Summary
Nous présentons un modèle in vitro pour évaluer la capacité neurorégénérative olfactive d’ensheathing de glia (OEG), après dommages neuronaux. Il est basé sur une coculture de neurones ganglionnaires rétiniens adultes axotomisés (RGN) sur les monocouches OEG et l’étude subséquente de la régénération axonale, en analysant les marqueurs axonals et somatodendritiques RGN.
Abstract
Les cellules olfactives d’ensheathing glia (OEG) sont localisées tout le chemin de la muqueuse olfactive à et dans la couche olfactive de nerf (ONL) de l’ampoule olfactive. Tout au long de la vie adulte, ils sont essentiels à la croissance axonale des neurones olfactifs nouvellement générés, de la propria lamina à l’ONL. En raison de leurs propriétés pro-régénératives, ces cellules ont été utilisées pour favoriser la régénération axonale dans les modèles de lésions de la moelle épinière ou du nerf optique.
Nous présentons un modèle in vitro pour apaiser et mesurer la capacité neurorégénérative d’OEG après des dommages neuronaux. Dans ce modèle, l’OEG humain réversiblement immortalisé (ihOEG) est cultivé comme monocouche, les rétines sont extraites des rats adultes et les neurones rétiniens de ganglion (RGN) sont coculturels sur le monocouche d’OEG. Après 96 h, les marqueurs axonals et somatodendritiques dans les RGN sont analysés par immunofluorescence et le nombre de RGNs avec l’axone et la longueur/neurone axonal moyen sont quantifiés.
Ce protocole a l’avantage sur d’autres analyses in vitro qui reposent sur des neurones embryonnaires ou postnatals, qu’il évalue les propriétés neurorégénératives oeg dans les tissus adultes. En outre, il est non seulement utile pour évaluer le potentiel neurorégénératif de l’ihOEG, mais peut être étendu à différentes sources d’OEG ou d’autres cellules gliales.
Introduction
Les neurones du système nerveux central adulte (SNC) ont une capacité de régénération limitée après une blessure ou une maladie. Une stratégie commune pour favoriser la régénération de CNS est la transplantation, au site de blessure, des types de cellules qui induisent la croissance axonale telle que des cellules souches, des cellules de Schwann, des astrocytes ou des cellules olfactives d’ensheathing glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG dérive de la crêteneurale 6 et se trouve dans la muqueuse olfactive et dans le bulbe olfactif. Chez l’adulte, les neurones sensoriels olfactifs meurent régulièrement à la suite de l’exposition à l’environnement et ils sont remplacés par des neurones nouvellement différenciés. OEG entoure et guide ces nouveaux axones olfactifs pour entrer dans l’ampoule olfactive et établir de nouvelles synapses avec leurs cibles dans le CNS7. En raison de ces attributs physiologiques, OEG a été employé dans des modèles des dommages de CNS tels que la moelle épinière ou la lésion de nerf optique et ses propriétés neuroregénératives et neuroprotective deviennentprouvées 8,9,10,11. Plusieurs facteurs ont été identifiés comme responsables des caractéristiques pro-régénératrices de ces cellules, y compris la production extracellulaire de protéases de matrice ou la sécrétion des facteurs neurotrophiques et axonalsde croissance 12,13,14.
Compte tenu des limitations techniques pour étendre les cellules OEG primaires, nous avons précédemment établi et caractérisé réversible immortalisé oeg humain (ihOEG) lignes clonales, qui fournissent un approvisionnement illimité d’OEG homogène. Ces cellules ihOEG proviennent de cultures primaires, préparées à partir d’ampoules olfactives obtenues lors d’autopsies. Ils ont été immortalisés par transduction de la sous-unité catalytique de télomérase (TERT) et de l’oncogène Bmi-1 et modifiés avec le virus SV40 grand antigène T15,16,17,18. Deux de ces lignées cellulaires ihOEG sont Ts14, qui maintient la capacité régénératrice des cultures originales et Ts12, une ligne régénérative faible qui est utilisée comme un faible contrôle de régénération dans ces expériences18.
Pour évaluer la capacité d’OEG à favoriser la régénération axonale après des dommages neuronaux, plusieurs modèles in vitro ont été mis en œuvre. Dans ces modèles, l’OEG est appliqué aux cultures d’origine neuronale différente et la formation et l’allongement de neurite- en réponse à la coculture gliale- sont assayed. Des exemples de telles sources neuronales sont les neurones corticals néonatals de rat19,les blessures d’éraflure exécutées sur les neurones embryonnaires de rat du tissu cortical20,les explants rétiniens de rat21,les neurones postnatals hypothalamiques ou hippocampal de rat22,23, neurones postnatals de ganglion de racine dorsale de rat24,neurones corticospinal postnatals de région de souris25,neurones humains de NT226,ou neurones corticals cérébraux postnatals sur les cultures réactives de cicatrice d’astrocyte27.
Dans ces modèles, cependant, l’analyse de régénération repose sur des neurones embryonnaires ou postnatals, qui ont une plasticité intrinsèque qui est absente dans les neurones adultes blessés. Pour surmonter cet inconvénient, nous présentons un modèle de régénération axonale adulte dans les cocultures de lignées OEG avec des neurones ganglionaux rétiniens adultes (RRG), basé sur celui développé à l’origine par Wigley et coll.28,29,30,31 et modifié et utilisé par notre groupe12,13,14,15,16,17,18,32,33. En bref, le tissu rétinien est extrait de rats adultes et digéré avec de la papaïne. La suspension cellulaire rétinienne est ensuite plaquée sur des couvre-plaques traités à la polylysine ou sur des monocouches Ts14 et Ts12. Les cultures sont maintenues pendant 96 h avant d’être fixées, puis l’immunofluorescence pour les protéines axonales (protéines MAP1B et NF-H)34 et les marqueurs somatodendritiques (MAP2A et B)35 sont effectués. La régénération axonale est quantifiée en pourcentage des neurones avec l’axone, en ce qui concerne la population totale de RRG et l’indice de régénération axonale est calculée comme la longueur axonale moyenne par neurone. Ce protocole est non seulement utile pour évaluer le potentiel neurorégénératif de l’ihOEG, mais peut être étendu à différentes sources d’OEG ou d’autres cellules gliales.
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Protocol
REMARQUE : L’expérimentation animale a été approuvée par les comités nationaux et institutionnels de bioéthique.
1. culture ihOEG (Ts12 et Ts14)
REMARQUE : Cette procédure se fait dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité de culture tissulaire.
- Préparez 50 mL me10 milieu de culture OEG tel que fourni dans le tableau 1.
- Préparer 5 mL de DMEM/F12-FBS, tel que prévu dans le tableau 1,dans un tube conique de 15 mL.
- Réchauffer les deux supports à 37 °C dans un bain d’eau propre, pendant 15 min.
- Décongeler les flacons des cellules Ts12 et Ts14 à 37 °C dans un bain d’eau propre.
- Resuspendez et ajoutez des cellules au milieu de culture DMEM/F12-FBS préparé à l’étape 2.
- Centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
- Aspirez au surnatant.
- Ajouter 500 μL de ME10 moyen et réutiliser la pastille.
- Préparer un plat de culture cellulaire p60 avec 3 mL de ME10 et ajouter la suspension cellulaire, dropwise.
- Déplacez-vous pour répartir les cellules uniformément sur la plaque.
- Cellules de culture à 37 °C dans 5% DE CO2.
