Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Coculture av akkotomiserte rotte Retinal Ganglion nevroner med Olfactory Ensheathing Glia, som en In Vitro modell av voksen aksonal regenerering

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863

Summary

Vi presenterer en in vitro modell for å vurdere olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative kapasitet, etter neural skade. Den er basert på en coculture av akotomiserte voksne retinal ganglion nevroner (RGN) på OEG monolayers og påfølgende studie av aksonal regenerering, ved å analysere RGN aksonale og somatodendritiske markører.

Abstract

Olfactory ensheathing glia (OEG) celler er lokalisert hele veien fra olfactory mucosa til og inn i olfactory nerve lag (ONL) av olfactory pære. Gjennom hele voksenlivet er de nøkkelen til aksonal dyrking av nygenererte olfaktoriske nevroner, fra lamina propria til ONL. På grunn av deres pro-regenerative egenskaper har disse cellene blitt brukt til å fremme aksonal regenerering i ryggmargen eller optiske nerveskademodeller.

Vi presenterer en in vitro modell for å analysere og måle OEG nevroregenerativ kapasitet etter nevrale skader. I denne modellen er reversibel udødeliggjort menneskelig OEG (ihOEG) dyrket som monolayer, netthinnen ekstraheres fra voksne rotter og retinal ganglion nevroner (RGN) er cocultured på OEG monolayer. Etter 96 timer analyseres aksonære og somatodendrittiske markører i RGN-er ved immunofluorescence og antall RGN-er med akson og gjennomsnittlig aksonal lengde/nevron kvantifiseres.

Denne protokollen har fordelen over andre in vitro-analyser som er avhengige av embryonale eller postnatale nevroner, at den evaluerer OEG neuroregenerative egenskaper i voksenvev. Det er heller ikke bare nyttig for å vurdere det neuroregenerative potensialet til ihOEG, men kan utvides til forskjellige kilder til OEG eller andre glialceller.

Introduction

Voksne sentralnervesystemet (CNS) nevroner har begrenset regenerativ kapasitet etter skade eller sykdom. En vanlig strategi for å fremme CNS regenerering er transplantasjon, på skadestedet, av celletyper som induserer aksonal vekst som stamceller, Schwann-celler, astrocytter eller olfaktoriske ensheathing glia (OEG)celler 1,2,3,4,5.

OEG kommer fra nevrale crest6 og lokaliserer i olfaktorisk slimhinne og i olfactory pære. Hos voksne dør olfaktoriske sensoriske nevroner regelmessig som følge av miljøeksponering, og de erstattes av nylig differensierte nevroner. OEG omgir og guider disse nye olfaktoriske aksonene for å gå inn i olfaktorisk pære og å etablere nye synapser med sine mål i CNS7. På grunn av disse fysiologiske egenskapene har OEG blitt brukt i modeller av CNS-skade som ryggmarg eller optisk nerveskade og dens nevroregenerative og nevrobeskyttende egenskaper blir bevist8,9,10,11. Flere faktorer har blitt identifisert som ansvarlig for de pro-regenerative egenskapene til disse cellene, inkludert ekstracellulær matrise proteaser produksjon eller sekresjon av nevrotrofiske og aksonalevekstfaktorer 12,13,14.

Gitt de tekniske begrensningene for å utvide primære OEG-celler, har vi tidligere etablert og karakterisert reversibel udødeliggjort menneskelig OEG (ihOEG) kloniske linjer, som gir en ubegrenset tilførsel av homogen OEG. Disse ihOEG cellene stammer fra primære kulturer, utarbeidet av olfaktoriske pærer oppnådd i obduksjoner. De ble udødeliggjort ved transduksjon av telomerase katalytisk underenhet (TERT) og onkogen Bmi-1 og modifisert med SV40-viruset stort T antigen15,16,17,18. To av disse ihOEG cellelinjer er Ts14, som opprettholder regenerativ kapasitet av de opprinnelige kulturer og Ts12, en lav regenerativ linje som brukes som en lav regenereringskontroll i disse eksperimentene18.

For å vurdere OEG kapasitet til å fremme aksonær regenerering etter nevrale skader, har flere in vitro-modeller blitt implementert. I disse modellene brukes OEG på kulturer av forskjellig nevronal opprinnelse og neurittdannelse og forlengelse – som svar på glialkokultur – analyseres. Eksempler på slike nevronale kilder er neonatal rottekortikale nevroner19, scratch sår utført på rotte embryonale nevroner fra kortikaltvev 20, rotte retinal explants21, rotte hypothalamus eller hippocampal postnatal nevroner22,23, postnatal rotte dorsal rot ganglion nevroner24, postnatal mus kortikospinalkanal nevroner25, menneskelige NT2 nevroner26, eller postnatal cerebral kortikale nevroner på reaktiv astrocytt arr-lignende kulturer27.

I disse modellene er regenereringsanalysen imidlertid avhengig av embryonale eller postnatale nevroner, som har en iboende plastisitet som er fraværende i skadede voksne nevroner. For å overvinne denne ulempen, vi presentere en modell av voksen aksonal regenerering i cocultures av OEG linjer med voksen retinal ganglion nevroner (RGNs), basert på den som opprinnelig ble utviklet av Wigley et al.28,29,30,31 og modifisert og brukes av vår gruppe12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kort, retinal vev ekstraheres fra voksne rotter og fordøyd med papain. Retinal celle suspensjon er deretter belagt på enten polylysin-behandlet coverslips eller på Ts14 og Ts12 monolayers. Kulturer opprettholdes i 96 timer før de er faste og deretter immunofluorescence for aksonære (MAP1B og NF-H proteiner)34 og somatodendritic (MAP2A og B)35 markører utføres. Aksonal regenerering kvantifiseres som en prosentandel av nevroner med akson, med hensyn til den totale populasjonen av RGN-er og aksonær regenereringsindeks beregnes som gjennomsnittlig aksonal lengde per nevron. Denne protokollen er ikke bare nyttig for å vurdere det neuroregenerative potensialet til ihOEG, men kan utvides til forskjellige kilder til OEG eller andre glialceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Dyreeksperimentering ble godkjent av nasjonale og institusjonelle bioetikkkomiteer.

1. ihOEG (Ts12 og Ts14) kultur

MERK: Denne prosedyren gjøres under sterile forhold i et biosikkerhetsskap for vevskultur.

  1. Forbered 50 ml ME10 OEG kulturmedium som angitt i tabell 1.
  2. Forbered 5 ml DMEM/F12-FBS, som angitt i tabell 1, i et konisk rør på 15 ml.
  3. Varm begge medier ved 37 °C i et rent vannbad, i 15 min.
  4. Tin Ts12 og Ts14 celle hetteglass ved 37 °C i et rent vannbad.
  5. Gjenoppstår og legg til celler i DMEM/F12-FBS kulturmedium utarbeidet i trinn 2.
  6. Sentrifuge i 5 min ved 200 x g.
  7. Aspire den overnaturlige.
  8. Tilsett 500 μL ME10 medium og gjenbruk pellet.
  9. Forbered en p60 celle kultur rett med 3 ml ME10 og tilsett cellulær suspensjon, dropwise.
  10. Flytt for å fordele cellene jevnt over platen.
  11. Kulturceller ved 37 °C i 5 % CO2.
    MERK: Etter å ha nådd samløpet, må minst en annen passasje gjøres for å optimalisere celler for kokultur. 90% samløpet er nødvendig før seeding dem på dekkglass for coculture. En samtidig p-60 har et gjennomsnittlig cellenummer på 7 x 105 for Ts14 og 2,5 x 106 for Ts12 cellelinjer. Ts12 og Ts14 cellelinjer skal passeres hver 2-3 dager.

2. Fremstilling av ihOEG (Ts12 og Ts14) for analysen

MERK: Dette trinnet må gjøres 24 timer før RGN-disseksjon og kokultur.

  1. Behandle 12 mm Ø dekkslips med 10 μg/ml poly-L-lysin (PLL) i 1 time.
    MERK: Dekkglassene kan stå over natten i PLL-løsning.
  2. Vask dekkglassene med 1x fosfatbuffersvann (PBS), tre ganger.
  3. Løsne Ts12- og Ts14 ihOEG-celler fra p60-cellekulturfatet.
    1. Tilsett 4 ml DMEM/F12-FBS kulturmedium (tabell 1) i et konisk rør på 15 ml. Varm ved 37 °C i rent vannbad.
    2. Fjern mediet fra plater og vask celler med 1 ml 1x PBS-EDTA, en gang.
    3. Tilsett 1 ml trypsin-EDTA i OEG-cellene og inkuber i 3–5 min ved 37 °C, 5 % CO2.
    4. Samle celler med en p1000 pipette og overføre dem til middels forberedt i trinn 3.1.
    5. Sentrifuge i 5 min ved 200 x g.
    6. Aspire den overnaturlige.
    7. Tilsett 1 ml ME10 medium og resuspend pellet.
    8. Telle cellenummeret i et hemocytometer.
  4. Frø 80 000 Ts14-celler eller 100 000 Ts12-celler/godt på dekkslepene i 24-brønnsplater i 500 μL me10 medium.
  5. Kulturceller ved 37 °C i 5 % CO2, i 24 timer.

3. Retinal vev disseksjon

MERK: 2 måneder gamle hanndsystar rotter brukes som RGN-kilde. To netthinnen (en rotte) for 20 brønner av en 24-brønns cellerett. Autoklav kirurgisk materiale før bruk. Papain dissosiasjon kit er kommersielt kjøpt (Table of Materials). Følg leverandørens instruksjoner for rekonstituering. Rekonstituer D,L-2-amino-5-fosfatonovalesyre (APV) i 5 mM lager og forberede aliquots.

  1. På analysedagen forbereder du følgende medier.
    1. Forbered en p60 cellekulturrett med 5 ml kald EBSS (hetteglass 1 av papaindissosiasjonssettet).
    2. Forbered en p60 cellekulturrett med rekonstituert hetteglass 2 (papain) av papaindissosiasjonssettet pluss 50 μL APV.  Deretter legger du til 250 μL ofrekonstituert hetteglass 3 (DNase pluss 5 μL APV).
    3. I et sterilt rør blande 2,7 ml hetteglass 1 med 300 μL hetteglass 4 (albumin-ovomucoid proteasehemmer). Tilsett 150 μL hetteglass 3 (DNase) pluss 30 μL APV.
    4. Forbered 20 ml Neurobasal-B27 medium (NB-B27) som angitt i tabell 1.
  2. Ofre en rotte ved kvelning med CO2.
  3. Fjern hodet ved halshugging med giljotin; plasser den i en 100 mm petriskål og spray hodet med etanol 70% før du plasserer den i en laminær strømningshette.
  4. Klipp rottens whiskers med saks slik at de ikke forstyrrer øyemanipulasjonen.
  5. Grip synsnerven med tang for å trekke ut øyeeplet nok til å kunne gjøre et snitt over øyet med en skalpell.
  6. Fjern linsen og glasslegemet humor og trekk ut netthinnen (oransje-lignende vev), mens de resterende lagene av øyet forblir inne (inkludert pigment epitellaget).
  7. Plasser netthinnen i p60 celle kultur parabolen tilberedt i trinn 3.1.1.
  8. Overfør netthinnen til p60 cellekulturfatet tilberedt i trinn 3.1.2 og kutt den med skalpell i små biter av omtrentlig størrelse < 1 mm.
  9. Overfør til et 15 ml plastrør.
  10. Inkuber vevet i 30 min, i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2, med agitasjon hvert 10.
  11. Dissosier celleklumper ved å pipetter opp og ned med et glass Pasteur pipette.
  12. Sentrifuger cellefjæringen ved 200 x g i 5 min.
  13. Kast supernatant og inaktivere papain, resuspend cellepellet i løsningen tilberedt i trinn 3.1.3. (1,5 ml i 2 øyne).
  14. Rør denne cellefjæringen forsiktig i 5 ml rekonstituert hetteglass 4.
  15. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
  16. Mens sentrifuging, fjern ME-10-mediet helt fra OEG 24-brønncelleplaten (tidligere forberedt i trinn 2) og bytt det ut med 500 μL NB-B27 medium per brønn.
  17. Kast de overnaturante og gjenoppuss cellene i 2 ml NB-B27-medium.
  18. Plate 100 μL retinal celle suspensjon, per brønn av m24 plate, på PLL-behandlet eller OEG monolayers-coverslips.
  19. Opprettholde kulturer ved 37 °C med 5 % CO2 for 96 timer i NB-B27-medium.

4. Immunstaining

  1. Etter 96 timer, fikse cellene i 10 min ved å legge til samme volum på 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS til kulturmediet (600 μL) (PFA endelig konsentrasjon 2%).
  2. Fjern mediet og PFA fra 24-multiwell-platen og tilsett igjen 500 μL på 4 % paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS. Inkuber i 10 min.
  3. Kast fikseren og vask 3 ganger med 1x PBS i 5 min.
  4. Blokk med 0,1 % Triton X-100/1 % FBS i PBS (PBS-TS) i 30–40 min.
  5. Forbered de primære antistoffene i PBS-TS-bufferen på følgende måte: SMI31 (mot MAP1B- og NF-H-proteiner) monoklonalt antistoff (1:500). 514 (gjenkjenner MAP2A og B proteiner) kanin polyklonalt antiserum (1:400).
  6. Tilsett primære antistoffer til kokulturer og inkuber over natten ved 4 °C.
  7. Neste dag, kast antistoffene og vask dekkglassene med 1x PBS, 3 ganger, i 5 min.
  8. Forbered de sekundære antistoffene i PBS-TS-bufferen på følgende måte: For SMI-31, antimus Alexa Fluor 488 (1:500). For 514, anti-kanin Alexa-594 (1:500).
  9. Inkuber celler med tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer i 1 time, ved RT, i mørket.
  10. Vask dekkglassene med 1x PBS, 3 ganger, i 5 min, i mørket.
  11. Til slutt monterer du dekkglass med monteringsmedium (Materials bord) og oppbevarer ved 4 °C.
    MERK: Når det er nødvendig, kan fluorescerende kjernefarging med DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol) utføres. Før montering, inkuber cellene i 10 min i mørket med DAPI (10 μg/ml i 1x PBS). Vask dekkglassene 3 ganger med 1x PBS, og monter til slutt dekkglassene med monteringsmediet.

5. Axonal regenerering kvantifisering

MERK: Prøver kvantifiseres under 40x-målet for et epifluorescencemikroskop. Minst 30 bilder bør tas på tilfeldige felt, med minst 200 nevroner, som skal kvantifiseres for hver behandling. Hvert eksperiment bør gjentas minst tre ganger.

  1. Kvantifisere prosentandelen av nevroner med axon (SMI31 positiv nøyritt) i forhold til den totale populasjonen av RGN (identifisert med MAP2A/B 514 positiv immunstaining av nevronal kropp og dendritt).
  2. Kvantifisere aksonal regenereringsindeksen eller gjennomsnittlig aksonal lengde (μm/nevron). Denne parameteren er definert som summen av lengdene (i μm) av alle identifiserte aksoner, delt på det totale antallet tellede nevroner, enten de presenterte en akson eller ikke. Aksonal lengde bestemmes ved hjelp av plugin NeuronJ av bildeprogramvaren ImageJ (NIH-USA).
  3. Beregn gjennomsnittet, standardavviket og statistisk signifikans ved hjelp av riktig programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokollen presenterer vi en in vitro-modell for å analysere OEG nevroregenerativ kapasitet etter nevronal skade. Som vist i figur 1,OEG kilden er en reversibel udødeliggjort menneskelig OEG klonisk cellelinje -Ts14 og Ts12-, som stammer fra primære kulturer, utarbeidet av olfactory pærer oppnådd iobduksjoner 15,17,18. Retinal vev ekstraheres fra voksne rotter, fordøyd, og retinal ganglion nevroner (RGN) suspensjon er belagt på enten PLL-behandlet dekkerlips eller på ihOEG monolayers, Ts14 eller Ts12. Kulturer opprettholdes i 96 timer før de er løst. Aksonale og somatodendrittiske markører analyseres ved immunofluorescence og aksonal regenerering kvantifiseres.

Ts14 OEG identitet vurderes ved immunstaining med markører som er beskrevet for å være uttrykt i ensheathing glia (Figur 2), som S100 β (Figur 2A) og vimentin (Figur 2B); GFAP-uttrykket ble også analysert for å kaste astrocyttkontaminering (figur 2C). Som vist uttrykte Ts14 S100 β vimentin, men ikke GFAP.

I den aksonale regenereringsanalysen sammenlignes Ts14 regenereringskapasitet med Ts12 i RGN-OEG-kokulturer, ved bruk av PLL-substrat som en negativ kontroll (figur 3). Både prosentandelen av celler med aksoner samt den gjennomsnittlige lengden på de regenererte aksonene var signifikant høyere i nevroner cocultured på Ts14 monolayers, sammenlignet med nevroner belagt på enten Ts12 celler eller PLL (Figur 3D,E). Representative bilder viser mangel på kapasitet på RGN til å regenerere sine aksoner over PLL eller Ts12 celler (Figur 3A, B), mens Ts14 stimulerer utveksten av aksoner i RGN (3C).

Figure 1
Figur 1: Diagram over rotte retinal ganglion nevroner med olfactory ensheathing glia celler coculture, som en modell av voksen aksonal regenerering. Udødeliggjorte menneskelige OEG (ihOEG) kloniske cellelinjer -Ts12 og Ts14- avledet fra primære kulturer fra olfaktoriske pærer. Retinal ganglion nevroner fra voksne rotter er belagt på enten PLL-behandlet dekkslepper (negativ kontroll) eller på Ts14 eller Ts12 monolayers. Kulturer opprettholdes i 96 timer før de er faste og aksonære og somatodendritiske markører analyseres ved immunofluorescence. Prosentandel av nevroner med akson og gjennomsnittlig aksonal lengde/nevron kvantifiseres for å analysere RGN aksonal regenerering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Identiteten til ihOEG cellelinje Ts14. Immunofluorescence bilder av Ts14 i kultur, merket med anti-S100 β (panel A, grønn) og vimentin (panel B, rød). GFAP-uttrykk (panel C, rød) ble også analysert for å kaste astrocyttforurensning. Kjerner er farget med DAPI (blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Analyse for aksonal regenerering i kokulturer av OEG-linjer med voksne retinale ganglionnevroner (RGN). (A-C) Immunofluorescence bilder som viser somatodendritttisk merking med 514 antistoff, som gjenkjenner mikrotubuli-assosiert protein MAP2A og B, i rødt, og med axon-spesifikke SMI31 antistoff i grønt, mot MAP1B og NF-H proteiner. Grønne piler indikerer RGN aksoner (SMI31-positiv: grønn) og gule piler indikerer nevronale legemer og dendritter (514 positive: rød og gul). (D, E) Grafer viser gjennomsnitt og standardavvik av prosentandelen av nevroner som viser aksoner og aksonær regenereringsindeksen, en parameter som gjenspeiler gjennomsnittlig aksonal lengde (μm) av aksoner per nevron. Minst 30 bilder (40x) ble tatt på tilfeldige felt og kvantifisert for hver celleprøve. Eksperimenter ble utført i triplicate, fra tre forskjellige rotter (N = 3), retinal vev samlet fra begge øyne, med duplikater for hver eksperimentell tilstand (hver glia populasjon testet). Stjerner indikerer statistisk signifikans: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, NS: ikke betydning (ANOVA og post hoc Tukey test sammenligninger mellom parametere kvantifisert for Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL, og Ts12 vs PLL). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OEG transplantasjon på CNS skade steder regnes som en lovende terapi for CNS skade på grunn av sin utspekulerende pro-neuroregenerative egenskaper7,8,9. Men, avhengig av vevskilden- olfaktorisk slimhinne (OM-OEG) versus olfaktorisk pære (OB-OEG) - eller donorens alder, finnes det betydelig variasjon i en slik kapasitet26,31,33,36. Derfor er det av betydning å ha en enkel og reproduserbar in vitro-modell for å analysere den nevroregenerative kapasiteten til en gitt OEG-prøve, før in vivo-studier starter. I denne protokollen er voksne rotters axotomiserte RGN cocultured på en monolayer av OEG til analyse. Senere analyse av RGN axonal og somatodendritiske markører ved immunofluorescence utføres for å vurdere RGN aksonal regenerering.

En innledende vanskelighet med analysen er kilden til OEG. I dette arbeidet bruker vi reversible udødeliggjorte menneskelige OEG (ihOEG) kloniske linjer, tidligere etablert og preget av vår gruppe15,16,17,18, som gir en ubegrenset tilførsel av homogen OEG. To av disse ihOEG cellelinjer er Ts14, som opprettholder den regenerative kapasiteten til de opprinnelige kulturene og Ts12, en lav regenerativ linje som brukes som en lav regenereringskontroll i disse eksperimentene18 Likevel, selv om det finnes tekniske begrensninger for å utvide menneskelige primære OEG-celler, kan de også fås fra nasal endoskopiske biopsier - OM - eller, i tilfelle OB-OEG, fra kadaverdonorer.

Utarbeidelse av monolayer OEG kulturer er en avgjørende prosedyre, som for mange celler kan føre til at kokulturen løsner fra platen. Derfor, før OEG forberedelse for analysen, anbefales det at brukeren bestemmer det optimale antall celler som skal belagt, avhengig av størrelse og divisjonshastighet.

Et annet kritisk problem er retinal vev dissosiasjon, etter retina disseksjon. Det er nødvendig å bryte opp vevfragmentene, etter inkubasjon i dissosiasjonsblandingen. Hvis det gjøres for kraftig, vil cellene bli ødelagt, men vevfragmenter vil bli stående intakt hvis de gjøres for svakt. For å oppnå en homogen cellesuspensjon foreslår vi at du fyller og tømmer en Pasteurpipette 10–15 ganger, med en mellomliggende diameter, samtidig som du unngår boblende. Pasteurpipetter med brede spisser kan begrenses ved hjelp av en Bunsen-brenner.

For å vurdere kapasiteten til ulike glialpopulasjoner for å fremme voksne nevroners aksonale regenerering, har vi fastslått at 96 h er tidsintervallet som passer best for målet fordi: 1) det er den lengste tiden å opprettholde kulturen i live uten å forstyrre OEG-monolayeren; og 2) det er tiden som trengs for nevroner å vokse aksoner lenge nok til å avsløre forskjeller mellom regenerative kapasiteter av ulike OEG populasjoner eller andre ikke-regenerative celler (det vil si fibroblaster12,13,14,15,16,17,18,32,33). Det ville sikkert være interessant å bestemme tidsforløpet av regenereringsprosessen, da det kunne gi informasjon om differensialregenerative egenskaper av forskjellige glialpopulasjoner, på kortere tider av co-kulturen. I våre hender, for regenerativ glia, er tidsforløpet mellom 72-96 h ganske lik for alle cellelinjene, selv om aksoner er kortere ved 72 timer (upubliserte data). Også, 96 h av co-kultur, tillater å studere OEG-avhengige mekanismer for voksen aksonalregenerering 12,14.

Under axonal regenerering kvantifisering, er det viktig å ta minst 30 bilder på 400 augments (40x mål), på ulike tilfeldige områder av coverslip, men etter hele aksoner av de fotograferte nevronene. Derfor må eksperimentereren ta seriebilder i de valgte områdene for å måle de virkelige aksonale lengdene.

Andre in vitro tilnærminger er også utviklet for å evaluere OEG regenerative funksjoner. I disse modellene brukes OEG på kulturer av forskjellig nevronal opprinnelse, og som svar på glialkokultur analyseres neurittdannelse og forlengelse19,20,21,22,23,24,25,26,27. Regenereringsanalysen er imidlertid avhengig av embryonale eller postnatale nevroner, som har en egenplastisitet fraværende fra skadede voksne nevroner. Denne modellen består av voksen aksonal regenerering i kokulturer av OEG linjer med voksne retinal ganglion nevroner (RGNer) overvinner denne ulempen. I tillegg dissekerer vi voksne netthinnen, og fordi vi kutter optisk nerve og aksoner trekkes tilbake i prosessen med disseksjon, får vi nevronale kropper rene av myelin, for å utføre kokulturen. Dette er forskjellen med andre deler av den voksne CNS, hvor myelin kan hindre veldig mye med disseksjon for å oppnå rene nevroner for kokulturen.

Basert på den som opprinnelig ble utviklet av Wigley et al.28,29,30,31, fremhever vi følgende forbedringer i protokollen. For det første, bruk av neurobasal medium supplert med B27 som OEG-RGN coculture medium, som tillater vekst av nevronale celler og positivt påvirker reproduserbarheten av eksperimentet. For det andre karakteriserer og kvantifiserer vi aksonal regenerering ved hjelp av en bestemt markør i aksonalt rom; og for det tredje bruker vi en ekstra direkte parameter, gjennomsnittlig aksonal lengde / nevron, som vurderer det aksonale vekstregenerative potensialet til OEG.

Oppsummert anser vi at dette er en enkel, reproduserbar, tidsbesparende og middels kostnadsanalyse, ikke bare nyttig for å vurdere det neuroregenerative potensialet til ihOEG, men også fordi det kan utvides til forskjellige kilder til OEG eller andre glialceller. Videre kan det brukes som et verdifullt bevis på konseptet av det neuroregenerative potensialet til en OEG eller glialprøve, før oversettelse til in vivo eller kliniske studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av prosjektet SAF2017-82736-C2-1-R fra Ministerio de Ciencia e Innovación til MTM-F og av Fundación Universidad Francisco de Vitoria til JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Tags

Nevrovitenskap utgave 165 olfaktorisk ensheathing glia (OEG) voksen aksonal regenerering in vitro analyse retinal ganglion nevroner (RGN) coculture axotomy
Coculture av akkotomiserte rotte Retinal Ganglion nevroner med Olfactory Ensheathing Glia, som en In Vitro modell av voksen aksonal regenerering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Portela-Lomba, M., Simón, D.,More

Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter