Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Cokultur af Axotomized Rat Retinal Ganglion Neuroner med Olfactory Ensheathing Glia, som en In Vitro Model af Voksen Axonal Regeneration

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863

Summary

Vi præsenterer en in vitro-model til vurdering af olfaktorisk ensheathing glia (OEG) neuroregenerativ kapacitet efter neural skade. Den er baseret på en cokultur af axotomiserede voksne retinale ganglion neuroner (RGN) på OEG monolag og efterfølgende undersøgelse af axonal regenerering, ved at analysere RGN axonale og somatodendritic markører.

Abstract

Olfaktoriske ensheathing glia (OEG) celler er lokaliseret hele vejen fra olfaktorisk slimhinde til og ind i olfaktoriske nervelag (ONL) af olfaktoriske pære. Gennem hele voksenlivet er de nøglen til axonal dyrkning af nygenererede olfaktoriske neuroner, fra lamina propria til ONL. På grund af deres pro-regenerative egenskaber, disse celler er blevet brugt til at fremme axonal regenerering i rygmarven eller synsnerve skade modeller.

Vi præsenterer en in vitro model til at analysere og måle OEG neuroregenerativ kapacitet efter neural skade. I denne model dyrkes reversibilisk udødeliggjort human OEG (ihOEG) som monolag, nethinder udvindes fra voksne rotter, og nethindeganglion neuroner (RGN) er cocultured på OEG monolayer. Efter 96 timer analyseres axonale og somatodendritiske markører i RGN'er ved immunfluorescens, og antallet af RGN'er med axon og den gennemsnitlige axonale længde / neuron kvantificeres.

Denne protokol har den fordel i forhold til andre in vitro-assays, der er afhængige af embryonale eller postnatale neuroner, at den vurderer OEG neuroregenerative egenskaber i voksent væv. Det er heller ikke kun nyttigt til vurdering af ihOEG's neuroregenerative potentiale, men kan udvides til forskellige kilder til OEG eller andre gliaceller.

Introduction

Voksne centralnervesystemet (CNS) neuroner har begrænset regenerativ kapacitet efter skade eller sygdom. En fælles strategi til fremme af CNS-regenerering er transplantation på skadestedet af celletyper, der fremkalder axonal vækst, såsom stamceller, Schwann-celler, astrocytter eller olfaktoriske ensheathing glia (OEG) celler1,2,3,4,5.

OEG stammer fra den neurale crest6 og lokaliserer i olfaktorisk slimhinde og i olfaktoriske pære. Hos den voksne dør olfaktoriske sensoriske neuroner regelmæssigt som følge af miljøeksponering, og de erstattes af nyligt differentierede neuroner. OEG omgiver og guider disse nye olfaktoriske axoner til at komme ind i den olfaktoriske pære og til at etablere nye synapser med deres mål i CNS7. På grund af disse fysiologiske egenskaber er OEG blevet brugt i modeller af CNS-skade som rygmarv eller synsnerveskade, og dens neuroregenerative og neurobeskyttende egenskaber bliver bevist8,9,10,11. Flere faktorer er blevet identificeret som ansvarlige for disse cellers pro-regenerative egenskaber, herunder ekstracellulær matrixproteases produktion eller sekretion af neurotrofiske og axonale vækstfaktorer12,13,14.

I betragtning af de tekniske begrænsninger for at udvide primære OEG-celler har vi tidligere etableret og karakteriseret reversible udødeliggjorte menneskelige OEG (ihOEG) klonlinjer, som giver et ubegrænset udbud af homogen OEG. Disse ihOEG-celler stammer fra primærkulturer, der er fremstillet af olfaktoriske pærer opnået i obduktioner. De blev udødeliggjort ved transduktion af telomerase katalytisk underenhed (TERT) og oncogene Bmi-1 og modificeret med SV40 virus store T antigen15,16,17,18. To af disse ihOEG-cellelinjer er Ts14, som bevarer den regenerative kapacitet i de oprindelige kulturer og Ts12, en lav regenerativ linje, der bruges som en lav regenereringskontrol i disse eksperimenter18.

For at vurdere OEG-kapaciteten til at fremme axonal regenerering efter neural skade er flere in vitro-modeller blevet implementeret. I disse modeller anvendes OEG på kulturer af forskellig neuronal oprindelse, og neuritdannelse og forlængelse - som reaktion på glial cokultur - analyseres. Eksempler på sådanne neuronale kilder er neonatal rotte kortikale neuroner19, ridser sår udført på rotte embryonale neuroner fra kortikalt væv20, rotte nethinde explants21, rotte hypothalamic eller hippocampal postnatal neuroner22,23, postnatal rotte dorsal rod ganglion neuroner24, postnatal mus corticospinal tarmkanalen neuroner25, humane NT2 neuroner26, eller postnatal cerebral kortikale neuroner på reaktive astrocyt ar-lignende kulturer27.

I disse modeller, dog regenerering assay bygger på embryonale eller postnatal neuroner, som har en iboende plasticitet, der er fraværende i sårede voksne neuroner. For at overvinde denne ulempe vi præsenterer en model af voksne axonal regenerering i samkulturer af OEG linjer med voksne nethinde ganglion neuroner (RGNs), baseret på den oprindeligt udviklet af Wigley et al.28,29,30,31 og modificeret og brugt af vores gruppe12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kort, nethindevæv udvindes fra voksne rotter og fordøjes med papain. Nethindecelleaffjedring belægges derefter på enten polylysinebehandlede coverslips eller på Ts14- og Ts12-monolag. Kulturer opretholdes i 96 timer, før de fastsættes, og derefter immunofluorescens for axonale (MAP1B og NF-H proteiner)34 og somatodendritic (MAP2A og B)35 markører udføres. Axonal regenerering kvantificeres som en procentdel af neuroner med axon, med hensyn til den samlede population af RGNs og axonal regenerering indeks beregnes som den gennemsnitlige axonal længde pr neuron. Denne protokol er ikke kun nyttig til vurdering af ihOEG's neuroregenerative potentiale, men kan udvides til forskellige kilder til OEG eller andre gliaceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Dyreforsøg blev godkendt af nationale og institutionelle bioetiske komitéer.

1. ihOEG (Ts12 og Ts14) kultur

BEMÆRK: Denne procedure udføres under sterile forhold i et biosikkerhedsskab til vævskultur.

  1. Forbered 50 mL ME10 OEG-kulturmedium som angivet i tabel 1.
  2. Der fremstilles 5 mL DMEM/F12-FBS, som anført i tabel 1,i et konisk rør på 15 mL.
  3. Varm begge medier ved 37 °C i et rent vandbad i 15 minutter.
  4. Optø Ts12- og Ts14-celler med 37 °C i et rent vandbad.
  5. Genbrug og føj celler til DMEM/F12-FBS-kulturmediet, der blev udarbejdet i trin 2.
  6. Centrifuge i 5 min ved 200 x g.
  7. Stræb efter supernatanten.
  8. Der tilsættes 500 μL ME10-medium, og pelletpen genbruges.
  9. Forbered en p60 celle kultur parabol med 3 mL ME10 og tilsæt cellulære suspension, dropwise.
  10. Flyt for at fordele cellerne ensartet på tværs af pladen.
  11. Dyrkningsceller ved 37 °C i 5% CO2.
    BEMÆRK: Når sammenløbet er nået, skal der mindst gøres en anden passage for at optimere cellerne til samkultur. 90% sammenløb er nødvendigt, før såning dem på coverslips til cokultur. Et sammenløbet p-60 har et gennemsnitligt cellenummer på 7 x 105 for Ts14 og 2,5 x 106 for Ts12-cellelinjer. Ts12- og Ts14-cellelinjer skal passeres hver 2-3. dag.

2. Forberedelse af ihOEG (Ts12 og Ts14) til analysen

BEMÆRK: Dette trin skal udføres 24 timer før RGN dissektion og cokultur.

  1. 12 mm Ø coverslips behandles med 10 μg/mL poly-L-lysin (PLL) i 1 time.
    BEMÆRK: Coverlips kan efterlades natten over i PLL-opløsning.
  2. Dæksedlerne vaskes med 1x fosfatbuffers saltvand (PBS) tre gange.
  3. Løsrive Ts12 og Ts14 ihOEG celler fra p60 cellekultur parabol.
    1. Der tilsættes 4 mL DMEM/F12-FBS dyrkningsmedium (tabel 1) til et konisk rør på 15 mL. Varm ved 37 °C i et rent vandbad.
    2. Fjern mediet fra plader og vask celler med 1 mL 1x PBS-EDTA, én gang.
    3. Der tilsættes 1 mL trypsin-EDTA til OEG-cellerne og inkuberes i 3-5 min ved 37 °C, 5% CO2.
    4. Indsamle celler med en p1000 pipette og overføre dem til medium udarbejdet i trin 3.1.
    5. Centrifuge i 5 min ved 200 x g.
    6. Stræb efter supernatanten.
    7. Tilsæt 1 mL ME10 medium og genbrug pellet.
    8. Tæl cellenummeret i et hæmocytometer.
  4. Frø 80.000 Ts14 celler eller 100.000 Ts12 celler / godt på coverlips i 24-brønd plader i 500 μL af ME10 medium.
  5. Dyrkningsceller ved 37 °C i 5% CO2, i 24 timer.

3. Nethindevæv dissektion

BEMÆRK: 2 måneder gamle mandlige Wistar rotter bruges som RGN kilde. To nethinder (en rotte) til 20 brønde af en 24-brønds celle skål. Autoklave kirurgisk materiale før brug. Papain dissociation kit er kommercielt købt (Tabel over materialer). Følg udbyderens instruktioner for rekonstitution. Rekonstituer D,L-2-amino-5-phosphonovalerinsyre (APV) i 5 mM lager og forbered aliquots.

  1. På dagen for analysen, forberede følgende medier.
    1. Forbered en p60 cellekultur skål med 5 mL kold EBSS (hætteglas 1 af papain dissociation kit).
    2. Forbered en p60 cellekultur skål med rekonstitueret hætteglas 2 (papain) af papain dissociation kit plus 50 μL APV.  Derefter tilsættes 250 μL af konstitueret hætteglas 3 (DNase plus 5 μL APV).
    3. I et sterilt rør blandes 2,7 mL hætteglas 1 med 300 μL hætteglas 4 (albumin-ovomucoid protease inhibitor). Der tilsættes 150 μL hætteglas 3 (DNase) plus 30 μL APV.
    4. Forbered 20 mL Neurobasal-B27-medium (NB-B27) som angivet i tabel 1.
  2. Ofre en rotte ved kvælning med CO2.
  3. Fjern hovedet ved halshugning med guillotine; placer den i en 100 mm petriskål og sprøjt hovedet med ethanol 70%, før den placeres i en laminar flow hætte.
  4. Skær rottens whiskers med en saks, så de ikke forstyrrer øjenmanipulationen.
  5. Grip synsnerven med pincet til at trække ud øjeæblet nok til at være i stand til at gøre et snit over øjet med en skalpel.
  6. Fjern linsen og glasagtige humor og trække nethinden (orange-lignende væv), mens de resterende lag af øjet ophold inde (herunder pigment epitel lag).
  7. Nethinden anbringes i p60-cellekulturretten, der er tilberedt i trin 3.1.1.
  8. Overfør nethinden til p60 cellekultur skålen tilberedt i trin 3.1.2 og skær den med skalpellen i små stykker af en omtrentlig størrelse < 1 mm.
  9. Overfør til et 15 mL plastrør.
  10. Inkuber vævet i 30 minutter i en befugtet inkubator ved 37 °C under 5% CO2, med omrøring hvert 10. minut.
  11. Dissociate celle klumper ved pipettering op og ned med et glas Pasteur pipette.
  12. Centrifuge celleaffjedringen ved 200 x g i 5 min.
  13. Supernatant kasseres, og papain inaktiveres, cellepillen genbruges i den opløsning, der er fremstillet i trin 3.1.3. (1,5 mL for 2 øjne).
  14. Denne celleaffjedring afpipetteres forsigtigt til 5 mL rekonstitueret hætteglas 4.
  15. Centrifuge ved 200 x g i 5 min.
  16. Mens centrifugering, helt fjerne ME-10 medium fra OEG 24 godt celle plade (tidligere udarbejdet i trin 2) og erstatte det med 500 μL af NB-B27 medium per brønd.
  17. Supernatanten kasseres og genbruges cellerne i 2 mL NB-B27 medium.
  18. Plade 100 μL nethindecelleaffjedring, pr. brønd af m24-pladen, på PLL-behandlede eller OEG monolayers-coverslips.
  19. Opretholde kulturer ved 37 °C med 5% CO2 i 96 timer i NB-B27 medium.

4. Immunostaining

  1. Efter 96 timer fikses cellerne i 10 minutter ved at tilsætte det samme volumen på 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS til dyrkningsmediet (600 μL) (PFA-slutkoncentration 2%).
  2. Fjern mediet og PFA fra 24-multiwell pladen og tilsæt igen 500 μL af 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS. Inkuber i 10 min.
  3. Kassér fixeren og vask 3 gange med 1x PBS i 5 min.
  4. Bloker med 0,1% Triton X-100/1% FBS i PBS (PBS-TS) i 30-40 min.
  5. Forbered de primære antistoffer i PBS-TS buffer som følger: SMI31 (mod MAP1B og NF-H proteiner) monoklonalt antistof (1:500). 514 (genkender MAP2A og B proteiner) kanin polyklonale antiserum (1:400).
  6. Der tilsættes primære antistoffer til cokulturer og inkuberes natten over ved 4 °C.
  7. Næste dag, kassér antistoffer og vask coverslips med 1x PBS, 3 gange, i 5 min.
  8. Forbered de sekundære antistoffer i PBS-TS buffer som følger: For SMI-31, anti-mus Alexa Fluor 488 (1:500). For 514, anti-kanin Alexa-594 (1:500).
  9. Inkuber celler med de tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer i 1 time, ved RT, i mørke.
  10. Vask coverslips med 1x PBS, 3 gange, i 5 min, i mørke.
  11. Endelig monteres coverslips med monteringsmedium(Tabel over materialer)og holdes ved 4 °C.
    BEMÆRK: Når det er nødvendigt, kan der udføres fluorescerende kernepletter med DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Før montering inkuberes cellerne i 10 minutter i mørke med DAPI (10 μg/mL i 1x PBS). Vask coverslips 3 gange med 1x PBS og endelig montere coverslips med montering medium.

5. Axonal regenerering kvantificering

BEMÆRK: Prøver kvantificeres under 40x-målet for et epifluorescensmikroskop. Der bør tages mindst 30 billeder på tilfældige felter med mindst 200 neuroner, der skal kvantificeres for hver behandling. Hvert forsøg skal gentages mindst tre gange.

  1. Quantificere procentdelen af neuroner med axon (SMI31 positiv neurit) i forhold til den samlede population af RGNs (identificeret med MAP2A/B 514 positiv immunostaining af neuronal krop og dendritter).
  2. Kvantificere det axonale regenereringsindeks eller middel axonal længde (μm/neuron). Denne parameter defineres som summen af længden (i μm) af alle identificerede axoner divideret med det samlede antal optalte neuroner, uanset om de præsenterede en axon eller ej. Axonal længde bestemmes ved hjælp af plugin NeuronJ af billedsoftwaren ImageJ (NIH-USA).
  3. Beregn middelværdien, standardafvigelsen og den statistiske signifikans ved hjælp af den relevante software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokol præsenterer vi en in vitro-model for at analysere OEG neuroregenerativ kapacitet efter neuronal skade. Som vist i figur 1er OEG-kilden en reversibel udødeliggjort human OEG-kloncellelinje -Ts14 og Ts12-, som stammer fra primærkulturer, fremstillet af olfaktoriske pærer opnået i obduktioner15,17,18. Nethindevæv udvindes fra voksne rotter, fordøjes, og nethinde ganglion neuroner (RGN) suspension er belagt på enten PLL-behandlede coverslips eller på ihOEG monolayers, Ts14 eller Ts12. Kulturer opretholdes i 96 timer, før de er fast. Axonale og somatodendritiske markører analyseres ved immunfluorescens, og axonal regenerering kvantificeres.

Ts14 OEG-identitet vurderes ved immunosangering med markører, der er beskrevet som værende udtrykt i ensheathing glia (Figur 2), såsom S100 β (Figur 2A) og vimentin (Figur 2B); GFAP-udtryk blev også analyseret for at kassere astrocytforurening (Figur 2C). Som vist udtrykte Ts14 S100 β og vimentin, men ikke GFAP.

I axonal regenereringsanalysen sammenlignes Ts14-regenerativ kapacitet med Ts12 i RGN-OEG-kokulturer ved hjælp af PLL-substrat som negativ kontrol (figur 3). Både procentdelen af celler med axoner samt den gennemsnitlige længde af de regenererede axoner var betydeligt højere i neuroner cocultured på Ts14 monolayers, sammenlignet med neuroner belagt på enten Ts12 celler eller PLL (Figur 3D, E). Repræsentative billeder viser RGN's manglende evne til at regenerere deres axoner over PLL- eller Ts12-celler (figur 3A,B), mens Ts14 stimulerer udvæksten af axoner i RGN (3C).

Figure 1
Figur 1: Diagram over rotte nethinde ganglion neuroner med olfaktoriske ensheathing glia celler coculture, som en model af voksne axonal regenerering. Udødeliggjorte menneskelige OEG (ihOEG) klonede cellelinjer -Ts12 og Ts14- stammer fra primære kulturer fra olfaktoriske pærer. Nethinde ganglion neuroner fra voksne rotter er belagt på enten PLL-behandlede coverslips (negativ kontrol) eller på Ts14 eller Ts12 monolayers. Kulturer opretholdes i 96 timer, før de er faste, og axonale og somatodendritiske markører analyseres ved immunfluorescens. Procentdel af neuroner med axon og gennemsnitlig axonal længde / neuron kvantificeres for at analysere RGN axonal regenerering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Identiteten af ihOEG-cellelinjen Ts14. Immunfluorescensbilleder af Ts14 i kultur, mærket med anti-S100 β (panel A, grøn) og vimentin (panel B, rød). GFAP udtryk (panel C, rød) blev også analyseret for at kassere astrocyt forurening. Nuclei er plettet med DAPI (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Analyse for axonal regenerering i cokulturer af OEG linjer med voksne nethinde ganglion neuroner (RGNs). (A–C) Immunfluorescensbilleder, der viser somatodendritisk mærkning med 514 antistof, som genkender mikrotubule-associeret protein MAP2A og B, i rødt og med axonspecifikt SMI31-antistof i grønt, mod MAP1B- og NF-H-proteiner. Grønne pile angiver RGN axoner (SMI31-positive: grønne) og gule pile angiver neuronale kroppe og dendritter (514 positive: rød og gul). (D,E) Grafer viser middel- og standardafvigelsen for procentdelen af neuroner, der udviser axoner, og det axonale regenereringsindeks, en parameter, der afspejler axonernes gennemsnitlige aksonalængde (μm) pr. neuron. Der blev taget mindst 30 billeder (40x) på tilfældige felter og kvantificeret for hver celleprøve. Forsøg blev udført i tre eksemplarer, fra tre forskellige rotter (N = 3), nethindevæv samlet fra begge øjne, med dubletter for hver eksperimentel tilstand (hver gliapopulation testet). Stjerner angiver den statistiske signifikans: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, NS: ikke-betydning (ANOVA og post hoc Tukey test sammenligninger mellem parametre kvantificeret for Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL, og Ts12 vs PLL). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OEG-transplantation på CNS-skadesteder betragtes som en lovende behandling for CNS-skade på grund af dens konstituerende pro-neuroregenerative egenskaber7,8,9. Afhængigt af vævskilden - olfaktorisk slimhinde (OM-OEG) versus olfaktorisk pære (OB-OEG) - eller donorens alder findes der imidlertid betydelige variationer i en sådan kapacitet26,31,33,36. Derfor er det vigtigt at have en let og reproducerbar in vitro-model for at analysere den neuroregenerative kapacitet af en given OEG-prøve, før der indledes in vivo-undersøgelser. I denne protokol, voksne rotter 'axotomized RGN er cocultured på en monolayer af OEG at analysere. Efterfølgende analyse af RGN axonal og somatodendritic markører ved immunofluorescens udføres for at vurdere RGN axonal regenerering.

En indledende vanskelighed ved analysen er kilden til OEG. I dette arbejde bruger vi reversible udødeliggjorte menneskelige OEG (ihOEG) klonlinjer, tidligere etableret og karakteriseret ved vores gruppe15,16,17,18, som giver et ubegrænset udbud af homogen OEG. To af disse ihOEG-cellelinjer er Ts14, som opretholder den regenerative kapacitet i de oprindelige kulturer og Ts12, en lav regenerativ linje, der bruges som en lav regenereringskontrol i disse eksperimenter18 Ikke desto mindre, selv om der findes tekniske begrænsninger for at udvide menneskets primære OEG-celler, kan de også fås fra nasal endoskopiske biopsier - OM - eller, i tilfælde af OB-OEG, fra kadaverdonorer.

Forberedelse af monolayer OEG kulturer er en afgørende procedure, da alt for mange celler kan forårsage cokultur at løsrive sig fra pladen. Derfor anbefales det, før OEG forbereder analysen, at brugeren bestemmer det optimale antal celler, der skal belagt, afhængigt af deres størrelse og divisionshastighed.

Et andet kritisk spørgsmål er nethindevæv dissociation, efter nethinden dissektion. Det er nødvendigt at bryde vævsfragmenterne efter inkubation i dissociationsblandingen. Hvis det gøres for kraftigt, vil cellerne blive ødelagt, men vævsfragmenter vil blive efterladt intakte, hvis de gøres for svagt. For at opnå en homogen celleaffjedring foreslår vi at fylde og tømme en Pasteur-pipette 10-15 gange med en spids af mellemdiameter, samtidig med at vi undgår boblende. Pasteur pipetter med brede spidser kan indsnævres ved hjælp af en Bunsen brænder.

For at vurdere kapaciteten hos forskellige glialpopulationer til at fremme voksne neuroners axonale regenerering har vi fastslået, at 96 timer er det tidsinterval, der passer bedst til målet, fordi: 1) det er den længste tid at opretholde kulturen i live uden at forstyrre OEG-monolayeren; og 2) det er den tid, det tager for neuroner at dyrke axoner længe nok til at afsløre forskelle mellem de regenerative kapaciteter af forskellige OEG-populationer eller andre ikke-regenerative celler (dvs. fibroblaster12,13,14,15,16,17,18,32,33). Det ville helt sikkert være interessant at bestemme tidsforløbet for regenereringsprocessen, da det kunne give oplysninger om de forskellige regenerative egenskaber hos forskellige glialpopulationer på kortere tidspunkter af samkulturen. I vores hænder, for regenerative glia, er tidskurset mellem 72-96 timer meget ens for alle cellelinjer, selvom axoner er kortere ved 72 timer (ikke-offentliggjorte data). Også, 96 h af co-kultur, giver mulighed for at studere OEG-afhængige mekanismer af voksne axonal regenerering12,14.

Under axonal regenerering kvantificering, er det vigtigt at tage mindst 30 billeder ved 400 forstærkninger (40x mål), på forskellige tilfældige områder af coverlip, men efter den komplette axoner af de fotograferede neuroner. Derfor skal eksperimentatoren tage serielle billeder i de valgte områder for at måle de rigtige axonale længder.

Der er også udviklet andre in vitro-tilgange til evaluering af OEG-regenerative funktioner. I disse modeller anvendes OEG på kulturer af forskellig neuronal oprindelse, og som reaktion på glial cokultur analyseres neuritdannelse og forlængelse19,20,21,22,23,24,25,26,27. Men regenerering assay er afhængig af embryonale eller postnatal neuroner, som har en iboende plasticitet fraværende fra sårede voksne neuroner. Denne model bestående af voksne axonal regenerering i cokulturer af OEG linjer med voksne nethinde ganglion neuroner (RGNs) overvinder denne ulempe. Derudover dissekerer vi voksne nethinder, og fordi vi skærer synsnerven og axoner trækker sig tilbage i dissektionsprocessen, får vi neuronale kroppe rene af myelin for at udføre cokulturen. Dette er forskellen med andre dele af den voksne CNS, hvor myelin kan hindre meget med dissektion for at opnå rene neuroner til cokulturen.

Baseret på den, der oprindeligt blev udviklet af Wigley et al.28,29,30,31, fremhæver vi følgende forbedringer i protokollen. For det første er brugen af neurobasal medium suppleret med B27 som OEG-RGN coculture medium, som tillader vækst af neuronale celler og positivt påvirker reproducerbarheden af eksperimentet. For det andet karakteriserer og kvantificerer vi axonal regenerering ved hjælp af en bestemt markør for det axonale rum; og for det tredje bruger vi en ekstra direkte parameter, den gennemsnitlige axonale længde / neuron, der vurderer OEG's axonale vækstregenerative potentiale.

Sammenfattende mener vi, at dette er en enkel, reproducerbar, tidsbesparende og medium-cost assay, ikke kun nyttig til vurdering af ihOEG's neuroregenerative potentiale, men også fordi det kan udvides til forskellige kilder til OEG eller andre gliaceller. Desuden kan det bruges som et værdifuldt bevis på begrebet neuroregenerativt potentiale i en OEG- eller glialprøve, før det oversættes til in vivo- eller kliniske undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet økonomisk af projektet SAF2017-82736-C2-1-R fra Ministerio de Ciencia e Innovación til MTM-F og af Fundación Universidad Francisco de Vitoria til JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Tags

Neurovidenskab olfaktorisk ensheathing glia (OEG) voksen axonal regenerering in vitro assay nethinde ganglion neuroner (RGN) cokultur axotomi
Cokultur af Axotomized Rat Retinal Ganglion Neuroner med Olfactory Ensheathing Glia, som en In Vitro Model af Voksen Axonal Regeneration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Portela-Lomba, M., Simón, D.,More

Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter