Desenvolvemos um método simple para isolar células cardíacas individuais de camundongos de alta qualidade pela técnica de perfusão antegrada. Este método é livre de Langendorff e útil para isolar miócitos ventriculares e atrial ou células intersticiais, como fibroblastos cardíacos ou progenitores.
Em pesquisas básicas usando coração de rato, isolar cardiomiócitos individuais viáveis é um passo técnico crucial a ser superado. Tradicionalmente, cardiomiócitos isolando de coelhos, cobaias ou ratos tem sido realizado através de perfusão retrógrada do coração com enzimas usando um aparelho Langendorff. No entanto, um alto grau de habilidade é necessário quando este método é usado com um pequeno coração de rato. Um método de perfusão antegrada que não usa um aparelho Langendorff foi recentemente relatado para o isolamento de cardiomiócitos de camundongos. Nós aqui relatamos um protocolo completo para a melhor perfusão antegrada do coração excisado para isolar células cardíacas individuais de camundongos adultos (8 a 108 semanas de idade). A perfusão antegrada é realizada injetando perfusato perto do ápice do ventrículo esquerdo do coração excisado, da qual a aorta foi presa, usando uma bomba de infusão. Todos os procedimentos são realizados em um tapete de aquecimento pré-aquecido sob um microscópio, que permite que os processos de injeção e perfusão sejam monitorados. Os resultados sugerem que miócitos ventriculares e atrial, e fibroblastos podem ser bem isolados de um único rato adulto simultaneamente.
Geralmente, o primeiro passo do isolamento celular único do tecido dissecado envolve picar o tecido em pequenos pedaços, seguido pela digestão do tecido conjuntivo e matriz extracelular com enzimas. No entanto, os cardiomiócitos não podem ser isolados com tal método de corte, pois o enriquecimento com componentes da matriz extracelular, incluindo fibras de colágeno e elastina, torna o miocárdio muito difícil de picar, e os cardiomiócitos são altamente sensíveis à hipóxia e outras alterações no microambiente. Assim, utilizando-se o sistema de perfusão retrógrada baseado em Langendorff1, desenvolveu-se um método de digestão da matriz extracelular com enzimas para isolar cardiomiócitos individuais do coração2,3,4.
Em modelos de camundongos, a perfusão retrógrada baseada em Langendorff do coração com enzimas também é usada para o isolamento de cardiomiócitos individuais5,6,7,8. No entanto, a canulação da pequena e fina aorta do rato e sua montagem no aparelho Langendorff para realizar a perfusão retrógrada requer um alto grau de habilidade, uma vez que o diâmetro da aorta no coração adulto é de aproximadamente 1,2 mm. Além disso, leva tempo para realizar vários experimentos, pois o aparelho Langendorff deve ser limpo antes de perfumar o próximo coração.
Como alternativa à perfusão retrógrada, foi desenvolvido um novo método para isolar cardiomiócitos de um coração de rato adulto sem um aparelho Langendorff. Este método de produção de época foi baseado na perfusão antegrada das artérias coronárias9. Recentemente melhoramos cada etapa deste protocolo antegrado, como a fixação da aorta, inserção da agulha e controle de temperatura, e monitoramos todos os procedimentos de perfusão com um microscópio10. Aqui informamos em detalhes o refinamento deste método de perfusão antegrada para encurtar o tempo de isolamento e fornecer um vídeo suplementar. Neste método, a perfusão do coração leva aproximadamente 7 minutos com 10 mL das enzimas, e este curto período de digestão aumenta a viabilidade das células. Trata-se de um método simples para isolar células cardíacas únicas em alta qualidade sem exigir a adição de produtos químicos, como monoxime de butanedione de 2,3 butanione (BDM)6,11 ou taurina5,8. Acreditamos que este método diminuirá o limiar de habilidade da técnica e aumentará a utilidade dos cardiomiócitos do rato na pesquisa básica.
Uma vez que o coração é altamente suscetível à isquemia, o tempo necessário para extirbir o coração e imergi-lo no CIB-EGTA gelado para parar a contração deve ser mantido aquém possível (<1 min). Este é o primeiro passo crítico deste método. O segundo passo crítico diz respeito à direção do coração. A orientação particular do coração excisado na etapa 2.1.2 torna mais fácil ver e remover a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da aorta. Após a limpeza ao redor da aorta, coloque o coração preso com o lado da superfície anterior sobre a placa de perfusão. O passo crítico final envolve a inserção da agulha de injeção. Ao avançar a agulha em direção ao coração, a agulha de injeção não deve ser separada da placa de perfusão, a fim de manter uma distância constante da placa. A posição da inserção está próxima ao ápice do ventrículo esquerdo. Insira a agulha cuidadosamente sem torcer, pois tal torção pode aumentar o orifício. A profundidade da inserção da agulha pode ser estimada observando a marca vermelha. Se a agulha for inserida muito profunda, a ponta pode perfurar através do septo ventricular e entrar no ventrículo direito ou embora a válvula mitral e entrar no átrio esquerdo. Depois de confirmar o desaparecimento do sangue da artéria coronária, a agulha deve ser fixada com fita adesiva na placa de perfusão.
Um comprimento maior da aorta dificulta a fixação da aorta na posição certa. Se o grampo estiver muito distante da ária, o coração pode girar após a infusão perfusada. Para evitar isso, corte a aorta logo abaixo da artéria braquiocefálica para encurtar a aorta antes de fixar.
Se o sangue não começar a descarregar após a perfusão a uma velocidade inicial de 0,5 mL/min, aumente a velocidade para 1 mL/min. Se isso não ajudar, a agulha de injeção pode ser posicionada incorretamente, como no ventrículo direito, septo ventricular ou parede do miocárdio esquerdo. Nesse caso, remova a agulha imediatamente e tente reinseri-la perto do ápice do ventrículo esquerdo. Ao inserir a agulha várias vezes, as células digeridas podem fluir dos orifícios abertos. Note que isso geralmente não afeta seriamente o isolamento celular.
Os operadores podem monitorar todo o processo de perfusão antegrada do coração usando um microscópio estereoscópico para observar as mudanças de cor e transparência e reiniciar a batida da ária junto com a digestão. Um total de 10 mL de mistura de enzimas deve ser o máximo necessário, mesmo para um coração velho. Em corações mais jovens (5-7 semanas de idade), reduzimos o volume para 9 mL, o que é semelhante à abordagem via perfusão retrógrada com a mesma mistura enzimática.
O supernatante na centrifugação final contém detritos, células sanguíneas e não miócitos, enquanto que a pelota contém principalmente cardiomiócitos e contaminando não-miócitos, como fibroblastos e células endoteliais. Para purificar os cardiomiócitos, mais passos são necessários. Em geral, a pelota deve ser resuspended no meio de cultura celular apropriada e pré-platado por 2h a 37°C em um prato de cultura de células teciduais, e, em seguida, remover suavemente os cardiomiócitos por pipetação e pré-chapa para cultura.
A mistura de enzimas contém uma baixa concentração de Ca2+ (0,3 mM). Incubamos, portanto, células digeridas em CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+) antes da ressuspensão final com a solução de resuspensão celular (1,8 mM Ca2+), e o aumento gradual do Ca2+ evita causar danos celulares7. Enquanto os cardiomiócitos isolados estiverem intactos (células quiescentes sem contração) este procedimento de adaptação ca2+não afeta a viabilidade celular em camundongos. Como as células danificadas estão morrendo durante esta incubação, consequentemente obtemos um grupo celular saudável. Da mesma forma, miócitos atrial intactos isolados (células quiescentes sem contração irregular) podem ser armazenados na mesma solução de resuspensão celular. No entanto, os miócitos atrial tendem a ser mais delicados a serem armazenados em comparação com os miócitos ventriculares.
Em laboratório, este método de isolamento é quase sempre bem sucedido a menos que a inserção da agulha no ventrículo esquerdo falhe. Também conseguimos isolar células do coração hipertrófico preparado pela constrição aórtica transversal cirúrgica. No entanto, em camundongos envelhecidos, que muitas vezes têm pequenos infartos do miocárdio, a perfusão cessa em alguns lugares, resultando em digestão incompleta e, portanto, um baixo rendimento(Figura 1C),semelhante ao método retrógrado baseado em Langendorff. Nesses casos, a forma distorcida do coração pode ser observada mesmo no início da perfusão.
Este método de perfusão antegrada é útil para isolar células cardíacas de camundongos de várias idades, mas não animais maiores, como coelhos e cobaias. Pode ser possível aplicar este método a ratos neonatais ou juvenis antes do desmamar.
Uma das vantagens deste método de perfusão antegrada é que ele diminui os obstáculos técnicos associados ao uso do método de perfusão retrógrada baseado em Langendorff para pequenos corações de camundongos. O tempo necessário para a perfusão é de aproximadamente 7 minutos com 10 mL das enzimas, este curto período de digestão aumenta a viabilidade das células. Além disso, permite que a perfusão seja realizada através da circulação coronária do coração, mesmo após a digestão das válvulas aórticas. O isolamento dos miócitos atrial geralmente requer perfusão retrógrada baseada em Langendorff e incubação adicional com enzimas17. Esta abordagem de perfusão antegrada, no entanto, pode perfusar profundamente o tecido com a enzima para isolar miócitos atrial.
Em experimentos usando vários camundongos, o aparelho Langendorff deve ser limpo antes de perfumar o próximo coração. No entanto, no método antegrade atual, desde que o número desejado de conjuntos de instrumentos (por exemplo, agulhas de seringa e placas de perfusão) sejam preparados com antecedência, a perfusão pode ser realizada continuamente.
Nós aqui relatamos a metodologia básica da perfusão antegrada do coração do rato usando as mesmas soluções que o método de perfusão retrógrada baseado em Langendorff sem produtos químicos adicionais. A composição do perfusato pode ser alterada para se adequar ao propósito do experimento, como o uso de um detergente contendo EGTA em vez das enzimas para fazer um coração descelularizado18.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a T. Yamamoto e Y. Mori por sua ajuda nos experimentos morfológicos. Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research (C) da Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 to M.O.K. e 17K08536 to H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |