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Neuroscience

वयस्क अक्षीय उत्थान के इन विट्रो मॉडल के रूप में, घ्राण एनशेथिंग ग्लिया के साथ एक्सोटॉमीड चूहा रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स की कूकल्चर

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 1, 3
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

Summary

हम तंत्रिका चोट के बाद घ्राण ensheathing ग्लिया (OEG) न्यूरोरेगेरेटिव क्षमता का आकलन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल प्रस्तुत करते हैं। यह आरजीएन एक्सोनल और सोमाटोडेन्ड्रिटिक मार्कर का विश्लेषण करके, ओईजी मोनोलेयर्स पर एक्सोटॉमीड वयस्क रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) और अक्षीय उत्थान के बाद के अध्ययन की एक सहसंस्कृति पर आधारित है।

Abstract

घ्राण ensheathing ग्लिया (OEG) कोशिकाओं को घ्राण म्यूकोसा से और घ्राण बल्ब के घ्राण तंत्रिका परत (ओएनएल) में सभी तरह से स्थानीयकृत किया जाता है। वयस्क जीवन के दौरान, वे नए उत्पन्न घ्राण न्यूरॉन्स के अक्षांक बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लैमिना प्रोप्रिया से ओएनएल तक। उनके समर्थक पुनर्योजी गुणों के कारण, इन कोशिकाओं को रीढ़ की हड्डी या ऑप्टिक तंत्रिका चोट मॉडल में अक्षीय उत्थान को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

हम तंत्रिका चोट के बाद OEG न्यूरोरेगेरेटिव क्षमता को परखने और मापने के लिए एक इन विट्रो मॉडल पेश करते हैं। इस मॉडल में, रिवर्सिबली रूप से अमर मानव ओईजी (आईएचओईजी) को मोनोलेयर के रूप में सुसंस्कृत किया जाता है, रेटिना वयस्क चूहों से निकाले जाते हैं और रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) को ओईजी मोनोलेयर पर सहसंस्कृत किया जाता है। 96 घंटे के बाद, आरजीएन में अक्षीय और सोमाटोडेन्ड्रिटिक मार्कर का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया जाता है और एक्सॉन के साथ आरजीएन की संख्या और मतलब एक्सोनल लंबाई/न्यूरॉन की मात्रा निर्धारित की जाती है।

इस प्रोटोकॉल में अन्य इन विट्रो परख पर लाभ है जो भ्रूण या प्रसवोत्तर न्यूरॉन्स पर भरोसा करते हैं, कि यह वयस्क ऊतक में ओईजी न्यूरोरेजेनेरेटिव गुणों का मूल्यांकन करता है। इसके अलावा, यह न केवल आईएचओईजी की न्यूरोरेगेरेटिव क्षमता का आकलन करने के लिए उपयोगी है बल्कि इसे ओईजी या अन्य ग्लियल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों तक बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) न्यूरॉन्स चोट या रोग के बाद सीमित पुनर्योजी क्षमता है। सीएनएस पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए एक आम रणनीति, चोट स्थल पर प्रत्यारोपण, सेल प्रकारों की है जो स्टेम सेल, श्वान कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स या घ्राण ensheathing ग्लिया (OEG) कोशिकाओं1,2,3,4,5जैसे अक्षीय विकास को प्रेरित करतीहै।

ओईजी तंत्रिका क्रेस्ट6 से निकला है और घ्राण म्यूकोसा में और घ्राण बल्ब में ढूंढता है। वयस्क में, घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स पर्यावरण जोखिम के परिणामस्वरूप नियमित रूप से मर जाते हैं और उन्हें नए विभेदित न्यूरॉन्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। ओईजी इन नए घ्राण अक्षों को घ्राण बल्ब में प्रवेश करने और सीएनएस 7 में अपने लक्ष्यों के साथ नए सिनेप्सस्थापितकरने के लिए घेर लेता है और मार्गदर्शन करताहै । इन शारीरिक विशेषताओं के कारण, ओईजी का उपयोग सीएनएस चोट जैसे रीढ़ की हड्डी या ऑप्टिक तंत्रिका चोट के मॉडलों में किया गया है और इसके न्यूरोरेग्नेटिव और न्यूरोप्रोटेक्टिव गुण सिद्ध हो जाते हैं8,9,10, 11। इन कोशिकाओं की प्रो-पुनर्योजी विशेषताओं के जिम्मेदार कई कारकों के रूप में पहचान की गई है, जिनमें एक्सेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटेसिस उत्पादन या न्यूरोट्रोफिक और एक्सोनल विकास कारकों का स्राव12,13,14शामिल है।

प्राथमिक ओईजी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए तकनीकी सीमाओं को देखते हुए, हमने पहले रिवर्सिबल अमर मानव ओईजी (ihOEG) क्लोनल लाइनों की स्थापना की और विशेषता बनाई, जो सजातीय ओईजी की असीमित आपूर्ति प्रदान करती है। ये ihOEG कोशिकाएं प्राथमिक संस्कृतियों से प्राप्त होती हैं, जो ऑटोप्सी में प्राप्त घ्राण बल्बों से तैयार होती हैं। उन्हें टेलोमेरेस उत्प्रेरक उपइकाइट (टीईआरटी) और ओन्कोजीन बीएमआई-1 के लेनदेन से अमर किया गया था और एसवी 40वायरस बड़े टी एंटीजन15, 16,17,18के साथ संशोधित किया गया था। इनमें से दो ihOEG सेल लाइनें Ts14 हैं, जो मूल संस्कृतियों और Ts12 की पुनर्योजी क्षमता को बनाए रखती हैं, एक कम पुनर्योजी रेखा जिसका उपयोग इन प्रयोगों में कम पुनर्जनन नियंत्रण के रूप में किया जाता है18।

तंत्रिका चोट के बाद अक्षीय उत्थान को बढ़ावा देने के लिए OEG क्षमता का आकलन करने के लिए, कई इन विट्रो मॉडल लागू किए गए हैं । इन मॉडलों में, ओईजी को विभिन्न न्यूरोनल मूल और न्यूराइट गठन और विस्तार की संस्कृतियों पर लागू किया जाता है- ग्लियल कोकल्चर के जवाब में- परख लिया जाता है। इस तरह के न्यूरोनल स्रोतों के उदाहरण नवजात चूहा कॉर्टिकल न्यूरॉन्स19,कॉर्टिकल ऊतक20से चूहे भ्रूण न्यूरॉन्स पर किए गए खरोंच घाव, चूहे रेटिना एक्सप्लांट21,चूहा हाइपोथैलेमिक या हिप्पोकैम्पल पोस्टनेटल न्यूरॉन्स22,23, पोस्टनेटल रैट डॉरसल रूट गैंगलियन न्यूरॉन्स24, प्रसवोत्तर माउस कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट न्यूरॉन्स25,ह्यूमन एनटी2 न्यूरॉन्स26,या पोस्टनेटल सेरेब्रल कॉर्टिकल न्यूरॉन्स पर प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट निशान जैसी संस्कृतियों पर27।

इन मॉडलों में, हालांकि, उत्थान परख भ्रूण या प्रसवोत्तर न्यूरॉन्स पर निर्भर करती है, जिसमें एक आंतरिक प्लास्टिसिटी होती है जो घायल वयस्क न्यूरॉन्स में अनुपस्थित होती है। इस खामी को दूर करने के लिए, हम वयस्क रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) के साथ ओईजी लाइनों की सहसंस्कृतियों में वयस्क अक्षीय उत्थान का एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं, जो मूल रूप से विग्ले एट अल द्वारा विकसित किया गयाहै।28, 29,30,31 और संशोधित और हमारे समूह द्वारा उपयोग12,13,14,15,16,17,18,32 ,33 संक्षेप में, रेटिना ऊतक वयस्क चूहों से निकाला जाता है और पापीन के साथ पचा जाता है। रेटिना सेल निलंबन तो या तो पॉलीसाइन-इलाज कवरस्लिप पर या Ts14 और Ts12 मोनोलेयर्स पर चढ़ाया जाता है । संस्कृतियों को तय करने से पहले ९६ घंटे के लिए बनाए रखा जाता है और फिर अक्षांश (MAP1B और एनएफ-एच प्रोटीन)३४ और सोमाटोडेन्ड्रिटिक (MAP2A और B)३५ मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस किया जाता है । एक्सोनल पुनर्जनन को एक्सॉन के साथ न्यूरॉन्स के प्रतिशत के रूप में निर्धारित किया जाता है, आरजीएन की कुल आबादी के संबंध में और अक्षारक पुनर्जनन सूचकांक की गणना प्रति न्यूरॉन औसत अक्षाणल लंबाई के रूप में की जाती है। यह प्रोटोकॉल न केवल आईएचओईजी की न्यूरोरेगेरेटिव क्षमता का आकलन करने के लिए उपयोगी है बल्कि इसे ओईजी या अन्य ग्लियल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों तक बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

नोट: पशु प्रयोग राष्ट्रीय और संस्थागत जैव नैतिकता समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. ihOEG (Ts12 और Ts14) संस्कृति

नोट: यह प्रक्रिया एक ऊतक संस्कृति जैवसेफ्टी कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में किया जाता है।

  1. तालिका1 में प्रदान की गई 50 एमएल एमईईजी संस्कृति माध्यम तैयार करें।
  2. डीएमईएम/एफ12-एफबीएस के 5 एमएल तैयार करें, जैसा कि टेबल 1में प्रदान किया गया है, 15 एमएल शंकु नली में।
  3. 15 मिनट के लिए, एक साफ पानी स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर दोनों मीडिया गर्म करें।
  4. गल Ts12 और Ts14 कोशिकाओं को एक साफ पानी स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर शीशियों ।
  5. स्टेप 2 में तैयार डीएमईएम/एफ12-एफबीएस कल्चर मीडियम में सेल को रिस्पेंड और जोड़ें ।
  6. 200 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
  7. सुपरनिट की ख्वाहिश।
  8. ME10 माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें और गोली को फिर से खर्च करें।
  9. ME10 के 3 एमएल के साथ एक p60 सेल कल्चर डिश तैयार करें और सेलुलर सस्पेंशन, ड्रॉपवाइज जोड़ें।
  10. कोशिकाओं को थाली में समान रूप से वितरित करने के लिए ले जाएँ।
  11. 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाएं।
    नोट: संगम तक पहुंचने के बाद, coculture के लिए कोशिकाओं को अनुकूलित करने के लिए कम से कम एक और मार्ग किया जाना चाहिए। सहसंस्कृति के लिए कवरस्लिप पर बोने से पहले 90% संगम की जरूरत होती है। एक कॉन्फ्लूंट पी-60 में Ts14 के लिए 7 x 105 और Ts12 सेल लाइनों के लिए 2.5 x10 6 का मतलब सेल नंबरहै। Ts12 और Ts14 सेल लाइनों को हर 2-3 दिनों में पारित किया जाना चाहिए।

2. परख के लिए ihOEG (Ts12 और Ts14) की तैयारी

नोट: यह कदम RGN विच्छेदन और coculture से पहले 24 घंटे किया जाना चाहिए ।

  1. 1 घंटे के लिए 10 μg/एमएल पॉली-एल-लिसिन (पीएलएल) के साथ 12 मिमी Ø कवरस्लिप का इलाज करें ।
    नोट: कवरस्लिप को पीएलएल समाधान में रातोंरात छोड़ा जा सकता है।
  2. कवरस्लिप को 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) से तीन बार धोएं।
  3. P60 सेल कल्चर डिश से अलग Ts12 और Ts14 ihOEG कोशिकाएं।
    1. डीएमईएम/एफ12-एफबीएस कल्चर मीडियम(टेबल 1)के 4 एमएल को 15 एमएल शंकु नली में जोड़ें । साफ पानी में नहाने से 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म हो जाएं।
    2. प्लेटों से माध्यम निकालें और 1x PBS-EDTA के 1 एमसीएल के साथ कोशिकाओं को धोने, एक बार ।
    3. ओईजी कोशिकाओं में ट्राइपसिन-ईडीटीए के 1 एमसीएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेटकरें।
    4. एक p1000 पिपेट के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें चरण 3.1 में तैयार मध्यम में स्थानांतरित करें।
    5. 200 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    6. सुपरनिट की ख्वाहिश।
    7. एमई10 मीडियम का 1 एमएल डालकर गोली को रीसल्पेंड करें।
    8. एक हीमोसाइटोमीटर में सेल नंबर गिनें।
  4. बीज ८०,००० Ts14 कोशिकाओं या १००,००० Ts12 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 24 में कवरस्लिप पर अच्छी तरह से ME10 माध्यम के μL में अच्छी तरह से प्लेटों ।
  5. 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाएं, 24 घंटे के लिए।

3. रेटिना ऊतक विच्छेदन

नोट: 2 महीने पुराने पुरुष Wistar चूहों RGN स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है । 24-कुआं सेल डिश के 20 कुओं के लिए दो रेटिना (एक चूहा) । उपयोग से पहले सर्जिकल सामग्री को ऑटोक्लेव करें। पापिन वियोजन किट व्यावसायिक रूप से खरीदी जाती है(सामग्री की तालिका)। पुनर्गठन के लिए प्रदाता के निर्देशों का पालन करें। 5 एमएम स्टॉक में डी, एल-2-अमीनो-5-फॉस्फोनोवेलेरिक एसिड (एपीवी) का पुनर्गठन करें और एलिकोट्स तैयार करें।

  1. परख के दिन, निम्नलिखित मीडिया तैयार करें।
    1. ठंड ईबीएसएस के 5 एमएल (पापीन वियोजन किट की शीशी 1) के साथ एक p60 सेल कल्चर डिश तैयार करें।
    2. एपीवी के पैपिन डिससोशेशन किट प्लस 50 माइक्रोन के पुनर्गठित शीशी 2 (पापीन) के साथ एक p60 सेल कल्चर डिश तैयार करें।  फिर, 250 माइक्रोएल ऑफरिल्टेड शीशी 3 (एपीवी के डीएनएसई प्लस 5 माइक्रोन) जोड़ें।
    3. एक बाँझ ट्यूब मिश्रण में शीशी 1 के 2.7 एमएल में शीशी 4 (एल्बुमिन-ओवोमुकाइड प्रोटीज अवरोधक) के 300 माइक्रोल के साथ। शीशी 3 (DNase) प्लस एपीवी के 30 μL के 150 माइक्रोल जोड़ें।
    4. टेबल 1में दिए गए न्यूरोबेसल-बी27 मीडियम (एनबी-बी27) की 20 एमएल तैयार करें ।
  2. सीओ2के साथ श्वासावरोध द्वारा चूहे का त्याग करें ।
  3. गिलोटिन के साथ डेपुटेशन द्वारा सिर को हटा दें; इसे 100 एमएम पेट्री डिश में रखें और लैमिनार फ्लो हुड में रखने से पहले सिर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
  4. चूहे की मूंछ को कैंची से काट लें ताकि वे आंखों में हेरफेर में हस्तक्षेप न करें।
  5. एक स्केलपेल के साथ आंख भर में एक चीरा बनाने में सक्षम होने के लिए पर्याप्त आंखों की पुतली को बाहर खींचने के लिए संदंश के साथ ऑप्टिक तंत्रिका पकड़ें।
  6. लेंस और विट्रियस हास्य को निकालें और रेटिना (नारंगी जैसे ऊतक) को बाहर निकालें, जबकि आंख की शेष परतें अंदर रहती हैं (वर्णक एपिथेलियल परत सहित)।
  7. रेटिना को चरण 3.1.1 में तैयार p60 सेल कल्चर डिश में रखें।
  8. रेटिना को चरण 3.1.2 में तैयार p60 सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें और इसे अनुमानित आकार और एलटी; 1 मिमी के छोटे टुकड़ों में स्केलपेल के साथ काट दें।
  9. एक 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
  10. ऊतक को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में, हर 10 मिनट में आंदोलन के साथ।
  11. एक ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके सेल झुरमुट को अलग करें।
  12. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें।
  13. सुपरनेट को त्यागें और पापिन को निष्क्रिय करने के लिए, चरण 3.1.3 में तैयार समाधान में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। (2 आंखों के लिए 1.5 एमएल)।
  14. इस सेल सस्पेंशन को पुनर्गठित शीशी 4 के 5 एमएल में सावधानी से पिपेट करें।
  15. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  16. अपकेंद्री करते समय, ओईजी 24 वेल सेल प्लेट (पहले चरण 2 में तैयार) से एमई-10 माध्यम को पूरी तरह से हटा दें और इसे एनबी-बी 27 माध्यम प्रति अच्छी तरह से 500 माइक्रोल से बदलें।
  17. सुपरनेट को त्यागें और कोशिकाओं को एनबी-बी27 माध्यम के 2 एमसीएल में फिर से रीसस्ट करें।
  18. प्लेट रेटिना सेल निलंबन के 100 माइक्रोन, m24 प्लेट के प्रति अच्छी तरह से, पीएलएल-इलाज या OEG मोनोलेयर्स-कवरस्लिप पर।
  19. एनबी-बी27 माध्यम में 96 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को बनाए रखें।

4. इम्यूनोदाता

  1. 96 घंटे के बाद, 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) की समान मात्रा को संस्कृति माध्यम (600 माइक्रोएल) (पीएफए अंतिम एकाग्रता 2%) में जोड़कर कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए ठीक करें।
  2. 24-मल्टीवेल प्लेट से मीडिया और पीएफए को हटा दें और एक बार फिर 1x पीएफबी में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 500 माइक्रोन जोड़ें। 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  3. फिक्सर को छोड़ें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
  4. 30-40 मिनट के लिए पीबीएस (पीबीएस-टीएस) में 0.1% ट्राइटन एक्स-100/1% एफबीएस के साथ ब्लॉक करें।
  5. पीबीएस-टीएस बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें: SMI31 (MAP1B और एनएफ-एच प्रोटीन के खिलाफ) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1:500)। 514 (MAP2A और बी प्रोटीन को पहचानता है) खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीसेरम (1:400)।
  6. कॉकल्चर में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  7. अगले दिन, एंटीबॉडी को त्यागें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस, 3 बार के साथ कवरस्लिप धोएं।
  8. पीबीएस-टीएस बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी को इस प्रकार तैयार करें: SMI-31 के लिए, एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 488 (1:500)। 514 के लिए, एंटी-रैबिट एलेक्सा-594 (1:500)।
  9. अंधेरे में, आरटी में, 1 एच के लिए संबंधित फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट कोशिकाएं।
  10. कवरस्लिप को 1x पीबीएस के साथ धोएं, 3 बार, 5 मिनट के लिए, अंधेरे में।
  11. अंत में, माउंट माउंट माउंट के साथ माउंट कवर्लिप्स बढ़ते माध्यम(सामग्री की तालिका)और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: जब भी आवश्यक हो, DAPI (4,6-diamidino-2-फेनीलिंडोल) के साथ फ्लोरोसेंट नाभिक धुंधला किया जा सकता है। बढ़ते से पहले, DAPI के साथ अंधेरे में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट (10 μg/1x PBS में एमएल) । 1x पीबीएस के साथ 3 बार कवरस्लिप धोएं और अंत में, बढ़ते माध्यम के साथ कवरस्लिप माउंट करें।

5. अक्षेसल उत्थान मात्रा

नोट: नमूनों को एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के 40x उद्देश्य के तहत निर्धारित किया जाता है। प्रत्येक उपचार के लिए निर्धारित किए जाने वाले कम से कम 200 न्यूरॉन्स के साथ, यादृच्छिक क्षेत्रों पर न्यूनतम 30 चित्र लिए जाने चाहिए। प्रत्येक प्रयोग को कम से कम तीन बार दोहराया जाना चाहिए।

  1. आरजीएन की कुल आबादी के सापेक्ष एक्सॉन (SMI31 सकारात्मक न्यूराइट) के साथ न्यूरॉन्स के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करें (मानचित्र 2ए/बी 514 न्यूरोनल बॉडी और डेंड्राइट्स के सकारात्मक इम्यूनोस्टेटिंग के साथ पहचाने गए)।
  2. अक्षांश उत्थान सूचकांक या मतलब अक्षांत लंबाई (μm/न्यूरॉन) की मात्रा । इस पैरामीटर को सभी पहचाने गए एक्सॉन की लंबाई (माइक्रोन में) के योग के रूप में परिभाषित किया गया है, जो गिना जाता न्यूरॉन्स की कुल संख्या से विभाजित है, चाहे उन्होंने एक अक्षतंश प्रस्तुत किया हो या नहीं। एक्सोनल लंबाई इमेज सॉफ्टवेयर इमेजजे (एनआईएच-यूएसए) के प्लगइन न्यूरोनजे का उपयोग करके निर्धारित की जाती है।
  3. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मतलब, मानक विचलन और सांख्यिकीय महत्व की गणना करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हम न्यूरोनल चोट के बाद ओईजी न्यूरोरेजेनेरेटिव क्षमता को परखने के लिए एक इन विट्रो मॉडल पेश करते हैं। जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है, ओईजी स्रोत एक रिवर्सिबल अमर मानव ओईजी क्लोनल सेल लाइन -Ts14 और Ts12-, जो प्राथमिक संस्कृतियों से निकला है, जो ऑटोप्सी15, 17,18में प्राप्त घ्राण बल्बों से तैयार किया गया है। रेटिना ऊतक वयस्क चूहों से निकाला जाता है, पचा, और रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (RGN) निलंबन या तो PLL-इलाज कवरस्लिप पर या ihOEG मोनोलेयर्स, Ts14 या Ts12 पर चढ़ाया जाता है । संस्कृतियों को तय होने से पहले ९६ घंटे तक बनाए रखा जाता है । एक्सोनल और सोमाटोडेंड्रिटिक मार्कर का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया जाता है और एक्सोनल पुनर्जनन की मात्रा निर्धारित की जाती है।

Ts14 OEG पहचान का मूल्यांकन ग्लूशेथिंग ग्लिया(चित्रा 2)में व्यक्त किए जाने वाले मार्कर के साथ इम्यूनोस्टेटिंग द्वारा किया जाता है, जैसे कि S100 β(चित्रा 2A)और विमेंटिन(चित्रा 2 बी); एस्ट्रोसाइट संदूषण(चित्रा 2सी)को त्यागने के लिए जीएफएपी अभिव्यक्ति का भी विश्लेषण किया गया। जैसा कि दिखाया गया है, Ts14 ने S100 β और विमेंटिन व्यक्त किया लेकिन GFAP नहीं।

एक्सोनल रीजनरेशन परख में, टीएसएस14 पुनर्योजी क्षमता की तुलना आरजीएन-ओईजी कोकल्चर में टीएस 12 से की जाती है, जो पीएलएल सब्सट्रेट को नकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 3)के रूप में उपयोग करता है। एक्सॉन के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ-साथ पुनर्जीवित एक्सॉन की औसत लंबाई दोनों ही Ts14 मोनोलेयर्स पर न्यूरॉन्स cocultured में काफी अधिक थे, जो या तो Ts12 कोशिकाओं या पीएलएल(चित्रा 3डी, ई)पर चढ़ाया न्यूरॉन्स की तुलना में थे । प्रतिनिधि छवियां पीएलएल या Ts12 कोशिकाओं(चित्रा 3ए, बी)पर अपने अक्षों को पुनर्जीवित करने के लिए आरजीएन की क्षमता की कमी दिखाती हैं, जबकि Ts14 आरजीएन (3 सी) में एक्सोन की वृद्धि को उत्तेजित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क अक्षीय उत्थान के मॉडल के रूप में घ्राण ensheathing ग्लिया कोशिकाओं coculture के साथ चूहा रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स का आरेख। मानव OEG (ihOEG) क्लोनल सेल लाइनों-Ts12 और Ts14-घ्राण बल्ब से प्राथमिक संस्कृतियों से व्युत्पन्न अमर । वयस्क चूहों से रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स को पीएलएल-इलाज कवरस्लिप (नकारात्मक नियंत्रण) या Ts14 या Ts12 मोनोलेयर पर चढ़ाया जाता है। संस्कृतियों को तय करने से पहले 96 घंटे के लिए बनाए रखा जाता है और एक्सोटोडेन्ड्रिटिक मार्कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विश्लेषण किए जाते हैं। अक्षतंतु और मतलब अक्षारक लंबाई के साथ न्यूरॉन्स का प्रतिशत/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ihOEG सेल लाइन Ts14 की पहचान। संस्कृति में Ts14 की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां, एंटी-S100 β (पैनल ए, ग्रीन) और विमेंटिन (पैनल बी, लाल) के साथ लेबल की गई हैं। एस्ट्रोसाइट संदूषण को त्यागने के लिए जीएफएपी अभिव्यक्ति (पैनल सी, लाल) का भी विश्लेषण किया गया था। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: वयस्क रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) के साथ ओईजी लाइनों की सहसंस्कृतियों में अक्षीय उत्थान के लिए परख। (ए-सी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां 514 एंटीबॉडी के साथ सोमाटोडेंड्रिटिक लेबलिंग दिखाती हैं, जो माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन MAP2A और बी को पहचानती है, लाल रंग में, और धुरंतु में एक्सॉन-विशिष्ट SMI31 एंटीबॉडी के साथ, MAP1B और एनएफ-एच प्रोटीन के खिलाफ। हरे तीर आरजीएन अक्षों (SMI31-सकारात्मक: हरे) और पीले तीर से संकेत मिलता है कि न्यूरोनल शरीर और dendrites (514 सकारात्मक: लाल और पीले)। (D,E) रेखांकन एक्सोन और अक्षजन और अक्षांत पुनर्जनन सूचकांक का प्रदर्शन करने वाले न्यूरॉन्स के प्रतिशत का मतलब और मानक विचलन दिखाते हैं, जो न्यूरॉन प्रति एक्सोन की औसत एक्सोनल लंबाई (माइक्रोन) को दर्शाती है। यादृच्छिक क्षेत्रों पर न्यूनतम 30 चित्र (40x) लिए गए थे और प्रत्येक सेल नमूने के लिए मात्रा निर्धारित की गई थी। तीन अलग-अलग चूहों (एन = 3) से त्रिपाल में प्रयोग किए गए थे, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (प्रत्येक ग्लिया जनसंख्या परीक्षण) के लिए डुप्लिकेट के साथ दोनों आंखों से जमा रेटिना ऊतक। एस्टीस्क सांख्यिकीय महत्व का संकेत देते हैं: * पी & 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001, एनएस: गैर महत्व (ANOVA और पोस्ट हॉक तुकी परीक्षण तुलना Ts14 बनाम Ts12, Ts14 बनाम पीएलएल, और Ts12 बनाम पीएसएल) के लिए निर्धारित मापदंडों के बीच तुलना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सीएनएस चोट स्थलों पर ओईजी प्रत्यारोपण सीएनएस चोट के लिए एक आशाजनक चिकित्सा माना जाता है क्योंकि इसके संविलियन प्रो-न्यूरोरेजेनेरेटिव गुण7,8,9हैं। हालांकि, ऊतक स्रोत-घ्राण म्यूकोसा (ओम-ओईजी) बनाम घ्राण बल्ब (ओबी-ओईजी) या दाता की आयु के आधार पर, ऐसी क्षमता26,31, 33,36में काफी भिन्नता मौजूद है। इसलिए, वीवो अध्ययन में शुरू करने से पहले, दिए गए ओईजी नमूने की न्यूरोरेजेनेरेटिव क्षमता को परखने के लिए एक आसान और प्रजनन योग्य इन विट्रो मॉडल होना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, वयस्क चूहों के एक्सोटॉमाइज्ड आरजीएन को परख करने के लिए ओईजी के मोनोलेयर पर cocultured किया जाता है। आरजीएन अक्षीय पुनर्जनन का आकलन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा आरजीएन अक्षीय और सोमाटोडेन्ड्रिटिक मार्कर का बाद में विश्लेषण किया जाता है।

परख की एक प्रारंभिक कठिनाई OEG का स्रोत है। इस काम में, हम रिवर्सिबल अमर मानव ओईजी (ihOEG) क्लोनल लाइनों का उपयोग करते हैं, जो पहले स्थापित और हमारे समूह15, 16,17,18द्वारा विशेषता है, जो सजातीय OEG की असीमित आपूर्ति प्रदान करते हैं। इनमें से दो ihOEG सेल लाइनें Ts14 हैं, जो मूल संस्कृतियों और Ts12 की पुनर्योजी क्षमता को बनाए रखती हैं, एक कम पुनर्योजी रेखा जिसका उपयोग इन प्रयोगों में कम पुनर्जनन नियंत्रण के रूप में किया जाता है18 फिर भी, हालांकि मानव प्राथमिक ओईजी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए तकनीकी सीमाएं मौजूद हैं, उन्हें नाक के एंडोस्कोपिक बायोप्सी-ओएम-या, ओबी-ओईजी के मामले में, शव दाता से भी प्राप्त किया जा सकता है।

मोनोलेयर ओईजी संस्कृतियों की तैयारी एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, क्योंकि बहुत सारी कोशिकाएं कोसंस्कृति को प्लेट से अलग कर सकती हैं। इसलिए, परख के लिए OEG तैयारी से पहले, यह सिफारिश की जाती है कि उपयोगकर्ता अपने आकार और विभाजन दर के आधार पर चढ़ाया जाने वाली कोशिकाओं की इष्टतम संख्या निर्धारित करता है।

रेटिना विच्छेदन के बाद एक और महत्वपूर्ण मुद्दा रेटिना ऊतक वियोजन है। विरूपण मिश्रण में इनक्यूबेशन के बाद, ऊतक के टुकड़ों को तोड़ना आवश्यक है। यदि बहुत सख्ती से किया जाता है, तो कोशिकाओं को नष्ट कर दिया जाएगा, लेकिन ऊतक के टुकड़े को तब बरकरार छोड़ दिया जाएगा यदि बहुत कमजोर किया जाता है। एक सजातीय कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए, हम बुदबुदाती से बचते हुए मध्यवर्ती व्यास की नोक के साथ 10-15 बार एक पाश्चर पिपेट भरने और खाली करने का सुझाव देते हैं। व्यापक युक्तियों के साथ पाश्चर पिपेट को बुनसेन बर्नर का उपयोग करके संकुचित किया जा सकता है।

वयस्क न्यूरॉन्स के अक्षीय उत्थान को बढ़ावा देने के लिए विभिन्न ग्लियल आबादी की क्षमता का आकलन करने के लिए, हमने निर्धारित किया है कि 96 एच समय अंतराल है जो उद्देश्य के लिए सबसे अच्छा है क्योंकि: 1) ओईजी मोनोलेयर को परेशान किए बिना संस्कृति को जीवित बनाए रखने का सबसे लंबा समय है; और 2) यह न्यूरॉन्स के लिए एक्सॉन विकसित करने के लिए आवश्यक समय है जो विभिन्न ओईजी आबादी या अन्य गैर-पुनर्योजी कोशिकाओं (यानी फाइब्रोब्लास्ट12, 13, 14,15,16,17,32, 33)की पुनर्योजी क्षमताओं के बीच अंतर को प्रकट करने के लिए पर्याप्त है। पुनर्जनन प्रक्रिया के समय पाठ्यक्रम का निर्धारण करना निश्चित रूप से दिलचस्प होगा, क्योंकि यह सह-संस्कृति के कम समय में विभिन्न ग्लियल आबादी के अंतर पुनर्योजी गुणों के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है। हमारे हाथों में, पुनर्योजी ग्लिया के लिए, 72-96 एच के बीच का समय पाठ्यक्रम सभी सेल लाइनों के लिए काफी समान है, हालांकि एक्सॉन 72 एच (अप्रकाशित डेटा) पर कम होते हैं। इसके अलावा, सह-संस्कृति के 96 एच, वयस्क अक्षीय उत्थान12, 14के ओईजी-निर्भर तंत्र का अध्ययन करने की अनुमतिदेताहै।

अक्षुण्ण उत्थान मात्रा के दौरान, कवरस्लिप के विभिन्न यादृच्छिक क्षेत्रों में 400 ऑमेंट्स (40x ऑब्जेक्टिव) पर न्यूनतम 30 चित्र लेना महत्वपूर्ण है, लेकिन फोटोग्राफेड न्यूरॉन्स के पूर्ण अक्षों का पालन करना। इसलिए, प्रयोगकर्ता को वास्तविक अक्षांक लंबाई को मापने के लिए चुने गए क्षेत्रों में धारावाहिक चित्र लेने चाहिए।

ओईजी पुनर्योजी कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए अन्य इन विट्रो दृष्टिकोण भी विकसित किए गए हैं। इन मॉडलों में, ओईजी को विभिन्न न्यूरोनल मूल की संस्कृतियों पर लागू किया जाता है और ग्लियल कोकल्चर के प्रत्युत्तर में, न्यूराइट गठन और विस्तार को19, 20,20, 22,23,24,25,26, 27कहाजाताहै। हालांकि, पुनर्जनन परख भ्रूण या प्रसवोत्तर न्यूरॉन्स पर निर्भर करता है, जिसमें घायल वयस्क न्यूरॉन्स से एक आंतरिक प्लास्टिसिटी अनुपस्थित होती है। वयस्क रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) के साथ ओईजी लाइनों की सहसंस्कृतियों में वयस्क अक्षीय उत्थान से मिलकर बना यह मॉडल इस कमी पर काबू पा रहा है। इसके अलावा, हम वयस्क रेटिना को विच्छेदन कर रहे हैं, और क्योंकि हम विच्छेदन की प्रक्रिया में ऑप्टिक तंत्रिका और अक्षों को वापस लेते हैं, हम कोर्बल्चर करने के लिए न्यूरोनल निकायों को मायलिन से साफ प्राप्त करते हैं। यह वयस्क सीएनएस के अन्य हिस्सों के साथ अंतर है, जहां मायलिन सहसंस्कृति के लिए स्वच्छ न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए विच्छेदन के साथ बहुत अधिक बाधा डाल सकता है।

मूल रूप से विग्ले एट अल द्वारा विकसित एक के आधार पर28,29,30,31,हम प्रोटोकॉल में निम्नलिखित सुधारों को उजागर करते हैं। सबसे पहले, ओईजी-आरजीएन कोकल्चर माध्यम के रूप में बी 27 के साथ पूरक न्यूरोबेसल माध्यम का उपयोग, जो न्यूरोनल कोशिकाओं के विकास की अनुमति देता है और प्रयोग की प्रजनन क्षमता को सकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। दूसरा, हम अक्षीय डिब्बे के एक विशिष्ट मार्कर का उपयोग करके अक्षीय उत्थान की विशेषता और मात्रा निर्धारित करते हैं; और तीसरा, हम एक अतिरिक्त प्रत्यक्ष पैरामीटर, मतलब अक्षीय लंबाई/न्यूरॉन का उपयोग करते हैं, जो ओईजी की अक्षीय विकास पुनर्योजी क्षमता का आकलन करता है।

संक्षेप में, हम मानते हैं कि यह एक सरल, प्रजनन योग्य, समय की बचत और मध्यम लागत परख है, न केवल आईएचओईजी की न्यूरोरेग क्षमता का आकलन करने के लिए उपयोगी है, बल्कि इसलिए भी कि इसे ओईजी या अन्य ग्लियल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, वीवो या नैदानिक अध्ययनों में अनुवाद से पहले, इसे ओईजी या ग्लियल नमूने की न्यूरोरेरेटिव क्षमता की अवधारणा के मूल्यवान सबूत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को परियोजना SAF2017-82736-C2-1-R से मिनिस्टरियो डी सिन्सिया ई इनोवासिओन से एमटीएम-एफ और फंडासिओन यूनीवर्सिडो फ्रांसिस्को डी विटोरिया द्वारा जेएस को आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 165 घ्राण ensheathing ग्लिया (OEG) वयस्क अक्षीय उत्थान इन विट्रो परख रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स (आरजीएन) कोकल्चर एक्सोटॉमी
वयस्क अक्षीय उत्थान के इन विट्रो मॉडल के रूप में, घ्राण एनशेथिंग ग्लिया के साथ एक्सोटॉमीड चूहा रेटिना गैंगलियन न्यूरॉन्स की कूकल्चर
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Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

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