REMARQUE : Après avoir atteint la confluence, au moins un autre passage doit être fait pour optimiser les cellules pour la coculture. 90% de confluence est nécessaire avant de les ensemencer sur les coverslips pour la coculture. Un confluent p-60 a un nombre moyen de cellules de 7 x 105 pour Ts14 et 2,5 x 106 pour les lignées cellulaires Ts12. Les lignées cellulaires Ts12 et Ts14 doivent être passages tous les 2 à 3 jours.
2. Préparation de l’ihOEG (Ts12 et Ts14) pour l’essai
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée 24 h avant la dissection et la coculture du RGN.
- Traiter les couvre-lips Ø de 12 mm avec 10 μg/mL poly-L-lysine (PLL) pendant 1 h.
REMARQUE : Les coverslips peuvent être laissés pendant la nuit dans la solution PLL. - Lavez les coverslips avec 1x phosphate tampon salin (PBS), trois fois.
- Détachez les cellules Ts12 et Ts14 ihOEG du plat de culture cellulaire p60.
- Ajouter 4 mL de milieu de culture DMEM/F12-FBS(tableau 1)à un tube conique de 15 mL. Chaud à 37 °C dans un bain d’eau propre.
- Retirer le milieu des assiettes et laver les cellules avec 1 mL de 1x PBS-EDTA, une fois.
- Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA aux cellules OEG et incuber pendant 3-5 min à 37 °C, 5 % de CO2.
- Recueillir les cellules avec une pipette p1000 et les transférer à moyen préparé à l’étape 3.1.
- Centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
- Aspirez au surnatant.
- Ajouter 1 mL de ME10 moyen et réutiliser la pastille.
- Comptez le numéro de cellule dans un hémocytomètre.
- Ensemencer 80 000 cellules Ts14 ou 100 000 cellules Ts12/puits sur les couvertures dans des plaques de 24 puits dans 500 μL de me10 moyen.
- Cellules de culture à 37 °C à 5 % de CO2, pendant 24 h.
3. Dissection des tissus rétiniens
REMARQUE : Les rats Wistar mâles de 2 mois sont utilisés comme source RGN. Deux rétines (un rat) pour 20 puits d’un plat cellulaire de 24 puits. Autoclave matériel chirurgical avant utilisation. Papain kit de dissociation est acheté commercialement (Table of Materials). Suivez les instructions du fournisseur pour la reconstitution. Reconstituer D, L-2-amino-5-phosphonovaleric acide (APV) dans le stock de 5 mM et préparer les aliquots.
- Le jour de l’analyse, préparez les médias suivants.
- Préparer un plat de culture cellulaire p60 avec 5 mL d’EBSS froid (flacon 1 du kit de dissociation de la papaïne).
- Préparer un plat de culture cellulaire p60 avec du flacon reconstitué 2 (papain) du kit de dissociation de la papaïne plus 50 μL d’APV. Ensuite, ajoutez 250 μL de flacon reconstitué 3 (DNase plus 5 μL d’APV).
- Dans un tube stérile, mélanger 2,7 mL de flacon 1 avec 300 μL de flacon 4 (inhibiteur de la protéase albumin-ovomucoïde). Ajouter 150 μL de flacon 3 (DNase) plus 30 μL d’APV.
- Préparer 20 mL de milieu Neurobasal-B27 (NB-B27) tel que fourni dans le tableau 1.
- Sacrifier un rat par asphyxie avec du CO2.
- Retirer la tête par décapitation avec de la guillotine; placez-le dans une boîte de Pétri de 100 mm et vaporisez la tête d’éthanol à 70 % avant de la placer dans un capot d’écoulement laminaire.
- Couper les moustaches du rat avec des ciseaux afin qu’ils n’interfèrent pas avec la manipulation des yeux.
- Saisir le nerf optique avec des forceps pour retirer le globe oculaire assez pour être en mesure de faire une incision à travers l’œil avec un scalpel.
- Retirez la lentille et l’humour vitreux et retirez la rétine (tissu orange), tandis que les couches restantes de l’œil restent à l’intérieur (y compris la couche épithéliale pigmentaire).
- Placez la rétine dans le plat de culture cellulaire p60 préparé à l’étape 3.1.1.
- Transférer la rétine dans le plat de culture cellulaire p60 préparé à l’étape 3.1.2 et le couper avec le scalpel en petits morceaux d’une taille approximative < 1 mm.
- Transférer dans un tube en plastique de 15 mL.
- Incuber le tissu pendant 30 min, dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5% de CO2,avec agitation toutes les 10 minutes.
- Dissocier les touffes de cellules en pipetage de haut en bas avec une pipette pasteur en verre.
- Centrifugeuse de la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min.
- Jetez le supernatant et inactivez la papaïne, réutilisez la pastille cellulaire dans la solution préparée à l’étape 3.1.3. (1,5 mL pour 2 yeux).
- Pipet soigneusement cette suspension cellulaire en 5 mL de flacon reconstitué 4.
- Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
- Pendant la centrifugeuse, retirez complètement le milieu ME-10 de la plaque cellulaire du puits OEG 24 (préalablement préparée à l’étape 2) et remplacez-la par 500 μL de NB-B27 moyen par puits.
- Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 2 mL de milieu NB-B27.
- Plaque 100 μL de suspension cellulaire rétinienne, par puits de la plaque m24, sur des monolayers-coverslips PLL ou OEG.
- Maintenir les cultures à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 96 h dans le milieu du NB-B27.
4. Immunostaining
- Après 96 h, fixer les cellules pendant 10 min en ajoutant le même volume de 4% de paraformaldéhyde (PFA) en 1x PBS au milieu de culture (600 μL) (concentration finale PFA 2%).
- Retirez le média et le PFA de la plaque 24-multiwell et ajoutez encore une fois 500 μL de 4% de paraformaldéhyde (PFA) en 1x PBS. Incuber pendant 10 min.
- Jeter le fixateur et laver 3 fois avec 1x PBS pendant 5 min.
- Bloc avec 0,1% Triton X-100/1% FBS en PBS (PBS-TS) pendant 30-40 min.
- Préparez les anticorps primaires dans le tampon PBS-TS comme suit : SMI31 (contre les protéines MAP1B et NF-H) anticorps monoclonaux (1:500). 514 (reconnaît les protéines MAP2A et B) antisérum polyclonal de lapin (1:400).
- Ajouter des anticorps primaires aux cocultures et incuber toute la nuit à 4 °C.
- Le lendemain, jetez les anticorps et lavez les coverslips avec 1x PBS, 3 fois, pendant 5 min.
- Préparez les anticorps secondaires dans le tampon PBS-TS comme suit: Pour SMI-31, anti-souris Alexa Fluor 488 (1:500). Pour 514, anti-lapin Alexa-594 (1:500).
- Incuber les cellules avec les anticorps secondaires fluorescents correspondants pendant 1 h, à RT, dans l’obscurité.
- Laver les coverslips avec 1x PBS, 3 fois, pendant 5 min, dans l’obscurité.
- Enfin, montez des coverslips avec support de montage(Table of Materials)et maintenez-les à 4 °C.
REMARQUE : Chaque fois que nécessaire, des noyaux fluorescents souillant avec DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) peuvent être exécutés. Avant de monter, incuber les cellules pendant 10 min dans l’obscurité avec dapi (10 μg/mL en 1x PBS). Lavez les coverslips 3 fois avec 1x PBS et enfin, montez les coverslips avec le support de montage.
5. Quantification de régénération axonale
REMARQUE : Les échantillons sont quantifiés dans le cadre de l’objectif 40x d’un microscope à épifluorescence. Un minimum de 30 photos doivent être prises sur des champs aléatoires, avec au moins 200 neurones, à quantifier pour chaque traitement. Chaque expérience doit être répétée au moins trois fois.
- Quantifier le pourcentage de neurones avec l’axone (SMI31 neurite positif) par rapport à la population totale de RGNs (identifié avec MAP2A/B 514 immunostaining positif du corps neuronal et des dendrites).
- Quantifier l’indice de régénération axonale ou la longueur axonale moyenne (μm/neurone). Ce paramètre est défini comme la somme des longueurs (en μm) de tous les axones identifiés, divisés par le nombre total de neurones comptés, qu’ils présentaient ou non un axone. La longueur axonale est déterminée à l’aide du plugin NeuronJ du logiciel d’image ImageJ (NIH-USA).
- Calculez la signification moyenne, l’écart type et la signification statistique à l’aide du logiciel approprié.
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Representative Results
Dans ce protocole, nous présentons un modèle in vitro pour apaiser la capacité neurorégénérative d’OEG après des dommages neuronaux. Comme le montre la figure 1, la source de l’OEG est une lignée cellulaire clonale humaine immortalisée réversible -Ts14 et Ts12-, qui provient de cultures primaires, préparées à partir d’ampoules olfactives obtenues dans les autopsies15,17,18. Le tissu rétinien est extrait de rats adultes, digérés, et la suspension des neurones ganglionnaires rétiniens (RGN) est plaquée soit sur des coverslips traités par PLL, soit sur des monocouches ihOEG, Ts14 ou Ts12. Les cultures sont maintenues pendant 96 h avant d’être fixées. Les marqueurs axonals et somatodendritiques sont analysés par immunofluorescence et la régénération axonale est quantifiée.
L’identité de l’OEG Ts14 est évaluée par immunostaining avec des marqueurs décrits comme étant exprimés dans des gliales ensheathing (figure 2), telles que S100 β (figure 2A) et vimentin (figure 2B); L’expression du GFAP a également été analysée pour rejeter la contamination par les astrocytes (figure 2C). Comme indiqué, Ts14 a exprimé S100 β et vimentin, mais pas GFAP.
Dans l’analyse de régénération axonale, la capacité régénérative Ts14 est comparée à Ts12 dans les cocultures RGN-OEG, en utilisant le substrat PLL comme un contrôle négatif (Figure 3). Le pourcentage de cellules avec des axones ainsi que la longueur moyenne des axones régénérés étaient significativement plus élevés chez les neurones coculés sur les monomères Ts14, comparativement aux neurones plaqués sur les cellules Ts12 ou PLL (Figure 3D,E). Les images représentatives montrent un manque de capacité de RGN à régénérer leurs axones au-dessus des cellules PLL ou Ts12 (figure 3A,B), tandis que Ts14 stimule l’repousse des axones dans RGN (3C).
Figure 1 : Diagramme des neurones ganglionnaires rétiniens de rat avec la coculture olfactive de cellules de glia ensheathing, comme modèle de régénération axonale adulte. Lignées cellulaires clonales immortalisées d’OEG humain (ihOEG) -Ts12 et Ts14- dérivées des cultures primaires des ampoules olfactives. Les neurones ganglionnaires rétiniens des rats adultes sont plaqués soit sur des coverslips traités par PLL (contrôle négatif) soit sur des monocouches Ts14 ou Ts12. Les cultures sont maintenues pendant 96 h avant d’être fixées et les marqueurs axonals et somatodendritiques sont analysés par immunofluorescence. Pourcentage de neurones avec axone et moyenne longueur axonale / neurone sont quantifiés pour apaiser la régénération axonale RGN. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Identité de la lignée cellulaire IhOEG Ts14. Images d’immunofluorescence de Ts14 en culture, étiquetées avec des β anti-S100 (panneau A, vert) et vimentine (panneau B, rouge). L’expression GFAP (panneau C, rouge) a également été analysée pour rejeter la contamination des astrocytes. Les noyaux sont tachés de DAPI (bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse de la régénération axonale dans les cocultures de lignées OEG avec des neurones ganglionaux rétiniens adultes (RRG). (A-C) Images d’immunofluorescence montrant l’étiquetage somatodendritique avec 514 anticorps, qui reconnaît les protéines MAP2A et B associées aux microtubules, en rouge, et avec des anticorps SMI31 spécifiques à l’axon en vert, contre les protéines MAP1B et NF-H. Les flèches vertes indiquent que les axones RGN (SMI31-positif : vert) et les flèches jaunes indiquent des corps neuronaux et des dendrites (514 positifs : rouge et jaune). (D,E) Les graphiques montrent une déviation moyenne et standard du pourcentage de neurones présentant des axones et l’indice de régénération axonale, un paramètre reflétant la longueur axonale moyenne (μm) des axones par neurone. Un minimum de 30 photos (40x) ont été prises sur des champs aléatoires et quantifiées pour chaque échantillon de cellule. Des expériences ont été réalisées en triplicate, à partir de trois rats différents (N = 3), tissu rétinien mis en commun des deux yeux, avec des doublons pour chaque condition expérimentale (chaque population de glia testés). Les astérisques indiquent la signification statistique : *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, NS: non importance (comparaisons de test Tukey ANOVA et post hoc entre les paramètres quantifiés pour Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL, et Ts12 vs PLL). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La transplantation d’OEG aux emplacements de dommages de CNS est considérée une thérapie prometteuse pour des dommages de CNS dus à ses propriétés pro-neurorégénérativesconstitutives 7,8,9. Toutefois, selon la source tissulaire — muqueuse olfactive (OM-OEG) par rapport à l’ampoule olfactive (OB-OEG) — ou l’âge du donneur, il existe des variations considérables dans cettecapacité 26,31,33,36. Par conséquent, il est important d’avoir un modèle in vitro facile et reproductible pour évaluer la capacité neurorégénérative d’un échantillon oeg donné, avant d’entreprendre des études in vivo. Dans ce protocole, rgn axotomized de rats adultes sont cocultured sur un monocouche de l’OEG pour l’essai. L’analyse suivante des marqueurs axonals et somatodendritic de RGN par immunofluorescence est exécutée pour évaluer la régénération axonale de RGN.
Une difficulté initiale de l’analyse est la source de l’OEG. Dans ce travail, nous utilisons réversible immortalisé oeg humain (ihOEG) lignes clonales, précédemment établi et caractérisé par notregroupe 15,16,17,18, qui fournissent un approvisionnement illimité d’OEG homogène. Deux de ces lignées cellulaires ihOEG sont Ts14, qui maintient la capacité régénératrice des cultures originales et Ts12, une ligne régénérative faible qui est utilisée comme un contrôle de régénération faible dans cesexpériences 18 Néanmoins, bien que des limitations techniques existent pour étendre les cellules OEG primaires humaines, ils peuvent également être obtenus à partir de biopsies endoscopiques nasales - OM - ou, dans le cas de OB-OEG, de donneurs de cadavres.
La préparation des cultures oeg monocouches est une procédure cruciale, car trop de cellules pourraient provoquer la coculture de se détacher de la plaque. Par conséquent, avant la préparation de l’OEG pour l’analyse, il est recommandé que l’utilisateur détermine le nombre optimal de cellules à plaquer, en fonction de leur taille et le taux de division.
Une autre question critique est la dissociation des tissus rétiniens, après la dissection de la rétine. Il est nécessaire de briser les fragments de tissu, après incubation dans le mélange de dissociation. Si elles sont faites trop vigoureusement, les cellules seront détruites, mais les fragments de tissu seront laissés intacts s’ils sont faits trop faiblement. Afin d’obtenir une suspension cellulaire homogène, nous vous suggérons de remplir et de vider une pipette Pasteur 10 à 15 fois, avec une pointe de diamètre intermédiaire, tout en évitant les bulles. Les pipettes Pasteur avec de larges pointes peuvent être rétrécies à l’aide d’un brûleur Bunsen.
Pour évaluer la capacité des différentes populations gliales à favoriser la régénération axonale des neurones adultes, nous avons déterminé que 96 h est l’intervalle de temps qui convient le mieux à l’objectif parce que: 1) c’est le plus long moment pour maintenir la culture vivante sans perturber le monocouche OEG; et 2) c’est le temps nécessaire pour que les neurones développent des axones assez longtemps pour révéler des différences entre les capacités régénératrices des différentes populations d’OEG ou d’autres cellules non régénératrices (c.-à-d. fibroblastes12,13,14,15,16,17,18,32,33). Il serait certainement intéressant de déterminer le cours du processus de régénération, car il pourrait fournir des informations sur les propriétés régénératrices différentielle des différentes populations gliale, à des moments plus courts de la co-culture. Dans nos mains, pour les gliagénératives, le cours du temps entre 72-96 h est assez similaire pour toutes les lignées cellulaires, bien que les axones soient plus courts à 72 h (données non publiées). En outre, 96 h de co-culture, permet d’étudier les mécanismes oeg-dépendants de la régénération axonaleadulte 12,14.
Au cours de la quantification de régénération axonale, il est important de prendre un minimum de 30 photos à 400 augmentations (objectif 40x), à différentes zones aléatoires de la couverture, mais en suivant les axones complets des neurones photographiés. Par conséquent, l’expérimentateur doit prendre des photos en série dans les zones choisies pour mesurer les longueurs axonales réelles.
D’autres approches in vitro ont également été développées pour évaluer les fonctions régénératrices de l’OEG. Dans ces modèles, oeg est appliqué aux cultures d’origine neuronale différente et, en réponse à la coculture gliaise, la formation de neurite et l’allongement sont assayed19,20,21,22,23,24,25,26,27. Cependant, l’analyse de régénération repose sur des neurones embryonnaires ou postnatals, qui ont une plasticité intrinsèque absente des neurones adultes blessés. Ce modèle consistant en la régénération axonale adulte dans les cocultures des lignes d’OEG avec les neurones rétiniens adultes de ganglion (RGNs) surmonte cet inconvénient. En outre, nous disséquer les rétines adultes, et parce que nous avons coupé le nerf optique et les axones se rétracter dans le processus de dissection, nous obtenons des corps neuronaux propres de la myéline, pour effectuer la coculture. C’est la différence avec d’autres parties du SNC adulte, où la myéline peut entraver beaucoup avec la dissection pour obtenir des neurones propres pour la coculture.
Sur la base de celui développé à l’origine par Wigley et coll.28,29,30,31, nous soulignons les améliorations suivantes dans le protocole. Tout d’abord, l’utilisation d’un milieu neurobasal complété par B27 comme milieu de coculture OEG-RGN, qui permet la croissance des cellules neuronales et affecte positivement la reproductibilité de l’expérience. Deuxièmement, nous caractérisons et quantifions la régénération axonale à l’aide d’un marqueur spécifique du compartiment axonal; et troisièmement, nous utilisons un paramètre direct supplémentaire, la longueur/neurone axonal moyen, qui évalue le potentiel régénérateur de croissance axonale d’OEG.
En résumé, nous considérons qu’il s’agit d’un essai simple, reproductible, gain de temps et à coût moyen, non seulement utile pour évaluer le potentiel neurorégénératif de l’ihOEG, mais aussi parce qu’il peut être étendu à différentes sources d’OEG ou d’autres cellules gliales. En outre, il pourrait être utilisé comme une preuve précieuse du concept du potentiel neurorégénératif d’un OEG ou d’un échantillon gliale, avant traduction à des études in vivo ou cliniques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus financièrement par le projet SAF2017-82736-C2-1-R de Ministerio de Ciencia e Innovación à MTM-F et par fundación Universidad Francisco de Vitoria à JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
References
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