من الجسم العصبي وdendrites).
  2. كمي مؤشر تجديد محور عصبي أو متوسط طول محور عصبي (μm / الخلايا العصبية). يتم تعريف هذه المعلمة على أنها مجموع أطوال (في μm) من جميع محاور عصبية محددة، مقسوما على العدد الإجمالي للخلايا العصبية التي تم عدها، سواء كانت قدمت محور عصبي أم لا. يتم تحديد طول Axonal باستخدام المساعد NeuronJ من برنامج الصور ImageJ (NIH-USA).
  3. احسب المتوسط والانحراف المعياري والمغزى الإحصائي باستخدام البرنامج المناسب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا البروتوكول، نقدم نموذج في المختبر إلى فحص OEG القدرة العصبية بعد إصابة الخلايا العصبية. كما هو مبين في الشكل 1، مصدر OEG هو عكسها خلد الإنسان OEG خط الخلية النيكل -Ts14 و Ts12 - ، والتي تستمد من الثقافات الأولية ، أعدت من المصابيح الشم التي تم الحصول عليها في تشريح الجثث15،17،18. يتم استخراج أنسجة الشبكية من الفئران البالغة، وهضمها، ويتم مطلي الخلايا العصبية العقدية الشبكية (RGN) تعليق على إما يغطي PLL المعالجة أو على monolayers ihOEG، Ts14 أو Ts12. يتم الحفاظ على الثقافات لمدة 96 ساعة قبل أن يتم إصلاحها. يتم تحليل علامات أكسونال وsmatodendritic بواسطة الفلوروسين المناعية ويتم تحديد كمي التجدد المحوري.

يتم تقييم هوية OEG 14 بواسطة المناعة مع علامات وصفها للتعبير عنها في الزمع(الشكل 2) ، مثل S100 β (الشكل 2A)و vimentin (الشكل 2B)؛ كما تم تحليل التعبير GFAP لتجاهل التلوث الفلكية(الشكل 2C). كما هو مبين، أعرب Ts14 S100 β و vimentin ولكن ليس GFAP.

في فحص تجديد محور عصبي، يتم مقارنة القدرة التجديدية Ts14 Ts12 في تربية الثقافات المشتركة RGN-OEG، وذلك باستخدام الركيزة PLL كتحكم سلبي(الشكل 3). وكانت كل من النسبة المئوية للخلايا مع محاور، فضلا عن متوسط طول محاور المحاور المجددة أعلى بكثير في الخلايا العصبية cocultured على Ts14 monolayers، مقارنة مع الخلايا العصبية مطلية على الخلايا إما Ts12 أو PLL(الشكل 3D, E). تظهر الصور التمثيلية نقصًا في قدرة RGN على تجديد محاورها على خلايا PLL أو Ts12(الشكل 3A, B)، بينما يحفز Ts14 على نمو المحاور في RGN (3C).

Figure 1
الشكل 1: الرسم التخطيطي للخلايا العصبية العقدية الشبكية الفئران مع الخلايا الشمية في الغليا الخلايا colia، كنموذج لتجديد محور عصبي الكبار. خلد الإنسان OEG (ihOEG) خطوط الخلايا التخفي -Ts12 و Ts14- المستمدة من الثقافات الأولية من المصابيح الشمية. يتم مطلي الخلايا العصبية العقدية الشبكية من الفئران البالغة على إما الأغطية المعالجة PLL (التحكم السلبي) أو على Ts14 أو Ts12 monolayers. يتم الحفاظ على الثقافات لمدة 96 ساعة قبل أن تكون ثابتة ويتم تحليل علامات محور عصبي وsmatodendritic بواسطة immunofluorescence. يتم تحديد كمية النسبة المئوية للخلايا العصبية مع محور عصبي ومتوسط طول محور عصبي / الخلايا العصبية إلى فحص RGN تجديد محور عصبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: هوية خط الخلية ihOEG Ts14. صور مناعية للفلوريس من Ts14 في الثقافة، وصفت مع المضادة S100 β (لوحة A، الأخضر) و vimentin (لوحة B، أحمر). كما تم تحليل تعبير GFAP (اللوحة C، الأحمر) لتجاهل التلوث الفلكي. النوى ملطخة مع DAPI (الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: فحص لتجديد محور عصبي في الثقافات المشتركة لخطوط OEG مع الخلايا العصبية العقدية الشبكية البالغة (RGNs). (أ - ج) صور immunofluorescence تظهر وضع العلامات somatodendritic مع 514 الأجسام المضادة، والتي تعترف البروتين المرتبطة ميكروتوبول MAP2A وباء، باللون الأحمر، ومع الأجسام المضادة SMI31 محور عصبي محددة في الأخضر، ضد MAP1B وNF-H البروتينات. تشير الأسهم الخضراء إلى axons RGN (SMI31-positive: الأخضر) والأسهم الصفراء تشير إلى أجسام الخلايا العصبية والتشعبات (514 إيجابية: الأحمر والأصفر). (D, E) تظهر الرسوم البيانية الانحراف المعياري ومتوسط النسبة المئوية للخلايا العصبية التي تظهر محاور عصبية ومؤشر تجديد محور عصبي، وهي معلمة تعكس متوسط طول محور عصبي (μm) من المحاور في الخلايا العصبية. تم التقاط 30 صورة (40x) كحد أدنى في حقول عشوائية وتم تحديدها كمياً لكل عينة خلية. أجريت التجارب في ثلاث نسخ، من ثلاثة فئران مختلفة (N = 3)، أنسجة الشبكية المجمعة من كلتا العينين، مع تكرار لكل حالة تجريبية (كل مجموعة glia اختبار). تشير العلامات النجمية إلى الأهمية الإحصائية: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, NS: غير أهمية (ANOVA ومقارنات اختبار Tukey بعد المخصصة بين المعلمات التي تم قياسها كمياً لـ Ts14 vs Ts12 و Ts14 vs PLL و Ts12 vs PLL). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعتبر زرع OEG في مواقع إصابات CNS علاجًا واعدًا لإصابة الجهاز العصبي المركزي بسبب خصائصه المكونة المؤيدة للأعصاب7،8،9. ومع ذلك ، اعتمادا على مصدر الأنسجة - الغشاء المخاطي الشمي (OM-OEG) مقابل لمبة الشم (OB-OEG) - أو عمر المتبرع ، يوجد اختلاف كبير في هذه القدرة26،31،33،36. ولذلك، فمن المهم أن يكون نموذج سهل وقابلة للاستنساخ في المختبر لتذوق القدرة العصبية من عينة OEG معينة، قبل البدء في دراسات الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، يتم استزراع الجرذان البالغة في الـ RGN على طبقة أحادية من OEG للمقايسة. يتم إجراء تحليل لاحق لعلامات الحساسية وsomatodendritic RGN عن طريق الفلوروسين المناعي لتقييم تجديد محوري RGN.

صعوبة أولية من الفحص هو مصدر OEG. في هذا العمل، ونحن نستخدم عكسها الخالدة OEG الإنسان (ihOEG) خطوط clonal، التي أنشئت سابقا وتتميز مجموعتنا15،16،17،18، والتي توفر إمدادات غير محدودة من OEG متجانسة. اثنان من هذه خطوط الخلايا ihOEG هي Ts14، الذي يحافظ على القدرة التجديدية للثقافات الأصلية و Ts12، وهو خط تجديدي منخفض يستخدم كتحكم تجديد منخفض في هذه التجارب18 ومع ذلك، على الرغم من وجود قيود تقنية لتوسيع خلايا OEG الأولية البشرية، فإنها يمكن أيضا الحصول عليها من الخزعات الأنفية بالمنظار -OM - أو، في حالة OB-OEG، من المتبرعين جثوفر.

إعداد الثقافات OEG أحادي الطبقات هو إجراء حاسم، كما أن العديد من الخلايا يمكن أن يسبب coculture للانفصال عن لوحة. لذلك ، قبل تحضير OEG للمجاح ، يوصى بأن يحدد المستخدم العدد الأمثل للخلايا التي يجب أن تكون مطلية ، اعتمادًا على حجمها ومعدل تقسيمها.

وثمة مسألة أخرى حرجة هي تفكك أنسجة الشبكية، بعد تشريح الشبكية. فمن الضروري لتفتيت شظايا الأنسجة، بعد الحضانة في مزيج تفكك. إذا فعلت بقوة جدا، سيتم تدمير الخلايا، ولكن سيتم ترك شظايا الأنسجة سليمة إذا فعلت ضعيفة جدا. من أجل الحصول على تعليق الخلية متجانسة، نقترح ملء وتفريغ ماصة باستور 10-15 مرات، مع غيض من قطر وسيطة، مع تجنب محتدما. يمكن تضييق ماصات باستور مع نصائح واسعة باستخدام الموقد Bunsen.

لتقييم قدرة السكان الدبقية المختلفة لتعزيز تجديد الخلايا العصبية الكبار 'محور عصبي, لقد قررنا أن 96 ح هو الفاصل الزمني الذي يناسب الهدف لأنه: 1) هو أطول وقت للحفاظ على الثقافة على قيد الحياة دون إزعاج أحادية OEG; و 2) هو الوقت اللازم للخلايا العصبية لزراعة المحاور لفترة كافية للكشف عن الاختلافات بين القدرات التجديدية لمختلف السكان OEG أو الخلايا الأخرى غير التجديدية (أي، الخلايا الليفية12،13،14،15،16،17،18،32،33). وسيكون من المفيد بالتأكيد تحديد المسار الزمني لعملية التجديد، حيث أنها يمكن أن توفر معلومات عن الخصائص التفاضلية المتجددة لمختلف السكان الدبقية، في أوقات أقصر من الثقافة المشتركة. في أيدينا ، لتجديد glia ، فإن الوقت بين 72-96 ساعة مشابه تمامًا لجميع خطوط الخلايا ، على الرغم من أن المحاور أقصر عند 72 ساعة (بيانات غير منشورة). أيضا، 96 ح من ثقافة المشتركة، ويسمح لدراسة الآليات التي تعتمد على OEG من تجديد محور عصبي الكبار12،14.

أثناء القياس الكمي لتجديد محور عصبي ، من المهم أن تأخذ ما لا يقل عن 30 صورة في 400 زيادة (40x الهدف) ، في مناطق عشوائية مختلفة من الغطاء ، ولكن بعد المحاور الكاملة للخلايا العصبية المصورة. لذلك، يجب أن تأخذ المجرّب الصور التسلسلية في المناطق المختارة لقياس أطوال المحور الحقيقي.

كما تم تطوير نُهُج أخرى في المختبر لتقييم وظائف التجديد OEG. في هذه النماذج، يتم تطبيق OEG على ثقافات من أصل عصبي مختلف، واستجابة لزلال تربية الثقاة، يتم فحص تشكيل نيوريت وتوسطيب19،20،21،22،23،24،25،26،27. ومع ذلك ، فإن فحص التجديد يعتمد على الخلايا العصبية الجنينية أو ما بعد الولادة ، والتي لها اللدونة الجوهرية غائبة عن الخلايا العصبية البالغة المصابة. هذا النموذج الذي يتألف من تجديد محور عصبي الكبار في الثقافات من خطوط OEG مع الخلايا العصبية العقدية الشبكية الكبار (RGNs) يتغلب على هذا العيب. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تشريح شبكية العين الكبار، ولأننا قطع العصب البصري والمحا محاور تتراجع في عملية تشريح، نحصل على الهيئات العصبية نظيفة من الميالين، لأداء ثقافة النقّال. هذا هو الفرق مع أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي الكبار، حيث يمكن أن تعوق myelin كثيرا مع تشريح للحصول على الخلايا العصبية النظيفة لزراعة الخلايا التكتهين.

استنادا إلى واحد وضعت أصلا Wigley وآخرون28،29،30،31، ونحن نسلط الضوء على التحسينات التالية في البروتوكول. أولاً، استخدام الوسط العصبي مكملة B27 كوسيط لزراعة تربية تعايش OEG-RGN، والذي يسمح بنمو الخلايا العصبية ويؤثر بشكل إيجابي على قابلية تكرار التجربة. ثانياً، نحن نميز ونحدد كميًا للتجدد المحوري باستخدام علامة محددة من مقصورة المحور المحوري؛ وثالثا، نستخدم معلمة مباشرة إضافية، متوسط طول محور عصبي / الخلايا العصبية، التي تقيم إمكانات تجديد النمو المحوري لـ OEG.

وباختصار، فإننا نعتبر أن هذا هو بسيط، استنساخ، توفير الوقت، ومقايسة متوسطة التكلفة، ليس فقط مفيدة لتقييم إمكانات العصبية ihOEG، ولكن أيضا لأنه يمكن أن تمتد إلى مصادر مختلفة من OEG أو الخلايا الدبقية الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه كدليل قيمة على مفهوم القدرة العصبية التنكسية لعينة OEG أو glial، قبل ترجمتها إلى في مجال المعلومات الحية أو الدراسات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل مالياً المشروع SAF2017-82736-C2-1-R من وزيرية سيو دي سيننسيا إي إنفوكسيون إلى MTM-F ومن مؤسسة يونيفرسيداد فرانسيسكو دي فيتوريا إلى JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Tags

علم الأعصاب، العدد 165، شعور فيسييثينغ غليا (OEG)، تجديد محور عصبي الكبار، في المختبر، الخلايا العصبية العقدية الشبكية (RGN)، تربية نقاب، axotomy
ثقافة اكسال من الخلايا العصبية الجرذ الشبكية جانجليون مع الشم Ensheathing غليا، كنموذج في المختبر من تجديد أكسونال الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Portela-Lomba, M., Simón, D.,… More

Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter