Summary
हमने एंटेग्रेड परफ्यूजन तकनीक द्वारा उच्च गुणवत्ता वाले व्यक्तिगत माउस हृदय कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरलई विधि विकसित की है। यह विधि लैंगेंडोर्फ-मुक्त है और वेंट्रिकुलर और एट्रियल मायोसाइट्स या इंटरस्टिटियल कोशिकाओं, जैसे कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट या जनक को अलग करने के लिए उपयोगी है।
Abstract
माउस दिल का उपयोग कर बुनियादी अनुसंधान में, व्यवहार्य व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना एक महत्वपूर्ण तकनीकी कदम है। परंपरागत रूप से, खरगोशों, गिनी सूअरों या चूहों से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना लैंडेनडोर्फ उपकरण का उपयोग करके एंजाइमों के साथ दिल के प्रतिगामी पर्फ्यूजन के माध्यम से किया गया है। हालांकि, जब इस विधि का उपयोग छोटे माउस दिल के साथ किया जाता है तो उच्च स्तर के कौशल की आवश्यकता होती है। एक एंटेग्रेड परफ्यूजन विधि जो लैंगेंडोर्फ उपकरण का उपयोग नहीं करती है, हाल ही में माउस कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए सूचित किया गया था। हम यहां वयस्क चूहों (8 - 108 सप्ताह पुराने) से व्यक्तिगत हृदय कोशिकाओं को अलग करने के लिए उत्पादित दिल के बेहतर एंटेग्रेड परफ्यूजन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। एंटेग्रेड परफ्यूजन उत्पादित दिल के बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के पास परफ्यूसेट इंजेक्शन द्वारा किया जाता है, जिसका महाधमनी एक जलसेक पंप का उपयोग करके दबाया गया था। सभी प्रक्रियाएं माइक्रोस्कोप के नीचे पूर्व-गर्म हीटर चटाई पर की जाती हैं, जो इंजेक्शन और पर्फ्यूजन प्रक्रियाओं की निगरानी करने की अनुमति देती है। परिणाम बताते हैं कि वेंट्रिकुलर और एट्रियल मायोसाइट्स, और फाइब्रोब्लास्ट को एक साथ एक वयस्क माउस से अच्छी तरह से अलग किया जा सकता है।
Introduction
आम तौर पर, विच्छेदित ऊतकों के एकल कोशिका अलगाव के पहले चरण में ऊतक को छोटे टुकड़ों में नख़रे जाने में शामिल होता है, जिसके बाद एंजाइमों के साथ संयोजी ऊतक और बाह्राश मैट्रिक्स का पाचन होता है। हालांकि, कार्डियोमायोसाइट्स को इस तरह के चॉपिंग विधि से अलग नहीं किया जा सकता है, क्योंकि कोलेजन और इलास्टिन फाइबर सहित एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स घटकों के साथ संवर्धन, मायोकार्डियम को कीमा बनाने के लिए बहुत कठिन बनाता है, और कार्डियोमायोसाइट्स हाइपोक्सिया और माइक्रोएनवायरमेंट में अन्य बदलावों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं। इस प्रकार, लैंगेंडोर्फ आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन सिस्टम1का उपयोग करके, एंजाइमों के साथ एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स को पचाने की एक विधि विकसित की गई हैताकि हृदय2,3,4से अलग-अलग कार्डियोमायोसाइट्स को अलग किया जा सके।
माउस मॉडल में, एंजाइमों के साथ दिल के लैंगेंडोर्फ आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन का उपयोग व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स5,6,7,8के अलगाव के लिए भी कियाजाताहै। हालांकि, छोटे और पतले माउस महाधमनी के कैनुलेशन और प्रतिगामी परफ्यूजन करने के लिए लैंगेंडोर्फ उपकरण पर इसके बढ़ते कौशल की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है, क्योंकि वयस्क दिल में महाधमनी का व्यास लगभग 1.2 मिमी है। इसके अलावा, कई प्रयोग करने में समय लगता है क्योंकि लैंगेंडोर्फ उपकरण को अगले दिल को छिद्रित करने से पहले साफ किया जाना चाहिए।
प्रतिगामी परफ्यूजन के विकल्प के रूप में, लैंगेंडोर्फ उपकरण के बिना वयस्क माउस हार्ट से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक उपन्यास विधि विकसित की गई थी। यह युग बनाने की विधि कोरोनरी धमनियों9के एंटेग्रेड परफ्यूजन पर आधारित थी । हमने हाल ही में इस एंटेग्रेड प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में सुधार किया है, जैसे कि महाधमनी, सुई प्रविष्टि और तापमान नियंत्रण का क्लैंपिंग, और माइक्रोस्कोप10के साथ सभी पर्फ्यूजन प्रक्रियाओं की निगरानी की। हम इसमें अलगाव के लिए समय को छोटा करने और एक पूरक वीडियो प्रदान करने के लिए इस एंटीग्रेड परफ्यूजन विधि के शोधन को विस्तार से रिपोर्ट करते हैं। इस विधि में, दिल का पर्फ्यूजन एंजाइमों के 10 एमएल के साथ लगभग 7 मिनट लेता है, और यह छोटा पाचन अवधि कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बढ़ाती है। यह 2,3-ब्यूनएक मोनोक्सीम (बीडीएम)6,11 या टॉरिन5,8जैसे रसायनों के अलावा की आवश्यकता के बिना उच्च गुणवत्ता पर एकल हृदय कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल तरीका है। हमारा मानना है कि यह विधि तकनीक की कौशल सीमा को कम करेगी और बुनियादी शोध में माउस कार्डियोमायोसाइट्स की उपयोगिता को बढ़ाएगी।
Protocol
सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुरूप अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित १९९६) द्वारा प्रकाशित और चिकित्सा विज्ञान पशु देखभाल और उपयोग समिति के शिगा विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित (2019-3-7 को मंजूरी दे दी) । तरीकों को अनुमोदित दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया ।
1. उपकरण और समाधान
नोट: प्रायोगिक प्रक्रिया की एक रूपरेखा एक प्रवाह आरेख(अनुपूरक चित्रा 1)में सचित्र है । एक जलसेक पंप (या सिरिंज पंप) का उपयोग एक तरफा प्रवाह के साथ दिल के एंटीग्रेड पर्फ्यूजन के लिए किया जाना चाहिए। एक पेरिस्टाल्टिक पंप जो स्पंदन प्रवाह बनाता है, की सिफारिश नहीं की जाती है।
