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Neuroscience

Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 1, 3
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

Summary

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell zur Beurteilung der olfaktorischen Ensheathing Glia (OEG) neuroregenerativen Kapazität, nach neuronalen Verletzungen. Es basiert auf einer Kokultur von axotomisierten adulten retinalen Ganglion neuronen (RGN) auf OEG-Monolayer und anschließende Studie der axonalen Regeneration, durch die Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern.

Abstract

Olfaktorische Ensheathing-Glia-Zellen (OEG) werden von der Riechschleimhaut bis hin zur Riechnervenschicht (ONL) der Riechbirne lokalisiert. Während des gesamten Erwachsenenlebens sind sie der Schlüssel für den axonalen Anbau von neu erzeugten olfaktorischen Neuronen, von der Lamina propria bis zum ONL. Aufgrund ihrer pro-regenerativen Eigenschaften wurden diese Zellen verwendet, um die axonale Regeneration in Rückenmarks- oder Sehnervenverletzungsmodellen zu fördern.

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell, um die neuroregenerative OEG-Kapazität nach neuronalen Verletzungen zu assayen und zu messen. In diesem Modell wird reversibel verewigtes menschliches OEG (ihOEG) als Monolayer kultiviert, Netzhaut werden aus erwachsenen Ratten extrahiert und Retinalganglionneuronen (RGN) werden auf die OEG-Monoschicht kokultiviert. Nach 96 h werden axonale und somatodendritische Marker in RGNs durch Immunfluoreszenz analysiert und die Anzahl der RGNs mit Axon und die mittlere axonale Länge/Neuron quantifiziert.

Dieses Protokoll hat den Vorteil gegenüber anderen In-vitro-Assays, die auf embryonalen oder postnatalen Neuronen basieren, dass es die neuroregenerativen OEG-Eigenschaften im erwachsenen Gewebe bewertet. Es ist auch nicht nur nützlich für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG, sondern kann auch auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden.

Introduction

Adult Central Nervous System (ZNS) Neuronen haben begrenzte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen oder Krankheiten. Eine gemeinsame Strategie zur Förderung der ZNS-Regeneration ist die Transplantation von Zelltypen an der Verletzungsstelle, die axonales Wachstum induzieren, wie Stammzellen, Schwannzellen, Astrozyten oder olfaktorische Ensheathing-Glia (OEG)-Zellen1,2,3,4,5.

OEG leitet sich vom Neuralkamm6 ab und lokalisiert in der riech-Mukose und in der Riechbirne. Bei Erwachsenen sterben olfaktorische sensorische Neuronen regelmäßig als Folge der Umweltexposition und werden durch neu differenzierte Neuronen ersetzt. OEG umgibt und führt diese neuen olfaktorischen Axone in die Riechbirne und um neue Synapsen mit ihren Zielen in der CNS7zuetablieren. Aufgrund dieser physiologischen Eigenschaften, OEG wurde in Modellen der ZNS-Verletzung wie Rückenmark oder Sehnerv-Verletzung verwendet und seine neuroregenerativen und neuroprotektive Eigenschaften werden bewiesen8,9,10,11. Mehrere Faktoren wurden als verantwortlich für die pro-regenerativen Eigenschaften dieser Zellen identifiziert, einschließlich extrazellulärer Matrixproteasen Produktion oder Sekretion von neurotrophen und axonalen Wachstumsfaktoren12,13,14.

Angesichts der technischen Einschränkungen zur Erweiterung primärer OEG-Zellen haben wir zuvor reversible, unsterblichen humane OEG (ihOEG) Klonlinien etabliert und charakterisiert, die eine unbegrenzte Versorgung mit homogenen OEG bieten. Diese ihOEG-Zellen stammen aus Primärkulturen, die aus olfaktorischen Glühbirnen hergestellt werden, die in Autopsien gewonnen werden. Sie wurden durch Transduktion der telomerase katalytischen Untereinheit (TERT) und des Onkogens Bmi-1 verewigt und mit dem SV40-Virus großes T-Antigen15,16,17,18modifiziert. Zwei dieser ihOEG-Zelllinien sind Ts14, das die Regenerationsfähigkeit der ursprünglichen Kulturen beibehält, und Ts12, eine niedrige regenerative Linie, die in diesen Experimenten als niedrige Regenerationskontrolle verwendet wird18.

Zur Bewertung der OEG-Fähigkeit zur Förderung der axonalen Regeneration nach neuralen Verletzungen wurden mehrere In-vitro-Modelle implementiert. In diesen Modellen wird OEG auf Kulturen unterschiedlicher neuronaler Herkunft angewendet und Neuritenbildung und Dehnung – als Reaktion auf gliaale Kokultur – werden als Assay untersucht. Beispiele für solche neuronalen Quellen sind neonatale Ratte kortikale Neuronen19, Kratzwunden an Ratten embryonalen Neuronen aus kortikalen Gewebedurchgeführt 20, Ratte Netzhautexplante21, Ratte hypothalamische oder hippocampale postnatale Neuronen22,23, postnatale Ratte dorsale Wurzel Ganglion Neuronen24, postnatale Maus kortikospinalen Trakt Neuronen25, menschliche NT2 Neuronen26, oder postnatale zerebrale kortikale Neuronen auf reaktive Astrozyten Narben-ähnliche Kulturen27.

In diesen Modellen beruht der Regenerationstest jedoch auf embryonalen oder postnatalen Neuronen, die eine intrinsische Plastizität aufweisen, die bei verletzten erwachsenen Neuronen fehlt. Um diesen Nachteil zu überwinden, präsentieren wir ein Modell der erwachsenen axonalen Regeneration in Kokulturen von OEG-Linien mit erwachsenen retinalen Ganglionneuronen (RGNs), basierend auf dem ursprünglich von Wigley et al.28,29,30,31 und modifiziert und von unserer Gruppe12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kurz gesagt, Netzhautgewebe wird von erwachsenen Ratten extrahiert und mit Papain verdaut. Die Netzhautzellsuspension wird dann entweder auf polylysinbehandelten Abdeckungen oder auf Ts14- und Ts12-Monolayern plattiert. Kulturen werden 96 h lang gepflegt, bevor sie fixiert werden, und dann wird immunfluoreszenz für axonale (MAP1B- und NF-H-Proteine)34 und somatodendritische (MAP2A und B)35 Marker durchgeführt. Die axonale Regeneration wird als Prozentsatz der Neuronen mit Axon quantifiziert, in Bezug auf die Gesamtpopulation der RGNs und der axonale Regenerationsindex wird als mittlere axonale Länge pro Neuron berechnet. Dieses Protokoll ist nicht nur nützlich für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG, sondern kann auch auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden.

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Protocol

HINWEIS: Tierversuche wurden von nationalen und institutionellen Bioethik-Ausschüssen genehmigt.

1. ihOEG (Ts12 und Ts14) Kultur

HINWEIS: Dieses Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einem Gewebekultur-Biosicherheitsschrank durchgeführt.

  1. Bereiten Sie 50 ml ME10 OEG-Kulturmedium wie in Tabelle 1vorgesehen vor.
  2. Bereiten Sie 5 ml DMEM/F12-FBS, wie in Tabelle 1vorgesehen, in einem 15 ml konischen Rohr vor.
  3. Beide Medien bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad 15 min erwärmen.
  4. Ts12- und Ts14-Zellen fläschbar bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad.
  5. Resuspendieren und fügen Sie Zellen zum DMEM/F12-FBS-Kulturmedium hinzu, das in Schritt 2 vorbereitet wurde.
  6. Zentrifuge für 5 min bei 200 x g.
  7. Aspirieren Sie den Überstand.
  8. Fügen Sie 500 l ME10 medium hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf.
  9. Bereiten Sie eine p60 Zellkulturschale mit 3 ml ME10 vor und fügen Sie die zelluläre Suspension tropfenweise hinzu.
  10. Bewegen Sie sich, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen.
  11. Kulturzellen bei 37 °C in 5%CO2.
    HINWEIS: Nach dem Erreichen des Zusammenflusses muss mindestens ein weiterer Durchgang durchgeführt werden, um Zellen für die Kokultur zu optimieren. 90 % Zusammenfluss werden benötigt, bevor sie auf den Deckeln für die Kokultur gesät werden. Eine konfluente p-60 hat eine mittlere Zellzahl von 7 x 105 für Ts14 und 2,5 x 106 für Ts12-Zelllinien. Die Zelllinien Ts12 und Ts14 sollten alle 2–3 Tage durchgelassen werden.

2. Vorbereitung von ihOEG (Ts12 und Ts14) für den

HINWEIS: Dieser Schritt muss 24 h vor DER RGN-Sektion und Kokultur durchgeführt werden.

  1. 12 mm ,-Abdeckungen mit 10 g/ml Poly-L-Lysin (PLL) für 1 h behandeln.
    HINWEIS: Die Abdeckungen können über Nacht in der PLL-Lösung gelassen werden.
  2. Waschen Sie die Deckellipsen dreimal mit 1x Phosphatpuffer-Saline (PBS).
  3. Trennen Sie Ts12 und Ts14 ihOEG-Zellen von p60-Zellkulturschale.
    1. 4 ml DMEM/F12-FBS Kulturmedium (Tabelle 1) zu einem 15 ml konischen Rohr hinzufügen. Bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad erwärmen.
    2. Entfernen Sie das Medium von Platten und Waschzellen mit 1 ml 1x 1x PBS-EDTA, einmal.
    3. 1 ml Trypsin-EDTA in die OEG-Zellen geben und 3–5 min bei 37 °C, 5%CO2brüten.
    4. Sammeln Sie Zellen mit einer p1000 Pipette und übertragen Sie sie auf Mittel in Schritt 3.1 vorbereitet.
    5. Zentrifuge für 5 min bei 200 x g.
    6. Aspirieren Sie den Überstand.
    7. 1 ml ME10 medium hinzufügen und das Pellet wieder aussetzen.
    8. Zählen Sie die Zellenzahl in einem Hämozytometer.
  4. Samen 80.000 Ts14-Zellen oder 100.000 Ts12-Zellen/well auf die Decklippen in 24-Well-Platten in 500 l ME10 medium.
  5. Kulturzellen bei 37 °C in 5%CO2, für 24 h.

3. Netzhautgewebesektion

HINWEIS: 2 Monate alte männliche Wistar Ratten werden als RGN-Quelle verwendet. Zwei Netzhaut (eine Ratte) für 20 Brunnen einer 24-Well-Zellschale. Autoklav chirurgisches Material vor gebrauchen. Papain Dissoziations-Kit wird kommerziell gekauft (Tabelle der Materialien). Befolgen Sie die Anweisungen des Anbieters zur Rekonstitution. D,L-2-amino-5-phosphonovalersäure (APV) in 5 mM Vorrat rekonstituieren und die Aliquots vorbereiten.

  1. Bereiten Sie am Tag des Testes die folgenden Medien vor.
    1. Bereiten Sie eine p60 Zellkulturschale mit 5 ml kaltem EBSS (Vial 1 des Papain-Dissoziationskits) zu.
    2. Bereiten Sie eine p60 Zellkulturschale mit rekonstituierter Durchstechflasche 2 (Papain) des Papain-Dissoziationskits plus 50 l APV vor.  Fügen Sie dann 250 l rekonstituierte Durchstechflasche 3 (DNase plus 5 l APV) hinzu.
    3. In einer sterilen Rohrmischung 2,7 ml Durchstechflasche 1 mit 300 l Durchstechflasche 4 (Albumin-Ovomucoid-Proteasehemmer). Fügen Sie 150 l Durchstechflasche 3 (DNase) plus 30 l APV hinzu.
    4. Bereiten Sie 20 ml Neurobasal-B27 medium (NB-B27) gemäß Tabelle 1vor.
  2. Opfern Sie eine Ratte durch Ersticken mitCO2.
  3. Entfernen Sie den Kopf durch Enthauptung mit Guillotine; In eine 100 mm Petrischale geben und den Kopf mit Ethanol 70% besprühen, bevor er in eine laminare Durchflusshaube gegeben wird.
  4. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Ratte mit einer Schere, damit sie die Augenmanipulation nicht stören.
  5. Greifen Sie den Sehnerv mit Derkunden, um den Augapfel so weit herauszuziehen, dass er mit einem Skalpell einen Schnitt über das Auge machen kann.
  6. Entfernen Sie die Linse und Glaskörper Humor und ziehen Sie die Netzhaut (orange-ähnliches Gewebe), während die verbleibenden Schichten des Auges im Inneren bleiben (einschließlich der Pigment-Epithelschicht).
  7. Legen Sie die Netzhaut in die in Schritt 3.1.1 zubereitete zellkulturgericht p60.
  8. Übertragen Sie die Netzhaut auf die in Schritt 3.1.2 zubereitete p60-Zellkulturschale und schneiden Sie sie mit dem Skalpell in kleine Stücke von ungefährer Größe < 1 mm.
  9. Transfer auf ein 15 ml Kunststoffrohr.
  10. Inkubieren Sie das Gewebe für 30 min, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2, mit Agitation alle 10 min.
  11. Dissoziieren Sie Zellklumpen, indem Sie mit einer glasigen Pasteurpipette nach oben und unten pfeifen.
  12. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min.
  13. Überstand entsorgen und Papain inaktivieren, das Zellpellet in der in Schritt 3.1.3 vorbereiteten Lösung wieder aufsetzen. (1,5 ml für 2 Augen).
  14. Diese Zellsuspension sorgfältig in 5 ml rekonstituierte Durchstechflasche 4 einleiten.
  15. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
  16. Beim Zentrifugieren das ME-10 Medium vollständig von der OEG 24 Brunnenzellplatte (bisher in Schritt 2) entfernen und durch 500 l NB-B27 Medium pro Brunnen ersetzen.
  17. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 2 ml NB-B27-Medium wieder aus.
  18. Platte 100 l Netzhautzellsuspension, pro Bohrung der m24-Platte, auf PLL-behandelte oder OEG-Monolayer-Coverlipslips.
  19. Halten Sie Kulturen bei 37 °C mit 5%CO2 für 96 h in NB-B27 medium.

4. Immunostaining

  1. Fixieren Sie die Zellen nach 96 h für 10 min, indem Sie dem Kulturmedium (600 l) das gleiche Volumen von 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS (600 'L) (PFA Endkonzentration 2%) zusetzen.
  2. Entfernen Sie die Medien und PFA von der 24-Multiwell-Platte und fügen Sie erneut 500 l 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS hinzu. 10 min inkubieren.
  3. Entsorgen Sie den Fixierer und waschen Sie 3 mal mit 1x PBS für 5 min.
  4. Block mit 0,1% Triton X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) für 30–40 min.
  5. Bereiten Sie die primären Antikörper im PBS-TS-Puffer wie folgt vor: SMI31 (gegen MAP1B- und NF-H-Proteine) monoklonaler Antikörper (1:500). 514 (erkennt MAP2A- und B-Proteine) polyklonales Antiserum (1:400).
  6. Fügen Sie Primärantikörper zu Kokulturen hinzu und brüten Sie über Nacht bei 4 °C.
  7. Am nächsten Tag die Antikörper entsorgen und die Deckellipsen mit 1x PBS, 3 mal, für 5 min waschen.
  8. Bereiten Sie die sekundären Antikörper im PBS-TS-Puffer wie folgt vor: Für SMI-31, Anti-Maus Alexa Fluor 488 (1:500). Für 514, Anti-Kaninchen Alexa-594 (1:500).
  9. Inkubieren Sie Zellen mit den entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörpern für 1 h, bei RT, im Dunkeln.
  10. Waschen Sie die Abdeckungen mit 1x PBS, 3 mal, für 5 min, im Dunkeln.
  11. Schließlich befestigen Sie Abdeckungen mit Montagemedium (Materialtabelle) und halten Sie bei 4 °C.
    HINWEIS: Bei Bedarf können fluoreszierende Kerne mit DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindole) gefärbt werden. Vor der Montage die Zellen 10 min im Dunkeln mit DAPI (10 g/ml in 1x PBS) inkubieren. Waschen Sie die Abdeckungen 3 mal mit 1x PBS und montieren Sie schließlich die Abdeckungen mit dem Montagemedium.

5. Axonale Regenerationsquantifizierung

HINWEIS: Die Proben werden unter dem 40-fachen Objektiv eines Epifluoreszenzmikroskops quantifiziert. Mindestens 30 Bilder sollten auf zufälligen Feldern mit mindestens 200 Neuronen aufgenommen werden, die für jede Behandlung quantifiziert werden müssen. Jedes Experiment sollte mindestens dreimal wiederholt werden.

  1. Quantifizieren Sie den Prozentsatz der Neuronen mit Axon (SMI31 positives Neurit) im Verhältnis zur Gesamtpopulation von RGNs (identifiziert mit MAP2A/B 514 positiver Immunostainierung von neuronalen Körpern und Dendriten).
  2. Quantifizieren Sie den axonalen Regenerationsindex oder die mittlere Axonlänge (m/neuron). Dieser Parameter ist definiert als die Summe der Längen (in m) aller identifizierten Axone, dividiert durch die Gesamtzahl der gezählten Neuronen, unabhängig davon, ob sie ein Axon präsentierten oder nicht. Die Axonallänge wird mit dem Plugin NeuronJ der Bildsoftware ImageJ (NIH-USA) bestimmt.
  3. Berechnen Sie den Mittelwert, die Standardabweichung und die statistische Signifikanz mit der entsprechenden Software.

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Representative Results

In diesem Protokoll stellen wir ein In-vitro-Modell vor, um die neuroregenerative OEG-Kapazität nach neuronalen Verletzungen zu assayen. Wie in Abbildung 1dargestellt, ist die OEG-Quelle eine reversible verewigte menschliche OEG-Klonzelllinie -Ts14 und Ts12-, die aus Primärkulturen stammt, die aus geruchserhaltenden Glühbirnen hergestellt werden, die in Autopsien15,17,18hergestellt werden. Netzhautgewebe wird von erwachsenen Ratten extrahiert, verdaut, und Retinal Ganglion Neuronen (RGN) Suspension wird entweder auf PLL-behandelten Abdeckungen oder auf ihOEG Monolayer, Ts14 oder Ts12 plattiert. Kulturen werden für 96 h gehalten, bevor sie fixiert werden. Axonale und somatodendritische Marker werden durch Immunfluoreszenz analysiert und die axonale Regeneration quantifiziert.

Ts14 OEG-Identität wird durch Immunfärbung mit Markern bewertet, die in Ensheathing Glia ausgedrückt werden (Abbildung 2), wie S100 β (Abbildung 2A) und Vimentin (Abbildung 2B); Die GFAP-Expression wurde auch analysiert, um die Kontamination der Astrozyten zu verwerfen (Abbildung 2C). Wie gezeigt, ts14 ausgedrückt S100 β und Vimentin, aber nicht GFAP.

Im axonalen Regenerationstest wird die Regenerationsfähigkeit von Ts14 mit Ts12 in RGN-OEG-Kokulturen verglichen, bei denen PLL-Substrat als Negativkontrolle verwendet wird (Abbildung 3). Sowohl der Anteil der Zellen mit Axonen als auch die durchschnittliche Länge der regenerierten Axone waren bei Neuronen, die auf Ts14-Monolayern kokultiviert wurden, signifikant höher als bei Neuronen, die entweder auf Ts12-Zellen oder PLL plattiert waren (Abbildung 3D,E). Repräsentative Bilder zeigen einen Mangel an Fähigkeit von RGN, ihre Axone über PLL- oder Ts12-Zellen zu regenerieren (Abbildung 3A,B), während Ts14 das Auswachsen von Axonen in RGN (3C) stimuliert.

Figure 1
Abbildung 1: Diagramm der ratnetzretinalen Ganglienneuronen mit olfaktorischer Vererbung glia zell koculture, als Modell der erwachsenen axonalen Regeneration. Verewigte menschliche OEG (ihOEG) klonale Zelllinien -Ts12 und Ts14- abgeleitet von Primärkulturen aus olfaktorischen Glühbirnen. Retinale Ganglienneuronen von erwachsenen Ratten werden entweder auf PLL-behandelten Coverlips (negative Kontrolle) oder auf Ts14- oder Ts12-Monolayern plattiert. Kulturen werden 96 h lang gepflegt, bevor sie fixiert werden, und axonale und somatodendritische Marker werden durch Immunfluoreszenz analysiert. Der Prozentsatz der Neuronen mit Axon und mittlerer Axonlänge/Neuron wird quantifiziert, um die AXonale Regeneration von RGN zu assayen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Identität der ihOEG-Zelllinie Ts14. Immunfluoreszenzbilder von Ts14 in der Kultur, beschriftet mit Anti-S100 β (Panel A, grün) und Vimentin (Panel B, rot). GfAP-Expression (Panel C, rot) wurde auch analysiert, um Astrozytenkontamination zu verwerfen. Kerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Assay zur axonalen Regeneration in Kokulturen von OEG-Linien mit adulten Retinalganglion neuronen (RGNs). (A–C) Immunfluoreszenzbilder, die eine somatodendritische Kennzeichnung mit 514 Antikörpern zeigen, die das mikrotubulieassoziierte Protein MAP2A und B in rot und mit axonspezifischem SMI31-Antikörper in grün gegen MAP1B- und NF-H-Proteine erkennt. Grüne Pfeile zeigen RGN-Axone (SMI31-positiv: grün) und gelbe Pfeile zeigen neuronale Körper und Dendriten (514 positiv: rot und gelb). (D,E) Die Graphikzeigt zeigt den Mittelwert und die Standardabweichung des Prozentsatzes der Neuronen mit Axonen und des axonalen Regenerationsindex, einem Parameter, der die mittlere Axonlänge (m) der Axone pro Neuron widerspiegelt. Mindestens 30 Bilder (40x) wurden auf zufälligen Feldern aufgenommen und für jede Zellprobe quantifiziert. Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung von drei verschiedenen Ratten (N = 3), Netzhautgewebe von beiden Augen gepoolt, mit Duplikaten für jede experimentelle Erkrankung (jede Gliapopulation getestet) durchgeführt. Sternchen geben die statistische Signifikanz an: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, NS: nicht signifizierbar (ANOVA und post hoc Tukey-Testvergleiche zwischen Parametern quantifiziert für Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL und Ts12 vs PLL). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

