Summary
Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.
Abstract
De Drosophila melanogaster mannelijke embryonale gonade is een voordelig model om verschillende aspecten van ontwikkelingsbiologie te bestuderen, waaronder, maar niet beperkt tot, kiemcelontwikkeling, piRNA-biologie en nichevorming. Hier presenteren we een dissectietechniek om de gonade ex vivo live in beeld te brengen tijdens een periode waarin in vivo live-imaging zeer ineffectief is. Dit protocol schetst hoe embryo's naar een beeldvormingsschaal kunnen worden overgebracht, de juiste geënsceneerde mannelijke embryo's kunnen worden gekozen en de geslachtsklier uit het omliggende weefsel kan worden ontleed met behoud van de structurele integriteit. Na dissectie kunnen geslachtsklieren worden afgebeeld met behulp van een confocale microscoop om dynamische cellulaire processen te visualiseren. De dissectieprocedure vereist een nauwkeurige timing en behendigheid, maar we geven inzicht in hoe veelvoorkomende fouten kunnen worden voorkomen en hoe deze uitdagingen kunnen worden overwonnen. Voor zover wij weten is dit het eerste dissectieprotocol voor de Drosophila embryonale gonade en zal live-imaging mogelijk maken tijdens een anders ontoegankelijk tijdsvenster. Deze techniek kan worden gecombineerd met farmacologische of celtype specifieke transgene manipulaties om dynamische processen te bestuderen die zich voordoen in of tussen de cellen in hun natuurlijke gonadale omgeving.
Introduction
De Drosophila melanogaster testis heeft gediend als een paradigma voor ons begrip van vele dynamische cellulaire processen. Studies van dit model hebben lichtgeworpen op stamceldelingsregulatie 1,2,3, kiemcelontwikkeling 4,5, piRNA-biologie 6,7,8 en niche-stamcelsignaleringsgebeurtenissen 9,10,11,12,13. Dit model is voordelig omdat het genetisch handelbaar is14,15 en een van de weinige is waar we stamcellen in hun natuurlijke omgeving kunnen live-imagen 3,16,17,18. Live-imaging van dit model is echter beperkt tot volwassen weefsel en vroege embryonale stadia, waardoor er een gat is in onze kennis van gonadale dynamiek in het late embryo, het precieze stadium waarin de niche zich voor het eerst vormt en begint te functioneren.
De embryonale gonade in een laat stadium is een bol, bestaande uit somatische nichecellen aan de voorzijde en geslachtscellen die door somatische gonadale cellen in meer achterste regio's worden geënt19. Dit orgaan kan live in vivo worden afgebeeld tot vroeg embryonaal stadium 17 17,20,21. Verdere beeldvorming wordt voorkomen door het initiëren van grootschalige spiercontracties. Deze weeën zijn zo ernstig dat ze de gonade uit het beeldvormingsframe duwen en een dergelijke beweging kan niet worden gecorrigeerd met beeldvormingssoftware. Ons lab is geïnteresseerd in het onthullen van de mechanismen van nichevorming, die plaatsvindt tijdens deze ongrijpbare periode voor live-imaging. Daarom hebben we een ex vivo benadering gegenereerd om de gonade levend in beeld te brengen vanaf embryonale fase 16, waardoor de studie van de celdynamiek tijdens deze cruciale periode van gonadeontwikkeling wordt vergemakkelijkt. Eerder werk uit ons laboratorium toont aan dat deze ex vivo beeldvorming de ontwikkeling van in vivo gonaden17 getrouw weergeeft. Deze techniek is de eerste en enige in zijn soort voor de Drosophila embryonale geslachtsklier.
Hier presenteren we het dissectieprotocol dat nodig is voor ex vivo live-beeldvorming van de gonade tijdens late embryonale stadia. Dit protocol kan worden gecombineerd met farmacologische behandelingen of transgene manipulatie van specifieke cellijnen in de gonade. Met behulp van deze techniek hebben we met succes de stappen van stamcelnichevorming17 in beeld gebracht. Deze beeldvormingsbenadering is dus instrumenteel voor het gebied van stamcelbiologie, omdat het visualisatie van de beginfasen van nichevorming in realtime binnen zijn natuurlijke omgeving mogelijk maakt15,17. Hoewel deze methode gunstig is voor het gebied van stamcelbiologie, is het ook van toepassing op het visualiseren van dynamische processen die zich tijdens dit ontwikkelingstijdpunt in de gonade voordoen, inclusief cellulaire herschikkingen22, celadhesie 2,12,23 en celmigratie23. Dit dissectieprotocol zal dus ons begrip van vele fundamentele celbiologische processen vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dag-voor-dissectie voorbereiding
- Slijp een wolfraamnaald24 elektrolytisch zodat de resulterende diameter ongeveer 0,03 mm is. Stel de geleverde spanning in op ongeveer 14 V en gebruik 3,3 M NaOH. Slijpen mag niet langer dan 1 of 2 minuten duren.
LET OP: NaOH is zeer corrosief en zal brandwonden veroorzaken bij contact met de huid. Draag handschoenen en een bril tijdens het hanteren en werk in een zuurkast.
OPMERKING: Bewaar NaOH na gebruik in een polypropyleen Falcon-buis. - Maak de voorbereide beeldvormende media. Combineer in een conische buis van 15 ml 4,25 ml Schneider's media met 750 μl foetaal runderserum (FBS, 15% eindconcentratie) en 27,5 μl penicilline-streptomycine (0,05 E / μl penicilline, 0,05 μg / μl eindconcentratie). Bewaar dit voorbereide beeldmedium bij 4 °C.
- Maak heptaan-lijmoplossing. Voeg ongeveer 0,5 ml heptaan toe aan een afsluitbare injectieflacon van 20 ml gevuld met ongeveer 20 cm dubbelzijdige tape. Rock ongeveer een uur op een nutator of roer met een pipetpunt totdat een consistentie tussen die van water en glycerol is bereikt. Deze oplossing van opgeloste lijm duurt enkele dagen voordat het heptaan verdampt. Om de oplossing op te frissen, voegt u een extra 0,5 ml heptaan toe en rockt u.
OPMERKING: Een effectieve heptaan-lijmoplossing kan worden bereid met behulp van verschillende verhoudingen van heptaan tot tape, evenals verschillende duur van schommelen / roeren. De bovenstaande specificaties zijn slechts suggesties voor het bereiden of opfrissen van een dergelijke adequate oplossing.
2. Embryoverzameling — 15-17 uur vóór dissectie
- Voeg verse gistpasta toe aan een appelsap agar bord25. Stel een embryo verzamelkooi in door volwassen vliegen (minder dan 10 dagen oud) toe te voegen aan een lege voedselfles, geperforeerd met kleine gaatjes26. Dek de opvangkooi af met de gegiste agarplaat, vastgeplakt aan de fles, en plaats de kooi met de plaat naar beneden gedurende 1 uur in een donkere incubator van 25 °C.
OPMERKING: De vliegen moeten een transgen tot expressie brengen dat de gonade fluorescerend markeert, bijvoorbeeld six4-eGFP::Moesin20, omdat dissectie van embryo's zal plaatsvinden onder een stereo-fluorescerende microscoop. Zie Tabel met materialen voor een lijst van genotypen die worden gebruikt om de geslachtsklier te markeren. - Haal de kooi uit de couveuse en gooi deze eerste verzameling weg. Vervang het door een vers gegiste agarplaat en plaats de kooi gedurende 2 uur terug in de couveuse.
OPMERKING: De eerste embryoverzameling wordt gebruikt om vrouwtjes te ontdoen van bevruchte, zich ontwikkelende embryo's, om een strak getimede tweede verzameling embryo's te bereiken. - Verwijder de agarplaat uit de kooi en plaats deze (met de gegiste kant naar boven gericht) op een vochtige papieren handdoek in een afsluitbare plastic container. Plaats deze vochtige kamer in een incubator van 25 °C om de embryo's gedurende 14,5 uur te laten rijpen (laatste leeftijden, 14,5-16,5 uur na het leggen van de eieren).
OPMERKING: Voer onmiddellijk voordat u begint met stap 2.4 stap 3.1 en 3.2 uit. - Haal de agarplaat uit de couveuse en voeg met een spuitfles voldoende water toe aan de agarplaat om de gistpasta op te lossen door lichtjes te borstelen met een verfkwast. Spoel de embryo's en opgeloste gist in een kleine gaaszeefmand die in een weegboot zit. Spoel de mand af met de waterspuitfles tot de meeste gistpasta door het gaas is gefilterd.
- Haal het water uit de weegboot en plaats de mand er weer in. Dechorioneer de embryo's door ze onder te dompelen in een 50% bleekoplossing, met behulp van een spuitfles. De bleekoplossing moet een diepte van 3-5 mm hebben. Houd de embryo's ondergedompeld in bleekmiddel gedurende ~ 2 minuten, met af en toe wervelen.
LET OP: Bleekmiddel is corrosief en kan de ogen en de luchtwegen irriteren of beschadigen. Draag handschoenen en een bril tijdens het hanteren van bleekmiddel.
OPMERKING: Voltooi gedurende deze tijd zoveel mogelijk van stap 3.3. De voortgang van de dechorionatie kan worden gecontroleerd door de mand onder een stereomicroscoop te plaatsen en te controleren op de afwezigheid van de dorsale aanhangsels. Dompel de embryo's indien nodig extra tijd onder in de bleekoplossing. - Gooi het bleekmiddel weg en spoel de embryo's in de mand grondig af met water uit een spuitfles (gedurende ~ 3 s, deeg de gaasmand met papieren handdoeken; herhaal dit 2-3 keer).
3. Bereiding van de dag van de dissectie
- Voeg 30 μL insuline (10 mg/ml) toe aan 1.500 μL bereide beeldvormingsmedia (zie stap 1.2) in een Eppendorf-buis van 1,5 ml (eindconcentratie van 0,2 mg/ml). Meng goed en laat de tube op de tafel zitten om op kamertemperatuur te balanceren.
- Bereid coverslip strips gecoat met lijm.
- Gebruik een diamantgepunt mes om een afdeksel van 22 mm x 22 mm in vier, even grote stroken te snijden (figuur 1A).
- Gebruik een tang om één strip op te pakken en verspreid in totaal ongeveer 30 μL heptaanlijmoplossing over beide zijden van de strip (figuur 1B). Om een gelijkmatige laag lijmresten te bereiken, kantelt u de strip onder verschillende hoeken terwijl het heptaan verdampt.
- Bewaar de met lijm bedekte strip in een lege sleuf van een coverslip-doos; om de kleverigheid te behouden, plaatst u de strip in een schuine, maar rechtopstaande positie, leunend tegen de randen van de doos om contact met doosoppervlakken te minimaliseren (figuur 1C). Sluit de doos zodat deeltjes in de lucht de lijm niet bedekken en de kleverigheid ervan verminderen.
- Plaats de volgende items op het tafelblad: een 6-inch glazen Pasteur-pipet, een microscoopglaasje, een P200- en een P1000-pipet met de juiste pipetpunten, Ringer's oplossing27 (pH aangepast tot 7,3 met NaOH) en een onbedekte, poly-D-lysine-gecoate 35 mm beeldvormingsschaal.
- Breng embryo's over van de gaaszeefmand naar een klein horlogeglas gevuld met 500-750 μL heptaan.
- Dep de zijkanten en onderkant van de mand droog met een doekje. Bevochtig een penseel in het heptaan, raak de kwast aan op de embryo's (het hydrofobe vitelline-membraan moet zich aan de borstelharen hechten) en dompel de penseel terug in het heptaan in het horlogeglas (embryo's moeten naar de bodem zinken).
OPMERKING: De volgende stappen moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd om te voorkomen dat de embryo's uitdrogen. Embryo's mogen niet langer dan 20 s aan lucht worden blootgesteld.
- Dep de zijkanten en onderkant van de mand droog met een doekje. Bevochtig een penseel in het heptaan, raak de kwast aan op de embryo's (het hydrofobe vitelline-membraan moet zich aan de borstelharen hechten) en dompel de penseel terug in het heptaan in het horlogeglas (embryo's moeten naar de bodem zinken).
- Breng de embryo's over op het microscoopglaasje met behulp van een Pasteur-pipet (figuur 1D). Trek embryo's langzaam in de pipet en beperk ze tot het smalle deel van de pipet. Pipetteer embryo's langzaam op de dia, zodat ze net binnen de punt van de pipet aggregeren voordat ze op de glijbaan stromen. Draai de hoek van een doekje in een fijne punt en verwijder heptaan van embryo's op de dia. Ze aggregeren en bedekken een kleiner gebied, waardoor het gemakkelijker wordt om ze in de volgende stap op een met lijm bedekte strip vast te leggen.
