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Biology

Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée

doi: 10.3791/61870 Published: May 28, 2021

Summary

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet l’imagerie sélective et sans étiquette de fractions chimiques spécifiques et elle a été utilisée efficacement pour imager des molécules lipidiques in vivo. Ici, nous fournissons une brève introduction au principe de la microscopie SRS et décrivons des méthodes pour son utilisation dans le stockage des lipides d’imagerie dans Caenorhabditis elegans.

Abstract

Le métabolisme des lipides est un processus physiologique fondamental nécessaire à la santé cellulaire et de l’organisme. Dysregulation du métabolisme des lipides provoque souvent l’obésité et beaucoup de maladies associées comprenant des désordres cardio-vasculaires, le diabète de type II, et le cancer. Pour faire progresser la compréhension actuelle de la régulation métabolique des lipides, les méthodes quantitatives permettant de mesurer avec précision les niveaux de stockage des lipides in vivo dans le temps et l’espace sont devenues de plus en plus importantes et utiles. Les approches traditionnelles pour analyser le stockage des lipides sont semi-quantitatives pour l’évaluation microscopique ou manquent d’informations spatio-temporelles pour la mesure biochimique. La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie chimique sans étiquette qui permet une détection rapide et quantitative des lipides dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire. Comme le contraste est exploité à partir de vibrations moléculaires intrinsèques, la microscopie SRS permet également un suivi quadridimensionnel des lipides chez les animaux vivants. Au cours de la dernière décennie, la microscopie SRS a été largement utilisée pour l’imagerie de petites molécules dans la recherche biomédicale et a surmonté les principales limitations des méthodes conventionnelles de coloration fluorescente et d’extraction lipidique. En laboratoire, nous avons combiné la microscopie SRS avec les outils génétiques et biochimiques disponibles pour le puissant organisme modèle, Caenorhabditis elegans, pour étudier la distribution et l’hétérogénéité des gouttelettes lipidiques à travers différentes cellules et tissus et finalement pour découvrir de nouvelles voies de signalisation conservées qui modulent le métabolisme des lipides. Ici, nous présentons les principes de travail et la configuration détaillée du microscope SRS et fournissons des méthodes pour son utilisation dans la quantification du stockage des lipides à des points de temps de développement distincts de type sauvage et de signalisation de l’insuline mutant déficient C. elegans.

Introduction

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L’obésité est devenue un problème de santé mondial menaçant un tiers de la population mondiale, et elle présente un grave problème médical, étant donné son association avec une mauvaise santé mentale1 et des maladies mortelles dont le diabète2,les maladiescardiovasculaires 3 et certains types de cancer4. L’étude du métabolisme des lipides est essentielle pour mieux comprendre les problèmes biologiques derrière l’obésité. La quantification rapide et spécifique du stockage lipidique implique la détection d’acides gras et de leurs dérivés, ainsi que de métabolites contenant des stérols, avec une sensibilité élevée et de préférence avec des informations spatiales. Les lipides sont des cibles difficiles à imager car ils manquent de fluorescence intrinsèque et ne peuvent pas être facilement marqués par fluorescence. Les étiquettes fluorescentes sont souvent plus grandes que les molécules lipidiques et, par conséquent, peuvent être chimiquement invasives et peu pratiques pour des applications in vivo. Une stratégie d’étiquetage sans étiquette ou minimale est nécessaire pour préserver la structure hydrophobe des molécules lipidiques5. Les développements récents dans les technologies d’imagerie ont créé des opportunités passionnantes pour l’imagerie sans étiquette des lipides dans les cellules, les tissus et les organismes vivants.

Les approches traditionnelles pour les analyses de stockage de lipides dans des échantillons biologiques incluent des essais biochimiques et des protocoles de coloration avec des colorants lipophiles. Les tests de quantification biochimique impliquant la spectrométrie de masse (MS) sont inégalés dans leur résolvabilité moléculaire, mais ils nécessitent de très grandes quantités d’échantillons et la préparation des échantillons prend généralement plusieurs heures, limitant leur application pour l’imagerie en temps réel des systèmes vivants5. Une autre limite majeure de ces essais est le manque d’informations spatiales. D’autre part, les colorants lipophiles tels que Oil Red O et Sudan Black fournissent une distribution tissulaire et cellulaire des organites de stockage des lipides et par rapport aux techniques de SEP, ces méthodes de coloration sont également peu coûteuses et faciles à réaliser. Cependant, ces protocoles de coloration nécessitent une fixation, ce qui peut avoir un impact sur la nature hydrophobe des gouttelettes lipidiques, générer des changements artificiels dans leur structure et entraîner des incohérences entre les expériences6. Les difficultés techniques liées aux techniques biochimiques et de coloration ont mené à la recherche de méthodes sans étiquette pour imager des molécules lipidiques et à l’augmentation rapide de l’utilisation de la microscopie cohérente de diffusion de Raman (CRS) dans l’imagerie lipidique.

L’effet Raman a d’abord été reconnu par Raman et Krishnan, où ils ont rapporté qu’en interagissant avec un photon, une molécule peut générer de la lumière diffusée sans changement de longueur d’onde (appelée diffusion de Rayleigh) ou rarement avec une longueur d’onde altérée (appelée diffusion Raman) et ce changement de longueur d’onde est caractéristique des groupes chimiques fonctionnels au sein de la molécule7. Lorsque les liaisons chimiques au sein d’une molécule sont excitées à un niveau d’énergie vibratoire plus élevé par un photon incident, appelé photon de pompe, l’énergie du photon dispersé, appelé photon de Stokes, devient plus faible. Sinon, les liaisons chimiques peuvent atteindre un niveau d’énergie vibratoire inférieur si elles sont à l’origine à un niveau supérieur, et le photon dispersé gagne de l’énergie pour être le photon anti-Stokes. La différence de fréquence entre l’incident et les photons dispersés est connue sous le nom de décalage Raman. Chaque liaison chimique au sein d’une molécule a un décalage Raman caractéristique et quantifiable. Par exemple, la liaisonCH2 présente un décalage Raman de 2 845cm-1,ce qui est abondant dans les chaînes d’acides gras8. Ce signal raman spontané est généralement très faible, ce qui a considérablement limité la vitesse d’imagerie en microscopie raman spontanée conventionnelle. Au fil des ans, diverses approches ont été développées pour augmenter la vitesse d’imagerie et la sensibilité de la microscopie Raman spontanée. La microscopie à diffusion Raman cohérente, y compris la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) et la microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS), est le progrès le plus récent. Cars et SRS ont des principes de travail légèrement différents, mais les deux sont des techniques sans étiquette qui ont une capacité d’imagerie en direct, peuvent fournir des informations spatiales et temporelles sur la dynamique de stockage des lipides, et ne nécessitent qu’une petite taille d’échantillon. La microscopie CARS souffre d’un fond non résonnant, qui provient de divers processus non linéaires, et les signaux CARS ont également une relation non linéaire avec la concentration de la molécule, ce qui complique ensemble le processus de quantification9. Contrairement à la microscopie CARS, la microscopie SRS ne génère pas de signaux de fond non résonnants et offre une dépendance linéaire à la concentration de la molécule d’intérêt. Ainsi, actuellement la microscopie SRS est plus largement utilisée pour l’imagerie lipidique.

En microscopie SRS, les signaux Raman spontanés faibles peuvent être amplifiés lorsqu’ils sont excités par deux faisceaux laser synchronisés avec leur différence de fréquence correspondant à la fréquence vibratoire de liaison chimique. La molécule connaîtra une transition améliorée vers un état excité grâce à une excitation cohérente. En conséquence, le taux de génération de photons de Stokes est augmenté. Par conséquent, l’intensité du faisceau « Stokes » transmis augmente (gain Raman stimulé, SRG) et l’intensité du faisceau « pompe » transmis diminue (perte Raman stimulée, SRL). La détection de signaux SRG ou SRL sous-tend la base de l’imagerie par microscopie à diffusion raman stimulée (SRS) de molécules avec des liaisons chimiques spécifiques10. Si la différence de fréquence entre les deux faisceaux laser ne correspond pas à la fréquence vibratoire de la liaison chimique au sein d’une molécule d’intérêt, ni les signaux SRG ni SRL ne seront générés. La vitesse d’imagerie de la microscopie SRS est d’environ 2 μsec par pixel ou 1 seconde par image, ce qui est beaucoup plus rapide que la microscopie Raman spontanée11. La résolution latérale typique pour la microscopie SRS est limitée par diffraction et autour de 300 nm. En outre, les processus optiques à deux photons de la microscopie SRS permettent l’imagerie 3D volumétrique d’échantillons de tissus relativement épais et la profondeur d’imagerie pourrait atteindre 300 à 500 μm. Dans l’ensemble, la microscopie SRS présente une technique d’imagerie efficace et sans étiquette pour détecter des biomolécules spécifiques, en particulier les lipides.

Les gouttelettes lipidiques sont des organites à membrane unique, qui sont le principal site de stockage cellulaire pour les lipides neutres, y compris les triacylglycérols (TAGs) et les esters de cholestérol (CE). Les liaisonsCH2 dans les chaînes d’acides gras de ces molécules lipidiques génèrent des signaux SRS forts à 2 845cm-1 lorsqu’elles sont excitées8,permettant ainsi la détection et la quantification des taux de lipides de stockage dans des cellules intactes, des sections tissulaires et même des organismes entiers 12,13,14,15. En particulier, C. elegans sont utiles pour les études d’imagerie lipidique en raison de leur transparence. Comme les mammifères, C. elegans stocke également les lipides dans les gouttelettes lipidiques et les voies de synthèse et de dégradation des molécules lipidiques sont hautement conservées16. Dans ce protocole, nous fournirons le principe de fonctionnement de la microscopie SRS, sa configuration fondamentale et décrirons les méthodes pour son utilisation dans l’imagerie lipidique chez C. elegans.

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Protocol

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1. Configuration instrumentale pour la microscopie à diffusion Raman stimulée

REMARQUE: Le système de microscopie SRS est construit sur un laser picoseconde avec oscillateur paramétrique optique intégré à la pompe et un microscope à balayage laser confocal. L’oscillateur fournit deux trains d’impulsions picosecondes, dont un faisceau de Stokes à 1 064 nm et un faisceau de pompe accordable entre 700 et 990 nm. Le chevauchement temporel et spatial des deux faisceaux est réalisé à l’intérieur du laser. Un modulateur électro-optique (MOE) intégré est conçu spécifiquement pour la microscopie SRS. Ce protocole se concentrera sur le couplage du laser avec le microscope et sur le fonctionnement quotidien de ce système (Figure 1). La configuration d’un système de microscope SRS évolue au cours de la dernière décennie. Il convient de noter que la description suivante ne représente qu’une des nombreuses configurations.

  1. Alimentation de faisceaux laser dans le microscope
    1. Configurez le périscope pour soulever le faisceau de la sortie de la source lumineuse picoseconde vers le port d’entrée laser IR sur le scanner du microscope.
      ATTENTION: Lisez le manuel du système laser avant de l’opération et prenez toutes les précautions requises car le rayonnement proche infrarouge généré par ce système laser de classe IV peut causer de graves dommages aux yeux et à la peau. Suivre les formations exigées par les services de sécurité environnementale de l’établissement. Portez des lunettes de protection et du sarrau de laboratoire avec des manches menottées.
    2. Tout d’abord, réglez le faisceau de la pompe à 750 nm et abaissez la puissance laser à 50 mW, qui peut être inspecté visuellement, affiliant l’alignement. Ensuite, utilisez un expanseur de faisceau(Figure 1,L1 et L2) pour ajuster le diamètre du faisceau afin de l’adapter à l’ouverture arrière des objectifs du microscope. Utilisez deux miroirs relais(Figure 1,M1 et M2) pour guider le faisceau laser vers le périscope(Figure 1,P1 et P2). Le périscope soulèvera le faisceau à la hauteur de l’ouverture du scanner et servira également de rétroviseur de direction pour l’alignement.
    3. Réglez les boutons sur le périscope au centre de la plage d’accord et choisissez la position initiale et l’angle de chaque miroir de sorte que le faisceau laser frappe le centre du miroir, approximativement.
    4. Effectuez l’alignement grossier à l’aide d’un port vide sur la tourelle de l’objectif et placez la sonde du capteur de puissance pour mesurer la puissance de la lumière transmise. Réglez le scanner du microscope au zoom le plus élevé (50x), puis mesurez la puissance de la lumière transmise avec le point de faisceau laser focalisé. Optimisez les boutons sur chaque miroir, M1 et M2, de manière itérative pour atteindre la puissance laser transmise la plus élevée.
    5. Effectuez l’alignement fin avec l’outil d’alignement. Placez le capuchon d’alignement de la cible de fluorescence sur le siège de l’objectif vide et ajustez les boutons de M1 pour centrer le point. Ensuite, introduisez le tube d’extension pour la cible et accordez les boutons de M2 pour centrer le spot.
    6. Répéter les étapes 1.1.4 et 1.1.5 jusqu’à ce que le faisceau centre la cible aux deux positions.
  2. Connexion de la détection et de l’électronique
    1. Configurez le module de détection SRS. Placez un séparateur de faisceau cuber après le condenseur pour diriger le laser transmis vers le module de photodiode. Le module comprend un télescope pour relayer et modifier la taille du faisceau pour s’adapter à la zone active de la photodiode, ainsi qu’un filtre optique pour retirer le faisceau de Stokes modulé et laisser passer le faisceau de la pompe pour la démodulation.
    2. Configurez la connexion électronique(Figure 1). L’intensité du faisceau de Stokes est modulée par une MOE intégrée à 20 MHz à l’intérieur du laser accordable picoseconde. La sortie de fréquence de modulation du laser est entrée dans l’amplificateur de verrouillage comme fréquence de référence pour la démodulation. Alimentez le signal de sortie de la photodiode dans l’amplificateur de verrouillage pour démoduler le SRL.
      REMARQUE: Les systèmes laser à une boîte peuvent être mis à niveau et donc leurs spécifications peuvent varier en raison de différentes dates de production. La version précédente du système laser accordable picoseconde, utilisée dans ce protocole, a un faisceau de Stokes de 1 064 nm, mais la version récente a un faisceau de Stokes de 1 031 nm. La fréquence de modulation de l’EOM utilisée dans ce protocole est personnalisée à 8 MHz, mais la fréquence de modulation par défaut pour le système récent peut être 10 ou 20 MHZ.
    3. Enfin, alimentez la sortie de l’amplificateur verrouillé dans la boîte analogique du microscope pour convertir le signal analogique électrique en signal numérique. Le système doit être prêt à traiter le signal SRS.
  3. Optimiser les conditions d’imagerie
    1. Faire un échantillon chimique pour l’alignement du système. Par exemple, utilisez le dodécane pour optimiser le microscope, car le dodécane a un signal SRS très fort des liaisons C-H. Utilisez un joint sécurisé pour faire une mini chambre; mettre 5 μL de dodécane et le recouvrir d’une lamelle.
      REMARQUE : Remplacer l’échantillon de dodécane lorsqu’il semble peu clair ou présente des débris, par un nouvel échantillon qui pourrait être utilisé pour l’alignement pendant 2 à 3 mois.
    2. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope. Concentrez-vous correctement sur les gouttelettes liquides. Cela peut être fait plus rapidement en recherchant le bord du tampon dodécane. Ajustez le condenseur pour l’éclairage Kohler.
    3. Définissez les paramètres d’imagerie. Vérifiez si l’étape de retard est sur les bons nombres. Réglez la longueur d’onde du faisceau de la pompe à 795,8 nm. À l’aide d’une carte de capteur IR et d’une visionneuse IR, vérifiez si le chemin du faisceau de la pompe est toujours correct.
    4. Réglez la puissance du faisceau de la pompe à 200 mW et le faisceau de Stokes à 400 mW sur le panneau de commande du système picoseconde.
      REMARQUE: Les débits laser de la sortie laser à l’objectif de poteau des deux faisceaux sont d’environ 25% pour la pompe et 14% pour Stokes pour cette configuration du système. Par conséquent, une puissance post-objectif du faisceau de la pompe est d’environ 50 mW et pour le faisceau stokes, elle est d’environ 56 mW. La largeur d’impulsion du récent système laser picoseconde est passée de 6 ps à 2 ps, par conséquent, la puissance laser appliquée devrait être encore plus faible.
    5. Réglez le gain de l’amplificateur verrouillé au maximum. Ouvrez l’obturateur pour les deux faisceaux, ainsi que l’obturateur principal du laser.
    6. Numérisez l’échantillon et vérifiez l’image sur l’écran de l’ordinateur. Changez le mode d’affichage en Hi-Lo dans le logiciel d’imagerie. Ajustez la plage pour voir une saturation d’environ 50%. Vérifiez si la saturation est centrée dans l’image. Sinon, ajustez soigneusement les rétroviseurs de direction, M1 et M2, pour maximiser l’intensité de l’image et centrer l’intensité maximale.
    7. Ajustez l’étage de retard et trouvez l’intensité maximale du signal SRS à partir de l’échantillon de dodécane. Le système est alors prêt à l’emploi.

2. Préparation d’échantillons de C. elegans pour l’imagerie par microscopie SRS

REMARQUE: En tant qu’organismes modèles, Caenorhabditis elegans se sont avérés très utiles pour de multiples techniques d’imagerie. Ils sont transparents pour tout le corps, donc divers tissus peuvent être enticacés chez l’animal intact sans avoir besoin de dissection. Chez C. elegans, les lipides neutres sont stockés dans des gouttelettes lipidiques situées dans l’intestin, qui se compose de 20 cellules épithéliales situées bisymétriquement autour de la lumière intestinale16. Les cellules hypodermiques et les ovocytes stockent également les lipides. La principale forme de lipides de stockage dans les gouttelettes lipidiques de C. elegans sont les triacylglycérols (TAGs)17, qui génèrent de forts signaux SRS en raison de l’abondance de liaisonsCH2 présentes dans leurs chaînes d’acides gras. Cette section se concentrera sur la façon de préparer des échantillons de C. elegans pour l’imagerie par microscopie SRS et la quantification de leurs niveaux de stockage de lipides intestinaux totaux.

  1. Préparation des lames d’imagerie
    1. Tout d’abord, préparez une solution d’agarose à 2% dans duH2Odistillé et assurez-vous que tout l’agarose fond avant de préparer les tampons d’agarose.
    2. Ajoutez une goutte d’agarose chaude à 2 % sur une lame vierge (environ 100 μL) qui est placée entre les lames de support avec deux couches de ruban de laboratoire et placez rapidement une deuxième lame sur la première lame. Appuyez doucement pour créer un tampon mince, même en agarose.
    3. Mettez ces glissières de côté en position fermée et ne les séparez pas tant que les vers ne sont pas prêts à être montés. Préparez des lames fraîches avant chaque séance d’imagerie, car les coussinets sécheront après 1 jour.
      REMARQUE: Utilisez des chambres d’imagerie multi-puits, si l’imagerie de plusieurs vers dans des écrans génétiques à haut débit18. Utilisez des configurations d’imagerie en direct pour imager la dynamique spatio-temporelle du métabolisme des lipides par le développement et le vieillissement19.
  2. Montage des vers
    1. Préparer l’agent anesthésiant en ajoutant de l’azide de sodium ou du lévamisole dans le tampon M9 à la concentration finale de 100 mM ou 1 mM, respectivement.
      REMARQUE: Utilisez le lévamisole si les vers doivent être récupérés après l’imagerie pour le génotypage après les tests génétiques.
      ATTENTION : Plusieurs agents anesthésiants, dont l’azide de sodium et le lévamisole, sont nocifs s’ils sont inhalés. Portez des gants et des vêtements de protection, ainsi que d’utiliser une hotte chimique lors de la préparation de ces solutions de travail.
    2. Placer une goutte d’agent anesthésiant sur une lamelle de couverture (environ 4 à 5 μL pour 10 à 20 vers).
      REMARQUE: Ajustez la quantité de l’agent anesthésiant en fonction du numéro de ver pour garder les vers aussi proches les uns des autres que possible. L’utilisation d’une trop grande quantité de liquide pour quelques vers peut provoquer la propagation des vers sur le coussinet d’agarose.
    3. Choisissez les vers à iréthiquer sous la microscopie de dissection et transférez-les à la gouttelette d’agent anesthésiant. Une fois tous les vers ajoutés à la gouttelette, déplacez-les à l’aide du sélecteur de vers et assurez-vous qu’ils ne se chevauchent pas.
    4. Séparez les lames de verre (à partir de l’étape 2.1) sans perturber le tampon d’agarose.
    5. Couvrez la gouttelette de ver avec la lame de verre qui a le tampon d’agarose. Assurez-vous que le coussinet d’agarose est orienté vers les vers. Alternativement, la gouttelette vieillissante anesthésiante peut également être ajoutée sur le tampon d’agarose et les vers peuvent être recouverts de la lamelle.
    6. Enfin, marquez l’emplacement des vers à l’aide d’un marqueur permanent sur la lame de verre.

3. Acquisition et analyse d’images

  1. Acquisition des images à l’aide du système de microscope SRS.
    1. Avant d’imager un échantillon, déterminez les paramètres d’imagerie et vérifiez les signaux SRS (comme expliqué dans le protocole 1).
    2. Montez la glissière avec la lame de couverture face à l’objectif. Allumez la source lumineuse et dirigez-la vers l’oculaire pour localiser les vers.
      REMARQUE: Utilisez une lentille objective 20x pour imager le stockage des lipides dans l’intestin entier. Envisagez d’utiliser une lentille objective 60x pour imager le stockage hypodermique des graisses ou pour quantifier la taille / le nombre de gouttelettes lipidiques.
    3. Ez les vers au point et ajustez la position du condenseur en conséquence.
    4. Éteignez la source lumineuse de champ lumineux et passez à l’unité de balayage laser. Commencez à analyser le premier ver à un rythme d’analyse rapide (par exemple, 512 x 512 pixels) et ajustez la mise au point fine pour trouver la zone d’intérêt. Pour le premier échantillon à imager, ajustez les puissances laser au niveau où les signaux SRS ne sont pas saturés.
    5. Passez à un taux de balayage plus lent (p. ex., 2 μs/pixel) et à une résolution plus élevée (p. ex., 1024 x 1024 pixels) pour obtenir l’image SRS.
      REMARQUE: Gardez les puissances laser constantes pour chaque échantillon à imager pendant la session d’imagerie.
    6. Enregistrez l’image SRS dans le format souhaité qui permet une haute résolution (par exemple, un fichier .tiff). Selon le logiciel d’imagerie et la configuration utilisés, enregistrez l’emplacement du premier ver avant de passer au suivant.
    7. Imagerie complète de tous les vers montés sur la lame. Éteignez l’obturateur pour bloquer les faisceaux laser. N’éteignez pas la source laser tant que tous les échantillons n’ont pas été images.
    8. Supprimez la diapositive avant de placer l’exemple de diapositive suivant. Répétez les étapes 3.1.2 à 3.1.7.
    9. Une fois que tous les échantillons ont été microscopés, mettez la source laser en veille et éteignez l’équipement associé, y compris l’amplificateur, le détecteur, le microscope et l’ordinateur.
  2. Analyse d’images à l’aide d’ImageJ
    1. Ouvrez les fichiers image (généralement .tiff) à quantifier dans ImageJ, en sélectionnant les fichiers et en les faisant glisser et en les déposant dans la fenêtre ImageJ. Téléchargez les plug-ins ImageJ appropriés, si vous utilisez des formats de microscope Olympus spécifiques (tels que les fichiers .oib).
    2. Sélectionnez les propriétés à analyser(Analyser > Définir les mesures). Pour la quantification du stockage total des lipides, sélectionnez Surface, Valeur de gris min et max et Valeur de gris moyenne.
    3. Utilisez l’outil de sélection de polygones et décrivez la région de l’intestin du ver à quantifier. Pour mesurer les paramètres sélectionnés à l’étape 3.2.2, cliquez sur Analyser > mesure. Une nouvelle fenêtre avec les résultats de la mesure apparaîtra. Répétez cette étape pour toutes les images ouvertes.
    4. Sélectionnez les mesures pour tous les vers d’un génotype donné et copiez/collez les résultats dans une nouvelle feuille de calcul. Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.4 pour tous les génotypes d’une même session d’imagerie.
    5. Sélectionnez une zone à proximité du ver qui n’a pas de signal SRS, à quantifier comme arrière-plan. Assurez-vous que la zone sélectionnée pour la mesure de fond ne contient pas de bactéries ou de débris qui pourraient également donner un signal SRS.
    6. Soustrayez la valeur de gris moyen d’arrière-plan des mesures de chaque ver individuel. Calculer la moyenne et l’écart type des valeurs grises moyennes soustraites de fond de tous les vers d’un génotype/groupe d’essai donné. Normaliser cette valeur à la moyenne du groupe témoin.
    7. Enfin, effectuez l’analyse statistique appropriée en utilisant la valeur de gris moyenne comme mesure des taux de lipides dans chaque ver. En règle générale, utilisez le test tde Student pour deux groupes et utilisez l’ANOVA unidirectionnelle avec un test de comparaison multiple approprié pour plus de deux groupes.
      Remarque : lorsque vous sélectionnez des images pour la présentation de la figure, assurez-vous que ces images sélectionnées ont la même distribution d’intensité de pixel. Définissez la luminosité et le contraste sur les mêmes valeurs pour toutes les images de la même figure(> Ajuster la luminosité et le contraste> ).

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Representative Results

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La signalisation de l’insuline est une voie endocrinienne importante qui affecte le développement, la reproduction, la durée de vie et le métabolisme. Chez les vers, la signalisation de l’insuline se compose d’environ 40 ligands peptidiques analogues à l’insuline, d’un orthologue de récepteur du facteur de croissance analogue à l’insuline DAF-2, d’une cascade de kinase PI3K /AKT en aval et de l’orthologue du facteur de transcription FoxO, DAF-1620. les mutants daf-2, qui n’ont pas le récepteur de l’insuline, ont plus de gouttelettes lipidiques dans leur intestin, le tissu de stockage des lipides du ver21,22. Utilisant la microscopie de SRS, nous avons quantifié les niveaux intestinaux de lipide dans le sauvage-type âge-synchronisés vers et mutants daf-2 pendant l’âge adulte. Conformément aux résultats précédents, nous avons constaté que les mutants daf-2 ont des taux de lipides plus élevés23,24 (Figure 2A). Nous avons observé une baisse des taux de lipides chez les vers de type sauvage à partir du jour 1 jusqu’au jour 9 de l’âge adulte (Figure 2A). Cependant, les taux de lipides chez les mutants daf-2 ont augmenté jusqu’à ce qu’ils aient 5 jours, puis ils étaient constants autour du niveau de 2,5 à 3,0 fois plus élevé que le type sauvage (Figure 2A).

DAF-16, l’orthologue du facteur de transcription FoxO de C. elegans, orchestre la plupart des fonctions en aval de la voie de signalisation de l’insuline. Les mutations nulles daf-16 suppriment plusieurs phénotypes observés dans les mutants daf-2, y compris la grosse accumulation. le locus génomique daf-16 code pour 8 transcriptions différentes(daf-16a-h),qui sont générées par un site de départ de transcription alternatif ou un épissage alternatif20. Parmi ceux-ci, daf-16a, daf-16b et daf-16d/f/h sont les transcriptions les plus abondantes et ils codent pour des protéines avec différents termini N. Les études avec des mutations et des transgènes isoforme-spécifiques ont suggéré que les isoformes DAF-16A et DAF-16D/F/H régulent le développement et la durée de vie de dauer24,25,tandis que DAF-16B est important pour le remodelage pharyngé pendant la formation de dauer26. Dans cette étude, utilisant la microscopie de SRS, nous avons étudié la spécificité d’isoform de DAF-16 en régulant le stockage intestinal de lipide. Nous avons constaté que l’inactivation du daf-16 supprime l’augmentation des taux de lipides des mutants du daf-2 (figure 2B,C). L’expression de l’isoforme daf-16a ou daf-16b dans le daf-2; les doubles mutants daf-16 ne restaure pas les taux de lipides. Cependant, l’expression de l’isoforme daf-16d/f/h est suffisante pour restaurer les taux lipidiques dans daf-2 ; daf-16 aux niveaux observés chez les mutants simples daf-2 (figure 2B,C). Ces résultats ont indiqué que spécifiquement les isoformes DAF-16D/F/H modulent le métabolisme de lipide dans les vers de mutant daf-2. Ceci est également compatible avec les résultats d’une étude récente qui a montré que la régulation olfactive du stockage des lipides est également médiée par les activités transcriptionnelles de DAF-16D/F/H27.

Figure 1
Figure 1 : Illustration du système de microscope SRS. Le laser tout-en-un fournit des faisceaux de pompe et de Stokes combinés temporellement et spatialement, un modulateur électro-optique (EOM) intégré et une fréquence de référence pour amplificateur de verrouillage. Le faisceau combiné est élargi par le télescope (L1 et L2), relayé par deux miroirs relais (M1 et M2) et soulevé par le périscope (P1 et P2), puis envoyé dans le scanner du microscope. Le faisceau combiné est scanné par l’unité de balayage (SU) dans le microscope et focalisé sur l’échantillon. La lumière transmise est recueillie par le condensateur. Un filtre enlèvera le faisceau de Stokes et laissera le faisceau de la pompe être détecté par la photodiode (PD). Les flèches pointillées grises montrent la connexion entre l’électronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Ill. 2 : La réduction de la signalisation de l’insuline chez C. elegans entraîne une augmentation du stockage des lipides. (A) En utilisant la microscopie SRS, les taux de lipides intestinaux des vers mutants de type sauvage et daf-2 sont quantifiés dans les jours 1, 3, 5, 7 et 9 de l’âge adulte. Chez les vers de type sauvage, les taux de lipides diminuent avec le temps, tandis que les mutants daf-2 accumulent des lipides jusqu’au jour 5 et ils ont environ 2,7 fois plus de lipides que les vers de type sauvage. (B) daf-16 suppression supprime les taux de lipides accrus dans les mutants daf-2. La restauration de l’expression de l’isoforme daf-16d/f/h dans daf-2; les doubles mutants daf-16 est suffisante pour augmenter les taux de lipides aux niveaux des mutants daf-2, tandis que la restauration de l’expression des isoformes daf-16a ou daf-16b n’est pas. *** p < 0,001, n.s. pas significative par ANOVA à sens unique avec le test de comparaisons multiples de Bonferroni. (C) Images SRS représentatives. Les pixels jaunes indiquent des taux de lipides plus élevés. La zone intestinale quantifiée est représentée en lignes pointillées. La barre d’échelle est de 40 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Pour se défendre contre l’obésité et ses troubles métaboliques associés, d’importants efforts de recherche ont été mis en œuvre pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de l’homéostasie lipidique. Pour la détection quantitative des molécules lipidiques dans les échantillons biologiques, l’imagerie sans étiquette par microscopie SRS s’est avérée être une alternative fiable aux tests biochimiques et à d’autres méthodes de coloration. Notre groupe et d’autres ont révélé de nouveaux mécanismes biologiques dans la régulation métabolique des lipides en combinant l’utilisation de C. elegans et de la microscopie SRS12,18,28,29,30,31. Dans ce protocole, utilisant la microscopie srs nous avons démontré que downregulating la signalisation d’insuline dans les vers mène à une augmentation des niveaux intestinaux totaux de lipide. Nous avons observé que commençant le jour 1 de l’âge adulte, les lipides s’accumulent dans l’intestin des mutants daf-2, qui ont la mutation de perte-de-fonction dans le gène de récepteur d’insuline, tandis que dans le sauvage-type les niveaux intestinaux de lipides de vers diminuent. En outre, compatible avec les études précédentes23,24,nous avons constaté que l’inactivation daf-16 peut supprimer complètement l’augmentation de stockage de lipide dans les mutants daf-2 et parmi les différentes isoformes daf-16, l’isoforme daf-16d/f/h régule spécifiquement l’homéostasie lipidique. Comme les études précédentes l’ont suggéré, la différence dans les niveaux de stockage des lipides intestinaux totaux chez les mutants daf-2 est probablement due à une combinaison de facteurs: augmentation de la synthèse lipidique de novo 32,diminution de l’utilisation des lipides33,ainsi qu’une reproduction réduite et une accumulation de jaune34. Les progrès récents dans les techniques cohérentes de spectroscopie Raman (SRS et CARS) aideraient à élucider davantage les mécanismes de la façon dont la signalisation de l’insuline contribue à la régulation de différents types de stockage de lipides dans des tissus distincts, y compris l’intestin, l’hypoderme et les ovocytes.

La microscopie SRS a été utilisée pour imager non seulement les lipides, mais aussi d’autres biomolécules, y compris l’ADN35,l’ARN14,les protéines13et le glucose36. Il a été mis en œuvre pour fournir des informations importantes sur de nombreux aspects de la biologie tels que la biologie cellulaire, la microbiologie, la biologie du cancer et la biologie du développement11. Plus récemment, l’utilisation de balises bioorthogonales (par exemple, les étiquettes d’alcyne et de deutérium), pour étiqueter au minimum les molécules d’intérêt, a encore amélioré la sensibilité et la spécificité de détection. Ces balises vibratoires minimales ne perturbent pas les propriétés chimiques de la molécule, mais fournissent un contraste chimique spécifique, car leur signal Raman se trouve dans la « fenêtre silencieuse » du spectre Raman14,37. En plus d’améliorer la sensibilité et la spécificité, la réalisation de l’imagerie SRS à super-résolution est également un domaine de recherche passionnant. Plusieurs groupes de recherche ont également des efforts pour minimiser la taille de l’équipement en créant un microscope SRS portatif38. Ainsi, l’application de l’imagerie SRS à la recherche biomédicale a ouvert de nouveaux sites pour des améliorations technologiques et chimiques afin de faire progresser l’imagerie lipidique.

Par rapport aux méthodes traditionnelles de quantification des lipides, la microscopie SRS présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il est effectué sans étiquette et même si une étiquette doit être utilisée, l’étiquette peut être aussi petite que deux atomes. Par conséquent, il ne souffre pas non plus du problème de photobleaching comme d’autres méthodes de marquage et de coloration fluorescentes. Deuxièmement, la capacité d’imagerie en direct utilisant des organismes entiers permet de suivre la dynamique de métabolites spécifiques29,39,40. Enfin, la microscopie SRS permet un degré plus élevé de multiplexage et peut donc être mise en œuvre pour imager simultanément plusieurs biomolécules dans des compartiments cellulaires distincts. La microscopie hyperspectrale SRS/CARS offre un grand avenir dans l’exploration de la dynamique métabolique de plusieurs biomolécules distinctes, ainsi que de différents types de compartiments de stockage des lipides tels que les particules jaunes dans C. elegans41 ou l’ester cholestéryle et les gouttelettes lipidiques riches en TAG dans différentes cellules et tissus de mammifères31. D’autre part, la microscopie SRS est confrontée à des limitations telles que le coût élevé du matériel et le manque de disponibilité commerciale complète. De plus, il nécessite une expertise pour maintenir et faire fonctionner le système, ce qui peut compliquer son adoption. L’évolution de l’intégration des sources lumineuses et des systèmes améliore la situation. La source laser à faible coût à base de fibres et les systèmes entièrement intégrés offrent de nouvelles opportunités de commercialisation et aideront à réduire le coût à l’avenir11,42,43. De plus, malgré les nouvelles approches technologiques visant à améliorer la vitesse d’imagerie et la résolution spatiale de l’imagerie SRS, la sensibilité de détection limitée pourrait continuer d’entraver la capacité de sonder les métabolites de faible abondance. Dans l’ensemble, l’utilisation de la microscopie SRS dans la recherche biomédicale a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. L’imagerie SRS bénéficiera également des améliorations technologiques en matière de sensibilité de détection, de résolution spatiale et de capacité de multiplexage, et, en fin de compte, élargira son utilisation dans la surveillance quantitative des biomolécules, en particulier des lipides.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), et par le chercheur HHMI (M.C.W.). Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center (CGC) pour les souches de C. elegans.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D converter Olympus Analog Unit
Agarose GeneMate 3119 For making agarose pads
Alignment tool - adapter Thorlabs SM1A4 For mounting the tool on scope
Alignment tool - target Thorlabs VRC2SM1 For viewing IR laser
Alignment tool - tube Thorlabs SM1L40 Length can vary
Autocorrelator (Optional) APE pulseCheck
Bandpass filter minicircuits BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope Nikon SMZ800 For handling and picking worms for imaging
Dodecane Sigma-Aldrich 44010 Used for calibration of the SRS signal
Filter Chroma Technology 890/220 CARS For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape VWR 89097 For making agarose pads
Glass coverslips VWR 48393-106 For covering worms for imaging
Glass microscope slide VWR 16004-422 For making agarose pads
Laser scanning microscope Olympus FV3000
Lens Thorlabs L1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B
For beam expander
Lock-in amplifier Zurich HF2LI
Lowpass filter minicircuits BLP-1.9+ For power supply noise suppression
Mirrors Thorlabs BB1-E03 For relay and periscope
Objective Olympus UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode Thorlabs FDS1010
Picosecond laser source APE picoEmerald
Power supply TEKPOWER TP1342U For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide Sigma S2002 For anaesthesizing the worms
Worm picker WormStuff 59-AWP

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References

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Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez <em>Caenorhabditis elegans</em> à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée
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Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).More

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).

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