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Biology

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61870
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

Summary

La microscopia estimulada de la dispersión de Raman (SRS) permite la proyección de imagen selectiva, etiqueta-libre de mitades químicas específicas y se ha empleado con eficacia para las moléculas del lípido de la imagen in vivo. Aquí, proporcionamos una breve introducción al principio de la microscopía SRS y describimos métodos para su uso en el almacenamiento de lípidos por imágenes en Caenorhabditis elegans.

Abstract

El metabolismo lipídico es un proceso fisiológico fundamental necesario para la salud celular y del organismo. La desregulación del metabolismo lipídico a menudo provoca obesidad y muchas enfermedades asociadas, incluidos los trastornos cardiovasculares, la diabetes tipo II y el cáncer. Para avanzar en la comprensión actual de la regulación metabólica lipídica, los métodos cuantitativos para medir con precisión los niveles de almacenamiento de lípidos in vivo en el tiempo y el espacio se han vuelto cada vez más importantes y útiles. Los enfoques tradicionales para analizar el almacenamiento de lípidos son semicuantita cuantitativos para la evaluación microscópica o carecen de información espacio-temporal para la medición bioquímica. La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imágenes químicas sin etiquetas que permite la detección rápida y cuantitativa de lípidos en células vivas con una resolución subcelular. Como el contraste se explota a partir de vibraciones moleculares intrínsecas, la microscopía SRS también permite el seguimiento cuatridimensional de lípidos en animales vivos. En la última década, la microscopía SRS ha sido ampliamente utilizada para imágenes de moléculas pequeñas en la investigación biomédica y superar las principales limitaciones de los métodos convencionales de tinción fluorescente y extracción de lípidos. En el laboratorio, hemos combinado la microscopía SRS con las herramientas genéticas y bioquímicas disponibles para el poderoso organismo modelo, Caenorhabditis elegans, para investigar la distribución y heterogeneidad de las gotitas de lípidos a través de diferentes células y tejidos y, en última instancia, para descubrir nuevas vías de señalización conservadas que modulan el metabolismo lipídico. Aquí, presentamos los principios de trabajo y la configuración detallada del microscopio SRS y proporcionar métodos para su uso en la cuantificación del almacenamiento de lípidos en distintos puntos de tiempo de desarrollo de tipo salvaje y la señalización de insulina deficiente mutante C. elegans.

Introduction

La obesidad se ha convertido en un problema de salud global que amenaza a un tercio de la población en todo el mundo, y presenta una grave preocupación médica, dada su asociación con la mala salud mental1 y enfermedades mortales como la diabetes2,las enfermedades cardiovasculares3 y algunos tipos de cáncer4. El estudio del metabolismo lipídico es esencial para comprender mejor los problemas biológicos detrás de la obesidad. La cuantificación rápida y específica del almacenamiento lipídico conlleva la detección de ácidos grasos y sus derivados, así como de metabolitos que contienen esteroles, con alta sensibilidad y preferiblemente con información espacial. Los lípidos son objetivos desafiantes para la imagen porque carecen de fluorescencia intrínseca y no se pueden etiquetar fácilmente fluorescentemente. Las etiquetas fluorescentes son a menudo más grandes que las moléculas lipídicas y, por lo tanto, pueden ser químicamente invasivas y poco prácticas para aplicaciones in vivo. La estrategia de etiquetado sin etiquetas o mínima es necesaria para preservar la estructura hidrofóbica de las moléculas lipídicas5. Los desarrollos recientes en tecnologías de la proyección de imagen han creado las oportunidades emocionantes para la proyección de imagen etiqueta-libre de lípidos en células, tejidos, y organismos vivos.

Los enfoques tradicionales para los análisis de almacenamiento de lípidos en muestras biológicas incluyen ensayos bioquímicos y protocolos de tinción con tintes lipofílicos. Los ensayos de cuantificación bioquímica que involucran espectrometría de masas (EM) son incomparables en su resolubilidad molecular, pero requieren cantidades de muestra muy grandes y la preparación de la muestra generalmente toma varias horas, lo que limita su aplicación para imágenes en tiempo real de sistemas vivos5. Otra limitación importante de estos ensayos es la falta de información espacial. Por otro lado, los tintes lipofílicos como Oil Red O y Sudan Black proporcionan distribución tisular y celular de orgánulos de almacenamiento de lípidos y, en comparación con las técnicas de EM, estos métodos de tinción también son de bajo costo y fáciles de realizar. Sin embargo, estos protocolos de tinción requieren fijación, lo que puede impactar la naturaleza hidrofóbica de las gotitas lipídicas, generar cambios artificiales en su estructura y resultar en inconsistencias entre experimentos6. Las dificultades técnicas asociadas a técnicas bioquímicas y de coloración han llevado a la búsqueda para los métodos etiqueta-libres para las moléculas del lípido de la imagen y al aumento rápido en el uso de la microscopia coherente de la dispersión de Raman (CRS) en proyección de imagen del lípido.

El efecto Raman fue reconocido por primera vez por Raman y Krishnan, donde informaron que al interactuar con un fotón, una molécula puede generar luz dispersa sin cambio en la longitud de onda (llamada dispersión de Rayleigh) o rara vez con una longitud de onda alterada (llamada dispersión Raman) y este cambio en la longitud de onda es característico de los grupos químicos funcionales dentro de la molécula7. Cuando los enlaces químicos dentro de una molécula se excitan a un nivel de energía vibracional más alto por un fotón incidente, llamado fotón de bomba, la energía del fotón disperso, llamado fotón de Stokes, se vuelve más baja. De lo contrario, los enlaces químicos pueden alcanzar un nivel de energía vibracional más bajo si originalmente están en un nivel más alto, y el fotón disperso gana energía para ser el fotón anti-Stokes. La diferencia de frecuencia entre los fotones incidentes y dispersos se conoce como el cambio Raman. Cada enlace químico dentro de una molécula tiene un cambio Raman característico y cuantificable. Por ejemplo, el enlaceCH2 tiene un desplazamiento Raman de 2.845 cm-1,que es abundante en cadenas de ácidos grasos8. Esta señal raman espontánea es generalmente muy débil, lo que ha limitado enormemente la velocidad de la proyección de imagen en microscopia raman espontánea convencional. A lo largo de los años, se han desarrollado varios enfoques para aumentar la velocidad de imagen y la sensibilidad de la microscopía Raman espontánea. La microscopía de dispersión Raman coherente, incluida la microscopía de dispersión Raman coherente anti-Stokes (CARS) y la microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS), es el progreso más reciente. CARS y SRS tienen principios de trabajo ligeramente diferentes, pero ambas son técnicas sin etiquetas que tienen capacidad de imágenes en vivo, pueden producir información espacial y temporal sobre la dinámica de almacenamiento de lípidos y solo requieren un tamaño de muestra pequeño. La microscopía CARS sufre de fondo no resonante, que proviene de varios procesos no lineales, y las señales CARS también tienen relación no lineal con la concentración de la molécula, lo que en conjunto complica el proceso de cuantificación9. A diferencia de la microscopía CARS, la microscopía SRS no genera señales de fondo no resonantes y ofrece una dependencia lineal de la concentración de la molécula de interés. Por lo tanto, actualmente la microscopía SRS es más ampliamente utilizada para la obtención de imágenes lipídicas.

En microscopía SRS, las señales Raman espontáneas débiles se pueden amplificar cuando están excitadas por dos rayos láser sincronizados con su diferencia de frecuencia que coincide con la frecuencia vibracional del enlace químico. La molécula experimentará una transición mejorada a un estado excitado debido a la excitación coherente. Como resultado, se aumenta la tasa de generación de fotones de Stokes. En consecuencia, la intensidad del haz "Stokes" transmitido aumenta (ganancia Raman estimulada, SRG) y la intensidad del haz de "bomba" transmitida disminuye (pérdida Raman estimulada, SRL). La detección de señales SRG o SRL subyace a la base para la obtención de imágenes de microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) de moléculas con enlaces químicos específicos10. Si la diferencia de frecuencia entre los dos rayos láser no coincide con la frecuencia vibracional del enlace químico dentro de una molécula de interés, no se generarán señales SRG ni SRL. La velocidad de imagen de la microscopía SRS es de alrededor de 2 μsec por píxel o 1 segundo por fotograma, que es mucho más rápido que la microscopía Raman espontánea11. La resolución lateral típica para la microscopía SRS es difracción limitada y alrededor de 300 nm. Además, los procesos ópticos de dos fotones de la microscopía SRS permiten obtener imágenes volumétricas en 3D de muestras de tejido relativamente gruesas y la profundidad de la imagen podría alcanzar los 300-500 μm. En general, la microscopía SRS presenta una técnica de imagen eficiente y sin etiquetas para detectar biomoléculas específicas, especialmente lípidos.

Las gotitas de lípidos son orgánulos de una sola membrana, que son el principal sitio de almacenamiento celular para lípidos neutros, incluidos los triacilglicerols (TAGs) y los ésteres de colesterol (CE). Losenlaces CH2 en las cadenas de ácidos grasos de estas moléculas lipídicas generan fuertes señales de SRS a 2.845 cm-1 cuando seexcitan 8,permitiendo así la detección y cuantificación de los niveles de lípidos de almacenamiento en células intactas, secciones de tejidos e incluso organismos enteros12,13,14,15. Particularmente, los elegans de la C. son útiles para los estudios de la proyección de imagen del lípido debido a su transparencia. Al igual que los mamíferos, C. elegans también almacena lípidos en gotitas lipídicas y las vías de síntesis y degradación de las moléculas lipídicas están altamente conservadas16. En este protocolo, proporcionaremos el principio de funcionamiento de la microscopia SRS, su configuración fundamental y describiremos los métodos para su uso en imágenes lipídicas en C. elegans.

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Protocol

1. Configuración instrumental para la microscopía de dispersión Raman estimulada

NOTA: El sistema de microscopía SRS se basa en un láser de picosegundos con oscilador paramétrico óptico integrado en la bomba y un microscopio de barrido láser confocal. El oscilador proporciona dos trenes de impulsos de picosegundos, incluyendo un haz de Stokes a 1.064 nm y un haz de bomba sintonizable entre 700-990 nm. La superposición temporal y espacial de los dos haces se logra dentro del láser. Un modulador electroóptico (EOM) incorporado está diseñado específicamente para microscopía SRS. Este protocolo se centrará en el acoplamiento del láser con el microscopio, y el funcionamiento diario de este sistema (Figura 1). La configuración de un sistema de microscopio SRS está evolucionando en la última década. Cabe señalar que la siguiente descripción sólo representa una de las varias configuraciones.

  1. Alimentación de rayos láser en el microscopio
    1. Configure el periscopio para levantar el haz desde la salida de la fuente de luz de picosegundos hasta el puerto de entrada láser IR en el escáner del microscopio.
      PRECAUCIÓN: Lea el manual del sistema láser antes de la operación y tome todas las precauciones necesarias porque la radiación infrarroja cercana generada por este sistema láser de Clase IV puede causar daños graves a los ojos y la piel. Completar las capacitaciones que son requeridas por los departamentos institucionales de seguridad ambiental. Use gafas protectoras y bata de laboratorio con mangas con puños.
    2. En primer lugar, establezca el haz de la bomba en 750 nm y baje la potencia del láser a 50 mW, que se puede inspeccionar visualmente, afiliando la alineación. A continuación, utilice un expansor de haz(Figura 1,L1 y L2) para ajustar el diámetro del haz para que se ajuste a la apertura posterior de los objetivos del microscopio. Utilice dos espejos de relé(Figura 1,M1 y M2) para guiar el rayo láser al periscopio(Figura 1,P1 y P2). El periscopio levantará el haz a la altura de la abertura del escáner y servirá como espejo de dirección para la alineación también.
    3. Ajuste las perillas del periscopio en el centro del rango de ajuste y elija la posición inicial y el ángulo de cada espejo de tal manera que el rayo láser golpee el centro del espejo, aproximadamente.
    4. Realice la alineación gruesa usando un puerto vacío en la torreta objetivo y coloque la sonda del medidor de potencia para medir la potencia de la luz transmitida. Configure el escáner del microscopio con el zoom más alto (50x) y, a continuación, mida la potencia de la luz transmitida con el punto de rayo láser enfocado. Optimice los mandos de cada espejo, M1 y M2, de forma iterativa para lograr la mayor potencia láser transmitida.
    5. Realice la alineación fina con la herramienta de alineación. Coloque la tapa de alineación del objetivo de fluorescencia en el asiento objetivo vacío y ajuste las perillas de M1 para centrar el punto. Luego, introduzca el tubo de extensión para el objetivo y afina las perillas de M2 para centrar el punto.
    6. Repita los pasos 1.1.4 y 1.1.5 hasta que el haz pídanos el objetivo en ambas posiciones.
  2. Conexión de detección y electrónica
    1. Configure el módulo de detección de SRS. Coloque un cuber divisor de haz después del condensador para dirigir el láser transmitido al módulo de fotodiodo. El módulo incluye un telescopio para retransmitir y cambiar el tamaño del haz para que se ajuste al área activa del fotodiodo, así como un filtro óptico para eliminar el haz modulado de Stokes y dejar que el haz de la bomba pase para la demodulación.
    2. Configurar la conexión electrónica (Figura 1). La intensidad del haz de Stokes es modulada por una PROA incorporada a 20 MHz dentro del láser sintonizable de picosegundos. La salida de frecuencia de modulación del láser se introduce en el amplificador de bloqueo como la frecuencia de referencia para la demodulación. Alimente la señal de salida del fotodiodo en el amplificador de bloqueo para demodular el SRL.
      NOTA: Los sistemas láser de una sola caja se pueden actualizar y, por lo tanto, sus especificaciones pueden variar debido a la diferente fecha de producción. La versión anterior del sistema láser sintonizable de picosegundos, utilizado en este protocolo, tiene un haz de Stokes de 1.064 nm, pero la versión reciente tiene un haz de Stokes de 1.031 nm. La frecuencia de modulación de la EOM utilizada en este protocolo se personaliza a 8 MHz, pero la frecuencia de modulación predeterminada para el sistema reciente puede ser de 10 o 20 MHz.
    3. Finalmente, alimente la salida del amplificador de bloqueo en la caja analógica del microscopio para convertir la señal analógica eléctrica en señal digital. El sistema debe estar listo para procesar la señal SRS.
  3. Optimizar las condiciones de obtención de imágenes
    1. Haga una muestra química para la alineación del sistema. Por ejemplo, utilice dodecano para optimizar el microscopio, porque el dodecano tiene una señal SRS muy fuerte de los enlaces C-H. Utilice un sello seguro para hacer una minicámara; poner 5 μL de dodecano y cubrirlo con un cubrebocas.
      NOTA: Reemplace la muestra de dodecano una vez que parezca poco clara o presente desechos, con una nueva muestra que podría usarse para la alineación durante 2-3 meses.
    2. Coloque la muestra en la etapa del microscopio. Concéntrese adecuadamente en la gota de líquido. Se puede hacer más rápido buscando el borde de la almohadilla de dodecano. Ajuste el condensador para la iluminación Kohler.
    3. Establezca los parámetros de imagen. Compruebe si la etapa de retraso está en los números correctos. Establezca la longitud de onda del haz de la bomba en 795,8 nm. Utilizando una tarjeta de sensor IR y un visor IR, compruebe si la ruta del haz de la bomba sigue siendo correcta.
    4. Establezca la potencia del haz de la bomba en 200 mW y el haz de Stokes en 400 mW en el panel de control del sistema de picosegundos.
      NOTA: Los rendimientos del láser desde la salida del láser hasta el objetivo posterior de los dos haces son aproximadamente del 25% para la bomba y el 14% para Stokes para esta configuración del sistema. Por lo tanto, una potencia de objetivo posterior de la viga de la bomba es de aproximadamente 50 mW y para la viga de Stokes es de alrededor de 56 mW. El ancho de pulso del reciente sistema láser de picosegundos ha cambiado de 6 ps a 2 ps, por lo tanto, la potencia del láser aplicada debería ser aún menor.
    5. Establezca la ganancia del amplificador de bloqueo al máximo. Abra el obturador tanto para los haces, así como el obturador principal del láser.
    6. Escanee la muestra y compruebe la imagen en la pantalla del ordenador. Cambie el modo de visualización a Hi-Lo en el software de imágenes. Ajuste el rango para ver una saturación de ~ 50%. Compruebe si la saturación está centrada en la imagen. Si no es así, ajuste cuidadosamente los espejos retrovisores de dirección, M1 y M2, para maximizar la intensidad de la imagen y centrar la intensidad máxima.
    7. Afina la etapa de retardo y encuentra la intensidad máxima de la señal SRS de la muestra de dodecano. El sistema está listo para su uso.

2. Preparación de muestras de C. elegans para imágenes de microscopía SRS

NOTA: Como organismos modelo, Caenorhabditis elegans han demostrado ser muy útiles para múltiples técnicas de imagen. Son transparentes de cuerpo entero, por lo tanto, se pueden obtener imágenes de varios tejidos en el animal intacto sin necesidad de disección. En C. elegans, los lípidos neutros se almacenan en gotitas lipídicas localizadas en el intestino, que consiste en 20 células epiteliales ubicadas bisimétricamente alrededor de la luz intestinal16. Las células hipodérmicas y los ovocitos también almacenan lípidos. La principal forma de almacenamiento de lípidos en las gotitas lipídicas de C. elegans son los triacilglicerols (TAGs)17,que generan fuertes señales de SRS debido a la abundancia de enlacesCH2 presentes en sus cadenas de ácidos grasos. Esta sección se centrará en cómo preparar muestras de C. elegans para imágenes de microscopía SRS y cuantificación de sus niveles totales de almacenamiento de lípidos intestinales.

  1. Preparación de las diapositivas de imágenes
    1. Primero, prepare una solución de agarosa al 2% enH2O destilado, y asegúrese de que toda la agarosa se derrita antes de preparar las almohadillas de agarosa.
    2. Agregue una gota de agarosa caliente al 2% en un portaobjetos en blanco (aproximadamente 100 μL) que se coloca entre los portaobjetos de soporte con dos capas de cinta de laboratorio y coloque rápidamente un segundo portaobjetos encima del primer portaobjetos. Presione suavemente para crear una almohadilla delgada, incluso de agarosa.
    3. Deje estas guías a un lado en posición cerrada y no las separe hasta que los gusanos estén listos para ser montados. Prepare diapositivas frescas antes de cada sesión de imágenes, ya que las almohadillas se secarán después de 1 día.
      NOTA: Utilice cámaras de imágenes de múltiples pozos, si toma imágenes de varios gusanos en pantallas genéticas de alto rendimiento18. Utilice configuraciones de imágenes en vivo para obtener imágenes de la dinámica espacio-temporal del metabolismo lipídico a través del desarrollo y el envejecimiento19.
  2. Montaje de los gusanos
    1. Preparar el agente anestesiante añadiendo azida de sodio o levamisol en tampón M9 a la concentración final de 100 mM o 1 mM, respectivamente.
      NOTA: Use levamisol si los gusanos necesitan ser recuperados después de la toma de imágenes para el genotipado después de las pruebas genéticas.
      PRECAUCIÓN: Varios agentes anestesiantes, incluyendo azida de sodio y levamisol, son dañinos si se inhalan. Use guantes y ropa de protección, así como una campana de humos químicos al preparar esas soluciones de trabajo.
    2. Coloque una gota de agente anestesiante en un cubrebocas (aproximadamente 4–5 μL para 10–20 gusanos).
      NOTA: Ajuste la cantidad del agente anestesiante según el número de gusano para mantener los gusanos lo más cerca posible entre sí. El uso de demasiado líquido para pocos gusanos puede hacer que los gusanos se propaguen en la almohadilla de agarosa.
    3. Recoja los gusanos que se visualizarán bajo la microscopía de disección y transfiéralos a la gotita del agente anestesiante. Después de que todos los gusanos se agregan a la gota, muévalos usando el selector de gusanos y asegúrese de que no se superpongan entre sí.
    4. Separe los portaobjetos de vidrio (del paso 2.1) sin perturbar la almohadilla de agarosa.
    5. Cubra la gota de gusano con el portaobjetos de vidrio que tiene la almohadilla de agarosa. Asegúrese de que la almohadilla de agarosa esté orientada hacia los gusanos. Alternativamente, la gotita de envejecimiento anestesiante también se puede agregar a la almohadilla de agarosa y los gusanos se pueden cubrir con el cubrebocas.
    6. Finalmente, marque la ubicación de los gusanos usando un marcador permanente en el portaobjetos de vidrio.

3. Adquisición y análisis de imágenes

  1. Adquisición de las imágenes mediante el sistema de microscopio SRS.
    1. Antes de tomar imágenes de cualquier muestra, determine los parámetros de imagen y verifique las señales srs (como se explica en el protocolo 1).
    2. Monte la diapositiva con la tapa hacia la lente objetivo. Encienda la fuente de luz de campo brillante y dirigídala al ocular para localizar los gusanos.
      NOTA: Utilice una lente objetiva 20x para obtener imágenes del almacenamiento de lípidos en todo el intestino. Considere el uso de una lente objetiva 60x para obtener imágenes del almacenamiento de grasa hipodérmica o para cuantificar el tamaño / número de gotas de lípidos.
    3. Enfoque los gusanos y ajuste la posición del condensador en consecuencia.
    4. Apague la fuente de luz de campo brillante y cambie a la unidad de escaneo láser. Comience a escanear el primer gusano a una velocidad de escaneo rápida (por ejemplo, 512 x 512 píxeles) y ajuste el enfoque fino para encontrar el área de interés. Para que se muestre la primera muestra, ajuste las potencias del láser al nivel en el que las señales SRS no estén saturadas.
    5. Cambie a una velocidad de escaneo más lenta (por ejemplo, 2 μs/píxel) y una resolución más alta (por ejemplo, 1024 x 1024 píxeles) para obtener la imagen SRS.
      NOTA: Mantenga las potencias láser constantes para cada muestra que se va a tomar una imagen durante la sesión de imágenes.
    6. Guarde la imagen SRS en el formato deseado que permita una alta resolución (como un archivo .tiff). Dependiendo del software de imágenes y la configuración utilizada, guarde la ubicación del primer gusano antes de pasar al siguiente.
    7. Imágenes completas de todos los gusanos que se montaron en la diapositiva. Apague el obturador para bloquear los rayos láser. No apague la fuente láser hasta que se muestren imágenes de todas las muestras.
    8. Quite la diapositiva antes de colocar la siguiente diapositiva de muestra. Repita los pasos 3.1.2–3.1.7.
    9. Una vez que todas las muestras han sido fotovidas, ponga la fuente láser en espera y apague el equipo asociado, incluyendo el amplificador, el detector, el microscopio y la computadora.
  2. Análisis de imágenes utilizando ImageJ
    1. Abra los archivos de imagen (normalmente .tiff) para ser cuantificados en ImageJ, seleccionando los archivos y arrastrándolos y soltándolos en la ventana de ImageJ. Descargue los plug-ins ImageJ apropiados, si utiliza formatos de microscopio Olympus específicos (como archivos .oib).
    2. Seleccione las propiedades que se van a analizar (Analizar > Definir medidas). Para la cuantificación total del almacenamiento de lípidos, seleccione Área, Valor de gris mínimo y máximo y Valor de gris medio.
    3. Utilice la herramienta de selección de polígonos y delinee la región del intestino del gusano que se va a cuantificar. Para medir los parámetros seleccionados en el paso 3.2.2, haga clic en Analizar > Medir. Aparecerá una nueva ventana con los resultados de la medición. Repita este paso para todas las imágenes abiertas.
    4. Seleccione las mediciones de todos los gusanos de un genotipo determinado y copie/pegue los resultados en una nueva hoja de cálculo. Repita los pasos 3.2.1–3.2.4 para todos los genotipos de la misma sesión de diagnóstico por imágenes.
    5. Seleccione un área en las proximidades del gusano que no tiene ninguna señal SRS, para cuantificar como fondo. Asegúrese de que el área seleccionada para la medición de fondo no contenga ninguna bacteria o residuo que también pueda dar una señal de SRS.
    6. Reste el valor gris medio de fondo de las mediciones de cada gusano individual. Calcule el promedio y la desviación estándar de los valores grises medios restados de fondo de todos los gusanos en un grupo de genotipo/prueba dado. Normalice este valor al promedio del grupo de control.
    7. Finalmente, realice el análisis estadístico apropiado utilizando el valor medio de gris como medida para los niveles de lípidos en cada gusano. Normalmente, utilice la prueba tde Student para dos grupos y utilice ANOVA unidireccional con una prueba de comparación múltiple adecuada para más de dos grupos.
      NOTA: Al seleccionar imágenes para la presentación de la figura, asegúrese de que las imágenes seleccionadas tengan la misma distribución de intensidad de píxeles. Establezca el brillo y el contraste en los mismos valores para todas las imágenes de la misma figura (Imagen > Ajustar > Brillo y contraste).

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Representative Results

La señalización de la insulina es un camino endocrino importante que afecta el desarrollo, la reproducción, la vida útil, y el metabolismo. En los gusanos, la señalización de insulina consiste en aproximadamente 40 ligandos peptídicos similares a la insulina, ortólogos daf-2 del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, cascada de quinasa PI3K/AKT aguas abajo y el ortólogo del factor de transcripción FoxO, DAF-1620. los mutantes daf-2, que carecen del receptor de insulina, tienen más gotitas de lípidos en su intestino, el gusano de almacenamiento de lípidos del tejido21,22. Usando microscopia del SRS, cuantificamos los niveles de lípidos intestinales en el salvaje-tipo edad-sincronizado gusanos y mutantes daf-2 durante edad adulta. De acuerdo con los resultados anteriores, encontramos que los mutantes daf-2 tienen niveles lipídicos más altos23,24 (Figura 2A). Observamos una disminución en los niveles de lípidos en gusanos de tipo salvaje desde el día 1 hasta el día 9 de la edad adulta(Figura 2A). Sin embargo, los niveles de lípidos en los mutantes daf-2 aumentaron hasta que tenían 5 días de edad y luego fueron constantes alrededor del nivel de 2,5-3,0 veces más alto que el de tipo salvaje (Figura 2A).

DAF-16, el ortólogo del factor de transcripción C. elegans FoxO, orquesta la mayoría de las funciones aguas abajo de la vía de señalización de la insulina. Las mutaciones nulas daf-16 suprimen varios fenotipos observados en mutantes daf-2, incluyendo la acumulación gorda. daf-16 genomic locus codifica para 8 transcripciones diferentes(daf-16a-h), que son generadas por el sitio de inicio de la transcripción alternativa, o el empalme alternativo20. Entre ellos, daf-16a, daf-16b y daf-16d/f/h son las transcripciones más abundantes y codifican para proteínas con diferentes N termini. Los estudios con mutaciones y transgenes específicos de la isoforma sugirieron que las isoformas DAF-16A y DAF-16D/F/H regulan el desarrollo y la vida útil de los dauer24,25, mientras que daf-16B es importante para la remodelación faríngea durante la formación de dauer26. En este estudio, usando microscopia del SRS, investigamos la especificidad del isoform de DAF-16 en la regulación del almacenaje intestinal del lípido. Encontramos que la inactivación de daf-16 suprime el aumento de los niveles de lípidos de los mutantes daf-2 (Figura 2B,C). Expresar daf-16a o daf-16b isoforma en el daf-2; daf-16 mutantes dobles no restaura los niveles de lípidos. Sin embargo, la expresión de la isoforma daf-16d/f/h es suficiente para restaurar los niveles de lípidos en daf-2; daf-16 a los niveles observados en daf-2 mutantes individuales(Figura 2B,C). Estos resultados revelaron que específicamente DAF-16D/F/H isoformas modula el metabolismo de lípidos en gusanos mutantes daf-2. Esto también es consistente con los resultados de un estudio reciente que mostró que la regulación olfativa del almacenamiento de lípidos también está mediada por las actividades transcripcionales de DAF-16D / F / H27.

Figure 1
Figura 1: Ilustración del sistema de microscopio SRS. El láser todo en uno proporciona bombas combinadas temporal y espacialmente y haces Stokes, modulador electroóptico (EOM) incorporado y frecuencia de referencia para el amplificador de bloqueo. El haz combinado es expandido por el telescopio (L1 y L2), retransmitido por dos espejos de relé (M1 y M2) y levantado por el periscopio (P1 y P2), y luego enviado al escáner del microscopio. El haz combinado es escaneado por la unidad de barrido (SU) en el microscopio y enfocado en la muestra. La luz transmitida es recogida por el condensador. Un filtro eliminará el haz de Stokes y dejará que el haz de la bomba sea detectado por el fotodiodo (PD). Las flechas discontinuas grises muestran la conexión entre la electrónica. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La reducción de la señalización de insulina en C. elegans conduce a un mayor almacenamiento de lípidos. (A)Usando microscopía SRS, los niveles de lípidos intestinales de gusanos mutantes de tipo salvaje y daf-2 se cuantifican en el día 1, 3, 5, 7 y 9 de la edad adulta. En los gusanos de tipo salvaje, los niveles de lípidos disminuyen con el tiempo, mientras que los mutantes daf-2 acumulan lípidos hasta el día 5 y tienen aproximadamente 2,7 veces más lípidos en comparación con los gusanos de tipo salvaje. (B)la deleción daf-16 suprime el aumento de los niveles de lípidos en los mutantes daf-2. Restauración de la expresión de la isoforma daf-16d/f/h en daf-2; daf-16 mutantes dobles es suficiente para aumentar los niveles de lípidos a daf-2 mutantes' niveles, mientras que la restauración de la expresión de daf-16a o daf-16b isoformas no es. *** p < 0,001, n.s. no significativa por ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. (C) Imágenes representativas de SRS. Los píxeles amarillos indican niveles de lípidos más altos. El área intestinal cuantificada se muestra en líneas discontinuas. La barra de escala es de 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

En defensa contra la obesidad y sus trastornos metabólicos asociados, se han implementado importantes esfuerzos de investigación para comprender mejor los mecanismos reguladores de la homeostasis lipídica. Para la detección cuantitativa de moléculas del lípido en muestras biológicas, la proyección de imagen etiqueta-libre por microscopia del SRS se ha demostrado para ser una alternativa confiable a los análisis bioquímicos y a otros métodos de coloración. Nuestro grupo y otros han revelado nuevos mecanismos biológicos en la regulación metabólica lipídica mediante la combinación del uso de C. elegans y microscopía SRS12,18,28,29,30,31. En este protocolo, usando microscopia del SRS demostramos que la señalización downregulating de la insulina en gusanos lleva a un aumento en niveles de lípido intestinales totales. Observamos que a partir del día 1 de la edad adulta, los lípidos se acumulan en el intestino de los mutantes daf-2, que tienen mutación de pérdida de función en el gen del receptor de insulina, mientras que en el salvaje-tipo gusanos los niveles de lípidos intestinales disminuyen. Además, de acuerdo con estudios anteriores23,24,encontramos que la inactivación de daf-16 puede suprimir completamente el aumento del almacenamiento de lípidos en mutantes daf-2 y entre las diferentes isoformas de daf-16, la isoforma daf-16d/f/h regula específicamente la homeostasis lipídica. Como sugirieron estudios anteriores, la diferencia en los niveles totales de almacenamiento de lípidos intestinales en los mutantes daf-2 es probablemente debido a una combinación de factores: aumento de la síntesis de lípidos de novo 32,disminución de la utilización de lípidos33,así como reducción de la reproducción y acumulación de yema34. Los avances recientes en las técnicas coherentes de espectroscopia Raman (SRS y CARS) ayudarían a dilucidar aún más los mecanismos de cómo la señalización de insulina contribuye a la regulación de diferentes tipos de almacenamiento de lípidos en distintos tejidos, incluidos el intestino, la hipodermis y los ovocitos.

La microscopía SRS se ha utilizado para obtener imágenes no sólo de lípidos, sino también de otras biomoléculas, incluyendo ADN35,ARN14,proteínas13y glucosa36. Se ha implementado para proporcionar información importante sobre muchos aspectos de la biología, como la biología celular, la microbiología, la biología del cáncer y la biología del desarrollo11. Más recientemente, el uso de etiquetas bioorthogonales (por ejemplo, etiquetas de alquino y deuterio), para etiquetar mínimamente las moléculas de interés, mejoró aún más la sensibilidad y especificidad de la detección. Estas etiquetas vibracionales mínimas no alteran las propiedades químicas de la molécula, sino que proporcionan un contraste químico específico, ya que su señal Raman está dentro de la "ventana silenciosa" del espectro Raman14,37. Además de mejorar la sensibilidad y la especificidad, lograr imágenes SRS de súper resolución también es un área de investigación emocionante. Varios grupos de investigación también tienen esfuerzos para minimizar el tamaño del equipo mediante la creación de microscopio SRS de mano38. Por lo tanto, la aplicación de las imágenes SRS a la investigación biomédica ha abierto nuevos lugares para mejoras tecnológicas y químicas para avanzar en las imágenes lipídicas.

En comparación con los métodos tradicionales de cuantificación de lípidos, la microscopía SRS tiene varias ventajas. En primer lugar, se realiza de una manera libre de etiquetas e incluso si se tiene que usar una etiqueta, la etiqueta puede ser tan pequeña como dos átomos. Por lo tanto, tampoco sufre del problema de fotoblanqueo como otros métodos de etiquetado y tinción fluorescente. En segundo lugar, la capacidad de la proyección de imagen viva usando organismos enteros permite seguir la dinámica de metabilitos específicos29,39,40. Finalmente, la microscopia SRS permite un mayor grado de multiplexación y, por lo tanto, se puede implementar para obtener imágenes de múltiples biomoléculas en distintos compartimentos celulares simultáneamente. La microscopía hiperespectral SRS/CARS tiene un gran futuro en la exploración de la dinámica metabólica de varias biomoléculas distintas, así como de diferentes tipos de compartimentos de almacenamiento de lípidos, como las partículas de yema en C. elegans41 o el éster de colesterilo y las gotitas lipídicas ricas en TAG en diferentes células y tejidos de mamíferos31. Por otro lado, la microscopía SRS se enfrenta a limitaciones como el alto costo en hardware y la falta de disponibilidad comercial completa. Además, requiere experiencia para mantener y ejecutar el sistema, lo que puede complicar su adopción. Los avances en la integración de fuentes de luz y sistemas están mejorando la situación. La fuente láser de bajo costo basada en fibra y los sistemas totalmente integrados ofrecen nuevas oportunidades en la comercialización y ayudarán a reducir el costo en el futuro11,42,43. Además, a pesar de los nuevos enfoques tecnológicos para mejorar la velocidad de la proyección de imagen y la resolución espacial de la proyección de imagen del SRS, la sensibilidad limitada de la detección puede continuar obstaculizando la capacidad de sondear los metabilitos de la abundancia baja. En general, el uso de la microscopía SRS en la investigación biomédica ha crecido enormemente en la última década. Las imágenes SRS se beneficiarán aún más de las mejoras tecnológicas en la sensibilidad de detección, la resolución espacial y la capacidad de multiplexación, y en última instancia ampliarán su uso en el monitoreo cuantitativo de biomoléculas, especialmente lípidos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), y por el investigador del HHMI (M.C.W.). Agradecemos al Caenorhabditis Genetics Center (CGC) por las cepas de C. elegans.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D converter Olympus Analog Unit
Agarose GeneMate 3119 For making agarose pads
Alignment tool - adapter Thorlabs SM1A4 For mounting the tool on scope
Alignment tool - target Thorlabs VRC2SM1 For viewing IR laser
Alignment tool - tube Thorlabs SM1L40 Length can vary
Autocorrelator (Optional) APE pulseCheck
Bandpass filter minicircuits BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope Nikon SMZ800 For handling and picking worms for imaging
Dodecane Sigma-Aldrich 44010 Used for calibration of the SRS signal
Filter Chroma Technology 890/220 CARS For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape VWR 89097 For making agarose pads
Glass coverslips VWR 48393-106 For covering worms for imaging
Glass microscope slide VWR 16004-422 For making agarose pads
Laser scanning microscope Olympus FV3000
Lens Thorlabs L1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		 For beam expander
Lock-in amplifier Zurich HF2LI
Lowpass filter minicircuits BLP-1.9+ For power supply noise suppression
Mirrors Thorlabs BB1-E03 For relay and periscope
Objective Olympus UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode Thorlabs FDS1010
Picosecond laser source APE picoEmerald
Power supply TEKPOWER TP1342U For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide Sigma S2002 For anaesthesizing the worms
Worm picker WormStuff 59-AWP

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References

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Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).

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