Summary
자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.
Abstract
지질 대사는 세포 와 유기체 건강에 필요한 기본적인 생리 과정입니다. 지질 대사의 dysregulation는 수시로 심장 혈관 무질서, 타입 II 당뇨병 및 암을 포함하여 비만 및 많은 관련질병을 유도합니다. 지질 대사 조절의 현재 이해를 증진하기 위해, 시간과 공간에서 생체 지질 저장 수준을 정확하게 측정하는 정량적 방법은 점점 더 중요하고 유용해지고 있다. 지질 저장을 분석하는 전통적인 접근 방식은 현미경 평가를 위한 반정성 또는 생화학적 측정을 위한 spatio-측두성 정보 부족입니다. 자극된 라만 산란(SRS) 현미경 검사는 세포 외 분해능을 가진 살아있는 세포에서 지질을 신속하고 정량적 검출할 수 있는 라벨이 없는 화학 영상 기술입니다. 본질적인 분자 진동에서 대조가 악용됨에 따라 SRS 현미경 검사법은 살아있는 동물의 지질을 4차원 추적할 수 있습니다. 지난 10년 동안, SRS 현미경 검사는 생체 의학 연구에서 작은 분자 이미징에 널리 사용되었으며 기존의 형광 염색 및 지질 추출 방법의 주요 한계를 극복했습니다. 실험실에서, 우리는 강력한 모형 유기체, Caenorhabditis elegans에 유효한 유전 및 생화학 공구와 SRS 현미경 검사를 결합했습니다, 다른 세포및 조직에 걸쳐 지질 물방울의 분포 그리고 이질성을 조사하고 궁극적으로 지질 대사를 조절하는 새로운 보존된 신호 통로를 발견하기 위하여. 여기서, 우리는 SRS 현미경의 작업 원리및 상세한 설정을 제시하고 야생 형 및 인슐린 신호 결핍 돌연변이 C. elegans의뚜렷한 발달 시점에서 지질 저장을 정량화하는 데 사용하는 방법을 제공합니다.
Introduction
비만은 전 세계 인구의 3분의 1을 위협하는 글로벌 건강 문제가 되었으며, 당뇨병 2, 심혈관 질환3 및 일부 유형의암4를포함한 정신 건강1 및 치명적인 질병과의 연관성을 감안할 때 심각한 의학적 우려를 제시하고 있다. 지질 대사의 연구는 비만 뒤에 생물학 문제를 더 잘 이해하기 위하여 필수적입니다. 지질 저장의 신속하고 구체적인 정량화는 지방산및 그 유도체의 검출뿐만 아니라 스테롤 함유 대사산물의 검출을 수반하며, 높은 감도와 바람직하게는 공간 정보로 수반된다. 지질은 본질적인 형광이 부족하고 쉽게 형광 태그가 될 수 없기 때문에 이미지에 도전적인 표적입니다. 형광 태그는 종종 지질 분자보다 더 크므로 생체 응용 분야에서 화학적으로 침습적이고 비실용적 일 수 있습니다. 지질 분자의 소수성 구조를 보존하기 위해서는 라벨이 없거나 최소한의 라벨링 전략이 필요하다5. 이미징 기술의 최근 발전은 살아있는 세포, 조직 및 유기체에 있는 지질의 레이블 없는 화상 진찰을 위한 흥미진진한 기회를 만들었습니다.
생물학적 샘플에서 지질 저장 분석을 위한 전통적인 접근은 심포성 염료를 가진 생화학적인 분석 및 염색 프로토콜을 포함합니다. 질량 분석법(MS)을 포함하는 생화학적 정량화 분석법은 분자 재사용과 비교할 수 없지만, 매우 많은 샘플 양이 필요하며 샘플 준비는 보통 몇 시간이 걸리며, 생활 시스템의 실시간 이미징을 위한 적용을 제한합니다5. 이러한 분석의 또 다른 주요 제한은 공간 정보의 부족이다. 한편, 오일 레드 O와 수단 블랙과 같은 지질성 염료는 지질 저장 소기관의 조직 및 세포 분포를 제공하고 MS 기술에 비해 이러한 염색 방법도 비용이 낮고 수행하기 쉽습니다. 그러나, 이러한 염색 프로토콜은 지질 방울의 소수성 특성에 영향을 미칠 수 있는 고정을 필요로 하며, 그 구조에 인위적인 변화를 일으키고 실험6사이의 불일치를 초래한다. 생화학 및 염색 기술과 관련된 기술적 어려움은 지질 분자를 이미지화하고 지질 이미징에서 일관된 라만 산란 (CRS) 현미경 검사법의 사용이 급격히 증가하는 라벨없는 방법을 찾는 데 주도했습니다.
라만 효과는 라만과 크리슈난에 의해 처음 인식되었으며, 광자와 상호 작용할 때 분자는 파장의 변화없이 산란된 빛을 생성할 수 있다고 보고했습니다(레일리 산란이라고 함) 또는 파장의 변화는 분자7내의 기능성 화학 군의 특징이다. 분자 내의 화학 결합이 펌프 광자라고 불리는 사건 광자에 의해 더 높은 진동 에너지 레벨에 흥분하면 스토크스 광자라고 불리는 흩어진 광자의 에너지가 낮아집니다. 그렇지 않으면, 화학 결합은 원래 더 높은 수준에 있는 경우 낮은 진동 에너지 수준에 도달할 수 있고, 흩어져 있는 광자는 안티 스토크스 광자될 에너지를 얻는다. 인시던트와 흩어진 광자의 빈도 차이를 라만 시프트라고 합니다. 분자 내의 각 화학 결합은 특징적이고 정량화 가능한 라만 시프트를 갖는다. 예를 들어,CH2 결합은 지방산 사슬8이풍부한 2,845cm-1의 라만 시프트를 갖는다. 이 자발적인 라만 신호는 일반적으로 매우 약하며, 이는 기존의 자발적인 라만 현미경 검사법의 이미징 속도를 크게 제한합니다. 수년에 걸쳐, 자발적인 라만 현미경 검사법의 화상 진찰 속도 및 감도를 높이기 위하여 각종 접근이 개발되었습니다. 일관된 라만 산란 현미경 검사법은 일관된 안티 스토크스 라만 산란 (CARS) 현미경 검사법과 자극 라만 산란 (SRS) 현미경 검사를 포함하여, 가장 최근의 진행이다. CARS와 SRS는 약간 다른 작동 원리를 가지고 있지만, 둘 다 라이브 이미징 기능을 가진 라벨이 없는 기술이며, 지질 저장 역학에 대한 공간 및 시간 정보를 얻을 수 있으며 작은 샘플 크기만 필요합니다. CARS 현미경 검사는 다양한 비선형 공정에서 비롯된 비공명 배경으로 고통받고 있으며, CARS 신호는 또한 분자 농도와 비선형관계를 가지며, 이는 함께 정량화 공정9을복잡하게 한다. CARS 현미경 검사법과 달리 SRS 현미경 검사는 불공명 배경 신호를 생성하지 않으며 관심 분자의 농도에 선형 의존성을 제공합니다. 따라서, 현재 SRS 현미경 검사는 지질 이미징에 더 널리 사용된다.
SRS 현미경 검사법에서, 약한 자발적인 라만 신호는 화학 결합 진동 주파수와 일치하는 주파수 차이와 두 개의 동기화 된 레이저 빔에 의해 흥분 될 때 증폭 될 수있다. 분자는 일관된 흥분된 흥분으로 인해 흥분된 상태로의 향상된 전환을 경험하게 될 것입니다. 그 결과, 스토크스 광자 세대의 비율이 향상됩니다. 따라서, 전송된 "Stokes" 빔의 강도(자극라만 게인, SRG)와 전송된 "펌프" 빔의 강도가 감소합니다(라만 손실, SRL 자극). SRG 또는 SRL 신호의 검출은 특정 화학 결합을 가진 분자의 자극된 라만 산란(SRS) 현미경 이미징의기초가 10을기초로 한다. 두 레이저 빔 간의 주파수 차이가 관심 분자 내의 화학 결합의 진동 주파수와 일치하지 않으면 SRG 또는 SRL 신호가 생성되지 않습니다. SRS 현미경 검사법의 이미징 속도는 픽셀당 약 2 μsec 또는 프레임당 1초이며, 이는 자발적인 라만 현미경 검사법11보다훨씬 빠릅니다. SRS 현미경 검사법에 대한 일반적인 측면 해상도는 회절이 제한되고 약 300 nm입니다. 또한, SRS 현미경 검사법의 2광광 광학 공정은 상대적인 두꺼운 조직 샘플의 체피 3D 이미징을 허용하고 이미징 깊이는 300-500 μm에 도달 할 수 있습니다. 전반적으로, SRS 현미경 검사는 특정 생체 분자, 특히 지질을 검출하기 위하여 능률적인, 레이블없는 화상 진찰 기술을 제시합니다.
지질 방울은 트리아실글리세롤(TAGs) 및 콜레스테롤 에스테르(CEs)를 포함한 중성 지질의 주요 세포 저장 사이트인 단일 멤브레인 세포기관입니다. 이들 지질 분자의 지방산 사슬에 있는CH2 결합은8을흥분할 때 2,845cm-1에서 강한 SRS 신호를 생성하여, 따라서 온전한 세포, 조직 단면 및 전체 유기체 12,13,14,15에서저장 지질 수준의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 특히, C. elegans는 그들의 투명성 때문에 지질 화상 진찰 연구 결과에 유용합니다. 포유류와 마찬가지로, C. elegans는 지질 물방울에 지질을 저장하고 지질 분자의 합성 및 분해 경로는 매우보존된다 16. 이 프로토콜에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 작동 원리, 그것의 근본적인 설치를 제공하고 C. elegans에있는 지질 화상 진찰에 그것의 사용을 위한 방법을 설명할 것입니다.
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Protocol
1. 자극 라만 산란 현미경 검사법에 대한 악기 설정
참고: SRS 현미경 시스템은 펌프 통합 광학 파라메트릭 발진기와 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 피코초 레이저를 기반으로 구축됩니다. 발진기는 1,064 nm의 스토크스 빔과 700-990 nm 사이의 펌프 빔을 포함하여 두 개의 피코초 펄스 트레인을 제공합니다. 두 빔의 시간적 및 공간 중첩은 레이저 내부에서 달성된다. 내장된 전자 광학 변조기(EOM)는 SRS 현미경 검사를 위해 특별히 설계되었습니다. 이 프로토콜은 레이저를 현미경과 결합하는 데 초점을 맞추고 이 시스템의 일상적인작동(도 1). SRS 현미경 시스템의 구성은 지난 10 년 동안 진화하고 있습니다. 다음 설명은 여러 구성 중 하나만 나타낸다는 점에 유의해야 합니다.
- 현미경으로 레이저 빔을 공급
- 잠망경을 설정하여 피코초 광원 출구에서 현미경 스캐너의 IR 레이저 입력 포트로 빔을 들어 올립니다.
주의: 작동 전에 레이저 시스템 매뉴얼을 읽고 이 Class IV 레이저 시스템에서 생성된 근적외선이 눈과 피부에 심각한 해를 끼칠 수 있기 때문에 필요한 모든 예방 조치를 취하십시오. 기관 환경 안전 부서에서 요구하는 교육을 완료합니다. 보호용 고글과 실험실 코트에 커프스 슬리브를 착용하십시오. - 먼저 펌프 빔을 750nm로 설정하고 레이저 전력을 50mW로 낮추고, 이를 시각적으로 검사하여 정렬을 일치시합니다. 이어서, 빔 익스팬더(도1,L1 및 L2)를 사용하여 현미경 목표의 후면 조리개에 맞게 빔 직경을 조절한다. 2개의 릴레이거울(도 1,M1 및 M2)을 사용하여 레이저 빔을 잠망경(도1,P1 및 P2)으로 안내합니다. 잠망경은 빔을 스캐너 개구부 높이까지 들어 올리고 정렬을 위한 스티어링 미러역할을 합니다.
- 튜닝 범위의 중앙에 잠망경에 손잡이를 설정하고 레이저 빔이 거울의 중심에 닿는 것을 있도록 각 미러의 초기 위치와 각도를 대략 선택합니다.
- 목표 포탑의 빈 포트를 사용하여 거친 정렬을 수행하고 전력 계측기 프로브를 배치하여 전송된 빛의 힘을 측정합니다. 현미경의 스캐너를 가장 높은 줌(50x)으로 설정한 다음, 집중된 레이저 빔 스폿으로 전달된 빛의 힘을 측정합니다. 각 미러, M1 및 M2의 노브를 최적화하여 가장 높은 전송 레이저 전력을 구현합니다.
- 정렬 도구와 미세 정렬을 수행합니다. 빈 목표 좌석에 형광 목표 정렬 캡을 넣고 M1의 노브를 조정하여 그 자리를 중앙에 놓습니다. 그런 다음, 대상에 대한 확장 튜브를 소개하고 그 자리를 중심으로 M2의 노브를 조정합니다.
- 빔이 두 위치에서 대상을 중심으로 할 때까지 1.1.4 및 1.1.5 단계를 반복합니다.
- 잠망경을 설정하여 피코초 광원 출구에서 현미경 스캐너의 IR 레이저 입력 포트로 빔을 들어 올립니다.
- 탐지 및 전자 장치 연결
- SRS 감지 모듈을 설정합니다. 응축기 후 빔 스플리터 덩이줄기를 배치하여 송신된 레이저를 포토다이오드 모듈로 지시합니다. 모듈에는 광다이오드의 활성 영역에 맞게 빔 크기를 릴레이하고 변경하는 망원경뿐만 아니라 변조 된 스토크스 빔을 제거하고 펌프 빔이 강등될 수 있도록 하는 광학 필터가 포함되어 있습니다.
- 전자 연결설정(그림 1). 스토크스 빔의 강도는 피코초 튜닝 레이저 내부의 20MHz에서 내장된 EOM에 의해 변조됩니다. 레이저의 변조 주파수 출력은 강등을 위한 기준 주파수로서 잠금 증폭기내로 입력된다. SRL을 강등하기 위해 포토디오드의 출력 신호를 잠금 증폭기로 공급합니다.
참고: 원박스 레이저 시스템을 업그레이드할 수 있으므로 생산 날짜가 달라지므로 사양이 다를 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 pico초 튜닝 레이저 시스템의 이전 버전은 1,064 nm의 스토크스 빔을 가지고 있지만, 최근 버전은 1,031 nm의 스토크스 빔을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 EOM의 변조 주파수는 8MHz로 사용자 정의되지만 최근 시스템의 기본 변조 주파수는 10 또는 20 MHz일 수 있습니다. - 마지막으로, 잠금 증폭기 출력을 현미경의 아날로그 상자에 공급하여 전기 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환합니다. 시스템은 SRS 신호를 처리할 준비가 되어 있어야 합니다.
- 이미징 조건 최적화
- 시스템 정렬을 위한 화학 샘플을 만듭니다. 예를 들어, 도데케인은 C-H 결합으로부터 매우 강한 SRS 신호를 가지고 있기 때문에 현미경을 최적화하기 위해 dodecane을 사용합니다. 안전한 씰을 사용하여 미니 챔버를 만듭니다. 도데케인 5μL을 넣고 커버슬립으로 덮습니다.
참고: 불분명해 보이거나 이물질을 제시하면 도데케인 샘플을 2-3개월 동안 정렬하는 데 사용할 수 있는 새로운 샘플로 교체합니다. - 현미경 단계에 샘플을 놓습니다. 액체 물방울에 제대로 초점을 맞춥니다. 그것은 도데카인 패드의 가장자리를 찾아 서 더 빨리 수행 할 수 있습니다. 콜러 조명에 대한 응축기를 조정합니다.
- 이미징 매개 변수를 설정합니다. 지연 단계가 올바른 숫자에 있는지 확인합니다. 펌프 빔 파장을 795.8nm로 설정합니다. IR 센서 카드와 IR 뷰어를 사용하여 펌프 빔 경로가 여전히 올바른지 확인합니다.
- 펌프 빔의 힘을 200mW로 설정하고 스토크스 빔을 pico초 시스템 제어판에 400mW로 설정합니다.
참고: 레이저 출구에서 두 빔의 포스트 목표에 이르는 레이저 처리량은 펌프의 경우 약 25%, 이 시스템 설정을 위한 스토크스의 경우 14%입니다. 따라서 펌프 빔의 사후 객관적인 힘은 약 50mW이며 스토크스 빔의 경우 약 56mW입니다. 최근 피코초 레이저 시스템의 펄스 폭이 6ps에서 2 ps로 변경되므로 적용된 레이저 전력은 더욱 낮아야 합니다. - 잠금 증폭기 게인을 최대로 설정합니다. 레이저의 메인 셔터뿐만 아니라 빔 모두에 대한 셔터를 엽니 다.
- 샘플을 스캔하고 컴퓨터 화면에서 이미지를 확인합니다. 이미징 소프트웨어에서 디스플레이 모드를 Hi-Lo로 변경합니다. 범위를 조정하여 ~50% 채도를 확인합니다. 채도가 이미지의 중심인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 조향 거울인 M1 및 M2를 신중하게 조정하여 이미지 강도를 최대화하고 피크 강도를 중심으로 합니다.
- 지연 단계를 미세 조정하고 도데케인 샘플에서 최대 SRS 신호 강도를 찾습니다. 그런 다음 시스템을 사용할 준비가 되었습니다.
- 시스템 정렬을 위한 화학 샘플을 만듭니다. 예를 들어, 도데케인은 C-H 결합으로부터 매우 강한 SRS 신호를 가지고 있기 때문에 현미경을 최적화하기 위해 dodecane을 사용합니다. 안전한 씰을 사용하여 미니 챔버를 만듭니다. 도데케인 5μL을 넣고 커버슬립으로 덮습니다.
2. SRS 현미경 이미징을 위한 C. elegans 견본의 준비
참고: 모델 유기체로서, Caenorhabditis elegans는 다중 화상 진찰 기술에 매우 유용하다는 것을 입증되었습니다. 그들은 전신 투명, 따라서 다양 한 조직 해부에 대 한 필요 없이 그대로 동물에서 이미지 될 수 있습니다. C. elegans에서 중성 지질은 장 내 지질 에 위치한 지질 방울에 저장되며, 이는 장루멘(16)의주위에 바이대칭적으로 위치한 20개의 상피 세포로 구성된다. 피하 세포와 난모세포는 또한 지질을 저장합니다. C. elegans 지질 방울에 저장 지질의 주요 형태는 트리아실 글리세롤 (TAGs)17,그들의 지방산 사슬에 존재하는 CH2 결합의 풍부로 인해 강한 SRS 신호를 생성. 이 섹션은 SRS 현미경 이미징 및 총 장 지질 저장 수준의 정량화를 위해 C. elegans 샘플을 준비하는 방법에 초점을 맞출 것입니다.
- 이미징 슬라이드 준비
- 먼저, 증류된 H2O로 2% 아가로즈 용액을 준비하고 아가로즈 패드를 준비하기 전에 모든 아가로즈가 녹는지 확인하십시오.
- 두 층의 실험실 테이프가 있는 지지 슬라이드 사이에 배치되는 빈 슬라이드(약 100μL)에 따뜻한 2% 아가로즈 한 방울을 추가하고 첫 번째 슬라이드 위에 두 번째 슬라이드를 빠르게 놓습니다. 부드럽게 눌러 얇고 아가로즈 패드를 만듭니다.
- 이러한 슬라이드를 닫힌 위치에 따로 놓고 웜을 장착할 준비가 될 때까지 분리하지 마십시오. 패드가 1 일 후에 건조하기 때문에 각 이미징 세션 전에 신선한 슬라이드를 준비하십시오.
참고 : 고처리량 유전 화면에서 여러 웜을 이미징하는 경우 멀티 웰 이미징 챔버를사용합니다(18). 개발 및 노화를 통해 지질 대사의 스파티오 측두동역학을 이미지하기 위해 라이브 이미징 설정을 사용합니다19.
- 웜 장착
- M9 버퍼에 아지드 또는 레바미솔 나트륨을 각각 100mM MM 또는 1mM의 최종 농도로 추가하여 마취제를 준비한다.
참고: 유전 스크린 후에 유전화를 위한 화상 진찰 후에 벌레를 복구해야 하는 경우에 levamisole를 사용하십시오.
주의: 아지데 나트륨과 레바미솔을 포함한 여러 마취제는 흡입시 유해합니다. 보호 장갑과 의류를 착용하고 작업 솔루션을 준비할 때 화학 연기 후드를 사용하십시오. - 마취제 한 방울을 커버슬립(10-20개의 웜의 경우 약 4-5 μL)에 놓습니다.
참고: 웜 수에 따라 마취제의 양을 조정하여 웜을 가능한 한 가깝게 유지합니다. 몇 벌레에 너무 많은 액체를 사용하면 벌레가 아가로즈 패드에 퍼질 수 있습니다. - 해부 현미경 검사에서 이미지할 웜을 선택하고 마취제 액적으로 옮기습니다. 모든 웜이 물방울에 추가된 후 웜 피커를 사용하여 주위를 이동하고 서로 겹치지 않도록 합니다.
- 아가로즈 패드를 어지럼주지 않고 유리 슬라이드(2.1단계에서)를 분리합니다.
- 아가로즈 패드가 있는 유리 슬라이드로 벌레 방울을 덮습니다. 아가로즈 패드가 벌레를 향하고 있는지 확인하십시오. 또는, 마취 노화 액적또한 아가로즈 패드에 첨가될 수 있으며 벌레는 커버슬립으로 덮을 수 있다.
- 마지막으로 유리 슬라이드의 영구 마커를 사용하여 웜의 위치를 표시합니다.
- M9 버퍼에 아지드 또는 레바미솔 나트륨을 각각 100mM MM 또는 1mM의 최종 농도로 추가하여 마취제를 준비한다.
3. 이미지 수집 및 분석
- SRS 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다.
- 어떤 견본든지를 이미징하기 전에, 화상 진찰 매개 변수를 결정하고 SRS 신호를 확인합니다 (프로토콜 1에서 설명된 대로).
- 슬라이드를 장착하여 커버슬립이 목표 렌즈를 향합니다. 밝은 필드 광원을 켜고 접안으로 이동하여 웜을 찾습니다.
참고: 20배의 객관적인 렌즈를 사용하여 창자 전체의 지질 저장 공간을 이미지화합니다. 60x 목표 렌즈를 사용하여 피하 지방 저장을 이미지화하거나 지질 방울 크기/번호를 정량화하는 것이 좋습니다. - 웜을 초점으로 가져오고 그에 따라 응축기 위치를 조정합니다.
- 밝은 필드 광원을 끄고 레이저 스캐닝 장치로 전환합니다. 빠른 검색 속도(예: 512 x 512 픽셀)로 첫 번째 웜 을 스캔하고 미세 한 초점을 조정하여 관심 영역을 찾습니다. 첫 번째 샘플을 이미지화하려면 레이저 힘을 SRS 신호가 포화되지 않은 수준으로 조정합니다.
- SRS 이미지를 얻기 위해 느린 스캔 속도(예: 2 μs/픽셀)와 더 높은 해상도(예: 1024 x 1024 픽셀)로 전환합니다.
참고: 이미징 세션 중에 모든 샘플을 이미지화할 레이저 전원을 일정하게 유지합니다. - SRS 이미지를 원하는 형식으로 저장하여 고해상도(예: .tiff 파일)를 가능하게 합니다. 사용된 이미징 소프트웨어 및 설정에 따라 다음 웜으로 이동하기 전에 첫 번째 웜의 위치를 저장합니다.
- 슬라이드에 장착된 모든 웜의 완전한 이미징. 셔터를 끄고 레이저 빔을 차단합니다. 모든 샘플이 이미지화될 때까지 레이저 소스를 끄지 마십시오.
- 다음 샘플 슬라이드를 배치하기 전에 슬라이드를 제거합니다. 3.1.2-3.1.7 단계를 반복합니다.
- 모든 샘플이 이미지화되면 레이저 소스를 대기 중으로 배치하고 증폭기, 검출기, 현미경 및 컴퓨터를 포함한 관련 장비를 끕니다.
- ImageJ를 이용한 이미지 분석
- 이미지를 열고(일반적으로 .tiff)을 열어 ImageJ에서 정량화할 수 있도록 파일을 선택하고 ImageJ 창으로 드래그하여 삭제합니다. 특정 올림푸스 현미경 형식(예: .oib 파일)을 사용하는 경우 적절한 ImageJ 플러그인을 다운로드합니다.
- 분석할 속성을 선택합니다(측정 >분석). 총 지질 저장 수량의 경우 영역, 최소 및 최대 회색 값 및 평균 회색 값을 선택합니다.
- 다각형 선택 도구를 사용하고 정량화할 웜 장의 영역을 간략하게 설명합니다. 3.2.2 단계에서 선택한 매개 변수를 측정하려면 측정 > 분석하십시오. 측정 결과가 있는 새 창이 팝업됩니다. 열려 있는 모든 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 지정된 유전자형의 모든 웜에 대한 측정값을 선택하고 결과를 새 스프레드시트에 복사/붙여넣습니다. 동일한 이미징 세션의 모든 유전자형에 대해 3.2.1-3.2.4 단계를 반복합니다.
- SRS 신호가 없는 웜 부근의 영역을 선택하여 배경으로 정량화합니다. 배경 측정을 위해 선택한 영역에 SRS 신호를 줄 수 있는 박테리아나 이물질이 포함되어 있지 않은지 확인합니다.
- 각 개별 웜의 측정에서 배경 평균 회색 값을 뺍니다. 지정된 유전자형/테스트 그룹의 모든 웜에서 평균 회색 값을 빼낸 배경의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 이 값을 대조군의 평균으로 정규화합니다.
- 마지막으로, 각 웜의 지질 수준에 대한 측정값으로서 평균 회색 값을 사용하여 적절한 통계 분석을 수행한다. 일반적으로 두 그룹에 대해 학생의 t-test를 사용하고 두 개 이상의 그룹에 적합한 다중 비교 테스트와 함께 단방향 ANOVA를 사용합니다.
참고: 그림 프레젠테이션을 위해 이미지를 선택할 때 선택한 이미지가 픽셀 강도 분포가 동일한지 확인합니다. 동일한 그림의 모든 이미지에 대해 밝기와 대비를 동일한 값으로설정합니다(이미지 > > 밝기 및 대비 조정).
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Representative Results
인슐린 신호는 발달, 재생산, 수명 및 신진 대사에 영향을 미치는 중요한 내분비 통로입니다. 웜에서, 인슐린 신호는 약 40인슐린 같은 펩티드 리간드, 인슐린 과 같은 성장 인자 수용체 정형돌로그 DAF-2, 다운스트림 PI3K/AKT 키나아제 캐스케이드, 및 FoxO 전사 인자 직교인, DAF-1620으로구성된다. daf-2 돌연변이체는 인슐린 수용체가 결여되어 장내 지질 방울이 더 많고, 벌레 지질 저장조직(21,22)이있다. SRS 현미경 검사를 사용하여, 우리는 성인기 도중 나이 동기화된 야생 형 벌레 및 daf-2 돌연변이에 있는 장 지질 수준을 정량화했습니다. 이전 결과와 일치, 우리는 daf-2 돌연변이가 더 높은 지질 수준을 가지고 있음을 발견23,24 (그림 2A). 성인9일째(그림2A)까지1일부터 야생형 벌레의 지질 수치가 감소하는 것을 관찰했습니다. 그러나, daf-2 돌연변이체의 지질 수준은 5일 전까지 증가했고, 야생형(그림2A)보다2.5~3.0배 높은 수준 주위가 일정하였다.
DAF-16, C. elegans FoxO 전사 인자 직교, 인슐린 신호 경로의 다운 스트림 기능의 대부분을 조율. daf-16 null 돌연변이는 지방 축적을 포함하여 daf-2 돌연변이체에서 관찰된 몇몇 표현형을 억제합니다. daf-16 게놈 궤적 8 가지 성적 증명서(daf-16a-h)에대 한 인코딩, 대안 전사 시작 사이트에 의해 생성 되는, 또는 대체 접합20. 그 중, daf-16a, daf-16b 및 daf-16d/f/h는 가장 풍부한 성적 증명서이며 다른 N 테르미니단백질을 위해 인코딩합니다. 동종포형 특이적 돌연변이 및 트랜스게놈을 가진 연구는 DAF-16A 및 DAF-16D/F/H 동소형태가 dauer 발달 및수명을조절하는반면,DAF-16B는 dauer formation26동안 인두 리모델링에 중요하다는 것을 시사한다. 이 연구에서는 SRS 현미경 검사를 사용하여 장 지질 저장을 조절하는 DAF-16의 동소형 특이성을 조사했습니다. 우리는 daf-16 비활성화 daf-2 돌연변이체(도 2B, C)의지질 수준의 증가를 억제한다는 것을 발견했습니다. daf-16a 또는 daf-16b 이소폼을 daf-2에서 표현; daf-16 이중 돌연변이체는 지질 수준을 복원하지 않습니다. 그러나, daf-16d/f/h 이소폼의 발현은 daf-2; daf-16에서 관찰된 수준으로 지질 수준을 회복하기에 충분하다(도2B,C). 이러한 결과는 특히 DAF-16D/F/H 이소폼이 daf-2 돌연변이 벌레의 지질 대사를 조절한다는 것을 밝혔습니다. 이는 또한 DAF-16D/F/H27의전사 활동을 통해 지질 저장의 후각 조절이 중재되는 것으로 나타난 최근의 연구 결과와 일치한다.
그림 1: SRS 현미경 시스템의 그림입니다. 올인원 레이저는 시간적, 공간적으로 결합된 펌프와 스토크스 빔, 내장된 전자광학 변조기(EOM) 및 잠금 증폭기의 기준 주파수를 제공합니다. 결합된 빔은 망원경(L1 및 L2)에 의해 확장되고, 두 개의 릴레이 거울(M1 및 M2)에 의해 릴레이되고 잠망경(P1 및 P2)에 의해 들어올린 다음 현미경스캐너로 전송된다. 결합된 광선은 현미경의 스캐닝 유닛(SU)에 의해 스캔되고 시료에 집중한다. 응축기에 의해 전달된 빛이 수집됩니다. 필터는 스토크스 빔을 제거하고 포토다이오드 (PD)에 의해 감지 될 펌프 빔을 둡니다. 회색 파선 화살표는 전자 제품 간의 연결을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: C. elegans에서 감소된 인슐린 신호는 증가된 지질 저장으로 이끌어 냅니다. (A)SRS 현미경을 사용하여, 야생형 및 daf-2 돌연변이벌레의 장지질 수준을 사용하여 성년1일, 3, 5, 7 및 9일째에 정량화된다. 야생 형 벌레에서, 지질 수준은 시간이 지남에 따라 감소, daf-2 돌연변이는 5 일까지 지질을 축적하고 야생 형 벌레에 비해 약 2.7 배 더 많은 지질을 가지고. (B) daf-16 삭제는 daf-2 돌연변이체에서 증가된 지질 수준을 억제합니다. daf-16d/f/h 이소폼을 daf-2에서 복원하는 반면, daf-16a 또는 daf-16b 등형의 표현을 복원하는 < 것은 아니며, 0.001, n.s.s. (C)대표 SRS 이미지. 노란색 픽셀은 더 높은 지질 수준을 나타냅니다. 정량화된 장 영역은 파선선으로 표시됩니다. 스케일 바는 40 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
비만과 그 관련 신진 대사 무질서에 대하여 방어에서, 지질 항상성의 규정 기계장치를 더 잘 이해하기 위하여 중요한 연구 노력이 실행되었습니다. 생물학적 샘플에서 지질 분자의 정량적 검출을 위해 SRS 현미경 검사법에 의한 라벨 없는 이미징은 생화학 적 분석 및 기타 염색 방법에 대한 신뢰할 수있는 대안으로 입증되었습니다. 우리 그룹 및 다른 사람들은 C. elegans 및 SRS 현미경검사12,18, 28,29,30,31의사용을 결합하여 지질 대사 조절에 새로운 생물학적메커니즘을공개했다. 이 프로토콜에서, SRS 현미경 검사를 사용하여 우리는 벌레에 있는 인슐린 신호가 총 장 지질 수준에 있는 증가로 이끌어 내는 것을 보여주었습니다. 우리는 성인의 시작 일 1, 지질은 인슐린 수용체 유전자에 있는 기능의 손실 돌연변이가 있는 daf-2 돌연변이의 창자에 축적되는 것을 관찰했습니다, 반면 야생 형 벌레장 지질 수준은 쇠퇴합니다. 또한, 이전 연구 와 일치23,24,우리는 daf-16 비활성화 완전히 daf-2 돌연변이체의 지질 저장 증가를 억제 할 수 있음을 발견하고 다른 daf-16 isoforms 중, daf-16d / f / h 이소형은 특히 지질 항상성을 조절. 이전 연구에서 알 수 있듯이, daf-2 돌연변이체의 총 장지질 저장 수치의 차이는 요인의 조합으로 인해 발생할 가능성이 높습니다: 드 노보 지질 합성32,지질 활용감소33,감소된 번식, 노른자 축적34. 일관된 라만 분광법 기술 (SRS 및 CARS)의 최근 발전은 인슐린 신호가 장, 피질 및 난모를 포함하여 다른 조직에서 다른 지질 저장 유형의 조절에 기여하는 방법의 메커니즘을 더욱 해명하는 데 도움이 될 것입니다.
SRS 현미경 검사는 지질뿐만 아니라 DNA 35, RNA14, 단백질(13),포도당(36)을포함한 다른 생체 분자를 이미지에도 활용되고 있다. 세포 생물학, 미생물학, 암 생물학 및 발달 생물학11과같은 생물학의 많은 양상에 중요한 통찰력을 제공하기 위해 구현되었습니다. 최근에는 바이오오르코날 태그(예: 알키네 및 중수소 태그)를 사용하여 관심 분자에 최소한의 라벨을 부착하여 검출 감도 및 특이성을 더욱 강화했습니다. 이러한 최소한의 진동 태그는 분자의 화학적 특성을 방해하지 않지만 라만 신호가 라만 스펙트럼14,37의"자동 창"내에 있기 때문에 특정 화학 적 대비를 제공한다. 감도와 특이성을 개선하는 것 외에도 초해상도 SRS 이미징을 달성하는 것도 흥미로운 연구 분야입니다. 몇몇 연구단은 또한 휴대용 SRS 현미경38을만들어 장비 크기를 최소화하는 노력을 하고 있습니다. 따라서, 생물 의학 연구에 SRS 이미징의 응용 프로그램은 지질 이미징을 진행하기 위해 기술 및 화학 개선을위한 새로운 장소를 열었습니다.
지질 수량의 전통적인 방법에 비해, SRS 현미경 검사법은 몇 가지 장점이 있습니다. 우선, 라벨이 없는 방식으로 수행되며 라벨을 사용해야 하는 경우에도 라벨은 두 원자만큼 작을 수 있습니다. 따라서, 또한 다른 형광 태깅 및 염색 방법으로 광표백 문제로 고통받지 않습니다. 둘째, 전체 유기체를 이용한 라이브 이미징의 기능을 통해 특정 대사산물29,39,40의역학을 추적할 수 있다. 마지막으로, SRS 현미경 검사는 멀티플렉싱의 높은 정도를 허용하고 그러므로 별개의 세포 구획에 있는 다중 생체 분자를 동시에 심상에 구현할 수 있습니다. 하이퍼스펙트럼 SRS/CARS 현미경검사는 여러 개의 뚜렷한 생체 분자의 대사 역학뿐만 아니라 C. elegans41 또는 콜레스테릴 에스테르 및 태그가 풍부한 지질 방울과 같은 다양한 유형의 지질 저장 구획을 탐구하는 데 있어 큰 미래를 보유하고 있습니다31. 한편, SRS 현미경 검사는 하드웨어의 높은 비용과 완전한 상업적 가용성의 부족과 같은 한계에 직면하고 있습니다. 또한 시스템을 유지하고 실행하려면 전문 지식이 필요하며, 이로 인해 채택이 복잡해질 수 있습니다. 광원과 시스템 통합의 발전은 상황을 개선하고 있습니다. 섬유 기반 저비용 레이저 소스와 완전 통합 시스템은 상용화에 새로운 기회를 제공하고 향후11,42,43의비용을 절감하는 데 도움이 될 것입니다. 또한, SRS 이미징의 이미징 속도 및 공간 적 해상도를 개선하기 위한 새로운 기술적 접근법에도 불구하고 제한된 검출 감도는 낮은 풍부의 대사 산물을 조사하는 기능을 계속 방해할 수 있습니다. 전반적으로, 생물 의학 연구에서 SRS 현미경 검사법의 사용은 지난 10 년 동안 엄청나게 성장했습니다. SRS 이미징은 검출 감도, 공간 해상도 및 멀티플렉스 기능의 기술적 개선의 이점을 더욱 활용하고 궁극적으로 생체 분자, 특히 지질의 정량적 모니터링에서 사용을 확장할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W에 의해 지원되었다.), DP1DK113644 (M.C.W.), 디임스 재단 (M.C.W.), 웰치 재단 (M.C.W.), HHMI 조사관 (M.C.W.). 우리는 C. elegans 균주에 대한 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool - adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool - target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool - tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
- Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
- Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
- Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
- Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
- Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
- Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
- Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
- Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
- Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
- Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
- Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
- Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
- Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
- Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
- Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
- Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
- Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
- Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
- Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
- Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
- Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
- Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
- Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
- Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
- Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
- Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).