- प्रायोगिक से पहले
- नेल पॉलिश के साथ टिप से लगभग 3 मिमी साइट पर इंजेक्शन सुई चिह्नित करें। हवा सूखी अनुमति देने के बाद, इसे कमरे के तापमान पर कंटेनर में रखें। परफ्यूजन के दौरान मायोकार्डियम में सम्मिलन की गहराई की पुष्टि करने के लिए एक लाल या उज्ज्वल रंग वांछनीय है।
- 1.5-, 0.5- और 0.2-एमएल नमूना ट्यूबों के ढक्कन को काटकर दिल को खड़ा करें और दो तरफा टेप या चिपकने वाले के साथ 60 मिमी संस्कृति पकवान के नीचे ढक्कन संलग्न करें। एक डिश में तीन अलग-अलग आकार के ढक्कन का निर्धारण माउस दिल के आकार के अनुसार उपयुक्त एक का चयन करना संभव बनाता है। इस हार्ट स्टैंड को धोने के बाद दोबारा इस किया जा सकता है।
- तालिका 1में दिखाए गए स्टॉक समाधान को बनाएं। स्टॉक सॉल्यूशंस को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- प्रयोग दिवस पर
नोट: सेल आइसोलेशन बफर (सीआईबी) में (एमएमएम में) 130 एनएसीएल, 5.4 केसीएल, 0.5 एमजीसीएल2,0.33 एनएएच2पीओ4,22 ग्लूकोज, 40 यूनिट/ एमएल इंसुलिन और 25 एचईपीई (पीएच को एनएओएच के साथ 7.4 में समायोजित); और टायरोड समाधान में (एमएमएम में) 140 एनएसीएल, 5.4 केसीएल, 1.8 सीएसीएल2,0.5 एमजीसीएल2,0.33एनएएच 2पीओ4, 5.5 ग्लूकोज और 5.0 एचईपी (पीएचएच को एनएओएच के साथ 7.4 में समायोजित) शामिल हैं।- सीआईबी तैयार करें। लगभग 32 डिग्री सेल्सियस तक माइक्रोवेव का उपयोग करके आसुत पानी (DW) का गर्म 160 एमएल और फिर 10X सीआईबी का 20 एमएल जोड़ें। 0.79 ग्राम ग्लूकोज और इंसुलिन समाधान के 10 माइक्रोन के अलावा के बाद, पीएच को 1 एम नाओएच का उपयोग करके समायोजित करें और डीएसडब्ल्यू के साथ 200 एमएल तक लाएं।
- एंजाइम मिक्स सॉल्यूशन (एंजाइम मिक्स) तैयार करें। सीआईबी के 30 मिलीग्राम (अंतिम सीए2 + एकाग्रता 0.3 मीटर है) में 30 मिलीग्राम कोलेजन, 1.8 मिलीग्राम ट्राइप्सिन, 1.8 मिलीग्राम प्रोटीज और 100 मिलियन सीएसीएल 2 स्टॉक समाधान जोड़ें (अंतिम सीए2 + एकाग्रता 0.3 m M है), मिश्रण करें, और इसे बर्फ पर रखें। चूहों में <4 सप्ताह पुराना है, ट्राइप्सिन और प्रोटीज को 0.9 मिलीग्राम10तक कम करें। उपयोग से पहले पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
- सीआईबी-सीए2+-बीएसए समाधान तैयार करें। सीआईबी के 15 एमएल (अंतिम सीए 2 + एकाग्रता1.2 mm है), मिश्रण, एक20-μm फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करने के लिए 30 मिलीग्राम बीएसए और 100 mM CaCl 2 स्टॉक समाधान के 90 माइक्रोन जोड़ें, और इसे बर्फ पर रखें।
- सीआईबी-ईजीटीए सॉल्यूशन तैयार करें। चरण 1.2.2 और 1.2.3 में वर्णित समाधान बनाने के बाद, 1:1000 कमजोर पड़ने पर शेष सीआईबी में 400 m M EGTA स्टॉक समाधान जोड़ें (अंतिम ईजीटीए एकाग्रता 0.4 mM है), और मिश्रण करें। सीआईबी-ईजीटीए के साथ 35 एमएम कल्चर डिश और हार्ट स्टैंड डिश भरें और उन्हें बर्फ पर रखें।
- एक 30-एमएल ग्लास बीकर में सीआईबी-EGTA के लगभग 20 एमएल डालो और बीकर में एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट खड़े हो जाओ, यह बर्फ पर रखते हुए ।
- टायरोड समाधान तैयार करें। 10X टायरोड के 100 एमएल को 800 एमएल DW में जोड़ें और माइक्रोवेव का उपयोग करके इसे लगभग 32 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। ग्लूकोज के 0.99 ग्राम और 1 एम सीएसीएल2के 1.8 एमएल जोड़ने के बाद, पीएच को 1 एम नाओएच का उपयोग करके समायोजित करें और डीएसडब्ल्यू के साथ 1000 एमएल तक लाएं।
- सेल रिस्पेशन सॉल्यूशन तैयार करें। 30 मिलीग्राम बीएसए और 50X एंटीबायोटिक दवाओं के 300 माइक्रोन को 15 एमएल टायरोड सॉल्यूशन में जोड़ें।
- सीरिंज तैयार करें। सीआईबी-ईजीटीए के साथ फ्लेक्सिब एक्सटेंशन ट्यूब और चिह्नित इंजेक्शन सुई से जुड़ी 20-एमएल सिरिंज भरें। गर्म एंजाइम मिश्रण के साथ 30 एमएल सिरिंज भरें। उपयोग से ठीक पहले तक उन दोनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- परफ्यूजन प्लेट तैयार करें। एक स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के नीचे हीटर चटाई को प्रीवार्म करें। प्रीवार्मेड हीटर मैट पर परफ्यूजन प्लेट (मल्टी-वेल कल्चर प्लेट का ढक्कन) रखें। उपयोग होने तक परफ्यूजन प्लेट में रखकर संवहनी क्लैंप को प्रीवार्म करें। पाइपिंग के लिए 60 मिमी कल्चर डिश रखें और प्रीवार्मेड हीटर मैट पर सेल छन्नी भी रखें।
2. माउस दिल का एंटेग्रेड परफ्यूजन
नोट: दिल चूसने के लिए इस्तेमाल किया प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट नरम होना चाहिए और तेजी से टिप की ओर पतला नहीं किया जाना चाहिए । सेरेशन के साथ एक छोटा सा वैस्कुलर क्लैंप चुनें। अनुशंसित उपकरणों को सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध किया गया है।
- माउस दिल का उत्तेजन और महाधमनी को क्लैंप करना
नोट: वयस्क चूहों (>८ सप्ताह पुराना) हेपरिन (८००० यूनिट/किलो) के साथ सोडियम पेंटोबार्बिटल (>३०० मिलीग्राम/किलो, इंट्रापेरिटोनियल [i.p.] इंजेक्शन) की अधिक मात्रा से इच्छामृत्यु होनी चाहिए ।- चूसने से माउस हार्ट को जल्दी से एक्साइज करें।
- दिल को बेनकाब करने के लिए वक्ष गुहा को जल्दी से खोलें। प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट को काटें, जिसकी नोक लगभग समान आकार है, या उससे थोड़ा छोटा है, उजागर दिल (आमतौर पर एक साइट पर टिप की ओर 0.5-एमएल मार्क से लगभग 1 सेमी, लेकिन यह दिल के आकार पर निर्भर करता है)।
- पिपेट में दिल चूसना, कैंची डालने के लिए पर्याप्त जगह बनाने के लिए पिपेट उठाएं, और पृष्ठीय पक्ष से घुमावदार कैंची के साथ दिल को उत्पादित करें, अटरिया को नुकसान पहुंचाने से बचें।
- संकुचन को रोकने के लिए तुरंत उत्पादित दिल को बर्फ से ठंडा सीआईबी-ईजीटीए युक्त 30-एमएल ग्लास बीकर में स्थानांतरित करें। यह प्रक्रिया आमतौर पर <1 मिनट लेती है।
- महाधमनी के आसपास सफाई
- बर्फ से ठंडा सीआईबी-ईजीटीए से भरा 35 मिमी संस्कृति पकवान में दिल स्थानांतरित करें और फेफड़ों और अन्य दृश्य ऊतकों को हटा दें, और फिर मोटे तौर पर साफ किए गए दिल को ठंडा सीआईबी-ईजीटीए से भरे दिल स्टैंड में स्थानांतरित करें और इसे शीर्ष के साथ नीचे रखें।
- स्टीरियोस्कोप के नीचे, महाधमनी के चारों ओर साफ करने के लिए वसा और संयोजी ऊतकों को हटा दें। यदि कट महाधमनी की लंबाई ब्रेकियोसेफेलिक धमनी, बाईं आम कैरोटिड धमनी या बाईं सबक्लेवियन धमनी सहित बहुत लंबी है, तो अगले चरण में आगे बढ़ने के लिए इसे छोटा करने के लिए ब्राकिओसेफेलिक धमनी के नीचे महाधमनी को काट दें। यह प्रक्रिया आमतौर पर लगभग 4 मिनट लेती है।
- महाधमनी क्लैंपिंग और परफ्यूजन प्लेट पर क्लैंप्ड दिल रखना
- माइक्रोस्कोप के नीचे दिल को हार्ट स्टैंड में रखें। ऑपरेटर को दिल की पूर्वकाल सतह का सामना करना चाहिए, चिमटी के साथ महाधमनी के अंत को उठाना चाहिए, और अटरिया के पास महाधमनी को एक छोटे संवहनी क्लैंप के साथ दबाना चाहिए, जबकि धीरे-धीरे महाधमनी पर थोड़ा सा धक्का देना चाहिए।
- पूर्वकाल की ओर से परफ्यूजन प्लेट पर क्लैंप किए गए दिल को रखें, और फिर इसे सूखने से रखने के लिए सीआईबी-ईजीटीए की कुछ बूंदों के साथ कवर करें। यह प्रक्रिया आमतौर पर <20 एस लेती है।
- चूसने से माउस हार्ट को जल्दी से एक्साइज करें।
- दिल का एंटेग्रेड परफ्यूजन
नोट: सबसे पहले, रक्त का निर्वहन करने और थक्के को रोकने के लिए सीआईबी-ईजीटीए के साथ दिल को छिद्रित करें।- इंजेक्शन सुई डालें और रक्त का निर्वहन करने के लिए परफ्यूजन शुरू करें
- लचीला विस्तार ट्यूब और जलसेक पंप पर एक चिह्नित इंजेक्शन सुई से जुड़े prewarmed सीआईबी-EGTA से भरा 20-एमएल सिरिंज सेट करें । सीआईबी-ईजीटीए के साथ सुई और ट्यूब को ध्यान से भरने के लिए 0.5 एमएल/मिनट की धीमी दर से पंप शुरू करें और ट्यूब में प्रवेश करने से किसी भी हवा को रोकना सुनिश्चित करें।
- इंजेक्शन सुई को सामने तिरछे आकार के छोटे पक्ष के साथ परफ्यूजन प्लेट पर रखें। सुई को दिल के शीर्ष की ओर तब तक स्लाइड करें जब तक कि वह इसे छू न जाए, और फिर ध्यान से बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के पास सुई को घुमाए बिना वेंट्रिकुलर कक्ष में डालें। प्रविष्टि करते समय प्लेट से सुई को अलग न करें।
- सुई प्रविष्टि की गहराई का अनुमान लगाने के लिए लाल निशान देखें। जब सुई प्रविष्टि पूरी हो जाती है, तो कोरोनरी धमनी से बहने वाले रक्त को डिस्चार्ज करना शुरू कर देना चाहिए।
- टेप के साथ प्लेट पर इंजेक्शन सुई को ठीक करें, और पंप की गति को 1 एमएल/मिनट तक बढ़ाएं। यह प्रक्रिया आमतौर पर लगभग 30 एस लेती है। यदि दिल सफलतापूर्वक परफ्यूज हो जाता है, तो एपिकार्डियम के ठीक नीचे केशिका में सीआईबी-ईजीटीए का प्रवाह माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है।
- एंजाइम मिश्रण के साथ दिल परफ्यूजन
नोट: एंजाइमेटिक परफ्यूजन के दौरान, सुई पर लाल निशान की जांच करके डाला सुई की गहराई की निगरानी की जा सकती है।- कोरोनरी धमनी से रक्त को पूरी तरह से डिस्चार्ज करने के लिए सीआईबी-ईजीटीए के 2-3 एमएल को परफ्यूस करने के बाद, परफ्यूसेट को एंजाइम मिश्रण में बदल दें। ट्यूब में प्रवेश करने के लिए हवा के बुलबुले की अनुमति देने से बचें। एंजाइम मिश्रण के प्रवाह की जांच करें, और यह सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन सुई लाल निशान की स्थिति की जांच करके बाहर नहीं आया है।
- 1-2 एमएल को रिस्फोस किए जाने के बाद पंप की स्पीड बढ़ाकर 1.5 एमएल/मिनट कर दी जाए। समय-समय पर पिपेट के साथ दिल से बहने वाले रक्त युक्त संचित पेफ्यूसेट को हटा दें।
नोट: समय के साथ, मायोकार्डियल दीवार कुछ स्थानों में पारदर्शी हो जाएगी और विचित्र दिखाई देगी, जो सफल पर्फ्यूजन के बाद एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के पाचन का संकेत है। एक अन्य संकेत एंजाइम मिश्रण में सीए2 + की उपस्थिति के कारण अलिंद की धड़कन को फिर से शुरू करना है। - जब एंजाइम मिश्रण की कुल मात्रा 10 मिलीएल होती है तो परफ्यूजन बंद कर दें।
- इंजेक्शन सुई डालें और रक्त का निर्वहन करने के लिए परफ्यूजन शुरू करें
3. व्यक्तिगत हृदय कोशिकाओं का अलगाव
- हृदय कोशिकाओं को अलग करना
- एंजाइम मिश्रण के साथ परफ्यूजन के बाद, हीटर मैट पर रखे 60 मिमी कल्चर डिश में सिरिंज में शेष एंजाइम मिश्रण के 10 एमएल को स्थानांतरित करें और 20 मिलीग्राम बीएसए (एंजाइम मिश्रण में 0.2% बीएसए) जोड़ें। गिरा बीएसए पाउडर धीरे-धीरे हाथ से घूमता हुआ घोलकर तुरंत भंग कर देना चाहिए। इंजेक्शन सुई और दिल से संवहनी क्लैंप निकालें।
- वेंट्रिकल्स और अटरिया को अलग करें और प्रत्येक को हीटर मैट पर 0.2% बीएसए के साथ पूरक एंजाइम मिश्रण में स्थानांतरित करें।
- वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स का अलगाव
- दो चिमटी के साथ एपिकार्डियम पकड़ो, और धीरे-धीरे फाड़ें और एंजाइम मिश्रण में निन्ट्रिक्स को 0.2% बीएसए के साथ छोटे टुकड़ों में पूरक में एक तरफ से खींचें। कोमल पाइपिंग (लगभग 30 बार) के साथ कोशिकाओं को तितर-बितर करें।
- 100-μm जाल सेल छलनी के माध्यम से अपाच्य मलबे को फ़िल्टर करें, और फिल्ट्रेट को 3 मिनट के लिए 50 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र के लिए 15-एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रीवार्मेड सीआईबी-सीए2 +-बीएसए समाधान में पेल्ड कार्डियोमायोसाइट्स को फिर से रीसुक्ल्ब करें, इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर इसे 3 मिनट के लिए 14 × जी पर अपकेंद्रित्र करें।
- सेल रिस्पेजन समाधान (संरचना तालिका 2में सूचीबद्ध है) में अंतिम उपजी कार्डियोमायोसाइट्स को फिर से खर्च करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- एट्रियल मायोसाइट्स का अलगाव
- चरण 3.2 में वेंट्रिकुलर मायोसिटे अंश के लिए अंतिम अपकेंद्रित्र के दौरान, एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करना शुरू करें। एटरिया को स्थानांतरित करें, जो कदम 3.1 में संग्रहीत है, प्रीवार्मेड सीआईबी-सीए2 +-बीएसए समाधान में, इसे टुकड़ों में फाड़ दें और हीटर मैट पर 10 माइक्रोन पर पिपेट टिप के साथ पिपेट करके कोशिकाओं को अलग करें।
- 3 मिनट के लिए 14 × जी पर सेल मिश्रण अपकेंद्रित्र और सेल पुनः प्राप्त करने के समाधान के साथ गोली अलिंद कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
- अलगाव और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृति
- स्टेप 3.2 में पहले सेंट्रलाइज से एक और 15-एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में सुपरनेट ट्रांसफर करें, और 5 मिनट के लिए 190 × जी पर सेंट्रलाइज करें। दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में अपकेंद्री के साथ उपजी कोशिकाओं को दो बार धोएं, और फिर डीएमईएम के साथ कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय एल्बुमिन (एफबीएस) और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक करें।
- संस्कृति फ्लास्क (25 सेमी2)में अंतिम कोशिका अंश को प्लेट करें और कोशिकाओं को 95% हवा और 5% सीओ2के आर्द्रीकृत वातावरण में फ्लास्क के नीचे का पालन करने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन 90 मिनट के बाद, असंबद्ध कोशिकाओं को त्यागें, और ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें। कोशिकाओं को लगभग 4 दिनों के बाद निकट उदारता होनी चाहिए, जिस बिंदु पर उन्हें ट्राइपसिनाइजेशन द्वारा परिलक्षित किया जाना चाहिए और नई संस्कृति व्यंजनों में वरीयता प्राप्त होना चाहिए।
4. अटरिया और वेंट्रिकल्स से प्रोटीन की कटाई
- परफ्यूजन के बाद, अटरिया और वेंट्रिकल्स को अलग करें, और उन्हें 1.5-एमएल नमूना ट्यूब में एक छोटे ग्राइंडर का उपयोग करके 10 मिलीग्राम ऊतक वजन के अनुपात में 10 मिलीग्राम ऊतक वजन के अनुपात में 100 माइक्रोन बफर में समरूप करें।
- प्रोटीन निकालने के लिए हर 10 मिनट में भंवर मिश्रण के साथ 40 मिनट के लिए बर्फ में समरूप रखें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 15000 × जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। प्रोटीन के नमूने के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनैंट अंश स्टोर करें।
5. अलग दिल की कोशिकाओं के इम्यूनोदाता
नोट: जैविक गोंद का उपयोग करके सेल इमेजिंग डिश के नीचे गैर-अनुयायी कार्डियोमायोसाइट्स का स्थिरीकरण आवश्यक है।
- एक ग्लास-बॉटम कल्चर डिश में अलग कार्डियोमायोसाइट्स का आसंजन
- सेल अलगाव शुरू करने से पहले, निर्माता के निर्देश के अनुसार जैविक गोंद (जैसे, सेल-टाक) के साथ ग्लास-बॉटम कल्चर डिश को कोट करें, DW के साथ कुल्ला करें, और कमरे के तापमान पर हवा-सूखी।
- सीआईबी-सीए2 +-बीएसए समाधान में अलग कार्डियोमायोसाइट्स के पुनर्संपण के बाद, गोंद-लेपित व्यंजनों के तल पर सेल निलंबन छोड़ दें, और आंदोलन के बिना कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- इम्यूनोस्टेपिंग
- जैविक गोंद के साथ प्रीकोट किए गए ग्लास-बॉटम डिश पर अलग-थलग कार्डियोमायोसाइट्स प्लेट करें और कोशिकाओं को पकवान का पालन करने की अनुमति देने के लिए इसे 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें। संस्कृति कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट बॉटम-ग्लास कल्चर व्यंजनों में।
- फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं कुल्ला, और मिलाते हुए के साथ 5 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ उन्हें ठीक करें। तीन बार 10 मिनट के लिए PBS के साथ तय कोशिकाओं को धोएं, और उन्हें मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए अवरुद्ध-पारमेबिलाइजेशन समाधान में इनक्यूबेट करें।
- प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 60 मिनट या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध-पारमेबिलाइजेशन समाधान में पतला किया जाता है। तीन बार 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, और फिर कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए फ्लोरेसेंस-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ।
- उन्हें 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद, DAPI (PBS में 1:10000 कमजोर पड़ने) के साथ नाभिक दाग। एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण करें।
6. पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग
- क्षैतिज माइक्रोइलेक्ट्रोड पुलर का उपयोग करके ग्लास केशिकाओं से पैच इलेक्ट्रोड को गढ़ें। इलेक्ट्रोड का प्रतिरोध 2 से 4 एमΩ तक था, जब एक कश्मीर+समृद्ध पिपेट समाधान(टेबल 2)से भरा हुआ था। अलग कार्डियोमायोसाइट्स के एक एलिकोट को 36-37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीएल/मिनट की दर से टायरोड के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप के मंच पर घुड़सवार एक रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करें ।
- पैच इलेक्ट्रोड के माध्यम से 1 हर्ट्ज की दर से अवधि में 5-10 एमएस की वर्तमान दालों को लागू करके 30 मिलीग्राम/एमएल एम्फोटेरिन बी युक्त K+-रिचपिपेट समाधान के साथ छिद्रित पैच-क्लैंप विधि का उपयोग करके रिकॉर्ड कार्रवाई क्षमता।
7. पश्चिमी दाग विश्लेषण
- इस अध्ययन में, छोटे-आणविक वजन वाले प्रोटीन का पश्चिमी दाग विश्लेषण करें, जैसे एट्रियल मार्कर एट्रियल नेट्रियिक पेप्टाइड (एएनपी)।
- प्रोटीन के नमूने को 1X नमूना बफर, 2% 2 ' मर्केप्टोथेनॉल की अंतिम एकाग्रता में भंग करें, और प्रोटीन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए विकृत करें। प्रत्येक कुएं में 20 माइक्रोग्राम प्रोटीन लोड करें, और 120 मिनट के लिए 20 एमए प्रति जेल के साथ बफर चलाने में इलेक्ट्रोफोरेसिस करें।
- प्रोटीन को 40 मिनट के लिए 10 वी पर ट्रांसफर बफर में पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें। स्थानांतरित झिल्ली को 5 मिनट के लिए टीबीस्ट के साथ दो बार धोएं, फिर कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए टीबीस्ट में 5% स्किम दूध के साथ ब्लॉक करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर टीबीस्ट में भंग प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच करें।
- झिल्ली को 7 मिनट के लिए टीबीस्ट के साथ 5 बार धोएं, और इसे कमरे के तापमान पर 120 मिनट के लिए टीबीस्ट में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ उगाएं।
- 7 मिनट के लिए टीबीस्ट के साथ झिल्ली को 5 बार धोने के बाद, केमी-ल्यूमिनेसेंस परख के साथ संकेतों की कल्पना करें और उन्हें लुमिनो-इमेज एनालाइजर के साथ विश्लेषण करें।
Representative Results
इस विधि का सिद्धांत सरल है: बाएं कक्ष से परफ्यूसेट प्रवाह, महाधमनी वाल्व खोला जाता है, और परफ्यूसेट रक्त रन के समान दिशा में कोरोनरी धमनी में चलता है, क्योंकि महाधमनी क्लैंपिंग द्वारा बंद हो जाती है, जो एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स को पचाने के लिए मायोकार्डियम के गहरे परफ्यूजन को सक्षम बनाता है।
वर्तमान विधि के साथ नए सिरे से अलग वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को चित्र 1 एमें दिखाया गया है । चित्रा 1B वेंट्रिकुलर और एट्रियल मायोसाइट्स की बढ़ी हुई छवियों को दिखाता है। इस अलगाव प्रक्रिया के परिणामस्वरूप उच्च उपज (70%-80%) वयस्क चूहों (8-10 सप्ताह) से रॉड के आकार के शांत वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के, जो अलगाव के बाद लगभग 5 घंटे के भीतर उपलब्ध थे(चित्रा 1C),पारंपरिक लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रक्रिया 7 का उपयोग करते समय इसीतरहका अंतराल । हालांकि, हौसले से अलग व्यवहार्य कोशिकाओं का अनुपात >2 साल पुराने(चित्रा 1C)के वृद्ध चूहों में कम था । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके वयस्क हृदय में प्राप्त वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की कुल संख्या लगभग 3 x 106 कोशिकाएं थीं, जो पहले रिपोर्ट किए गए मूल्य के समान थी7,12। वेंट्रिकुलर और एट्रियल मायोसाइट्स(चित्रा 1D)में दर्ज की गई कार्रवाई क्षमता लैंगेंडोर्फ-आधारित विधि10द्वारा प्राप्त कोशिकाओं के समान थी। एक इम्यूनोस्टेटिंग विश्लेषण ने पुष्टि की कि वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की सारकोमेट्रिक संरचना स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली कोशिका झिल्ली(चित्रा 2 ए)के साथ अच्छी तरह से व्यवस्थित थी। इस विधि से अलग किए गए व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग सीधे प्रयोगों में किया जा सकता है, जैसे कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण10 या इम्यूनोस्टेटिंग प्रयोग।
कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट इंटरस्टिशियल स्पेस में मौजूद हैं। बाहुलर मैट्रिक्स के पर्याप्त पाचन के परिणामस्वरूप उन कोशिकाओं का अलगाव होता है। अलग हृदय फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की स्थिति के तहत पैदा होता है और कई बार पारित किया जा सकता है या एक उपयुक्त सेल जलाशय समाधान में तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत । चित्रा 2B से पता चलता है कि अधिकांश सुसंस्कृत हृदय फाइब्रोब्लास्ट उपसंस्कृति के दौरान मायोफिब्रोब्लास्ट में बदल गए थे, जैसा कि α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन13,14की अभिव्यक्ति से पुष्टि की गई थी। इसके अलावा, हृदय जनकों को वर्तमान विधि से अलग किया जा सकता है और उपयुक्त संस्कृति माध्यम में सुसंस्कृत किया जा सकता है, जो स्वचालित रूप से10, 15को मात देना शुरू करदेतेहैं।
मजबूत मायोकार्डियम का समरूपीकरण आसान नहीं है, विशेष रूप से वृद्ध चूहों से हृदय ऊतक के लिए, जिसमें बड़ी मात्रा में बाहुलीय फाइबर होते हैं। एंटेग्रेड परफ्यूजन के बाद, अटरिया और वेंट्रिकल्स से प्रोटीन को प्रोटीन निकालने के लिए हल्के बल के साथ लाइसिस बफर में आसानी से समरूप किया जा सकता है। एक पश्चिमी दाग विश्लेषण अटरिया में एएनपी की विशिष्ट अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, लेकिन वयस्क (20 सप्ताह पुराने) और वृद्ध (१०८ सप्ताह पुराने) चूहों(चित्रा 3)से वेंट्रिकल में नहीं ।
चित्रा 1. चूहों से अलग कार्डियोमायोसाइट्स। ए वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स हौसले से एंटेग्रेड परफ्यूजन के साथ अलग, कम आवर्धन के साथ अधिग्रहीत छवियों के साथ । अंतिम धोने के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स को सेल रिसुस्पेन समाधान के 2 एमएल के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया था, जिनमें से 100 माइक्रोन को ग्लास-बॉटम कल्चर डिश और सेल सेटलमेंट पर छोड़ दिया गया था। बार, 100 माइक्रोन.B अलग वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स (ऊपरी) और एट्रियल मायोसाइट्स (लोअर) की बढ़ी हुई छवियां। बार, 100 माइक्रोन.C पृथक कोशिकाओं को कोशिका पुन: पेंशन समाधान में निलंबित कर दिया गया था और वांछित अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था, और एक माइक्रोस्कोप के तहत 10-15 क्षेत्रों में लाइव वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की संख्या गिनी गई थी। गोल कोशिकाओं को अपरिवर्तनीय रूप से घायल या मृतमाना जाता था 16. 8-10 सप्ताह पुराने 3 चूहों से हरे, नीले और लाल प्रतीक प्राप्त किए गए थे, और काले प्रतीक 106 सप्ताह पुराने माउस से थे। पीला प्रतीक प्रत्येक समूह के मतलब को इंगित करता है। D. प्रतिनिधि कार्रवाई क्षमता 8-10 चूहों के वेंट्रिकुलर (काले) और एट्रियल (लाल) मायोसाइट्स से दर्ज की गई है। डेटा कोशिकाओं से अलगाव के बाद लगभग 3 घंटे प्राप्त किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। अलग माउस वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स में α-ऐक्टिन के लिए इम्यूनोस्टेटिंग और सुसंस्कृत माउस कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट में α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन। ए कन्फोकल लेजर स्कैनिंग α-ऐक्टिनिन (ग्रीन), नाभिक (नीला) के लिए डैपी स्टेनिंग और एंटीग्रेड परफ्यूजन के साथ माउस हार्ट से अलग वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की डीआईसी छवि। बार, 50 माइक्रोन.B इम्यूनोस्टेनिंग α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (हरा), नाभिक (नीला) के लिए डीएपीआई धुंधला और एंटीग्रेड परफ्यूजन के साथ माउस हार्ट से अलग कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट की डीआईसी छवि। कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट चार दिनों के लिए संस्कारी थे । बार, 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3। अटरिया और वेंट्रिकल्स में एएनपी का पश्चिमी दाग विश्लेषण। अटरिया (ए) और वयस्क (20 सप्ताह) और वृद्ध (108 सप्ताह) दिलों से तैयार एविल्टर मार्कर एट्रियल न्यूट्रिशेटिक पेप्टाइड (एएनपी) के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण करता है। एएनपी अटरिया में मौजूद है लेकिन वेंट्रिकल्स में अनुपस्थित है। ग्लानिडाहाइड 3- फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (गपध) को कंट्रोल हाउस कीपिंग प्रोटीन के रूप में इस्तेमाल करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| दिल की कोशिकाओं को अलग करने के लिए स्टॉक समाधान | |
| 10X सीआईबी (500 एमएल) | |
| नैक | 37.99 ग्राम |
| केसीआई | 2.01 ग्राम |
| 1 एम एमजीसीएल2 | 2.5 एमएल |
| एनएएच2पीओ4 | 0.23 ग्राम |
| हेपेस | 29.79 ग्राम |
| डीएसडब्ल्यू | 500 एमएल तक भरें |
| 100 एमएमएल सीएसीएल2 स्टॉक सून | |
| सीएसीएल2 | 100 एमएमएम |
| 400 m EGTA स्टॉक समाधान | |
| ईजीटीए | 400 एमएमएम |
| इंसुलिन समाधान | |
| इन्सुलिन | 0.1 एम एचसीएल में 1 यूनिट/एमएल |
| 50X एंटीबायोटिक्स स्टॉक समाधान (20 एमएल) | |
| पेनिसिलीन | 100 मिलीग्राम |
| स्ट्रेप्टोमाइसिन | 100 मिलीग्राम |
| फिनोल लाल | 1.5 ग्राम |
| डीएसडब्ल्यू | 20 एमएल और फ़िल्टरिंग के साथ बंध्याकरण |
| 10X टायरोड समाधान (1000 एमएल) | |
| नैक | 81.82 ग्राम |
| केसीएल | 4.03 ग्राम |
| 1 एम एमजीसीएल2 | 5 एमएल |
| एनएएच2पीओ4 | 0.47 ग्राम |
| हेपेस | 11.92 ग्राम |
| नाओह | 0.8 ग्राम |
| डीएसडब्ल्यू | 1000 एमएल तक भरें |
| इम्यूनोदाता के लिए स्टॉक सोलुटिन | |
| दापी स्टॉक | |
| दापी | मेथनॉल में 2 मिलीग्राम/एमएल |
| पश्चिमी दाग के लिए स्टॉक समाधान | |
| हेपेस बफर (100 एमएल) | |
| नैक | 0.88 ग्राम |
| 400 m EGTA | 0.25 एमएल |
| हेपेस | 0.24 ग्राम |
| 1M NaOH | पीएच को समायोजित करें 7.4 |
| डीएसडब्ल्यू | 500 एमएल तक भरें |
| प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल | |
| पूरा मिनी | 1 टैबलेट |
| डीएसडब्ल्यू | 0.4 एमएल |
तालिका 1. स्टॉक समाधानों का विवरण। स्टॉक सॉल्यूशंस को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए Aliquot प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल।
| आइसोल्टिंग हार्ट सेल्स के लिए समाधान | |
| सीआईबी (200 एमएल) | |
| 10X सीआईबी | 20 एमएल |
| इंसुलिन समाधान | 0.01 एमएल |
| ग्लूकोज़ | 0.79 ग्राम |
| 1M NaOH | पीएच 7.4 को समायोजित करें |
| डीएसडब्ल्यू | 200 एमएल तक भरें |
| एंजाइम-मिक्स समाधान (30 एमएल) | |
| कोलेजनस टाइप2 | 30 मिलीग्राम |
| ट्राइप्सिन | 1.8 मिलीग्राम |
| प्रोटीज़ | 1.8 मिलीग्राम |
| 100 एमएमएल सीएसीएल2 स्टॉक समाधान | 0.09 एमएल |
| सीआईबी | 30 एमएल |
| सीआईबी-सीए2 +-बीएसए (15 एमएल) | |
| बीएसए | 30 मिलीग्राम |
| 100 एमएमएल सीएसीएल2 स्टॉक समाधान | 0.18 एमएल |
| सीआईबी | 15 एमएल |
| सीआईबी-ईजीटीए (150 एमएल) | |
| 400 m EGTA स्टॉक समाधान | 0.150 एमएल |
| सीआईबी | 150 एमएल |
| टायरोड समाधान (1000 एमएल) | |
| 10X टायरोड स्टॉक समाधान | 100 एमएल |
| ग्लूकोज़ | 0.99 ग्राम |
| 1M CaCl2 | 1.8 एमएल |
| 1M NaOH | पीएच 7.4 को समायोजित करें |
| डीएसडब्ल्यू | 1000 एमएल तक भरें |
| सेल रिस्पेंशन समाधान (15 एमएल) | |
| बीएसए | 30 मिलीग्राम |
| 50X एंटीबायोटिक्स स्टॉक समाधान | 0.3 एमएल |
| टायरोड समाधान | 15 एमएल |
| इम्यूनोदाता के लिए समाधान | |
| सेल अनुयायी समाधान (0.3 एमएल) | |
| सेल-टाक | 0.01 एमएल |
| 0.1 एम नाएचसीओ3 (पीएच8.0) | 0.285 एमएल |
| 0.1 एम नाओएच | 0.005 एमएल |
| अवरुद्ध-परमेबिलिजान समाधान (10 एमएल) | |
| भ्रूण गोजातीय सीरम | 1 एमएल |
| ट्राइटन एक्स-100 | 1 एमएल |
| 10X पीबीएस | 1 एमएल |
| डीएसडब्ल्यू | 7 एमएल |
| कश्मीर+ रिच पिपेट समाधान | |
| पोटेशियम एस्पार्टेट | 70 एमएमएम |
| केसीएल | 50 एमएमएम |
| केएच2पीओ4 | 10 mm |
| एमजीएसओ4 | 1 mm |
| एटीपी डिसोडियम नमक | 3 एमएमएम |
| जीटीपी लिथियम नमक | 0.1 mm |
| ईजीटीए | 5 एमएमएम |
| हेपेस | 5 एमएमएम |
| कोह | पीएच 7.2 को समायोजित करें |
| पश्चिमी ब्लॉट्स के लिए समाधान | |
| लाइसिस बफर (1 एमएल) | |
| हेप्स बफर | 0.86 एमएल |
| नॉनइडेट-पी40 | 0.1 एमएल |
| प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल | 0.04 एमएल |
| रननिंग बफर (1000 एमएल) | |
| 10X टीजी (0.25 एम ट्रिस और 1.92 एम ग्लाइसिन) | 100 एमएल |
| एसडीएस | 1 ग्राम |
| डीएसडब्ल्यू | 900 एमएल |
| स्थानांतरण बफर (1000 एमएल) | |
| 10X टीजी | 100 एमएल |
| मेथनॉल | 200 एमएल |
| डीएसडब्ल्यू | 700 एमएल |
| ब्लॉटिंग बफर (टीबीएसएल) (1000 एमएल) | |
| 5एम एनएसीएल | 20 एमएल |
| 2M Tris-HCl (पीएच 7.5) | 5 एमएल |
| 10% ट्वीन 20 | 10 एमएल |
| डीएसडब्ल्यू | 965 एमएल |
तालिका 2. दिल की कोशिकाओं, इम्यूनोदाते और पश्चिमी ब्लॉटिंग को अलग करने के लिए काम करने वाले समाधानों का विवरण। प्रयोगों से ठीक पहले सभी कामकाजी समाधान तैयार करें।
अनुपूरक चित्र 1। सेल अलगाव की रूपरेखा। एक ही दिल से वेंट्रिकुलर और एट्रियल मायोसाइट्स और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव का प्रवाह चित्र। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
चूंकि दिल इस्केमिया के लिए अतिसंवेदनशील होता है, इसलिए संकुचन को रोकने के लिए इसे बर्फ-ठंडे सीआईबी-ईजीटीए में विसर्जित करने के लिए लिया गया समय (<1 मिनट) कम रखा जाना चाहिए। यह इस विधि का पहला महत्वपूर्ण कदम है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम दिल की दिशा से संबंधित है। चरण 2.1.2 में उत्पादित दिल का विशेष अभिविन्यास महाधमनी के चारों ओर वसा और संयोजी ऊतकों को देखना और हटाना आसान बनाता है। महाधमनी के चारों ओर सफाई करने के बाद, पर्फ्यूजन प्लेट पर पूर्वकाल सतह की ओर के साथ क्लैंप किए गए दिल को रखें। अंतिम महत्वपूर्ण कदम इंजेक्शन सुई के सम्मिलन शामिल है। सुई को दिल की ओर आगे बढ़ाते समय, इंजेक्शन सुई को प्लेट से निरंतर दूरी बनाए रखने के लिए परफ्यूजन प्लेट से अलग नहीं किया जाना चाहिए। प्रविष्टि की स्थिति बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के पास है। घुमा के बिना ध्यान से सुई डालें, क्योंकि इस तरह के घुमा छेद बड़ा हो सकता है। लाल निशान देखकर सुई के सम्मिलन की गहराई का अनुमान लगाया जा सकता है। यदि सुई बहुत गहरी डाली जाती है, तो टिप वेंट्रिकुलर सेप्टम के माध्यम से छेद सकती है और दाएं वाल्व में प्रवेश कर सकती है और बाएं एट्रियम में प्रवेश कर सकती है। कोरोनरी धमनी से रक्त के गायब होने की पुष्टि के बाद, सुई को टेप से परफ्यूजन प्लेट में तय किया जाना चाहिए।
एक लंबी महाधमनी लंबाई सही स्थिति में महाधमनी को दबाना मुश्किल बना देती है। यदि क्लैंप अटरिया से बहुत दूर है, तो दिल जलसेक के बाद घुमा सकता है। इसे रोकने के लिए, क्लैंपिंग से पहले महाधमनी को छोटा करने के लिए ब्रैकिओसेफेलिक धमनी के ठीक नीचे महाधमनी को काट लें।
यदि 05 एमएल/मिनट की प्रारंभिक गति से परफ्यूजन के बाद रक्त का निर्वहन शुरू नहीं होता है, तो गति को 1 एमएल/मिनट तक बढ़ाएं। यदि इससे मदद नहीं मिलती है, तो इंजेक्शन सुई को गलत तरीके से तैनात किया जा सकता है, जैसे कि दाएं वेंट्रिकल, वेंट्रिकुलर सेप्टम या बाएं मायोकार्डियल दीवार में। ऐसे में सुई को तुरंत हटा दें और बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के पास इसे फिर से डालने की कोशिश करें। सुई को कई बार डालने पर, पचाने वाली कोशिकाएं खुले छेदों से बाहर निकल सकती हैं। ध्यान दें कि यह आमतौर पर कोशिका अलगाव को गंभीर रूप से प्रभावित नहीं करता है।
ऑपरेटर रंग और पारदर्शिता में परिवर्तन और पाचन के साथ अटरिया की धड़कन को फिर से शुरू करने के लिए स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दिल के एंटीग्रेड परफ्यूजन की पूरी प्रक्रिया की निगरानी कर सकते हैं। एंजाइम मिश्रण के कुल 10 मिलील अधिकतम आवश्यक होना चाहिए, यहां तक कि एक पुराने दिल के लिए भी। छोटे दिलों (5-7 सप्ताह पुराने) में, हम मात्रा को 9 एमएल तक कम करते हैं, जो एक ही एंजाइम मिश्रण के साथ प्रतिगामी परफ्यूजन के माध्यम से दृष्टिकोण के समान है।
अंतिम अपकेंद्रित्र पर सुपरनेट में मलबे, रक्त कोशिकाओं और गैर-मायोसाइट्स होते हैं जबकि, गोली में मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं और फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे गैर-मायोसाइट्स को दूषित करते हैं। कार्डियोमायोसाइट्स को शुद्ध करने के लिए, और अधिक कदम की आवश्यकता है। सामान्य तौर पर, गोली को उपयुक्त सेल संस्कृति माध्यम में फिर से निलंबित किया जाना चाहिए और ऊतक सेल कल्चर डिश पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रीप्लाट किया जाना चाहिए, और फिर धीरे-धीरे संस्कृति के लिए पाइपिंग और प्रीपलेटिंग द्वारा कार्डियोमायोसाइट्स को हटा दें।
एंजाइम मिश्रण में सीए2 + (0.3 mM) की कम एकाग्रता होती है। इसलिए हम कोशिका पुनःपिण समाधान (1.8 m M Ca2+)के साथ अंतिम पुनः प्राप्त होने से पहले सीआईबी-सीए2 +में पचा कोशिकाओं को इनक्यूबेट करते हैं, और सीए2 + में क्रमिक वृद्धि सेल क्षति7के कारण से बचता है। जब तक अलग कार्डियोमायोसाइट्स बरकरार हैं (कोई संकुचन के साथ शांत कोशिकाओं) इस Ca2 +अनुकूल प्रक्रिया चूहों में कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है । चूंकि इस इनक्यूबेशन के दौरान क्षतिग्रस्त कोशिकाएं मर रही हैं, इसलिए हम फलस्वरूप एक स्वस्थ कोशिका समूह प्राप्त करते हैं। इसी तरह, अलग अक्षुण्ण एट्रियल मायोसाइट्स (अनियमित संकुचन के बिना शांत कोशिकाओं) को एक ही कोशिका पुनः प्राप्त करने के समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, एट्रियल मायोसाइट्स वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की तुलना में संग्रहीत होने के लिए अधिक नाजुक होते हैं।
प्रयोगशाला में, यह अलगाव विधि लगभग हमेशा सफल होती है जब तक कि बाईं वेंट्रिकल में सुई सम्मिलन विफल न हो जाए। हम सर्जिकल ट्रांसवर्स महाधमनी कसना द्वारा तैयार हाइपरट्रोफिड दिल से कोशिकाओं को अलग करने में भी सफल रहे हैं। हालांकि, वृद्ध चूहों में, जिनमें अक्सर छोटे मायोकार्डियल इंफेक्शन होते हैं, कुछ स्थानों पर परफ्यूजन बंद हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अधूरा पाचन होता है और इस प्रकार लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रतिगामी विधि के समान कम उपज(चित्रा 1 सी)होती है। ऐसे मामलों में, परफ्यूजन की शुरुआत में भी दिल की विकृत आकृति देखी जा सकती है।
यह एंटेग्रेड परफ्यूजन विधि विभिन्न उम्र के चूहों से दिल की कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोगी है, लेकिन खरगोश और गिनी सूअरों जैसे बड़े जानवर नहीं हैं। इस विधि को प्रात: यनात से पहले नवजात या किशोर चूहों पर लगाना संभव हो सकता है।
इस एंटीग्रेड परफ्यूजन विधि के फायदों में से एक यह है कि यह छोटे माउस दिलों के लिए लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन विधि का उपयोग करने से जुड़ी तकनीकी बाधाओं को कम करता है। परफ्यूजन के लिए आवश्यक समय एंजाइमों के 10 एमएल के साथ लगभग 7 मिनट है, यह छोटा पाचन अवधि कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बढ़ाती है। इसके अलावा, यह महाधमनी वाल्व पचाने के बाद भी हृदय के कोरोनरी परिसंचरण के माध्यम से किया जा करने के लिए पर्फ्यूजन सक्षम बनाता है। एट्रियल मायोसाइट्स के अलगाव के लिए आमतौर पर लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन औरएंजाइमों 17के साथ आगे इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। हालांकि, यह एंटेग्रेड परफ्यूजन दृष्टिकोण, एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए एंजाइम के साथ ऊतक को गहराई से व्याप्त कर सकता है।
कई चूहों का उपयोग कर प्रयोगों में, लैंगेंडोर्फ उपकरण को अगले दिल को छिद्रित करने से पहले साफ किया जाना चाहिए। हालांकि, वर्तमान एंटेग्रेड विधि में, जब तक वांछित संख्या में उपकरण सेट (उदाहरण के लिए, सीरिंज सुई और परफ्यूजन प्लेटें) पहले से तैयार किए जाते हैं, परफ्यूजन लगातार किया जा सकता है।
हम इसके साथ ही लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन विधि के समान समाधानों का उपयोग करके माउस दिल के एंटीग्रेड परफ्यूजन की बुनियादी पद्धति की रिपोर्ट करते हैं जिसमें कोई अतिरिक्त रसायन नहीं है। प्रयोग के उद्देश्य के अनुरूप परफ्यूसेट की संरचना को बदला जा सकता है, जैसे कि एंजाइमों के बजाय ईजीटीए युक्त डिटर्जेंट का उपयोग करना 18 को डिसेलुलराइज्ड हार्ट18बनाने के लिए।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक मॉर्फोलॉजिक प्रयोगों में उनकी सहायता के लिए टी यामामोटो और वाई मोरी का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (18K06871 से एमओके और 17K08536 से एच.M) तक ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
| Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
| Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
| Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
| Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
| Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
| ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
| Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
| Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
| 4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
| Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
| EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
| Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
| GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
| Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
| Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
| Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
| Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
| Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
| Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
| Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
| Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
| 10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
| Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
| Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
| Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
| Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
| Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
| 4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
| SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
| Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
| 10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
| Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
| All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |
References
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