Summary
אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.
Abstract
תאי גליה מעוגנים חוש הריח (OEG) מותאמים כל הדרך מן רירית הריח אל ולתוך שכבת עצב הריח (ONL) של נורת הריח. לאורך כל החיים הבוגרים, הם המפתח לגידול אקסונלי של נוירונים חוש הריח החדש שנוצר, מן הפרופריה למינה ל ONL. בשל תכונותיהם הפרו-רגנרטיביות, תאים אלה שימשו לטיפוח התחדשות אקסונית בחוט השדרה או במודלים של פגיעה בעצב הראייה.
אנו מציגים מודל במבחנה כדי לבצע בדיקה ולמדוד את היכולת הנוירו-רה-רגנרטיבית של OEG לאחר פגיעה עצבית. במודל זה, OEG אנושי מונצח באופן הפיך (ihOEG) הוא מתורבת כמונולאייר, רשתית מופקים חולדות מבוגרים נוירונים גנגליון רשתית (RGN) הם cocultured על מונולאיר OEG. לאחר 96 שעות, סמנים אקסונליים וסמוטונדריטיים ב- RGNs מנותחים על ידי כשל חיסוני ומספר ה- RGNs עם אקסון והאורך/נוירון האקסונלי הממוצע מכומתים.
לפרוטוקול זה יש יתרון על פני מבחני הפריה חוץ גופיים אחרים המסתמכים על נוירונים עובריים או לאחר לידה, כי הוא מעריך תכונות נוירו-רגנרטיביות OEG ברקמה הבוגרת. כמו כן, זה לא רק שימושי להערכת הפוטנציאל neuroregenerative של ihOEG אבל ניתן להרחיב למקורות שונים של OEG או תאים גליה אחרים.
Introduction
נוירונים במערכת העצבים המרכזית למבוגרים (CNS) יש יכולת רגנרטיבית מוגבלת לאחר פציעה או מחלה. אסטרטגיה נפוצה לקידום התחדשות מערכת העצבים המרכזית היא השתלה, באתר הפציעה, של סוגי תאים שגורמים לצמיחה אקסונאלית כגון תאי גזע, תאי שוואן, אסטרוציטים או חוש הריח ensheathing גליה (OEG) תאים1,2,3,4,5.
OEG נובעת מהציצה העצבית6 ומאתרת ברירית הריח ובנורת הריח. אצל המבוגרים, נוירונים חושיים חושיים חושיים מתים באופן קבוע כתוצאה מחשיפה סביבתית והם מוחלפים על ידי נוירונים שהובחנו לאחרונה. OEG מקיפה ומנחה את האקסונים חוש הריח החדשים האלה להיכנס לנורת הריח ולהקים סינפסות חדשות עם המטרות שלהם במערכת העצבים המרכזית7. בשל תכונות פיזיולוגיות אלה, OEG שימש במודלים של פגיעה במערכת העצבים המרכזית כגון פגיעה בחוט השדרה או בעצב הראייה ותכונותיו הנוירו-רגנרטיביות והנוירו-פרוטקטיביות מוכחות8,9,10,11. מספר גורמים זוהו כאחראים למאפיינים הפרו-רגנרטיביים של תאים אלה, כולל ייצור פרוטאזות מטריצה חוץ-תאית או הפרשת גורמי גדילה נוירוטרופיים וקסוניים12,13,14.
בהתחשב במגבלות הטכניות להרחבת תאי OEG ראשוניים, הקמנו בעבר ואפיינו קווי שיבוט אנושיים מונצחים הפיכים (ihOEG), המספקים אספקה בלתי מוגבלת של OEG הומוגני. תאים אלה ihOEG נובעים תרבויות ראשוניות, מוכן נורות חוש הריח שהושגו נתיחה שלאחר המוות. הם הונצחו על ידי התמרה של subunit קטליטית טלומראז (TERT) ואת oncogene Bmi-1 ושונו עם וירוס SV40 גדול T אנטיגן15,16,17,18. שניים מקווי תא ihOEG אלה הם Ts14, אשר שומר על יכולת ההתחדשות של התרבויות המקוריות ו Ts12, קו רגנרטיבי נמוך המשמש בקרת התחדשות נמוכה בניסויים אלה18.
כדי להעריך את יכולת OEG לטפח התחדשות אקסונלית לאחר פגיעה עצבית, מספר מודלים במבחנה יושמו. במודלים אלה, OEG מוחל על תרבויות ממוצא עצבי שונה היווצרות neurite והתארכות – בתגובה coculture גליה – הם assayed. דוגמאות של מקורות עצביים כאלה הם נוירונים קליפת המוח חולדה יילודים19, פצעי שריטה שבוצעו על נוירונים עובריים חולדה מרקמת קליפת המוח20, חולדה רשתית explants21, חולדה היפותלמית או היפוקמפוס לאחר הלידה נוירונים22,23, נוירונים גנגליון שורש עכברוש לאחר הלידה24, נוירונים קורטיקוספינל עכבר לאחר הלידה25, נוירונים אנושיים NT226, או נוירונים קליפת המוח לאחר הלידה על תרבויות אסטרוציטים תגובתי דמוי צלקת27.
במודלים אלה, לעומת זאת, מבחני ההתחדשות מסתמכים על נוירונים עובריים או לאחר לידה, שיש להם פלסטיות מהותית הנעדרת בנוירונים בוגרים פצועים. כדי להתגבר על החיסרון הזה, אנו מציגים מודל של התחדשות אקסונלית למבוגרים ב cocultures של קווי OEG עם נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים (RGNs), המבוסס על אחד שפותח במקור על ידי Wigley et al.28,29,30,31 ושונה בשימוש על ידי הקבוצה שלנו12,13,14,15,16,17,18,32,33. בקצרה, רקמת הרשתית מופקת מעכברושים בוגרים ומתעכלת עם פפאין. השעיית תאי רשתית מצופה לאחר מכן על כיסויים שטופלו בפוליסין או על Ts14 ו Ts12 monolayers. תרבויות נשמרות במשך 96 שעות לפני שהם קבועים ולאחר מכן immunofluorescence עבור אקסונל (MAP1B ו NF-H חלבונים)34 ו somatodendritic (MAP2A ו- B)35 סמנים מבוצע. התחדשות אקסונלית מכומתת כאחוז של נוירונים עם אקסון, ביחס לאוכלוסייה הכוללת של RGNs ומדד התחדשות אקסונלי מחושב כאורך אקסונלי ממוצע לכל נוירון. פרוטוקול זה אינו שימושי רק להערכת הפוטנציאל הנוירו-רגנרטיבי של ihOEG, אלא ניתן להרחיבו למקורות שונים של OEG או תאי גליה אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדות ביואתיקה לאומיות ומוסדיות.
1. תרבות ihOEG (Ts12 ו- Ts14)
הערה: הליך זה נעשה בתנאים סטריליים בארון biosafety תרבית רקמות.
- הכן 50 מ"ל ME10 OEG תרבות בינונית כפי שסופק בטבלה 1.
- הכן 5 מ"ל של DMEM / F12-FBS, כפי שסופק בטבלה 1, בצינור חרוט 15 מ"ל.
- מחממים את שתי המדיה ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים, במשך 15 דקות.
- להפשיר Ts12 ו Ts14 בקבוקונים תאים ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים.
- התחדש והוסף תאים למדיום התרבות DMEM/F12-FBS שהוכן בשלב 2.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם.
- שאפו את הסופרנט.
- הוסף 500 μL של ME10 בינוני ו resuspend גלולה.
- הכן צלחת תרבות תא p60 עם 3 מ"ל של ME10 ולהוסיף את ההשעיה הסלולר, dropwise.
- העבר כדי לפזר את התאים באופן אחיד על פני הצלחת.
- תאי תרבות ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2.
הערה: לאחר הגעה להתכנסות, יש לעשות לפחות מעבר נוסף כדי למטב תאים עבור coculture. 90% מפגש יש צורך לפני זריעת אותם על כריכות עבור coculture. p-60 confluent יש מספר תא ממוצע של 7 x 105 עבור Ts14 ו 2.5 x 106 עבור קווי תא Ts12. יש להעביר קווי תאים Ts12 ו- Ts14 כל 2-3 ימים.
2. הכנת ihOEG (Ts12 ו- Ts14) לבדיקה
הערה: שלב זה חייב להיעשות 24 שעות לפני ניתוח RGN ושיתוף פעולה.
- יש לטפל בכיסויי Ø 12 מ"מ עם 10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-ל-לידין (PLL) למשך שעה.
הערה: ניתן להשאיר את הכיסויים למשך הלילה בפתרון PLL. - לשטוף את הכיסויים עם 1x פוספט מלח חיץ (PBS), שלוש פעמים.
- נתק תאי Ts12 ו- Ts14 ihOEG מתבשיל תרבות התא p60.
- הוסף 4 מ"ל של מדיום תרבות DMEM/F12-FBS(טבלה 1)לצינור חרוט של 15 מ"ל. חם ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים.
- הסר את המדיום מצלחות ולשטוף תאים עם 1 מ"ל של 1x PBS-EDTA, פעם אחת.
- הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לתאי OEG והדגירה במשך 3-5 דקות ב 37 °C (69 °F), 5% CO2.
- לאסוף תאים עם p1000 פיפטה ולהעביר אותם בינוני מוכן בשלב 3.1.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם.
- שאפו את הסופרנט.
- הוסף 1 מ"ל של ME10 בינוני ו resuspend גלולה.
- ספור את מספר התא במד המוציטים.
- זרע 80,000 תאי Ts14 או 100,000 תאי Ts12 / גם על הכותרות בלוחות 24-באר ב 500 μL של ME10 בינוני.
- תאי תרבות ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2, עבור 24 שעות.
3. ניתוח רקמת רשתית
הערה: חולדות Wistar זכר בן חודשיים משמשים כמקור RGN. שתי רשתיות (חולדה אחת) עבור 20 בארות של צלחת תא 24-באר. מובלעת אוטומטית של חומר כירורגי לפני השימוש. ערכת ניתוק פפאין נרכשת באופן מסחרי(שולחן החומרים). בצע את הוראות הספק לצורך השבה. לשקם D,L-2-אמינו-5-phosphonovaleric חומצה (APV) במלאי 5 מ"מ ולהכין את aliquots.
- ביום ההסמכה, הכינו את המדיה הבאה.
- הכן צלחת תרבות תא p60 עם 5 מ"ל של EBSS קר (בקבוקון 1 של ערכת דיסוציאציה פפאין).
- הכן צלחת תרבות התא p60 עם בקבוקון מחדש 2 (פפאין) של ערכת דיסוציאציה פפאין בתוספת 50 μL של APV. לאחר מכן, להוסיף 250 μL של בקבוקון 3 (DNase בתוספת 5 μL של APV).
- בצינור סטרילי לערבב 2.7 מ"ל של בקבוקון 1 עם 300 μL של בקבוקון 4 (מעכב פרוטאז אלבומין-ovomucoid). הוסף 150 μL של בקבוקון 3 (DNase) בתוספת 30 μL של APV.
- הכן 20 מ"ל של מדיום Neurobasal-B27 (NB-B27) כפי שסופק בטבלה 1.
- להקריב חולדה על ידי חנק עם CO2.
- הסר את הראש על ידי עריפת ראש עם גיליוטינה; מניחים אותו בצלחת פטרי 100 מ"מ ומרססים את הראש באתנול 70% לפני שמניחים אותו במכסה המנוע של זרימת למינאר.
- חותכים את השפם של החולדה עם מספריים כדי שהם לא יפריעו למניפולציה בעין.
- לאחוז בעצב הראייה עם מלקחיים כדי לשלוף את גלגל העין מספיק כדי להיות מסוגל לעשות חתך על פני העין עם אזמל.
- הסר את העדשה ואת ההומור זגוגית ולשלוף את הרשתית (רקמה דמוית כתום), בעוד השכבות הנותרות של העין להישאר בפנים (כולל שכבת אפיתל פיגמנט).
- מניחים את הרשתית בצלחת תרבות התא p60 מוכן בשלב 3.1.1.
- מעבירים את הרשתית לצלחת תרבות התא p60 שהוכנה בשלב 3.1.2 וחותכים אותה עם האזמל בחתיכות קטנות בגודל משוער < 1 מ"מ.
- מעבירים לצינור פלסטיק 15 מ"ל.
- דגירה את הרקמה במשך 30 דקות, באינקובטור לח ב 37 °C (70 °F) תחת 5% CO2, עם תסיסה כל 10 דקות.
- לנתק גושי תאים על ידי צנרת למעלה ולמטה עם פיפט פסטר זכוכית.
- צנטריפוגה השעיית התא ב 200 x g במשך 5 דקות.
- להשליך supernatant כדי להשבית פפאין, resuspend גלולה התא בתמיסה שהוכנה בשלב 3.1.3. (1.5 מ"ל עבור 2 עיניים).
- בזהירות pipet השעיית תא זה לתוך 5 מ"ל של בקבוקון מחדש 4.
- צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- תוך כדי צנטריפוגה, להסיר לחלוטין את ME-10 בינוני מלוח התא OEG 24 היטב (שהוכן בעבר בשלב 2) ולהחליף אותו עם 500 μL של NB-B27 בינוני לכל באר.
- השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 2 מ"ל של NB-B27 בינוני.
- צלחת 100 μL של השעיית תאי רשתית, לכל באר של צלחת m24, על PLL מטופלים או OEG monolayers-coverslips.
- לשמור על תרבויות ב 37 °C (70 °F) עם 5% CO2 עבור 96 שעות במדיום NB-B27.
4. חיסון
- לאחר 96 שעות, לתקן את התאים במשך 10 דקות על ידי הוספת נפח זהה של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS למדיום התרבות (600 μL) (ריכוז סופי PFA 2%).
- הסר את המדיה ואת PFA מהצלחת 24 multiwell ושוב להוסיף 500 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS. דגירה במשך 10 דקות.
- השלך את המתקן ולשטוף 3 פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות.
- חסום עם 0.1% טריטון X-100/1% FBS ב- PBS (PBS-TS) למשך 30-40 דקות.
- הכינו את הנוגדנים העיקריים במאגר PBS-TS כדלקמן: SMI31 (נגד חלבוני MAP1B ו- NF-H) נוגדן חד שבטי (1:500). 514 (מזהה חלבוני MAP2A ו- B) אנטיסרום פוליקלונלי ארנב (1:400).
- מוסיפים נוגדנים ראשוניים לקוקולטורות ומדגרים במשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
- למחרת, להשליך את הנוגדנים ולשטוף את coverslips עם 1x PBS, 3 פעמים, במשך 5 דקות.
- הכינו את הנוגדנים המשניים במאגר PBS-TS כדלקמן: עבור SMI-31, נגד העכבר אלקסה פלואור 488 (1:500). עבור 514, אנטי ארנב אלקסה-594 (1:500).
- דגירה תאים עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים המתאימים במשך 1 שעות, ב RT, בחושך.
- לשטוף את העטיפות עם 1x PBS, 3 פעמים, במשך 5 דקות, בחושך.
- לבסוף, הר coverslips עם מדיוםהרכבה (שולחן החומרים)ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
הערה: במידת הצורך, ניתן לבצע כתמי גרעיני פלואורסצנטיים עם DAPI (4,6-diamidino-2-פנילינדול). לפני ההרכבה, דגירה התאים במשך 10 דקות בחושך עם DAPI (10 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS). לשטוף את coverslips 3 פעמים עם 1x PBS ולבסוף, הר את coverslips עם מדיום הרכבה.
5. כימות התחדשות אקסון
הערה: דגימות מכמתות תחת המטרה 40x של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. מינימום של 30 תמונות יש לצלם על שדות אקראיים, עם לפחות 200 נוירונים, כדי לכמת עבור כל טיפול. כל ניסוי צריך לחזור על עצמו לפחות שלוש פעמים.
- לכמת את אחוז הנוירונים עם אקסון (SMI31 נייטריט חיובי) ביחס לאוכלוסייה הכוללת של RGNs (מזוהה עם MAP2A / B 514 חיסון חיובי של גוף עצבי דנדריטים).
- לכמת את אינדקס התחדשות אקסון או ממוצע אורך אקסונלי (μm / נוירון). פרמטר זה מוגדר כסכום האורכים (ב מיקרומטר) של כל האקסונים שזוהו, מחולק במספר הכולל של נוירונים שנספרו, בין אם הם הציגו אקסון או לא. אורך אקסונל נקבע באמצעות התוסף NeuronJ של תוכנת התמונה ImageJ (NIH-USA).
- חשב את הממוצע, סטיית התקן והמובהקות הסטטיסטית באמצעות התוכנה המתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל במבחנה כדי לתבוע את היכולת הנוירו-רגנרטיבית של OEG לאחר פגיעה עצבית. כפי שמוצג באיור 1, מקור ה-OEG הוא קו תאים שיבוט אנושי מונצח הפיך -Ts14 ו- Ts12-, הנובע מתרבויות עיקריות, המוכן מנורות חוש הריח המתקבלות בנתיחה שלאחר המוות15,17,18. רקמת רשתית מופקת חולדות מבוגרים, מתעכל, נוירונים גנגליון רשתית (RGN) השעיה מצופה על כיסויים שטופלו PLL או על monolayers ihOEG, Ts14 או Ts12. תרבויות נשמרים במשך 96 שעות לפני שהם קבועים. סמנים אקסונליים וסמוטונדריטיים מנותחים על ידי כשל חיסוני והתחדשות אקסונלית מכומתת.
זהות ה-OEG של Ts14 מוערכת על ידי חיסון עם סמנים המתוארים כמתבטאים בהסתרת גליה (איור 2), כגון S100 β (איור 2A) ו-vimentin (איור 2B); ביטוי GFAP נותח גם כדי להשליך זיהום אסטרוציטים (איור 2C). כפי שמוצג, Ts14 ביטא S100 β ו vimentin אבל לא GFAP.
בחשבון ההתחדשות האקסונלי, קיבולת ההתחדשות של Ts14 מושווית ל- Ts12 בקוקולטורות RGN-OEG, תוך שימוש במצע PLL כפקד שלילי (איור 3). הן אחוז התאים עם האקסונים והן האורך הממוצע של האקסונים המחודשים היו גבוהים משמעותית בנוירונים שהתבססו על מונוליירים של Ts14, בהשוואה לנוירונים המצופה בתאי Ts12 או PLL (איור 3D,E). תמונות מייצגות מראות חוסר יכולת של RGN לחדש את האקסונים שלהם מעל תאי PLL או Ts12(איור 3A,B),בעוד Ts14 מגרה את תפוצת האקסונים ב- RGN (3C).
איור 1: תרשים של נוירוני גנגליון רשתית עכברושים עם חוש הריח המקיף את שיתוף המשותף של תאי גליה, כמודל של התחדשות אקסון למבוגרים. קווי תאי שיבוט אנושיים מונצחים (ihOEG) -Ts12 ו- Ts14 - נגזרים מתרבויות ראשוניות מנורות חוש הריח. נוירונים גנגליון רשתית מעכברושים בוגרים מצופים על כיסויים שטופלו PLL (שליטה שלילית) או על Ts14 או Ts12 monolayers. תרבויות נשמרות במשך 96 שעות לפני שהן קבועות וסמנים אקסונליים וסמוטונדריטיים מנותחים על ידי חיסוניות. אחוז הנוירונים עם אקסון ואורך/נוירון אקסונלי ממוצע מכמתים להתחדשות אקסונלית של RGN. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זהות קו תא ihOEG Ts14. Immunofluorescence תמונות של Ts14 בתרבות, שכותרתו אנטי S100 β (פאנל A, ירוק) ו vimentin (פאנל B, אדום). ביטוי GFAP (פאנל C, אדום) נותח גם כדי להשליך זיהום אסטרוציטים. גרעינים מוכתמים ב- DAPI (כחול). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: בדיקות להתחדשות אקסונלית בקוקולטורות של קווי OEG עם נוירוני גנגליון רשתית למבוגרים (RGNs). (A-C) תמונות אימונופלואורסצנטיות המציגות תיוג סומטו-נדריטי עם 514 נוגדנים, המזהה חלבונים הקשורים למיקרוטובולה MAP2A ו- B, באדום, ועם נוגדן SMI31 ספציפי לאקסון בירוק, נגד חלבוני MAP1B ו- NF-H. חצים ירוקים מציינים אקסונים RGN (SMI31 חיובי: ירוק) וחצים צהובים מצביעים על גופים עצביים דנדריטים (514 חיובי: אדום וצהוב). (ד,ה) גרפים מראים ממוצע וסטיית תקן של אחוז הנוירונים המציגים אקסונים ומדד התחדשות אקסון, פרמטר המשקף את אורך האקסון הממוצע (μm) של אקסונים לנוירון. לפחות 30 תמונות (40x) צולמו בשדות אקראיים וכומתו עבור כל דגימת תא. ניסויים בוצעו בשלושה עכברושים שונים (N = 3), רקמת רשתית מאוגדת משתי העיניים, עם כפילויות עבור כל מצב ניסיוני (כל אוכלוסיית גליה נבדק). כוכביות מציינות את המובהקות הסטטיסטית: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, NS: ללא משמעות (ANOVA והשוואות מבחן שלאחר הוק טוק בין פרמטרים המכומתים עבור Ts14 לעומת Ts12, Ts14 לעומת PLL ו- Ts12 לעומת PLL). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השתלת OEG באתרי פגיעה במערכת העצבים המרכזית נחשבת לטיפול מבטיח לפציעה במערכת העצבים המרכזית בשל תכונותיה הפרו-נוירו-נוירו-רגנרטיביות המכוננות7,8,9. עם זאת, בהתאם למקור הרקמה - רירית חוש הריח (OM-OEG) לעומת נורת חוש הריח (OB-OEG) - או גיל התורם, קיימת שונות ניכרת בקיבולת כזו26,31,33,36. לכן, יש חשיבות יש מודל במבחנה קל לשחזור כדי לעבור על היכולת הנוירו-רה-רגנרטיבית של מדגם OEG נתון, לפני ייזום במחקרים vivo. בפרוטוקול זה, RGN אקסוטומיה של חולדות בוגרות הם cocultured על מונולייר של OEG כדי לבצע את ההסתעפות. ניתוח מאוחר יותר של סמנים אקסונליים וסמוטונדריים RGN על ידי immunofluorescence מבוצע כדי להעריך התחדשות אקסון RGN.
קושי ראשוני של ההסמכה הוא המקור של OEG. בעבודה זו, אנו משתמשים בקווי שיבוט אנושיים מונצחים הפיכים (ihOEG), שהוקמו בעבר ומאופיינים על ידי הקבוצה שלנו15,16,17,18, המספקים אספקה בלתי מוגבלת של OEG הומוגני. שניים מקווי התאים האלה של ihOEG הם Ts14, אשר שומר על יכולת ההתחדשות של התרבויות המקוריות ו- Ts12, קו רגנרטיבי נמוך המשמש כבקרת התחדשות נמוכה בניסויים אלה18 אף על פי כן, למרות מגבלות טכניות קיימות כדי להרחיב את תאי OEG העיקריים האנושיים, הם יכולים גם להתקבל מביופסיות אנדוסקופיות האף – OM – או, במקרה של OB-OEG, מתורמי גופות.
הכנת תרבויות OEG monolayer הוא הליך מכריע, כמו תאים רבים מדי עלול לגרום coculture להתנתק מהצלחת. לכן, לפני הכנת OEG לבדיקה, מומלץ כי המשתמש קובע את המספר האופטימלי של תאים להיות מצופה, בהתאם לגודל שלהם ואת קצב החלוקה.
נושא קריטי נוסף הוא ניתוק רקמת הרשתית, לאחר ניתוח רשתית. יש צורך לשבור את שברי הרקמה, בעקבות הדגירה בתמהיל הדיסוציאציה. אם נעשה במרץ רב מדי, התאים יושמדו, אבל שברי רקמה יישארו שלמים אם נעשה חלש מדי. על מנת להשיג השעיית תא הומוגני, אנו ממליצים למלא ולרוקן פיפט פסטר 10-15 פעמים, עם קצה של קוטר ביניים, תוך הימנעות מבעבע. ניתן לצמצם פיפטות פסטר עם טיפים רחבים באמצעות מבער בונזן.
כדי להעריך את היכולת של אוכלוסיות גליה שונות לטפח התחדשות אקסונלית של נוירונים בוגרים, קבענו כי 96 שעות הוא מרווח הזמן המתאים ביותר למטרה כי: 1) זה הזמן הארוך ביותר כדי לשמור על התרבות בחיים מבלי להפריע monolayer OEG; ו 2) זה הזמן הדרוש לנוירונים לגדל אקסונים מספיק זמן כדי לחשוף הבדלים בין קיבולות רגנרטיביות של אוכלוסיות OEG שונות או תאים אחרים שאינם רגנרטיביים (כלומר, fibroblasts12,13,14,15,16,17,18,32,33). זה בהחלט יהיה מעניין לקבוע את מהלך הזמן של תהליך ההתחדשות, כפי שהוא יכול לספק מידע על תכונות התחדשות דיפרנציאלי של אוכלוסיות גליה שונות, בזמנים קצרים יותר של תרבות משותפת. בידיים שלנו, עבור גליה רגנרטיבית, מסלול הזמן בין 72-96 שעות דומה למדי עבור כל קווי התא, אם כי האקסונים קצרים יותר ב 72 שעות (נתונים שלא פורסמו). כמו כן, 96 h של תרבות משותפת, היתרים ללמוד מנגנונים תלויי OEG של התחדשות אקסון למבוגרים12,14.
במהלך כימות התחדשות אקסון, חשוב לקחת מינימום של 30 תמונות ב 400 augments (המטרה 40x), באזורים אקראיים שונים של coverslip, אבל בעקבות האקסונים המלאים של הנוירונים המצולמים. לכן, הנסיין חייב לצלם תמונות סדרתיות באזורים שנבחרו כדי למדוד את האורכים האקסונליים האמיתיים.
גישות במבחנה אחרות פותחו גם כדי להעריך פונקציות רגנרטיביות OEG. במודלים אלה, OEG מוחל על תרבויות ממוצא עצבי שונה, ובתגובה coculture גליה, היווצרות neurite והתארכות הם assayed19,20,21,22,23,24,25,26,27. עם זאת, מבחני ההתחדשות מסתמכים על נוירונים עובריים או לאחר לידה, אשר יש פלסטיות מהותית נעדר נוירונים מבוגרים פצועים. מודל זה המורכב התחדשות אקסון למבוגרים cocultures של קווי OEG עם נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים (RGNs) מתגבר על חיסרון זה. בנוסף, אנו מנתחים רשתית למבוגרים, ומכיוון שאנו חותכים עצב הראייה ואקסונים לסגת בתהליך של ניתוח, אנו מקבלים גופים עצביים נקיים של מיאלין, כדי לבצע את coculture. זה ההבדל עם חלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית הבוגרת, שם מיאלין יכול לעכב מאוד עם הניתוח כדי להשיג נוירונים נקיים עבור coculture.
בהתבסס על אחד שפותח במקור על ידי Wigley ואח'28,29,30,31, אנו מדגישים את השיפורים הבאים בפרוטוקול. ראשית, השימוש במדיום נוירובאסלי בתוספת B27 כאמצעי קוקולטורה OEG-RGN, המאפשר צמיחה של תאים עצביים ומשפיע באופן חיובי על הרבייה של הניסוי. שנית, אנו מאפיינים וכמתים התחדשות אקסונית באמצעות סמן ספציפי של תא האקסון; ושלישית, אנו משתמשים בפרמטר ישיר נוסף, אורך/נוירון אקסונלי ממוצע, המעריכה את פוטנציאל הצמיחה האקסונית של OEG.
לסיכום, אנו רואים כי זהו פשוט, לשחזור, חיסכון בזמן, ועלות בינונית assay, לא רק שימושי להערכת הפוטנציאל הנוירו-רגנרטיבי של ihOEG, אלא גם משום שניתן להרחיב אותו למקורות שונים של OEG או תאי גליה אחרים. יתר על כן, זה יכול לשמש כהוכחה בעלת ערך של מושג הפוטנציאל הנוירו-אורגני של מדגם OEG או גלייה, לפני התרגום לתוך vivo או מחקרים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה כספית על ידי פרויקט SAF2017-82736-C2-1-R משריו דה סינסיה e Innovación ל MTM-F ועל ידי Fundación אוניברסיטת פרנסיסקו דה ויטוריה ל JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
References
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
- Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
- Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
- Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
- Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
- Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
- Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
- Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
- Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
- Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
- Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
- Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
- García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
- García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
- Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
- Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
- Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
- Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
- Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
- Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
- Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
- Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
- Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
- Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
- Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
- Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
- Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
- García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
- Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).