- Pak met een tang een met lijm bedekte strip op en raak deze voorzichtig aan de embryo's aan (figuur 1E). Plaats de strip in de beeldvormingsschaal, embryo side-up, en net buiten het Poly-D-Lysine-gecoate centrum. Druk de strip met een tang op de schaal om ervoor te zorgen dat deze op zijn plaats is bevestigd. Overspoel de schaal onmiddellijk met 2-3,5 ml Ringer's oplossing; Dompel de embryo's eerst onder om te voorkomen dat ze uitdrogen (figuur 1F).
4. Dissectie
OPMERKING: Deze stappen moeten worden uitgevoerd onder een stereo-fluorescerende microscoop.
- Devitellinize 10-15 embryo's.
OPMERKING: Dit kan variëren van twee embryo's, voor beginners, tot vijftien embryo's, voor experts.- Selecteer stadium 16-embryo's op basis van darmmorfologie (figuur 2). In dit stadium hebben embryo's drie darmvernauwingen die vier gestapelde darmsegmenten creëren (figuur 2B, B '). Om de devitellinisatie te starten, doorboort u het geselecteerde embryo aan het ene uiteinde, bij voorkeur het voorste, met de wolfraamnaald. Het embryo kan uit zijn vitelline-membraan springen, maar zo niet, pel het membraan van het embryo af.
OPMERKING: Embryo's die te jong zijn om te ontleden, hebben niet-geregionaliseerde ingewanden (figuur 2C). Dissectie van stadium 17-embryo's is mogelijk, maar uitdagender dan dissectie van stadium 16-embryo's omdat de cuticula zich in dit stadium begint te ontwikkelen. Early Stage 17 embryo's presenteren zich met vier darmsegmenten die ten opzichte van elkaar zijn verschoven (figuur 2D,D'). - Haak de naald door het embryo in een gebied ver van de geslachtsklieren. Breng het gehaakte embryo over naar het met poly-lysine bedekte gebied van de schaal (vanaf hier eenvoudigweg "afdekslip" genoemd) en sleep het tegen de bodem totdat het zich hecht. Herhaal deze stappen en schik gedevitelliniseerde embryo's op een rij langs de bovenkant van de poly-lysine-gecoate afdekslip (figuur 3A), waardoor er voldoende ruimte onderblijft voor verdere dissectie.
OPMERKING: De geslachtsklieren verschijnen als kleine bolvormige aggregaten van cellen die helder moeten fluoresceren, afhankelijk van de specifieke gebruikte marker en het transgene kopienummer. In dit stadium bevinden de geslachtsklieren zich zijdelings in segment A5, op ongeveer 70% -80% van de embryolengte van de voorste. Gedurende het dissectieprotocol kan het weefsel aan de naald blijven plakken. Om de naald van het puin te ontdoen, tilt u deze net boven het oppervlak van de Oplossing van de Ringer op. Devitellinisatie kan slordig zijn zolang de eigenlijke geslachtsklier zo min mogelijk wordt verstoord.
- Selecteer stadium 16-embryo's op basis van darmmorfologie (figuur 2). In dit stadium hebben embryo's drie darmvernauwingen die vier gestapelde darmsegmenten creëren (figuur 2B, B '). Om de devitellinisatie te starten, doorboort u het geselecteerde embryo aan het ene uiteinde, bij voorkeur het voorste, met de wolfraamnaald. Het embryo kan uit zijn vitelline-membraan springen, maar zo niet, pel het membraan van het embryo af.
- Finesseer de geslachtsklieren uit het embryo en op de schaal (figuur 3C,D).
- Fileer eerst het embryo om het inwendige bloot te leggen (figuur 3C). Snijd vanuit het midden door het embryo en beweeg de naald naar achteren, tussen de geslachtsklieren. Plaag wat inwendig weefsel uit, omdat dit veel beter aan de schaal blijft plakken dan de externe nagelriem. De kleverigheid van het weefsel zal de volgende manipulaties in staat stellen om de gonade te onthullen en deze aan de dekslip te laten hechten.
OPMERKING: Als er geen weefsel aan de schaal kleeft, probeer het dan naar een niet-verontreinigd gebied van de gecoate dekslip te brengen; de buitenste delen van de afdekplaat zullen bijzonder plakkerig zijn. Zoals vermeld in stap 4.1.2, maakt het niet uit of de dissectiemanipulaties resulteren in een gemangeld embryokarkas, zolang de geslachtsklieren ongedeerd blijven. - Gebruik de naald om rond een gonade te snijden totdat een stuk weefsel, inclusief de gonade, is gescheiden van het resterende karkas. Trek met de naald dit weefsel naar een vers gebied van gecoate dekslip en trek het tegen de bodem totdat het zich aan de schaal hecht.
OPMERKING: De beste beeldvorming zal worden bereikt voor die gevallen waarin de gonade zelf zich rechtstreeks aan de afdekslip hecht, in plaats van indirecte aanhechting via bovenliggend weefsel. Daarom, als weefsel van het karkas wordt weggeleid, probeer dan eerst de gonade de hoes te laten aanraken, in plaats van vreemd weefsel. - Verwijder zoveel mogelijk omringend weefsel van de gonade (figuur 3D) door met de naald voorzichtig het kleefweefsel van de gonade weg te slepen. Vermijd het rechtstreeks aanraken van de gonade, wat het zou beschadigen (figuur 4E). Om ervoor te zorgen dat de gonade voldoende aan de schaal is gehecht, beweegt u de naald in een zachte cirkelvormige beweging rond de gonade - als deze beweegt, raakt u de naald aan het resterende klevende weefsel aan en richt u de gonade naar een vers gebied van kleverige dekzeilslip. Herhaal dit proces totdat er geen detecteerbare beweging van de geslachtsklier is.
- Keer terug naar het embryokarkas en ontleed de tweede geslachtsklier. Herhaal dit proces op zoveel mogelijk embryo's, maar niet langer dan 25 minuten. De levensvatbaarheid van het weefsel zal in de oplossing van Ringer na meer dan ~ 40-45 minuten worden aangetast.
- Fileer eerst het embryo om het inwendige bloot te leggen (figuur 3C). Snijd vanuit het midden door het embryo en beweeg de naald naar achteren, tussen de geslachtsklieren. Plaag wat inwendig weefsel uit, omdat dit veel beter aan de schaal blijft plakken dan de externe nagelriem. De kleverigheid van het weefsel zal de volgende manipulaties in staat stellen om de gonade te onthullen en deze aan de dekslip te laten hechten.
- Nadat de dissecties zijn voltooid, gebruikt u een onuitwisbare marker om registratiemarkeringen toe te voegen aan de buitenrand van de beeldvormingsschaal om de oriëntatie tijdens de dissectie vast te leggen.
- Verwijder de met lijm beklede strip uit de schaal.
- Steek voorzichtig de onderste pin van een tang onder de strip, sluit en kantel de strip langzaam naar boven om deze van de schaal te bevrijden met zo min mogelijk klotsen van de oplossing van de Ringer om verstoring van de aangehechte geslachtsklieren tot een minimum te beperken.
OPMERKING: De strip moet worden gekanteld van de ontleedde gonaden.
- Steek voorzichtig de onderste pin van een tang onder de strip, sluit en kantel de strip langzaam naar boven om deze van de schaal te bevrijden met zo min mogelijk klotsen van de oplossing van de Ringer om verstoring van de aangehechte geslachtsklieren tot een minimum te beperken.
- Draag de schaal voorzichtig naar de beeldmicroscoop op een manier die klotsen van de ringeroplossing voorkomt.
5. Beeldvorming
- Plaats de beeldschaal in de podiumhouder en gebruik de registratiemarkeringen om de schotel in de geschatte richting te plaatsen zoals tijdens de dissectie. Met behulp van brightfield-microscopie en een laag vermogen (~ 10x) objectief, identificeer en breng in beeld elk stuk weefsel dat aan de afdekslip is gehecht. Schakel de oculairinstellingen om fluorescentie te onthullen en scan met behulp van de binoculaire oculairs systematisch de schotel en markeer de positie van elke gonade in de beeldvormingssoftware (zie Materialentabel).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de geslachtsklieren gecentreerd zijn in het gezichtsveld voordat u posities markeert. - Verwijder voorzichtig de hele podiumhouder, met de beeldschaal in de houder, en plaats de montage op de werkbank.
- Vervang de Ringer-oplossing door het voorbereide beeldvormende medium dat insuline bevat (zie stap 1.2 en 3.1).
- Gebruik een P1000 om alle Ringer-oplossing uit de binnenste bovenste richel van de beeldschaal te verwijderen (pipetteer geen Ringer's uit het centrale afdekslipgebied). Schakel vervolgens over naar een P200 en plaats de punt net onder het oppervlak van de resterende Ringer's in het centrale gebied. Verwijder voorzichtig 50-100 μL Ringer's; verwijder NIET de hele oplossing.
- Trek ~200 μL beeldmedia op en plaats de P200-tip opnieuw net onder het oppervlak van de resterende Ringer's en voeg deze beeldmedia langzaam toe. Voeg vervolgens de resterende beeldmedia (~ 1.300 μL) toe aan de schaal, te beginnen bij de buitenste rand van de bovenste richel. Beweeg tijdens het pipetteren naar de centrale koepel van de vloeistof en voeg de twee uiteindelijk samen door de pipetpunt over beide te borstelen. Plaats het deksel op de schaal.
OPMERKING: Beeldvormende media moeten de volledige binnendiameter van de schotel bedekken, met een diepte van ongeveer 2 mm, om verdamping te voorkomen (figuur 4D).
- Schakel de microscoop over naar een objectief met een hoger vermogen (63x, 1,2 NA), breng de juiste dompelvloeistof aan op basis van het gebruikte objectief (onderdompelingsvloeistoftype en brekingsindex vereist door het objectief) en vervang vervolgens de fasehouderassemblage. Gebruik brightfield-microscopie om te focussen op weefsel dat aan de onderkant van de beeldvormingsschaal is gehecht.
OPMERKING: Als het podium niet is verplaatst, moet de laatste gonade in beeld komen zodra het doel is gericht. - Stap door elke gemarkeerde gonadepositie en pas die positie indien nodig aan. Selecteer welke geslachtsklieren naar afbeelding moeten worden gebracht op basis van beeldhelderheid, geslacht van gonaden, enz. Pas de beeldinstellingen aan (meerkanaals, belichtingstijden, laserintensiteiten, stappen uit de Z-serie, time-lapse met de juiste intervallen, enz.). Begin met beeldvorming.
OPMERKING: Mannelijke geslachtsklieren kunnen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van zowel een niche als aan het andere uiteinde van de geslachtsklier, een cluster van kleine, zeer cirkelvormige somatische cellen die mannelijk-specifieke somatische gonadale voorlopers (msSGP's) worden genoemd. Als de six4-eGFP::moesin fluorescerende marker wordt gebruikt, zijn de nichecellen de op een na helderste cellen in de gonade, de helderste zijn de msSGP's. In dit stadium hebben vrouwelijke geslachtsklieren geen niche of msSGP's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We illustreren de bereiding van de beeldvormingsschaal in figuur 1, zoals beschreven in "Bereiding op dag van dissectie". Deze methoden moeten uiteindelijk resulteren in goed gehydrateerde embryo's die zich hechten aan een dekstrip, die tijdelijk aan de bodem van de schaal wordt bevestigd en ondergedompeld in de oplossing van Ringer (figuur 1F). Met een mes met diamantpunt kan men een afdekslip van 22 x 22 mm netjes in drie tot vier kleinere stroken snijden (figuur 1A). Terwijl we deze strips met een tang hanteren, gebruiken we een pipet om voldoende heptaanlijm over te brengen om deze strips te coaten, waardoor ze een klevend, getextureerd oppervlak krijgen (figuur 1B). De gecoate strips kunnen gemakkelijk worden opgeborgen in een lege afdekdoos om de kleefoppervlakken tot 2 uur schoon te houden (figuur 1C). Zodra deze gecoate stroken zijn gemaakt, is het doel om embryo's in een aggregaat aan de strip te hechten, in de buurt van de lange rand van de strip (figuur 1E). Het is noodzakelijk om eerst een paar embryo's van het horlogeglas op een schone glasplaat over te brengen en ze te drogen (figuur 1D). Gebruik vervolgens snel een tang om de gecoate strip voorzichtig aan te raken aan de embryo's, zodat ze zich hechten (figuur 1E). Vervolgens drukken we de strip onmiddellijk naar de bodem van de dissectieschaal met embryo's naar boven gericht en bedekken de embryo's met ringer's oplossing (figuur 1F). Als dit doel wordt bereikt, zal het bekijken van embryo's onder een traditionele brightfield stereomicroscoop volledig gehydrateerde, gezonde embryo's in hun vitelline membranen onthullen (figuur 1G). Als in plaats daarvan het proces van het overbrengen van deze embryo's op de strip en het bedekken ervan met oplossing meer dan ongeveer 30 s duurt, zullen de embryo's uitdrogen en slap worden (figuur 1G '). Slappe embryo's zijn niet gezond en zijn ongelooflijk uitdagend om te ontleden, dus efficiënt werken tijdens dit proces is van vitaal belang.
Figuur 1: Montage en hydratatie van embryo's voorafgaand aan dissectie. (A–F) Stappen voor het hechten van embryo's aan een strook met lijm bedekte coverslip en het vastzetten van de strip aan een beeldvormingsschaal. (A) Coverslip eenmaal gescoord met een diamantgepunt mes (mes aangegeven met pijlpunt) om een strook te maken. (B) Aanbrengen van heptaanlijm op afgesneden dekstrook, vastgehouden met een tang. (C) Vier met lijm beklede stroken drogen in een dekdoos. (D–E) Pijlen wijzen naar embryo's. (D) Dechorionated embryo's die in heptaan zijn verzameld en op de rand van een microscoopglaasje zijn verdreven. Overtollig heptaan werd verwijderd met een kimwipe. (E) Met lijm beklede strip waaraan embryo's zijn bevestigd. (F) De definitieve opstelling van het gerecht onmiddellijk voorafgaand aan de dissectie. Let op de ondiepe laag van ringer's oplossing (pijlpunt) en plaatsing van de strip (pijl) boven de binnenste dissectiecirkel. (G–G') Embryo's kleefden zich aan de strip in het gerecht. (G) Goed gehydrateerde, turgide embryo's. (G') Embryo's die uitgedroogd zijn geraakt als gevolg van langdurige blootstelling aan lucht, zichtbaar door ingestorte vitelline-membranen. Sterretjes duiden op slappe embryo's. Schaalbalken zijn 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het bekijken van een embryo onder een stereo-fluorescerende microscoop maakt een duidelijke visualisatie van de darm mogelijk, die automatisch fluoresceert in het GFP-kanaal. Darmmorfologie dient als een proxy voor embryonale leeftijd bij het kiezen van embryo's om te ontleden. Omdat embryo's die zich aan de strook van de dekslip hechten enigszins in leeftijd zullen variëren, zullen ze een breed scala aan darmmorfologieën presenteren (figuur 2A). Om gonade niche morfogenese levend in beeld te brengen, ontleden we vroege stadium 16-embryo's. Deze embryo's vertonen vier geregionaliseerde darmsecties die op een gelijkmatige rij zijn gestapeld (figuur 2B', stippellijnen). Jongere embryo's vertonen een zakachtige, niet-geregionaliseerde darm (figuur 2C) en hebben nog niet voldoende extracellulaire matrix (ECM) rond hun geslachtsklieren om een efficiënte kweek van het intacte orgaan mogelijk te maken. Oudere embryo's die al zijn begonnen met nicheverdichting vertonen vier darmgebieden die niet gelijkmatig zijn gestapeld en in plaats daarvan ten opzichte van elkaar zijn verschoven (figuur 2D', stippellijnen). Deze embryo's hebben een dikkere nagelriem, wat het dissectieproces uitdagender maakt.
Figuur 2: Selectie van geschikte embryo's voor gonadissectie. Embryo's kleefden zich aan een met lijm bedekte deklip voorafgaand aan dissectie. Embryo's drukken six4-eGFP::moesin (groen) uit, dat de geslachtsklier- en vetlichaamcellen markeert. Merk op dat de darm auto-fluoresceert in groen. Pijlen geven mannelijke geslachtsklieren aan (te onderscheiden door de aanwezigheid van fel fluorescerende msSGP's) die zichtbaar zijn in elk paneel. Schaalbalken geven 0,25 mm aan. (A) Embryo's van verschillende stadia. (B-D) Embryo's van verschillende stadia in het midden van het beeld, georiënteerd met anterieur naar links en dorsaal omhoog. (B) Een embryo in een vroeg stadium 16 dat op de juiste wijze is gerijpt voor dissectie. (B') De vier gestapelde darmgebieden worden aangegeven met gestippelde witte lijnen. (C) Een stadium 15 embryo dat te jong is om te ontleden (onderste embryo). Merk op dat de fluorescerende darmzak net voor de gonade nog geen discrete gebieden heeft. (D) Een embryo uit laat stadium 16 dat moeilijk te ontleden is vanwege het ontwikkelen van een cuticula. Merk op dat de vier darmregio's ten opzichte van elkaar zijn gaan roteren ter voorbereiding op darmlusvorming. (d') De vier darmregio's worden geschetst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het is belangrijk om embryo's te ontleden die een onuitwisbare fluorescerende marker in de gonade tot expressie brengen, en deze marker moet zichtbaar zijn onder een stereo-fluorescerende microscoop. Hier hebben we ervoor gekozen om six4-eGFP::moesin20 te gebruiken om de gonade te markeren (figuur 2 en figuur 3, pijlen) voor visualisatie tijdens dissectie.
We illustreren het gonadissectieproces in figuur 3. De dissectie van de juiste geënsceneerde embryo's op de met poly-lysine beklede schaal zorgt voor een schone isolatie van de geslachtsklieren van deze embryo's (figuur 3D). Embryo's die zijn gedevitelliniseerd, hechten zich aan het gerecht en kunnen voorafgaand aan de dissectie in een handige rij worden gerangschikt (figuur 3A). Embryo-devitellinisatie en -overdracht naar de poly-lysine is een onnauwkeurig proces dat zodanig is dat weefsel kan worden geëxtrudeerd uit de grenzen van het embryolichaam (zie stukje weefsel tussen Embryo 1 en Embryo 2, en gemangeld Embryo 4; Figuur 3A). Deze onnauwkeurigheid is van geen belang, zolang de geslachtsklieren ongedeerd blijven. Een standaard stereo-fluorescerende microscoop maakt identificatie van de gonade in het gedevitelliniseerde embryolichaam mogelijk (figuur 3B, pijl). De eerste paar manipulaties met een scherpe dissectienaald moeten de geslachtsklieren van het embryokarkas scheiden, hoewel er wat auto-fluorescerend weefsel blijft kleven (figuur 3C). Extra manipulaties resulteren in geïsoleerde geslachtsklieren die zich direct aan de gecoate schaal hechten (figuur 3D).
Figuur 3: Het dissectieproces. (A–D) Embryo's die six4-eGFP::moesin (groen) tot expressie brengen in opeenvolgende stadia in het dissectieprotocol. (A) Vier gedevitelliniseerde embryo's die zijn overgebracht naar het poly-lysine-gecoate dissectiegebied van de schotel. Merk op hoe de embryo's in een nette rij zijn uitgelijnd om opeenvolgende neerwaartse dissecties in de schaal te vergemakkelijken. Het kleine stukje weefsel tussen Embryo 1 en 2 maakt deel uit van de darm van Embryo 2, geëxtrudeerd tijdens handdevitellinisatie. (B) Hogere vergrotingsaanzicht van embryo van (A), aangegeven met het sterretje. (C) Het resterende karkas van een embryo dat langs de middellijn is gefileerd. De pijlpunt duidt op een afgesloten geslachtsklier, nog steeds zwaar ingebed in embryonale weefsels. (D) Een volledig ontleed geslachte geslachtsklier. Merk op dat er slechts minimaal vreemd weefsel (pijlpunt) in de buurt van de geslachtsklier achterblijft. Pijlen wijzen naar mannelijke geslachtsklieren. Schaalbalken zijn 0,25 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zodra de geslachtsklieren zijn ontleed, kan men de Ringer-oplossing vervangen door beeldvormende media en beeldgekweekte geslachtsklieren direct in dezelfde schaal die wordt gebruikt voor dissectie. We gebruiken een confocale microscoop van een draaiende schijf. Brightfield-visualisatie van een geïsoleerde gonade op een confocale microscoop onthult een donkere schaduw rond de perifrand van de gonade (figuur 4A-B, pijlen), de ECM die de integriteit van de gonade behoudt tijdens beeldvorming. We presenteren een voorbeeld van een gezonde, goed gekweekte gonade die GFP-gelabelde F-actine tot expressie brengt in somatische gonadale cellen20 en een RFP-gelabelde histonmarker om alle kernen28 te visualiseren (figuur 4C-C'). Omdat alle cellen in dit embryo de RFP-histonmarker tot expressie brengen, worden zowel gonadale cellen als cellen van ander aanhangend weefsel waargenomen bij het bekijken van rode emissie. We onderscheiden de grenzen van de gonade met behulp van de gonade-specifieke GFP-marker (figuur 4C', omtrek). Het is duidelijk dat deze gekweekte gonade gezond is omdat de gonadegrens glad en rond is (figuur 4C', omtrek), en omdat gonadale cellen gelijkmatige niveaus van RFP-histonfluorescentie hebben in de kernen (figuur 4C', pijl). Als in plaats daarvan gonaden niet voldoende gehydrateerd zijn tijdens beeldvorming, kunnen kernen en six4-eGFP::moesine fluorescentie punctaat worden (figuur 4D, pijl) naarmate het geslachtsweefsel verschrompelt. Verder, als de gonade-ECM overmatig wordt beschadigd tijdens dissectie, wordt de gonadegrens aangetast, wat blijkt uit de aanwezigheid van gonade-specifieke cellen (figuur 4E, sterretjes) buiten de grenzen van de gonade (figuur 4E, pijl).
Figuur 4: Het lokaliseren van gezonde geslachtsklieren tijdens live-imaging. (A) Lage en (B) hoge vergroting brightfield views van twee ontlede geslachtsklieren die aan de coverslip kleefden. (C–C') Eén filmframe van ex vivo beeldvorming van nicheverdichting in een gezonde geslachtsklier. Somatische gonadale cellen drukken six4-eGFP::moesin (groen) uit en alle cellen drukken His2Av-mRFP (rood) uit. (C') Gonade grens gemarkeerd met een witte stippellijn. His2Av-mRFP zichtbaar buiten de gonadegrens is waarschijnlijk vetlichaam dat nog steeds aan de ontlede geslachtsklier is bevestigd. Pijl wijst naar een kiemcelkern met uniform His2Av-mRFP-signaal, wat aangeeft dat de geslachtsklier gezond is. (D–E) Representatieve negatieve uitkomsten van het ex vivo dissectieprotocol. (D) Een frame van een beeldvormingssessie waarin de geslachtsklier is uitgedroogd als gevolg van mediaverdamping. Merk pyknotische kernen op als His2Av-mRFP condenseert (pijl) en discontinue vlekken van six4-eGFP::moesin langs de gonadegrens. (E) Ex vivo beeldvormingsframe waarin extracellulaire matrix is aangetast tijdens dissectie. Merk op dat sommige geslachtscellen (sterretjes) de gonadegrens (pijl) verlaten. Geslachtscellen zijn gelabeld met nos-lifeact::tdtomato (magenta), en somatische gonadale cellen met six4-eGFP::moesin (groen). Schaalbalken tonen 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gonaden kunnen gedurende ongeveer 5 uur worden gekweekt met behulp van deze ex vivo beeldvormingsmethode, waardoor beeldacquisitie mogelijk is van de dynamische morfogenesegebeurtenissen die optreden in de late embryonale gonadeontwikkeling. In ons lab hebben we dit protocol met succes gebruikt om de verdichting van de vormende stamcelniche17 in beeld te brengen (figuur 5). Voorafgaand aan de verdichting is de nis een los aggregaat van somatische cellen aan de voorste gonade (figuur 5A, groen), omgeven door kiembaancellen gelabeld met nos-lifeact::tdtomato29 (zie Tabel met materialen), waarvan de eerste laag kiembaanstamcellen zal zijn (figuur 5A, magenta). Dit niche-aggregaat presenteert zich aanvankelijk met een onregelmatige grens (figuur 5A', stippellijn). In de loop van de beeldvorming zien we individuele nichecellen hun posities herschikken, terwijl het niche-aggregaat gladdere randen krijgt. Deze cellulaire herschikkingen resulteren ook in een afname van het nichegebied (figuur 5C). Onze observaties van celherschikkingen en naburige kiemceldelingen die gelijktijdig met deze ontwikkelingsfase plaatsvinden, informeerden ons begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan nicheverdichting17. Dit protocol biedt dus de mogelijkheid om celherschikkingen, vormveranderingen, delingen en andere cellulaire gebeurtenissen te visualiseren met de resolutie die nodig is om morfogenetische gebeurtenissen in gonaden in een laat stadium te analyseren.
Figuur 5: Een ex vivo gekweekte gonade die nicheverdichting ondergaat. Stills uit een beeldvormingsreeks die onmiddellijk na dissectie van geslachtsklieren van vroege stadium 16-embryo's werden verkregen. (A–C) Geslachtscellen (magenta) worden gelabeld met nos-lifeact::tdtomato en somatische gonadale cellen (groen) worden gelabeld door six4-eGFP::moesin. De nis (gestippelde witte lijn) is omlijnd in A'-C'. Schaalbalken geven 10 μm aan. Anterieur is links en posterior is rechts. (A) Op het eerste tijdspunt (t = 0 min) in de beeldvormingsreeks zijn nichecellen klaar met assembleren op de voorste gonade en bevinden ze zich in een vroeg stadium van verdichting. (B) Halverwege de beeldvormingsreeks en het verdichtingsproces (t = 1 h 48 min) is de nis begonnen te circulariseren, maar de rand blijft onregelmatig. (C) Aan het einde van de beeldvormingsreeks (t = 4 h 21 min) heeft de nis een sterk gladgestreken, gecirkelde grens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de gogonadogenese ondergaat de embryonale gonade, en met name de stamcelniche in de mannelijke geslachtsklier15, snelle morfologische veranderingen. Ontwikkelingsmechanismen die ten grondslag liggen aan deze dynamische veranderingen worden het best begrepen door middel van live-imaging technieken. In embryonaal stadium 17 wordt in vivo beeldvorming van de gonade echter onmogelijk gemaakt door het begin van grootschalige spiercontracties17. Met dit protocol bieden we een succesvol alternatief: dissectie van de geslachtsklieren direct op een beeldvormingsschaal voor ex vivo live-imaging. Dit protocol presenteert de enige beschikbare methode om live-imaging van de embryonale gonade in een laat stadium te bereiken.
De kritieke stappen van het protocol moeten worden uitgevoerd met een acute focus op behendigheid en timing. Voorafgaand aan dissectie is een snelle montage van embryo's van het grootste belang om ervoor te zorgen dat de embryo's niet uitdrogen en gezond en turgid blijven, wat devitellinisatie en dissectie vergemakkelijkt. Tijdens dissectie is het van vitaal belang om verstoring van de gonadale extracellulaire matrix te voorkomen, wat wordt bereikt met alleen delicate en nauwkeurige manipulaties. Het gebruik van een dergelijke behendigheid zal er ook voor zorgen dat de gonade in direct contact staat met de beeldvormingsschaal, waardoor een heldere beeldvorming direct door de coverslip mogelijk is. Na dissectie moet de oplossing van Ringer worden omgeschakeld voor beeldvormende media met behulp van alleen zachte zuiging en uitdrijving met een pipet om losraken van de gonade te voorkomen. Ten slotte is het belangrijk om de totale dissectietijd te beperken tot 25 minuten. Dit zorgt ervoor dat de hoeveelheid tijd die tijdens de dissectie in de oplossing van Ringer wordt doorgebracht en de locatie van het weefsel bij de confocale, beperkt is tot een niet-toxische blootstelling. Met meer oefening zal de dissectiesnelheid verbeteren en zal personalisatie van de dissectiesequentie optreden. In onze ervaring kan voldoende dissectie worden bereikt na ongeveer een week regelmatig oefenen, met volledige beheersing van de dissectie haalbaar in ongeveer 1 maand. Om het leren te vergemakkelijken, raden we aan om individuele stappen te oefenen voordat u het hele protocol uitvoert.
Er zijn een aantal best practices die de uitdagingen in verband met dit protocol verbeteren, te beginnen met het genotype van de embryo's die worden gebruikt voor dissectie. Opname van meerdere kopieën van het transgen dat wordt gebruikt om de gonade te markeren, zal de gonade helderder maken en daarom gemakkelijker te visualiseren en te ontleden. De dissectie zelf werkt het beste met een scherpe naald, hoewel deze niet te veel moet worden geslepen, omdat deze tegen de bodem van de beeldvormingsschaal buigt en belast raakt met vreemd weefsel. Schneider's imaging media fluoresceert automatisch in het groene emissiespectrum, wat het een uitdaging maakt om gonaden gemarkeerd met GFP te lokaliseren zodra de media zijn toegevoegd. Daarom is het van cruciaal belang om de confocale beeldvormingssoftware te gebruiken om de locatie van geslachtsklieren te markeren terwijl ze zich nog in de Oplossing van de Ringer bevinden. Als het lokaliseren van geslachtsklieren bij de confocal moeilijk blijft, raden we na de volgende dissectie aan om te schetsen of een afbeelding te maken van de relatieve positionering van geslachtsklieren in de schaal terwijl ze nog steeds bij de dissectiemicroscoop zitten. Markeer vervolgens de buitenkant van de schaal om de oriëntatie aan te geven tijdens de dissectie en pas deze oriëntatie aan bij de overgang naar de confocale microscoop. Eenmaal gelokaliseerd bij de confocal, als een gonade verstoord of verminkt lijkt, probeer dan bij de volgende dissectie meer aanhangend weefsel rond de gonade achter te laten. Integendeel, als een gonade aanwezig is maar wazig lijkt op alle vlakken, is er waarschijnlijk weefsel tussen de coverslip en de gonade, en toekomstige dissecties moeten streven naar een betere isolatie van de gonade van het aanhangende weefsel. In onze ervaring heeft het aannemen van deze praktijken het leren en uitvoeren van dit protocol vergemakkelijkt.
Tijdens de vorming van dit protocol hebben we verschillende wijzigingen geïdentificeerd die kunnen worden toegepast. Voor nicheverdichtingsstudies streven we ernaar embryo's te ontleden in fase 16. In dit stadium heeft het embryo nog geen significante hoeveelheden cuticula ontwikkeld en kleeft het gemakkelijk aan de met poly-lysine bedekte schaal. Deze techniek kan echter worden gewijzigd om oudere embryo's met de cuticula te ontleden door ze voor de eerste incisie aan de binnenwand van het met polylysine bedekte gebied te plakken. Zodra interne weefsels zijn blootgesteld, zal het embryokarkas aan de poly-lysine blijven kleven en kan de dissectie normaal verlopen. Naast aanpassingen voor embryoleeftijd hebben we deze techniek met succes aangepast om meerdere genotypen in hetzelfde gerecht te ontleden. Homozygote mutanten kunnen bijvoorbeeld worden gescheiden van heterozygoten van broers en zussen door het gebruik van een gemakkelijk waarneembare marker zoals vervormd-YFP op het balancerchromosoom. Na devitellinisatie moeten embryo's worden overgebracht naar beide zijden van de coverslip op basis van de aan- of afwezigheid van de marker. Dissectie moet naar beneden gaan in het gerecht zoals beschreven in het protocol, met extra zorg om segregatie van verschillende genotypen te behouden. Ook kan dit protocol mogelijk worden aangepast om andere cultuurmedia dan die van Schneider te gebruiken, hoewel een oppervlakkig onderzoek van Shields en Sang M3 Insect Media niet-levensvatbare geslachtsklieren opleverde (gegevens niet getoond). Bovendien combineert dit protocol goed met farmacologische manipulaties door het medicijn eenvoudigweg te combineren met de beeldvormingsmedia. Gedurende een periode van 5 uur van beeldvorming kan hertoevoeging van het geneesmiddel nodig zijn om een effectieve concentratie te behouden. Ten slotte, hoewel dit protocol is ontwikkeld met de bedoeling om nicheverdichting te visualiseren, een fenomeen dat specifiek is voor mannelijke geslachtsklieren, zou dit protocol in theorie ook kunnen worden geïmplementeerd om de zich ontwikkelende eierstok live in beeld te brengen door eenvoudig gonaden te ontleden en af te beelden die geen niche en msSGP's hebben.
Beperkingen die verband houden met deze techniek hebben betrekking op de duur van de kweektijd en de ex vivo aard van de cultuur. Zoals het geval is met drosophila-eikamers in het middenstadium30, beginnen gekweekte geslachtsklieren te sterven na ongeveer 5 uur ex vivo live-beeldvorming, wat blijkt uit verlies van weefselintegriteit (kernen worden pyknotisch en celmembranen verschrompelen). Dus als men gebeurtenissen in een later stadium in de mannelijke geslachtsklier wilde onderzoeken, zou men gonaden van 1e instar of oudere larven moeten ontleden door wijzigingen aan te brengen in het hier gepresenteerde protocol en die vervolgens in beeld brengen onder omstandigheden die vergelijkbaar zijn met die hier worden gepresenteerd. We sluiten echter niet uit dat ex vivo live-imaging na vijf uur mogelijk is als verbeterde kweekomstandigheden worden ontwikkeld, hoewel er een limiet kan zijn als mechanische signalen uit het embryo nodig zijn voor de ontwikkeling van gonaden. Misschien wel het ernstigste nadeel van de techniek is te wijten aan de inherente ex vivo aard. Wanneer ze ex vivo worden gekweekt, kunnen cellen een onnatuurlijk potentieel hebben dat niet representatief is voor de in vivo biologie31. Bovendien kunnen subtiliteiten van kweekomgevingen, waaronder media-inhoud en matrixstijfheid, een drastische invloed hebben op het celgedrag32. Met deze gevoeligheid in gedachten is het van vitaal belang om ervoor te zorgen dat kweekomstandigheden de in vivo biologie nauwkeurig weerspiegelen. We hebben maatregelen genomen om te bevestigen dat in vivo niche-ontwikkeling en signalering ex vivo17 wordt samengevat. In het kort hebben we vastgesteld dat het lot van nichecellen in stand wordt gehouden en het aantal nichecellen ongewijzigd is met behulp van de markers Fasciclin-III en E-cadherine. Ook is STAT-signalering aanwezig en delen kiembaanstamcellen orthogonaal, wat suggereert dat de nichefunctionaliteit behouden blijft. We hebben echter niet geverifieerd dat de relevante in vivo biologie intact blijft in andere, niet-nicheweefsels in de geslachtsklier. Toekomstig ex vivo onderzoek van deze andere weefsels moet een uitgebreide analyse omvatten om er zeker van te zijn dat dit inderdaad het geval is.
Een toekomstige richting die men met dit protocol zou kunnen nemen, zou de opname van een barrière in de beeldvormingsschaal omvatten, zodat één dissectiesessie zowel een controlegroep als een medicamenteuze behandelingsgroep kan bevatten. Deze verbetering zou het mogelijk maken om fouten tussen technische replicaties te minimaliseren, waardoor de wetenschappelijke nauwkeurigheid wordt verbeterd.
Er zijn geen andere echte alternatieven voor dit protocol, omdat het de enige beschikbare methode is om de live gebeurtenissen van dit orgaan tijdens de late embryonale ontwikkeling te onderzoeken. Als zodanig zijn voorheen onbeantwoordbare vragen over gonademorfogenese nu toegankelijk met deze vooruitgang. Deze vragen omvatten de fijne kneepjes van celdelingen, cytoskeletale veranderingen en celintercalatiegebeurtenissen die de vorming van stamcelniches engonadogenese regelen. Geen van deze gebeurtenissen is detecteerbaar in de stilstaande beelden van deze processen die zijn verkregen met behulp van een fix-and-stain-techniek. Over het algemeen ontsluit deze methode de mogelijkheid om de dynamiek in de late embryonale Drosophila-gonade te onderzoeken, en een dergelijke doorbraak heeft sterke implicaties voor de vooruitgang van een groot aantal biologische velden, waaronder stamcel-nichebiologie, piRNA-biologie en organogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Lindsey W. Plasschaert en Justin Sui bedanken voor hun substantiële bijdragen aan de vroege ontwikkeling van dit protocol. De auteurs zijn de vlieggemeenschap dankbaar voor hun vrijgevigheid met reagentia, en in het bijzonder Ruth Lehmann en Benjamin Lin voor hun geschenk van de nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'-lijn voorafgaand aan de publicatie ervan. Aandelen verkregen van het Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) werden gebruikt in deze studie. Dit werk werd ondersteund door NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 en R35GM136270 (S.D), evenals trainingsbeurzen T32GM007229 (B.W.) en F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