OEG-Transplantation an ZNS-Verletzungsstellen gilt aufgrund ihrer konstitutiven pro-neuroregenerativen Eigenschaften7,8,9als vielversprechende Therapie für ZNS-Verletzungen. Je nach Gewebequelle – Olfaktorische Schleimhaut (OM-OEG) versus Olfaktorinde (OB-OEG) – oder dem Alter des Spenders besteht jedoch eine erhebliche Veränderung in dieser Kapazität26,31,33,36. Daher ist es wichtig, ein einfaches und reproduzierbares In-vitro-Modell zu haben, um die neuroregenerative Kapazität einer bestimmten OEG-Probe zu untersuchen, bevor in vivo-Studien eintraten. In diesem Protokoll werden die axotomisierten RGN von erwachsenen Ratten auf eine Monoschicht des OEG kokultiviert, um zu assay. Nachfolgende Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern durch Immunfluoreszenz wird durchgeführt, um die axonale RGN-Regeneration zu bewerten.

Eine anfängliche Schwierigkeit des Assays ist die Quelle des OEG. In dieser Arbeit verwenden wir reversible verewigte menschliche OEG (ihOEG) Klonlinien, die zuvor durch unsere Gruppe15,16,17,18gekennzeichnet wurden und eine unbegrenzte Versorgung mit homogenem OEG bieten. Zwei dieser ihOEG-Zelllinien sind Ts14, das die Regenerationsfähigkeit der ursprünglichen Kulturen beibehält, und Ts12, eine niedrige regenerative Linie, die in diesen Experimenten als niedrige Regenerationskontrolle verwendet wird18 Dennoch, obwohl technische Einschränkungen bestehen, um menschliche primäre OEG-Zellen zu erweitern, können sie auch aus nasalen endoskopischen Biopsien – OM – oder, im Falle von OB-OEG, von Kadaverspendern bezogen werden.

Die Herstellung von monolayern OEG-Kulturen ist ein entscheidendes Verfahren, da zu viele Zellen dazu führen könnten, dass sich die Cokultur von der Platte löst. Daher wird empfohlen, dass der Anwender vor der OEG-Vorbereitung für den Test die optimale Anzahl der zu plattierenden Zellen bestimmt, abhängig von ihrer Größe und Teilungsrate.

Ein weiteres kritisches Problem ist die Netzhautgewebedissoziation nach Netzhautsektion. Es ist notwendig, die Gewebefragmente nach der Inkubation in der Dissoziationsmischung aufzubrechen. Wenn dies zu energisch geschieht, werden die Zellen zerstört, aber Gewebefragmente bleiben intakt, wenn sie zu schwach gemacht werden. Um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, empfehlen wir, eine Pasteurpipette 10-15 Mal mit einem Zwischendurchmesser zu füllen und zu entleeren, ohne zu sprudeln. Pasteurpipetten mit breiten Spitzen können mit einem Bunsenbrenner verengt werden.

Um die Fähigkeit verschiedener Gliapopulationen zur Förderung der axonalen Regeneration erwachsener Neuronen zu bewerten, haben wir festgestellt, dass 96 h das Zeitintervall ist, das am besten zum Ziel passt, denn: 1) es ist die längste Zeit, um die Kultur am Leben zu erhalten, ohne die OEG-Monoschicht zu stören; und 2) es ist die Zeit, die Neuronen benötigt, um Axone lang genug zu züchten, um Unterschiede zwischen den regenerativen Fähigkeiten verschiedener OEG-Populationen oder anderer nicht-regenerativer Zellen aufzudecken (d.h. Fibroblasten12,13,14,15,16,17,18,32,33). Es wäre sicherlich interessant, den zeitlichen Verlauf des Regenerationsprozesses zu bestimmen, da er Informationen über die differenzierten regenerativen Eigenschaften verschiedener Gliapopulationen in kürzeren Zeiten der Kokultur liefern könnte. In unseren Händen ist der Zeitverlauf für regenerative Glia für alle Zelllinien ziemlich ähnlich, obwohl Axone bei 72 h kürzer sind (unveröffentlichte Daten). Auch 96 h Kokultur, erlaubt oEG-abhängige Mechanismen der erwachsenen axonalen Regeneration zu studieren12,14.

Bei der axonalen Regenerationsquantifizierung ist es wichtig, mindestens 30 Bilder bei 400 Augmenten (40x Objektiv), an verschiedenen zufälligen Bereichen des Coverslips, aber nach den vollständigen Axonen der fotografierten Neuronen zu machen. Daher muss der Experimentator serielle Bilder in den ausgewählten Bereichen machen, um die realen Axonallängen zu messen.

Weitere In-vitro-Ansätze wurden entwickelt, um oEG-Regenerationsfunktionen zu bewerten. In diesen Modellen wird OEG auf Kulturen unterschiedlicher neuronaler Herkunft angewendet und als Reaktion auf gliaale Kokultur, Neuritenbildung und Dehnung werdenuntersucht 19,20,21,22,23,24,25,26,27. Der Regenerationstest beruht jedoch auf embryonalen oder postnatalen Neuronen, die eine intrinsische Plastizität haben, die von verletzten erwachsenen Neuronen fehlt. Dieses Modell, das aus der axonalen Regeneration erwachsener Erwachsener in Kokulturen von OEG-Linien mit adulten Retinal-Ganglien-Neuronen (RGNs) besteht, überwindet diesen Nachteil. Darüber hinaus sezieren wir adulte Netzhaut, und weil wir Sehnerven schneiden und Axone im Prozess der Zerlegung zurückziehen, erhalten wir neuronale Körper sauber von Myelin, um die Kokultur durchzuführen. Dies ist der Unterschied zu anderen Teilen des erwachsenen ZNS, wo Myelin sehr stark mit der Sezieren behindern kann, um saubere Neuronen für die Cokultur zu erhalten.

Basierend auf der ursprünglich von Wigley et al.28,29,30,31entwickelten , heben wir die folgenden Verbesserungen im Protokoll hervor. Erstens, die Verwendung von neurobasalen Medium mit B27 als OEG-RGN-Cokulturmedium ergänzt, die das Wachstum von neuronalen Zellen ermöglicht und positiv wirkt sich auf die Reproduzierbarkeit des Experiments. Zweitens charakterisieren und quantifizieren wir die axonale Regeneration, indem wir einen bestimmten Marker des axonalen Fachs verwenden; und drittens verwenden wir einen zusätzlichen direkten Parameter, die mittlere axonale Länge/Neuron, der das axonale Wachstums-Regenerationspotenzial von OEG bewertet.

Zusammenfassend sind wir der Ansicht, dass dies ein einfacher, reproduzierbarer, zeitsparender und kostengünstiger Assay ist, der nicht nur für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG nützlich ist, sondern auch, weil er auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden kann. Darüber hinaus könnte es als wertvoller Beweis für das Konzept des neuroregenerativen Potenzials einer OEG oder Gliaprobe verwendet werden, bevor es in in vivo oder klinische Studien übersetzt wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Projekt SAF2017-82736-C2-1-R von Ministerio de Ciencia e Innovacién bis MTM-F und durch die Stiftung Universidad Francisco de Vitoria an JS finanziell unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurowissenschaften Ausgabe 165 olfaktorische Ensheathing Glia (OEG) adult axonale Regeneration In-vitro-Assay Retinal Ganglion Neuronen (RGN) Kokultur Axotomie
Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration
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Portela-Lomba, M., Simón, D.,… More

Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

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