Summary
We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.
Abstract
In fundamenteel onderzoek met behulp van muishart is het isoleren van levensvatbare individuele cardiomyocyten een cruciale technische stap om te overwinnen. Traditioneel wordt het isoleren van cardiomyocyten van konijnen, cavia's of ratten uitgevoerd via retrograde perfusie van het hart met enzymen met behulp van een Langendorff-apparaat. Een hoge mate van vaardigheid is echter vereist wanneer deze methode wordt gebruikt met een klein muishart. Een antegradeperfusiemethode die geen Langendorff-apparaat gebruikt, is onlangs gemeld voor de isolatie van cardiomyocyten van muizen. We rapporteren hierin een volledig protocol voor de verbeterde antegradeperfusie van het verwijderde hart om individuele hartcellen te isoleren van volwassen muizen (8 - 108 weken oud). Antegradeperfusie wordt uitgevoerd door perfusaat te injecteren in de buurt van de top van de linkerventrikel van het verwijderde hart, waarvan de aorta werd geklemd, met behulp van een infuuspomp. Alle procedures worden uitgevoerd op een voorverwarmde verwarmingsmat onder een microscoop, waardoor de injectie- en perfusieprocessen kunnen worden gecontroleerd. De resultaten suggereren dat ventriculaire en atriale myocyten en fibroblasten tegelijkertijd goed kunnen worden geïsoleerd van een enkele volwassen muis.
Introduction
Over het algemeen omvat de eerste stap van de eencellige isolatie van ontleed weefsel het gehakt van het weefsel in kleine stukjes, gevolgd door de vertering van het bindweefsel en extracellulaire matrix met enzymen. Cardiomyocyten kunnen echter niet worden geïsoleerd met een dergelijke hakmethode, omdat verrijking met extracellulaire matrixcomponenten, waaronder collageen- en elastinevezels, het myocardium te moeilijk maakt om te hakken, en de cardiomyocyten zijn zeer gevoelig voor hypoxie en andere veranderingen in het micromilieu. Zo is met behulp van het op Langendorff gebaseerde retrograde perfusiesysteem1een methode ontwikkeld om de extracellulaire matrix met enzymen te verteren om individuele cardiomyocyten uit het hart te isoleren2,3,4.
In muismodellen wordt op Langendorff gebaseerde retrograde perfusie van het hart met enzymen ook gebruikt voor de isolatie van individuele cardiomyocyten5,6,7,8. De cannulatie van de kleine en dunne muisaorta en de montage ervan op het Langendorff-apparaat om retrograde perfusie uit te voeren, vereist echter een hoge mate van vaardigheid, omdat de diameter van de aorta in het volwassen hart ongeveer 1,2 mm is. Bovendien kost het tijd om meerdere experimenten uit te voeren, omdat het Langendorff-apparaat moet worden gereinigd voordat het volgende hart wordt doordrongen.
Als alternatief voor retrograde perfusie werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het isoleren van cardiomyocyten uit een volwassen muizenhart zonder Langendorff-apparaat. Deze epoch-making methode was gebaseerd op de antegrade perfusie van de kransslagaders9. We hebben onlangs elke stap van dit antegradeprotocol verbeterd, zoals het klemmen van de aorta, het inbrengen van de naald en temperatuurregeling, en hebben alle perfusieprocedures met een microscoop gecontroleerd10. We rapporteren hierin in detail de verfijning van deze antegrade perfusiemethode om de tijd voor isolatie te verkorten en een aanvullende video te bieden. Bij deze methode duurt de perfusie van het hart ongeveer 7 minuten met 10 ml van de enzymen, en deze korte spijsverteringsperiode verhoogt de levensvatbaarheid van de cellen. Dit is een eenvoudige methode voor het isoleren van enkele hartcellen van hoge kwaliteit zonder toevoeging van chemicaliën, zoals 2,3-butanedion monoxime (BDM)6,11 of taurine5,8. Wij geloven dat deze methode de vaardigheidsdrempel van de techniek zal verlagen en het nut van muiscardymyocyten in fundamenteel onderzoek zal verbeteren.
Protocol
Alle dierproeven voldeden aan de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals gepubliceerd door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, herzien 1996) en werden goedgekeurd door de institutional Review Board van de Shiga University of Medical Science Animal Care and Use Committee (goedgekeurd nr. 2019-3-7). De methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde richtlijnen.
1. Instrumenten en oplossing
OPMERKING: Een overzicht van de experimentele procedure wordt geïllustreerd in een stroomdiagram (Aanvullende figuur 1). Een infuuspomp (of spuitpomp) moet worden gebruikt voor de antegradeperfusie van het hart met een eenrichtingsstroom. Een peristaltische pomp die een pulserende stroom creëert, wordt niet aanbevolen.
- Vóór de experimentele
- Markeer de injectienaald op een plaats op ongeveer 3 mm van de punt met nagellak. Nadat u het aan de lucht hebt laten drogen, houdt u het op kamertemperatuur in de container. Een rode of heldere kleur is wenselijk om de diepte van inbrengen in het myocardium tijdens perfusie te bevestigen.
- Laat het hart staan door de deksels af te snijden van monsterbuizen van 1,5, 0,5 en 0,2 ml en de deksels aan de onderkant van een kweekschaal van 60 mm te bevestigen met dubbelzijdige tape of lijm. Fixatie van drie deksels van verschillende grootte in één gerecht maakt het mogelijk om de juiste te kiezen op basis van de grootte van het muishart. Deze hartstandaard kan na het wassen opnieuw worden gebruikt.
- Maak voorraadoplossing zoals weergegeven in tabel 1. Bewaar de voorraadoplossingen op 4 °C.
- Op de experimenteerdag
OPMERKING: Celisolatiebuffer (CIB) bevat (in mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4,22 glucose, 40 eenheden/ml insuline en 25 HEPES (pH aangepast naar 7,4 met NaOH); en Tyrode-oplossing bevat (in mM) 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 5,5 glucose en 5,0 HEPES (pH aangepast naar 7,4 met NaOH).- Bereid de CIB voor. Verwarm 160 ml gedestilleerd water (DW) met behulp van een magnetron tot ongeveer 32 °C en voeg vervolgens 20 ml 10X CIB toe. Na toevoeging van 0,79 g glucose en 10 μL insulineoplossing, de pH aanpassen met 1 M NaOH en brengen tot 200 ml met DW.
- Bereid de enzymmixoplossing (enzymmix). Voeg 30 mg collagenase, 1,8 mg trypsine, 1,8 mg protease en 90 μL 100 mM CaCl2-stamoplossing toe aan 30 ml CIB (de uiteindelijke Ca2+ concentratie is 0,3 mM), meng en houd het op ijs. Bij muizen <4 weken oud, verminder trypsine en protease tot 0,9 mg10. Warm bij 37 °C in een waterbad voor gebruik.
- Bereid de CIB-Ca2+-BSA oplossing voor. Voeg 30 mg BSA en 90 μL van 100 mM CaCl2 stamoplossing toe aan 15 ml CIB (uiteindelijke Ca2+ concentratie is 1,2 mM), meng, filtreer door een filter van 20 mM en houd het op ijs.
- Bereid de CIB-EGTA oplossing voor. Voeg na het maken van de oplossingen beschreven in stap 1.2.2 en 1.2.3 400 mM EGTA-stamoplossing toe aan de resterende CIB bij een verdunning van 1:1000 (uiteindelijke EGTA-concentratie is 0,4 mM) en meng. Vul de 35 mm kweekschaal en hartstandaardschaal met CIB-EGTA en houd ze op ijs.
- Giet ongeveer 20 ml CIB-EGTA in een glazen bekerglas van 30 ml en zet een plastic transferpipet in het bekerglas, waardoor het op ijs blijft.
- Bereid de Tyrode-oplossing voor. Voeg 100 ml 10X Tyrode toe aan 800 ml DW en verwarm het met een magnetron tot ongeveer 32 °C. Na toevoeging van 0,99 g glucose en 1,8 ml cacl2, past u de pH aan met 1 M NaOH en brengt u deze met DW op 1000 ml.
- Bereid de celreanimatieoplossing voor. Voeg 30 mg BSA en 300 μL 50X antibiotica toe aan 15 ml Tyrode-oplossing.
- Maak spuiten klaar. Vul de spuit van 20 ml die is verbonden met de flexibele verlengbuis en de gemarkeerde injectienaald met CIB-EGTA. Vul de spuit van 30 ml met de opgewarmde enzymmix. Houd ze beide op 37 °C tot vlak voor gebruik.
- Maak de perfusieplaat klaar. Verwarm de kachelmat voor onder een stereoscopische microscoop. Plaats de perfusieplaat (deksel van een multi-well kweekplaat) op de voorverwarmde kachelmat. Verwarm de vaatklem voor door deze tot gebruik in de perfusieplaat te plaatsen. Plaats de kweekschaal van 60 mm voor pipetten en de celzeef ook op de voorverwarmde kachelmat.
2. Antegrade perfusie van het muizenhart
OPMERKING: De plastic transferpipet die wordt gebruikt voor het zuigen van het hart moet zacht zijn en niet scherp taps toelopend naar de punt. Kies een kleine vaatklem met serratie. De aanbevolen instrumenten zijn opgenomen in de tabel met materialen.
- Excisie van het muizenhart en het klemmen van de aorta
OPMERKING: De volwassen muizen (>8 weken oud) moeten worden geëuthanaseerd door een overdosis natriumpentobarbital (>300 mg/kg, intraperitoneale [i.p.] injectie) met heparine (8000 eenheid/kg).- Accijns het muizenhart snel door te zuigen.
- Open de borstholte snel om het hart bloot te stellen. Snijd de plastic transferpipet, waarvan de punt ongeveer even groot is als, of iets kleiner dan, het blootgestelde hart (meestal op een plaats ongeveer 1 cm van de 0,5 ml markering naar de punt, maar het hangt af van de hartgrootte).
- Zuig het hart in de pipet, til de pipet op om voldoende ruimte te creëren om een schaar in te brengen en haal het hart met een gebogen schaar van de rugkant, waardoor beschadiging van de atria wordt voorkomen.
- Breng het accijnshart onmiddellijk over op het glazen bekerglasglas van 30 ml met ijsgekoelde CIB-EGTA om de samentrekking te stoppen. Deze procedure duurt meestal <1 min.
- Schoonmaken rond de aorta
- Breng het hart over in een 35 mm kweekschaal gevuld met ijskoude CIB-EGTA en verwijder de long en andere zichtbare weefsels, en breng vervolgens het ruw gereinigde hart over naar de hartstandaard gevuld met gekoelde CIB-EGTA en plaats het met de top naar beneden.
- Verwijder onder de stereoscopische microscoop het vet en bindweefsel om rond de aorta schoon te maken. Als de lengte van de gesneden aorta te lang is, inclusief de brachiocephalische slagader, de linker gewone halsslagader of de linker subclavische slagader, snijdt u de aorta net onder de brachiocephalische slagader af om deze in te korten om door te gaan naar de volgende stap. Deze procedure duurt meestal ongeveer 4 minuten.
- Het klemmen van de aorta en het plaatsen van het geklemde hart op de perfusieplaat
- Plaats het hart onder de microscoop in de hartstandaard. De bediener moet het voorste oppervlak van het hart onder ogen zien, het uiteinde van de aorta met een pincet oppakken en de aorta in de buurt van de atria klemmen met een kleine vasculaire klem terwijl hij zachtjes op de aorta drukt.
- Plaats het geklemde hart op de perfusieplaat met de voorste kant naar boven en bedek het vervolgens met een paar druppels CIB-EGTA om te voorkomen dat het uitdroogt. Deze procedure duurt meestal <20 s.
- Accijns het muizenhart snel door te zuigen.
- Antegrade perfusie van het hart
OPMERKING: Doordrenk eerst het hart met CIB-EGTA om bloed af te voeren en stolling te voorkomen.- Steek de injectienaald in en start de perfusie om bloed af te voeren
- Stel de 20 ml spuit gevuld met voorverwarmde CIB-EGTA in op de flexibele verlengbuis en een gemarkeerde injectienaald op de infuuspomp. Start de pomp met een langzame snelheid van 0,5 ml/min om de naald en buis voorzichtig te vullen met CIB-EGTA en zorg ervoor dat er geen lucht in de buis komt.
- Plaats de injectienaald op de perfusieplaat met de kortere zijde van de diagonale vorm vooraan. Schuif de naald naar de top van het hart totdat deze deze aanraakt en steek de naald vervolgens voorzichtig in de buurt van de top van de linkerventrikel in de ventriculaire kamer zonder te draaien. Maak de naald niet los van de plaat tijdens het inbrengen.
- Let op de rode markering om de diepte van het inbrengen van de naald te schatten. Wanneer het inbrengen van de naald is voltooid, moet het bloed dat uit de kransslagader stroomt, worden afgevoerd.
- Bevestig de injectienaald met tape op de plaat en verhoog de pompsnelheid tot 1 ml/min. Deze procedure duurt meestal ongeveer 30 s. Als het hart met succes wordt doordrenkt, kan de stroom van de CIB-EGTA in het capillair net onder het epicardium onder de microscoop worden gezien.
- Perfusie van het hart met enzymmix
OPMERKING: Tijdens enzymatische perfusie kan de diepte van de ingebrachte naald worden gecontroleerd door de rode markering op de naald te controleren.- Na het perfuseren van 2-3 ml CIB-EGTA om bloed volledig uit de kransslagader te lozen, verandert u het perfusaat in enzymmix. Vermijd het toelaten van luchtbellen in de buis. Controleer de stroom van het enzymmengsel en zorg ervoor dat de injectienaald er niet uit is gekomen door de positie van de rode markering te controleren.
- Nadat 1-2 ml is doordrenkt, verhoogt u de pompsnelheid tot 1,5 ml/min. Verwijder het opgehoopte perfusaat dat bloed bevat dat van tijd tot tijd met een pipet uit het hart is gevloeid.
OPMERKING: Na verloop van tijd zal de myocardwand op sommige plaatsen doorschijnend worden en gevlekt lijken, wat een teken is van de spijsvertering van de extracellulaire matrix na succesvolle perfusie. Een ander teken is het opnieuw opstarten van atriale slagen veroorzaakt door de aanwezigheid van Ca2+ in de enzymmix. - Stop perfusie wanneer het totale volume van het enzymmengsel perfused 10 ml is.
- Steek de injectienaald in en start de perfusie om bloed af te voeren
3. Isolatie van individuele hartcellen
- Hartcellen ontkoppelen
- Breng na perfusie met het enzymmengsel 10 ml van het enzymmengsel dat in de spuit achterbleef over naar een kweekschaal van 60 mm die op de verwarmingsmat is geplaatst en voeg 20 mg BSA (0,2% BSA in enzymmix) toe. Het gevallen BSA-poeder moet onmiddellijk oplossen door voorzichtig met een hand te wervelen. Verwijder de injectienaald en de vaatklem uit het hart.
- Scheid de ventrikels en atria en breng elk over in het enzymmengsel aangevuld met 0,2% BSA op de verwarmingsmat.
- Isolatie van ventriculaire myocyten
- Pak het epicardium met twee pincet en scheur en trek de ventrikels voorzichtig van links naar rechts in de enzymmix aangevuld met 0,2% BSA in kleine stukjes. Verspreid de cellen met zachte pipetten (ongeveer 30 keer).
- Filtraat filteren door een gaascelzeef van 100 μm en het filtraat gedurende 3 minuten overbrengen naar een centrifugebuis van 15 ml voor centrifugeren met een centrifuge van 50 × g. Resuspend de gepinte cardiomyocyten in voorverwarmde CIB-Ca2+-BSA-oplossing, incubeer het gedurende 5 minuten bij 37 °C en centrifugeer het vervolgens gedurende 3 minuten op 14 × g.
- Resuspend de laatste neergeslagen cardiomyocyten in celreanipatieoplossing (samenstelling is vermeld in tabel 2) en houd deze op 37 °C.
- Isolatie van atriale myocyten
- Begin tijdens de laatste centrifugeren voor de ventriculaire myocytfractie in stap 3.2 met het isoleren van de atriale myocyten. Breng de atria, opgeslagen zoals in stap 3.1, over naar de voorverwarmde CIB-Ca2+-BSA-oplossing, scheur deze in stukken en dissocieert de cellen door met pipetpunt bij 10 μL op de kachelmat te pipetten.
- Centrifugeer het celmengsel gedurende 3 minuten op 14 × g en resuspend de geplet atriale cellen met celreanimatieoplossing.
- Isolatie en cultuur van hartfibrose
- Breng het supernatant van de eerste centrifugeer in stap 3.2 over naar een andere centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 190 × g. Was de neergeslagen cellen tweemaal met centrifugeren in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en schors de cellen vervolgens met DMEM aangevuld met 10% foetale runderalbumine (FBS) en antibiotica.
- Leg de laatste celfractie in een kweekkolf (25 cm2) en laat de cellen zich aan de bodem van de kolf hechten in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2. Gooi na 90 minuten incubatie de niet-aangehed cellen weg en voeg een vers kweekmedium toe. Cellen moeten na ongeveer 4 dagen in de buurt van confluency komen, waarna ze moeten worden versterkt door trypsinisatie en in nieuwe kweekgerechten moeten worden gezaaid.
4. Eiwitten oogsten uit atria en ventrikels
- Na perfusie scheidt u de atria en ventrikels en homogeniseert u ze in een lysisbuffer met een verhouding van 10 mg weefselgewicht tot 100 μL buffer met behulp van een kleine grinder in een monsterbuis van 1,5 ml.
- Houd het homogenaat 40 minuten in ijs met vortexmenging om de 10 minuten om eiwitten te extraheren en centrifugeer de buis vervolgens op 15000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Bewaar de supernatansfractie bij -80 °C als eiwitmonster.
5. Immunostaining van geïsoleerde hartcellen
OPMERKING: Immobilisatie van niet-hechtende cardiomyocyten naar de bodem van de celbeeldvormingsschaal met behulp van biologische lijm is noodzakelijk.
- Hechting van geïsoleerde cardiomyocyten aan een kweekschaal met glazen bodem
- Voordat u met celisolatie begint, bekleedt u de kweekschaal met glazen bodem met biologische lijm (bijv. Cell-Tak) volgens de instructies van de fabrikant, spoelt u af met DW en droogt u deze af bij kamertemperatuur.
- Na resuspensie van de geïsoleerde cardiomyocyten in CIB-Ca2+-BSA-oplossing, laat u de celsuspensie op de bodem van de met lijm bedekte gerechten vallen en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie.
- Immunostaining
- Leg de geïsoleerde cardiomyocyten op een schotel met glazen bodem voorgecoat met biologische lijm en houd deze 40 minuten op kamertemperatuur zodat de cellen zich aan de schaal kunnen hechten. Kweek hartfibroblasten in bodemglas cultuurgerechten.
- Spoel cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en fixeer ze met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 5 minuten met schudden. Was de vaste cellen drie keer gedurende 10 minuten met PBS en incubeer ze in blokkeer-permeabilisatieoplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met schudden.
- Sondecellen met primair antilichaam verdund in blokkeer-permeabilisatieoplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Was de cellen driemaal gedurende 10 minuten met PBS en incubeer vervolgens met fluorescentie-gelabeld secundair antilichaam gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Na ze drie keer te hebben gewassen met PBS gedurende 10 minuten, bevlekt u de kernen met DAPI (1:10000 verdunning in PBS). Analyseer de fluorescerende signalen met behulp van een confocale laserscanmicroscoop.
6. Hele-cel patch klem opnames
- Fabriceer de patchelektroden uit een glazen haarvat met behulp van een horizontale micro-eclectrode trekker. De weerstand van de elektrode varieerde van 2 tot 4 MΩ wanneer deze gevuld was met een K+-rijke pipetoplossing (Tabel 2). Breng een aliquot van geïsoleerde cardiomyocyten over naar een opnamekamer die op het podium van een omgekeerde microscoop is gemonteerd, oversmolten met Tyrode met een snelheid van 1 ml/min bij 36-37 °C.
- Registreer actiepotentiaal met behulp van de geperforeerde patchklemmethode met K+-rijke pipetoplossing met 30 mg/ml amfotericine B door stroompulsen van 5-10 ms aan te brengen met een snelheid van 1 Hz via de patchelektrode.
7. Westerse vlekanalyses
- Voer in deze studie een westerse vlekanalyse uit van eiwitten met een klein molecuulgewicht, zoals atriale marker atriale natriuretische peptide (ANP).
- Los het eiwitmonster op in de eindconcentratie van 1X Monsterbuffer, 2% 2' mercaptoethanol, en denatureer de eiwitten gedurende 60 min bij 37 °C. Laad 20 μg eiwit in elke put en voer elektroforese uit in de lopende buffer met 20 mA per gel gedurende 120 minuten.
- Breng het eiwit gedurende 40 minuten over naar een PVDF-membraan in transferbuffer bij 10 V. Was het overgedragen membraan tweemaal met TBST gedurende 5 minuten, blokkeer vervolgens met 5 % magere melk in TBST gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en sonde met het primaire antilichaam dat 's nachts bij 4 °C in TBST is opgelost.
- Was het membraan 5 keer met TBST gedurende 7 minuten en incubeer het met het secundaire antilichaam verdund in TBST gedurende 120 minuten bij kamertemperatuur.
- Nadat u het membraan 5 keer gedurende 7 minuten met TBST hebt gewassen, visualiseert u de signalen met een chemi-luminescentietest en analyseert u ze met een lichtbeeldanalysator.
Representative Results
Het principe van deze methode is eenvoudig: het perfusaat stroomt uit de linkerkamer, de aortaklep wordt geopend en het perfusaat loopt in dezelfde richting in de kransslagader als de bloedloop, omdat de aorta wordt gesloten door klemmen, waardoor de diepe perfusie van het myocardium mogelijk is om de extracellulaire matrix te verteren.
Ventriculaire myocyten die vers met de huidige methode zijn geïsoleerd , zijn weergegeven in figuur 1A. Figuur 1B toont vergrote beelden van de ventriculaire en atriale myocyten. Deze isolatieprocedure resulteerde in een hoog rendement (70%-80%) van staafvormige quiescente ventriculaire myocyten van volwassen muizen (8-10 weken), die binnen ongeveer 5 uur na isolatie beschikbaar waren (figuur 1C), een vergelijkbaar interval als bij het gebruik van de traditionele op Langendorff gebaseerde procedure7. De verhouding van vers geïsoleerde levensvatbare cellen was echter lager bij oudere muizen van >2 jaar oud (figuur 1C). Het totale aantal ventriculaire myocyten dat met behulp van dit protocol per volwassen hart werd verkregen , was ongeveer 3 x10 6 cellen, wat vergelijkbaar was met de eerder gerapporteerde waarde7,12. De actiepotentiaal die werd geregistreerd in de ventriculaire en atriale myocyten (figuur 1D) was vergelijkbaar met die in cellen die werden verkregen met de op Langendorff gebaseerde methode10. Een immunostaining-analyse bevestigde dat de sarctische structuur van de ventriculaire myocyten goed georganiseerd was met een duidelijk zichtbaar celmembraan (figuur 2A). De individuele cardiomyocyten die met deze methode zijn geïsoleerd, kunnen direct worden gebruikt in experimenten, zoals een elektrofysiologisch analyse10- of immunostaining-experiment.
Hartfibroseblasten bestaan in interstitiële ruimtes. Voldoende vertering van de extracellulaire matrix resulteert in de isolatie van die cellen. De geïsoleerde hartfibroblasten verspreiden zich onder kweekomstandigheden en kunnen meerdere keren worden gepasseerd of opgeslagen in vloeibare stikstof in een geschikte celreservoiroplossing. Figuur 2B toont aan dat de meeste gekweekte hartfibroblasten tijdens subcultuur in myofibroblasten waren veranderd , zoals bevestigd door de verhoogde expressie van α-gladde spieractin13,14. Ook kunnen de hartgenitors worden geïsoleerd met de huidige methode en gekweekt in het juiste cultuurmedium, dat automatisch10,15begint te kloppen .
Homogenisatie van het robuuste myocardium is niet eenvoudig, vooral niet voor hartweefsel van oude muizen, dat een grote hoeveelheid extracellulaire vezels bezit. Na antegradeperfusie kunnen eiwitten uit de atria en ventrikels gemakkelijk worden gehomogeniseerd in de lysisbuffer met lichte kracht om eiwitten te extraheren. Een westerse vlekanalyse toonde de specifieke expressie van ANP aan bij atria, maar niet bij ventrikels van volwassen (20 weken oude) en oudere (108 weken oude) muizen (figuur 3).
Figuur 1. Geïsoleerde cardiomyocyten van muizen. A. Ventriculaire myocyten vers geïsoleerd met de antegradeperfusie, met beelden verkregen met een lage vergroting. Na de laatste wasbeurt werden de cardiomyocyten geresuspendeerd met 2 ml celreanimatieoplossing, waarvan 100 μL op de kweekschaal met glazen bodem werd gedropt en celafzetting wachtte. Staaf, 100 μm.B. Vergrote afbeeldingen van geïsoleerde ventriculaire myocyten (boven) en atriale myocyten (lager). Bar, 100 μm.C. Geïsoleerde cellen werden in de celresuspensieoplossing opgehangen en gedurende de gewenste periode bij 37°C bewaard, en het aantal levende ventriculaire myocyten werd geteld in 10-15 velden onder een microscoop. Afgeronde cellen werden geacht onomkeerbaar gewond of dood te zijn16. Groene, blauwe en rode symbolen werden verkregen van 3 muizen op 8-10 weken oud, en zwarte symbolen waren van 106 weken oude muis. Geel symbool geeft het gemiddelde van elke groep aan. D. Representatieve actiepotentiaal geregistreerd uit ventriculaire (zwarte) en atriale (rode) myocyten van 8-10 muizen. De gegevens werden ongeveer 3 uur na isolatie uit de cellen verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Immunostaining voor α-actinine in geïsoleerde muis ventriculaire myocyten en α-gladde spier actine in gekweekte muis cardiale fibroblasten. A. Confocale laserscanmicroscopie van immunostaining voor α-actinine (groen), DAPI-kleuring voor kernen (blauw) en een DIC-afbeelding van ventriculaire myocyten geïsoleerd uit het muishart met antegradeperfusie. Bar, 50 μm.B. Immunostaining voor α-gladde spier actine (groen), DAPI-kleuring voor kernen (blauw) en een DIC-afbeelding van hartfibroblasten geïsoleerd uit het muishart met antegradeperfusie. Hartfibroseblasten werden vier dagen gekweekt. Bar, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Westerse vlekanalyses van ANP in atria en ventrikels. Westerse vlekanalyses voor het atriale marker atriale natriuretic peptide (ANP) in atria (A) en ventrikels (V) bereid uit volwassen (20 weken) en oude (108 weken) harten. ANP is aanwezig in de atria maar afwezig in de ventrikels. Gebruik glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) als controle-eiwit voor het huishouden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Voorraadoplossingen voor het isoleren van hartcellen | |
| 10X CIB (500 ml) | |
| NaCl | 37,99 g |
| KCI | 2,01 g |
| 1 M MgCl2 | 2,5 ml |
| NaH2PO | 0,23 g |
| HEPES | 29,79 g |
| Dw | Vul tot 500 ml |
| 100 mM CaCl2 voorraad soution | |
| CaCl2 | 100 mM |
| 400 mM EGTA voorraadoplossing | |
| EGTA | 400 mM |
| Insuline-oplossing | |
| insuline | 1 eenheid/ml in 0,1 M HCl |
| 50X Antibiotica voorraadoplossing (20 ml) | |
| penicilline | 100 mg |
| Streptomycine | 100 mg |
| Fenol rood | 1,5 g |
| Dw | 20 ml en steriliseren met filtering |
| 10X Tyrode oplossing (1000 ml) | |
| NaCl | 81,82 g |
| Kcl | 4,03 g |
| 1 M MgCl2 | 5 ml |
| NaH2PO | 0,47 g |
| HEPES | 11,92 g |
| NaOH | 0,8 g |
| Dw | Vul tot 1000 ml |
| Voorraadslutine voor immunostaining | |
| DAPI-voorraad | |
| DAPI | 2 mg/ml methanol |
| Voorraadoplossingen voor westerse vlekken | |
| HEPES buffer (100 ml) | |
| NaCl | 0,88 g |
| 400 mM EGTA | 0,25 ml |
| HEPES | 0,24 g |
| 1M NaOH | de pH aanpassen tot 7,4 |
| Dw | Vul tot 500 ml |
| Proteaseremmers cocktail | |
| Complete mini | 1 tablet |
| Dw | 0,4 ml |
Tabel 1. Beschrijving van de voorraadoplossingen. Houd voorraadoplossingen op 4 °C. Aliquot proteaseremmers cocktail voor opslag bij -20 °C.
| Oplossingen voor het isoleren van hartcellen | |
| CIB (200 ml) | |
| 10X CIB | 20 ml |
| Insuline-oplossing | 0,01 ml |
| glucose | 0,79 g |
| 1M NaOH | pH aanpassen tot 7,4 |
| Dw | Vul tot 200 ml |
| Enzymmixoplossing (30 ml) | |
| Collagenase type 2 | 30 mg |
| Trypsine | 1,8 mg |
| protease | 1,8 mg |
| 100 mM CaCl2 voorraadoplossing | 0,09 ml |
| Cib | 30 ml |
| CIB-Ca2+-BSA (15 ml) | |
| Bsa | 30 mg |
| 100 mM CaCl2 voorraadoplossing | 0,18 ml |
| Cib | 15 ml |
| CIB-EGTA (150 ml) | |
| 400 mM EGTA voorraadoplossing | 0,150 ml |
| Cib | 150 ml |
| Tyrode oplossing (1000 ml) | |
| 10X Tyrode voorraadoplossing | 100 ml |
| glucose | 0,99 g |
| 1M CaCl2 | 1,8 ml |
| 1M NaOH | pH aanpassen tot 7,4 |
| Dw | Vul tot 1000 ml |
| Celresuspensieoplossing (15 ml) | |
| Bsa | 30 mg |
| 50X Antibiotica voorraadoplossing | 0,3 ml |
| Tyrode-oplossing | 15 ml |
| Oplossingen voor immunostaining | |
| Celaanhechtingsoplossing (0,3 ml) | |
| Cel-Tak | 0,01 ml |
| 0,1 M NaHCO3 (pH8,0) | 0,285 ml |
| 0.1 M NaOH | 0,005 ml |
| Blocking-permeabilizatin oplossing (10 ml) | |
| Foetale runderserum | 1 ml |
| Triton X-100 | 1 ml |
| 10X PBS | 1 ml |
| Dw | 7 ml |
| K+ rijke pipetoplossing | |
| Kalium aspartaat | 70 mM |
| Kcl | 50 mM |
| KH2PO4 | 10 mM |
| MgSO4 | 1 mM |
| ATP dinatriumzout | 3 mM |
| GTP lithiumzout | 0,1 mM |
| EGTA | 5 mM |
| HEPES | 5 mM |
| Koh | pH aanpassen tot 7,2 |
| Oplossingen voor westerse vlekken | |
| Lysisbuffer (1 ml) | |
| HEPES-buffer | 0,86 ml |
| Niet-idet-P40 | 0,1 ml |
| Proteaseremmers cocktail | 0,04 ml |
| Runnning buffer (1000 ml) | |
| 10X TG (0,25 M Tris en 1,92 M Glycine) | 100 ml |
| Sds | 1 g |
| Dw | 900 ml |
| Transferbuffer (1000 ml) | |
| 10x TG | 100 ml |
| methanol | 200 ml |
| Dw | 700 ml |
| Blotting buffer (TBST) (1000 ml) | |
| 5M NaCl | 20 ml |
| 2M Tris-HCl (pH 7,5) | 5 ml |
| 10% Tween 20 | 10 ml |
| Dw | 965 ml |
Tabel 2. Beschrijving van de werkoplossingen voor het isoleren van hartcellen, immunostaining en western blotting. Bereid alle werkende oplossingen voor vlak voor de experimenten voor.
Aanvullend figuur 1. Overzicht van de celisolatie. Stroomdiagram van de isolatie van ventriculaire en atriale myocyten en hartfibblasten uit één hart. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Discussion
Aangezien het hart zeer gevoelig is voor ischemie, moet de tijd die nodig is om het hart te verwijderen en onder te dompelen in ijskoude CIB-EGTA om de samentrekking te stoppen, zo kort mogelijk worden gehouden (<1 min). Dit is de eerste kritieke stap van deze methode. De tweede kritische stap betreft de richting van het hart. De bijzondere oriëntatie van het verwijderde hart in stap 2.1.2 maakt het gemakkelijker om het vet en bindweefsel rond de aorta te zien en te verwijderen. Plaats na het reinigen rond de aorta het geklemde hart met de voorste oppervlakzijde naar boven op de perfusieplaat. De laatste kritieke stap omvat het inbrengen van de injectienaald. Wanneer u de naald naar het hart opstuurt, mag de injectienaald niet van de perfusieplaat worden losgemaakt om een constante afstand tot de plaat te behouden. De positie van de invoeging bevindt zich in de buurt van de top van de linkerventrikel. Steek de naald voorzichtig in zonder te draaien, omdat een dergelijke verdraaiing het gat kan vergroten. De diepte van het inbrengen van de naald kan worden geschat door naar de rode markering te kijken. Als de naald te diep wordt ingebracht, kan de punt door het ventriculaire septum prikken en de rechterventrikel of de mitralisklep binnendringen en het linkeratrium binnendringen. Na bevestiging van het verdwijnen van het bloed uit de kransslagader, moet de naald met tape op de perfusieplaat worden bevestigd.
Een langere aortalengte maakt het moeilijk om de aorta op de juiste positie te klemmen. Als de klem te ver van de atria verwijderd is, kan het hart draaien na perfusaatinfusie. Om dit te voorkomen, snijdt u de aorta net onder de brachiocephalische slagader af om de aorta in te korten voordat u deze klemt.
Als het bloed niet begint te ontladen na perfusie bij een beginsnelheid van 0,5 ml/min, verhoog dan de snelheid tot 1 ml/min. Als dat niet helpt, kan de injectienaald verkeerd worden geplaatst, zoals in de rechterventrikel, het ventriculaire septum of de linker myocardwand. Verwijder in dat geval de naald onmiddellijk en probeer deze opnieuw in de buurt van de top van de linkerventrikel te plaatsen. Bij het meerdere keren inbrengen van de naald kunnen verteerd cellen uit de geopende gaten stromen. Merk op dat dit meestal geen ernstige invloed heeft op de celisolatie.
De operators kunnen het hele proces van antegradeperfusie van het hart volgen met behulp van een stereoscopische microscoop om de veranderingen in kleur en transparantie te observeren en het kloppen van de atria samen met de spijsvertering opnieuw op gang te brengen. In totaal moet 10 ml enzymmix het maximaal vereiste zijn, zelfs voor een oud hart. In jongere harten (5-7 weken oud) verminderen we het volume tot 9 ml, wat vergelijkbaar is met de aanpak via retrograde perfusie met dezelfde enzymmix.
Het supernatant bij de uiteindelijke centrifugeren bevat puin, bloedcellen en niet-myocyten, terwijl de pellet voornamelijk cardiomyocyten bevat en niet-myocyten verontreinigt, zoals fibroblasten en endotheelcellen. Om de cardiomyocyten te zuiveren, zijn meer stappen nodig. Over het algemeen moet de pellet worden geresuspendeerd in het juiste celkweekmedium en gedurende 2 uur bij 37 °C op een weefselcelkweekschaal worden gepreplateerd en vervolgens voorzichtig de cardiomyocyten verwijderen door pipetten en preplateren voor kweek.
Het enzymmengsel bevat een lage concentratie ca2+ (0,3 mM). Daarom incuberen we verteerd cellen in CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+) vóór de uiteindelijke resuspensie met de celresuspensieoplossing (1,8 mM Ca2+), en de geleidelijke toename van Ca2+ voorkomt het veroorzaken van celschade7. Zolang de geïsoleerde cardiomyocyten intact zijn (rustgevende cellen zonder samentrekking) heeft deze Ca2+aanpassingsprocedure geen invloed op de levensvatbaarheid van cellen bij muizen. Omdat de beschadigde cellen tijdens deze incubatie afsterven, verkrijgen we bijgevolg een gezonde celgroep. Evenzo kunnen geïsoleerde intacte atriale myocyten (rustgevende cellen zonder onregelmatige samentrekking) worden opgeslagen in dezelfde celreanissieoplossing. De atriale myocyten zijn echter meestal delicater om te worden opgeslagen in vergelijking met de ventriculaire myocyten.
In het laboratorium is deze isolatiemethode bijna altijd succesvol, tenzij het inbrengen van de naald in de linkerventrikel mislukt. We zijn er ook in geslaagd om cellen te isoleren van het hypertrofie hart, bereid door chirurgische transversale aortavernauwing. Bij oudere muizen, die vaak kleine myocardinfarcten hebben, stopt de perfusie echter op sommige plaatsen, wat resulteert in onvolledige spijsvertering en dus een lage opbrengst (figuur 1C), vergelijkbaar met de op Langendorff gebaseerde retrograde methode. In dergelijke gevallen kan de vervormde vorm van het hart zelfs aan het begin van de perfusie worden waargenomen.
Deze antegradeperfusiemethode is nuttig voor het isoleren van hartcellen van muizen van verschillende leeftijden, maar niet van grotere dieren, zoals konijnen en cavia's. Het kan mogelijk zijn om deze methode toe te passen op neonatale of juveniele ratten voordat ze worden gespeend.
Een van de voordelen van deze antegradeperfusiemethode is dat het de technische obstakels vermindert die gepaard gaan met het gebruik van de op Langendorff gebaseerde retrograde perfusiemethode voor kleine muizenharten. De tijd die nodig is voor perfusie is ongeveer 7 minuten met 10 ml van de enzymen, deze korte spijsverteringsperiode verhoogt de levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien maakt het perfusie mogelijk om door de coronaire circulatie van het hart te worden uitgevoerd, zelfs nadat de aortakleppen zijn verteerd. Isolatie van atriale myocyten vereist meestal op Langendorff gebaseerde retrograde perfusie en verdere incubatie met enzymen17. Deze antegrade perfusiebenadering kan het weefsel echter diep doordringen met het enzym om atriale myocyten te isoleren.
In experimenten met meerdere muizen moet het Langendorff-apparaat worden gereinigd voordat het volgende hart wordt doordrongen. In de huidige antegrademethode kan echter, zolang het gewenste aantal instrumentensets (bijv. injectienaalden en perfusieplaten) van tevoren wordt voorbereid, continu perfusie worden uitgevoerd.
Hierin rapporteren we de basismethodologie van de antegradeperfusie van het muizenhart met dezelfde oplossingen als de op Langendorff gebaseerde retrograde perfusiemethode zonder extra chemicaliën. De samenstelling van het perfusaat kan worden aangepast aan het doel van het experiment, zoals het gebruik van een wasmiddel dat EGTA bevat in plaats van de enzymen om een gedecelluliseerd hart te maken18.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs danken T. Yamamoto en Y. Mori voor hun hulp bij de morfologische experimenten. Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research (C) van de Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 tot M.O.K. en 17K08536 tot H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
| Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
| Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
| Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
| Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
| Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
| ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
| Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
| Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
| 4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
| Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
| EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
| Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
| GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
| Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
| Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
| Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
| Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
| Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
| Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
| Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
| Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
| 10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
| Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
| Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
| Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
| Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
| Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
| 4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
| SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
| Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
| 10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
| Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
| All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |
References
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Joshi-Mukherjee, R., et al. Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).
- Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
- Zhou, Y. Y., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).
- Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Sambrano, G. R., et al. Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes. Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).
- Limana, F., et al. bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair. Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).
- Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).
- Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes. American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).
- Nakamura, H., et al. Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice. European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).
- Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).
