Summary
نحن نصف ثلاث طرق لزرع نخاع العظم (BMT): BMT مع تشعيع الجسم الكلي ، BMT مع التشعيع المحمية ، وطريقة BMT مع عدم وجود تكييف مسبق (BMT بالتبني) لدراسة التجويف الدموي الكلو في نماذج الماوس.
Abstract
الورم الدموي المكلور هو حالة سائدة مرتبطة بالعمر تنتج عن تراكم الطفرات الجسدية في الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs). الطفرات في جينات السائق، التي تمنح اللياقة الخلوية، يمكن أن تؤدي إلى تطوير استنساخ HSPC الآخذة في التوسع التي تؤدي بشكل متزايد إلى الكريات البيض ذرية تؤوي الطفرة الجسدية. ولأن الهيماتوبويزات الكلونية ارتبطت بأمراض القلب والسكتة الدماغية والوفيات، فإن تطوير أنظمة تجريبية تقوم بنمذجة هذه العمليات هو المفتاح لفهم الآليات التي تؤدي إلى الحد من عامل الخطر الجديد هذا. عادة ما تستخدم إجراءات زرع نخاع العظم التي تنطوي على تكييف النقوي في الفئران ، مثل تشعيع الجسم الكلي (TBI) ، لدراسة دور الخلايا المناعية في أمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، لا مفر من الضرر المتزامن لمتخصصة نخاع العظم وغيرها من المواقع ذات الاهتمام ، مثل القلب والدماغ ، مع هذه الإجراءات. وهكذا، طور مختبرنا طريقتين بديلتين لتقليل أو تجنب الآثار الجانبية المحتملة الناجمة عن TBI: 1) زرع نخاع العظم مع التدريع التشعيع و 2) BMT بالتبني للفئران غير مشروطة. في الأعضاء المحمية ، يتم الحفاظ على البيئة المحلية مما يسمح بتحليل الهيماتوبويز الكلومي في حين أن وظيفة الخلايا المناعية المقيمة غير مضطربة. في المقابل ، فإن BMT بالتبني للفئران غير المكيفة له ميزة إضافية تتمثل في الحفاظ على كل من البيئات المحلية للأعضاء ومكانة الهيماتوبوتي. هنا، نقارن ثلاثة نهج مختلفة لإعادة تشكيل الخلايا الدموية ونناقش نقاط قوتها وحدودها لدراسات الهيماتوبويزات الكلوية في أمراض القلب والأوعية الدموية.
Introduction
الهيماتوبويز الكلوي (CH) هو شرط الذي لوحظ في كثير من الأحيان في الأفراد المسنين ويحدث نتيجة لتوسيع الجذعية الدموية وخلية السلف (HSPC) استنساخ تحمل طفرة جينية1. وقد اقترح أنه بحلول سن 50, معظم الأفراد سوف تكون قد اكتسبت في المتوسط خمس طفرات إكسونية في كل HSPC2, ولكن معظم هذه الطفرات سوف يؤدي إلى عواقب ضئيلة أو معدومة phenotypic للفرد. ومع ذلك ، إذا كانت إحدى هذه الطفرات تمنح عن طريق الصدفة ميزة تنافسية ل HSPC - مثل تعزيز انتشارها أو تجديدها الذاتي أو بقائها أو مزيجا من هذه - فقد يؤدي ذلك إلى التوسع التفضيلي للاستنساخ المتحول بالنسبة إلى مركبات الكربون الهيدروفلورية الأخرى. ونتيجة لذلك، فإن الطفرة ستنتشر بشكل متزايد من خلال نظام الهيماتوبوتيستيك حيث يؤدي HSPC المتحول إلى خلايا دم ناضجة، مما يؤدي إلى مجموعة متميزة من الخلايا المتحولة داخل الدم المحيطي. في حين ارتبطت الطفرات في العشرات من الجينات سائق مرشح مختلفة مع الأحداث التخفي داخل نظام الهيماتوبويات، من بين هذه، والطفرات في ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي 3 ألفا(DNMT3A)وعشرة أحد عشر نقل 2 (TET2) هي الأكثر انتشارا3. وقد وجدت العديد من الدراسات الوبائية أن الأفراد الذين يحملون هذه الطفرات الوراثية لديهم خطر أعلى بكثير من أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD), السكتة الدماغية, والوفيات سببية جميع3,4,5,6,7. في حين أن هذه الدراسات قد حددت أن هناك علاقة بين CH وزيادة الإصابة بالأمراض القلبية الوعائية والسكتة الدماغية، ونحن لا نعرف ما إذا كانت هذه العلاقة سببية أو ظاهرة مشتركة مع عملية الشيخوخة. للحصول على فهم أفضل لهذا الارتباط ، مطلوب نماذج حيوانية مناسبة تلخص بشكل صحيح الحالة البشرية ل CH.
وقد تم إنشاء العديد من نماذج الحيوانات CH من قبل مجموعتنا وغيرها باستخدام حمار وحشي، والفئران، والرئيسيات غير البشرية8،9،10،11،12،13،14. وغالبا ما تستخدم هذه النماذج أساليب إعادة تشكيل الدم عن طريق زرع الخلايا المعدلة وراثيا، وأحيانا باستخدام إعادة دمج Cre-lox أو نظام CRISPR. يسمح هذا النهج بتحليل طفرة جينية محددة في الخلايا الدموية لتقييم كيفية مساهمتها في تطور المرض. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه النماذج غالبا ما تستخدم خلايا con أو مراسل للتمييز بين آثار الخلايا المتحولة من الخلايا العادية أو البرية. في كثير من الحالات، مطلوب نظام ما قبل تكييف لإغراق الخلايا الجذعية الدموية المانحة بنجاح.
حاليا، زرع نخاع العظم إلى الفئران المتلقية يمكن تقسيمها إلى فئتين رئيسيتين: 1) تكييف النقوي و 2) زرع غير مشروطة. يمكن تحقيق تكييف النقوي بإحدى طريقتين، وهما التشعيع الكلي للجسم (TBI) أو العلاج الكيميائي15. يتم تنفيذ TBI عن طريق إخضاع المتلقي لجرعة قاتلة من أشعة غاما أو الأشعة السينية ، وتوليد فواصل الحمض النووي أو الروابط المتقاطعة داخل الخلايا المقسمة بسرعة ، مما يجعلها لا يمكن إصلاحها16. Busulfan وسيكلوفوسفاميد هما أدوية العلاج الكيميائي شائعة الاستخدام التي تعطل مكانة الهيماتوبويات وبالمثل تسبب تلف الحمض النووي للخلايا الانقسام بسرعة. والنتيجة الصافية للشرط المسبق النقوي هي موت الخلايا الدموية، الذي يدمر نظام الهيماتوبويتيك لدى المتلقي. هذه الاستراتيجية لا تسمح فقط لengraftment ناجحة من HSPCs المانحة، ولكن يمكن أيضا منع رفض الكسب غير المشروع عن طريق قمع الجهاز المناعي المتلقي. ومع ذلك ، فإن الشروط المسبقة النقوي لها آثار جانبية شديدة مثل تلف الأنسجة والأعضاء وخلاياها المناعية المقيمة بالإضافة إلى تدمير مكانة نخاع العظمالأصلية 17. ولذلك، اقترحت أساليب بديلة للتغلب على هذه الآثار الجانبية غير المرغوب فيها، ولا سيما فيما يتعلق بالضرر الذي يلحق بالأجهزة ذات الاهتمام. وتشمل هذه الأساليب التشعيع المحمية من الفئران المتلقية وBMT بالتبني للفئران غيرمشروطة 9،17. حماية الصدر، تجويف البطن، الرأس أو المناطق الأخرى من التشعيع عن طريق وضع حواجز الرصاص يحافظ على الأنسجة ذات الأهمية المحمية من الآثار الضارة للإشعاع ويحافظ على سكان الخلايا المناعية المقيمين. من ناحية أخرى ، فإن BMT بالتبني من HSPCs للفئران غير المكيفة له ميزة إضافية لأنه يحافظ على مكانة الهيماتوبوتية الأصلية. في هذه المخطوطة، نقوم بوصف بروتوكولات ونتائج زراعة الخلايا الهيدروجرافية بعد عدة نظم زرع في الفئران، وتحديدا تسليم HSPC إلى فئران TBI، إلى الفئران المحمية جزئيا من الإشعاع، وإلى الفئران غير المكيفة. الهدف العام هو مساعدة الباحثين على فهم الآثار الفسيولوجية المختلفة لكل طريقة وكذلك كيفية تأثيرها على النتائج التجريبية في وضع CH وأمراض القلب والأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فرجينيا على جميع الإجراءات المتعلقة بمواضيع الحيوانات.
1. قبل الشروط المسبقة
- ضع الفئران المتلقية على الماء المكمل بالمضادات الحيوية (5 mM sulfamethoxazole، 0.86 m m trimethoprim) ~ 24 ساعة قبل التشعيع. وهذا ضروري لمنع العدوى، حيث سيتم قمع الجهاز المناعي بعد التشعيع، والحفاظ عليه لمدة أسبوعين بعد التشعيع. عند هذه النقطة، تكملة الفئران مع هلام التغذية / الترطيب لتشجيع التغذية ومنع فقدان الوزن والجفاف بعد التشعيع.
الشكل 1: صور تظهر مختلف الاجهزة المسبقة. (أ)إعداد تشعيع الجسم الكلي قفص دائري باستخدام أشعة غاما (سيزيوم-137): شعاع الإشعاع يأتي من الجزء الخلفي من المشعع في اتجاه المحور ص (الإشعاع الأفقي). (ب) إعداد تشعيع الجسم الإجمالي قفص الماوس باستخدام الأشعة السينية: يتم وضع قفص الماوس في غرفة عاكسة. يأتي شعاع الإشعاع من أعلى المشعع على شكل مخروط (إشعاع عمودي). المسافة من مصدر الإشعاع إلى القفص هي 530 مم(C)صينية قابلة للتعديل في الأشعة السينية المشععة: يتم استخدام هذا الإعداد للتشعيع محمية جزئيا باستخدام الأشعة السينية. يأتي شعاع الإشعاع من أعلى المشعع على شكل مخروط (إشعاع عمودي). المسافة من مصدر الإشعاع إلى الدرج هي 373 مم، ونصف قطرها 250 مم(D) درع الصدر: يتم وضع الفئران المخدرة على صينية. يتم وضع الفئران مقلوبة على بعضها البعض في مواقف supine مع الذراعين والساقين ممتدة بالكامل. يتم محاذاة الطرف السفلي من الدرع الرصاص مع عظم xiphisternum والطرف العلوي مع الغدة الصعترية. (E) التدريع البطني: يتم وضع الفئران المخدرة كما هو الحال في إعداد درع الصدر مع الطرف السفلي من الدرع الرصاصي المنحاز إلى فتحة شج والطرف العلوي أسفل الحجاب الحاجز. (F)إعداد التشعيع التدريع الرأس باستخدام أشعة غاما (سيزيوم-137): يتم تسجيل نبوات الماوس تخدير أسفل ويتم وضع الماوس في مقيد مخروطي. يغطي الدرع الرصاص الأسود (ملحوظ) رأس الفأر وأذنيه. يأتي شعاع الإشعاع من الجزء الخلفي من المشعع في اتجاه المحور Y (الإشعاع الأفقي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. الشروط المسبقة للفئران المتلقية (اختياري)
- إشعاع الجسم الكلي
- ضع الفئران المتلقية في قفص دائري مقطع بشكل موحد ، أو قفص فأر في الغرفة العاكسة داخل نصف القطر المحسوب لتلقي نفس جرعة الإشعاع ؛ ومع ذلك، ينصح بحد أقصى 8 فئران لكل قفص دائري و5 فئران لكل قفص فأر لضمان التشعيع الموحد(الشكل 1A، B).
- لتحقيق النقوي الكامل، تأكد من أن الفئران المتلقية تتلقى جرعة إشعاعية إجمالية قدرها 11 غراي في جزئين 5.5 Gy مفصولين بفاصل زمني من 4 إلى 24 ساعة.
ملاحظة: بينما يمكن الحصول على engraftment الأمثل عن طريق تنفيذ فاصل زمني 4 ساعة بين الكسور، وهذا يمكن أن تمتد إلى فاصل زمني 24 ساعة، والتي يمكن أن تكون مفيدة عندما العمل و / أو المشعع غير متوفر.
- إشعاع محمي جزئيا
- تخدير الفئران المتلقية عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (80-100 ملغ / كغ) وزين (5-10 ملغ / كغ). ضبط النفس من حركة الماوس أمر بالغ الأهمية لضمان التشعيع موحدة وحماية فعالة لأجهزة الاستهداف أثناء عملية التدريع.
- للصدر والبطن التدريع، وتوجيه شعاع الإشعاع من الأشعة السينية المشعع عموديا إلى الماوس(الشكل 1C).
- ضع الفئران المخدرة على لوحة مسطحة ، مركزة مصدر الإشعاع من الأعلى. وضع الفئران مقلوب لبعضها البعض في موقف supine مع الذراعين والساقين تمديد كامل(الشكل 1D، E).
ملاحظة: يسمح مرفق الأشعة السينية، لهذه التجربة، بوضع فأرين في كل مرة داخل دائرة نصف قطرها الفعالة التي تسمح بالإشعاع الموحد. في حين يتم حساب نصف قطرها الفعال على أساس المسافة بين مصدر الإشعاع والصوانية ، فإن عدد الحيوانات التي يمكن تشعيعها في وقت واحد سيعتمد على المشعع المحدد. - ربط الكفوف من الفئران على لوحة باستخدام الشريط لضمان الفئران هي شل حركتها أثناء إجراء التشعيع. وضع الرصاص التدريع بحيث يغطي المناطق التي تتطلب الحماية.
- لحماية الصدر، قم بإعداد الدرع الرصاصي عن طريق قياس الطول من عظمة الماوس xiphisternum إلى الغدة الصعترية وحساب السماكة التي ستوفر حماية كافية من مصدر الإشعاع. ضع الرصاص التدريع بحيث الطرف السفلي محاذاة مع عظم xiphisternum. سوف الطرف العلوي من حاجز الرصاص تناسب بالقرب من الغدة الصعترية (الشكل 1D).
- للتدريع البطن، وإعداد الدرع الرصاص عن طريق قياس طول من فتحة العين الماوس إلى الحجاب الحاجز وحساب سمك من شأنها أن توفر حماية كافية من مصدر الإشعاع. ضع الرصاص التدريع بحيث الطرف السفلي محاذاة مع فتحة فتحة العين. الطرف العلوي من الدرع الرصاص سوف يصلح تحت الحجاب الحاجز (الشكل 1E).
ملاحظة: قد يؤدي توطين درع الرصاص ليكون متسقا بين الأفواج إلى تقليل بعض التباين فيما يتعلق بحجم الفئران.
- ضع الفئران المخدرة على لوحة مسطحة ، مركزة مصدر الإشعاع من الأعلى. وضع الفئران مقلوب لبعضها البعض في موقف supine مع الذراعين والساقين تمديد كامل(الشكل 1D، E).
- لدرع الرأس، توجيه شعاع الإشعاع من المشعع السيزيوم أفقيا إلى الماوس.
- الشريط بعناية النبوات من الماوس تخدير إلى البطن. وهذا يضمن أن تحصل الأسلحة على جرعة كاملة من الإشعاع ولا يغطيها الدرع.
- لدرع الرأس، ضع الماوس في مقيد مخروطي، والذي يناسب داخل درع الرصاص. مرة واحدة في الماوس داخل المقيد مخروطية، الشريحة المقيد في فتحة داخل الدرع الرصاص(الشكل 1F). يجب أن يغطي الدرع الرصاصي رأس الفأر وأذنيه بالكامل (~ 3.2 سم) ، تاركا بقية جسم الماوس مكشوفا للإشعاع. يمكن ضبط وضع المقيد داخل الدرع ليناسب الحيوانات المختلفة الحجم عن طريق انزلاقه داخل أو خارج الدرع.
- ضع الفئران داخل المشعع ، عموديا على مصدر التشعيع.
- تعريض الفئران لاثنين من 5.5 جي أجزاء من الإشعاع (الجرعة الإجمالية من 11 غراي) مفصولة بفاصل زمني 4-24 ساعة.
- بعد كل كسر تشعيع، ضع الأقفاص مع الفئران المخدرة على الحصير الساخن أو تحت مصابيح الحرارة الحمراء لمنع انخفاض حرارة الجسم والمساعدة في التعافي من التخدير.
ملاحظة: يجب توخي الحذر لعدم ارتفاع درجة حرارة الماوس المخدر عند استخدام مصباح لأنها لا يمكن الهروب من الحرارة. وكما هو موضح أعلاه، يمكن أن يختلف تحديد مواقع الحيوانات وسماكة الدرع الرصاصي بين الدراسات القائمة على السمات المحددة للمشع (نوع/اتجاه الإشعاع للشعاع، وما إلى ذلك). وسيحتاج الباحثون إلى تعديل تجاربهم وفقا لذلك.
3. عزل العظام
ملاحظة: من الناحية المثالية، يجب أن تكون الفئران المانحة والفئران المتلقية متشابهة في العمر، وفي غضون 8-12 أسبوعا. ويفضل استخدام ما لا يقل عن 3 فئران كمتبرعين (بدلا من متبرع واحد) لتقليل التغايرية (حتى عند استخدام الفئران ذات النمط الجيني نفسه). يمكن الحصول على ما يقرب من 40 مليون خلية نخاع عظمي غير مكسورة من ستة عظام (عظما الفخذ وعظما الساق واثنين من العضد) من فأر واحد. زرع 5 ملايين من خلايا نخاع العظم لكل فأر المتلقي عادة ضمان engraftment.
- قتل الفئران المانحة عن طريق خلع عنق الرحم دون تخدير (الطريقة المفضلة لتجنب التلوث الكيميائي للخلايا) ووضع كل فأر على لوحة ماصة.
- تطهير الجلد باستخدام رذاذ الإيثانول 70٪.
- جعل قطع عرضية صغيرة في الجلد تحت القفص الصدري وعقد الجلد بإحكام على جانبي الشق، المسيل للدموع في اتجاهين متعاكسين نحو الرأس والقدمين. قشر الجلد من جميع الأطراف.
- قطع على الكتفين ومفاصل الكوع، وإزالة العضلات المرفقة والأنسجة الضامة بمساعدة كيمويب للحصول على humeri.
- قم بخلع مفصل الورك بعناية بين عظم الفخذ وعظام الورك. استخدام مقص حاد لقطع على طول رأس عظم الفخذ وفصل الساقين. قطع على مفصل الركبة لفصل عظم الفخذ والساق، وإزالة بعناية العضلات المرفقة والأنسجة الضامة بمساعدة كيمويب لحصاد عظم الفخذ والساق.
ملاحظة: إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على البشرة العظام سليمة خلال هذه الخطوة. تجاهل أي كسور العظام بسبب فقدان العقم. يمكن جمع عظام الورك وعظام العمود الفقري بالإضافة إلى عظم الفخذ والساق وعظم العضد. لجمع عظام العمود الفقري، يمكن استخدام هاون والحشرات لسحق العظام إلى قطع وحصاد خلايا نخاع العظام. - وضع العظام المعزولة من الفئران من نفس النمط الجيني في أنبوب مخروطي 50 مل المقابلة التي تحتوي على 20 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني معقمة، ويبقيه على الجليد حتى مزيد من الاستخدام. إيلاء اهتمام خاص لوضع العظام بشكل صحيح في أنابيب مع الأنماط الجينية المتطابقة.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لكل المانحة تغيير قفازات بين كل فأر. أيضا، مقص نظيفة وغيرها من الصكوك مع الإيثانول 70٪ بين كل فأر.
4. عزل خلايا نخاع العظم
ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في خزانة فئة السلامة الحيوية II.
- إعداد مجموعات الأنبوب: قم بعمل ثقب صغير في الجزء السفلي من أنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 0.5 مل باستخدام إبرة 18 G ووضعه في أنبوب طرد دقيق معقم سعة 1.5 مل ، والذي يحتوي على 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم بارد الجليد في الأسفل.
ملاحظة: بما أن ستة عظام فقط يمكن أن تندرج في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.5 مل، فمن المستحسن إعداد مجموعات أنبوب كافية لمعالجة جميع العظام في نفس الوقت. - يستنشق برنامج تلفزيوني ونقل العظام المعزولة على طبق زراعة الخلايا 100 ملم معقمة. عقد كل العظام باستخدام ملقط ناعم، وقطع بعناية epiphyses قبالة كل نهاية باستخدام مقص الصغيرة التي تم تعقيمها في الأوتوكلاف. ضع العظام المقطوعة في مجموعات الأنبوب المعدة.
- طاردة مركزية الأنابيب في 10،000 س ز ل 35 s في 4 °C.
- بعد الطرد المركزي، تأكد من أن نخاع العظم قد تمت إزالته بنجاح من العظام. يجب أن تظهر العظام بيضاء وشفافة مع بيليه أحمر كبير نسبيا في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل. تجاهل أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.5 مل.
ملاحظة: إذا فشل الفحص البصري في الكشف عن نخاع العظم في الجزء السفلي من أنبوب 1.5 مل، اقطع العظم مرة أخرى وكرر الخطوة 4.3. - Resuspend نخاع العظم في 1 مل من الجليد البارد برنامج تلفزيوني، ثم نقل تعليق الخلية من نفس النمط الجيني إلى أنبوب مخروطي مطابقة 50 مل.
- فصل الخلايا عن طريق تمريرها من خلال إبرة 18 G مع حقنة 10 مل 10 مرات.
- تصفية تعليق خلية واحدة من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. إضافة إضافية الجليد الباردة PBS إلى حجم النهائي من 10 مل، وإعادة إنفاق الخلايا من خلال الاستخدام اللطيف للموازة المعونة.
- جهاز طرد مركزي عند 310 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أسبيرات supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 10 مل من وسائل الإعلام RPMI خالية من المصل. الغيار 30 ميكرولتر من هذه المواد لعد الخلية.
- تحديد تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية، وحساب حجم تعليق الخلية المطلوبة لزرع. على سبيل المثال من BMT 100٪، 5 × 106 خلايا نخاع العظام مطلوبة لكل ماوس المتلقي.
ملاحظة: للحصول على BMT تنافسية، وإعداد ما مجموعه 5 × 106 خلايا نخاع العظام التي تتألف من خليط من الخلايا المانحة (على سبيل المثال، CD45.2+) والخلايا المنافسة (على سبيل المثال، CD45.1+). ينصح بشدة بإعداد خلايا نخاع العظم الإضافية. على سبيل المثال، إذا كان هناك 10 فئران متلقية لكل مجموعة تجريبية، فإننا عادة ما نعد خلايا كافية ل 12 فأرا متلقيا. - نقل الحجم المحسوب لتعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 310 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- يستنشق supernatant وإعادة إنفاق الخلايا باستخدام المبلغ المحسوب من المتوسط RPMI خالية من المصل لتحقيق كثافة الخلية المناسبة وحجم. عادة، 200 ميكرولتر هو الحجم الأمثل للحقن المداري الرجعية.
5. زرع خلايا نخاع العظم للفئران المشععة
- تخدير الفئران المتلقية مع 5٪ isoflurane.
- في حين يتم تخدير الفئران، حقن ببطء 200 ميكروغرام من خلايا نخاع العظام في الوريد المداري الرجعية باستخدام إبرة 28-30 G مع حقنة الأنسولين.
- بدلا من ذلك، تنفيذ تسليم الخلايا المانحة عن طريق الحقن الوريد الوريدي الوريد الذيل وحقن الفخذ داخل الدم، مع الحد الأقصى لحجم 0.2 مل و 25 ميكرولتر، على التوالي.
- بمجرد حقن الخلايا ، ضع قطرة من قطرات العين المحتوية على البروباراكايين على سطح العين لتخفيف الألم. ويمكن بعد ذلك السماح للحيوان باستعادة وعيه.
6. زرع خلايا نخاع العظم للفئران غير مشروطة
- تخدير الفئران المتلقية عن طريق استنشاق 5٪ isoflurane.
- حقن 5 × 106 خلايا نخاع العظام غير المفرغة من أي من النمط الجيني الرجعية المداري في الفئران المتلقية غير المشععة مع حقنة الأنسولين 28-30 G.
- كرر الخطوتين 6.1 و 6.2 على مدى 3 أيام متتالية، بحيث يتم زرع الفئران المتلقية مع ما مجموعه 1.5 × 107 خلايا نخاع العظم.
ملاحظة: لأن BMT بالتبني دون إجراء ما قبل تكييف يتطلب زرع نخاع العظم لمدة 3 أيام متتالية، ينبغي للمرء أن يحاول عيون بديلة لكل حقنة. - بعد الحقن، وإدارة قطرة من قطرات العين التي تحتوي على البروباراكايين إلى العين المصابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لمقارنة تأثير ثلاث طرق BMT /ما قبل التكييف على زراعة الخلايا المانحة ، تم تحليل كسور الخلايا المانحة في الدم المحيطي وأنسجة القلب عن طريق قياس التدفق الخلوي في 1 شهر بعد BMT. كانت الخلايا المعزولة ملطخة بعلامات الكريات البيض المحددة لتحديد المجموعات الفرعية المختلفة من الكريات البيض. في هذه التجارب، تم تسليم خلايا نخاع العظم من النوع البري C57BL/6 (CD45.2) إلى WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) الفئران المتلقية لتمييز الخلايا المانحة من خلايا المستلم. وقد سبق أن وصف وانغ وآخرون9 استراتيجيات قياس التدفق الخلوي التي استخدمت في الشكل التكميلي 1.
تلقت المجموعة المعالجة بالإشعاع الكلي للجسم (TBI) 5 × 106 خلايا نخاع العظم بعد جرعة إشعاع قاتلة إجمالية قدرها 11 Gy في جزئين 5.5 Gy مفصولين بفاصل زمني قدره 4 ساعات. في الدم المحيطي للفئران المتلقية ، تم استئصال الخلايا الأحادية والعدلات والخلايا B إلى حد كبير واستبدالها بذرية الخلايا المشتقة من نخاع العظم المانحة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استبدال السكان monocyte القلب المقيمين والنيوتروف في قلوب الفئران المتلقية تماما تقريبا من قبل الخلايا المشتقة من المانحين(الشكل 2A).
في مجموعة التشعيع المحمية جزئيا ، تم تشعيع الفئران المتلقية بدرع الصدر وزرعها بخلايا نخاع العظم 5 ×10 6 بعد جرعة إشعاع إجمالية قدرها 11 Gy في جزئين 5.5 Gy مفصولين بفاصل زمني قدره 4 ساعات. وعلى النقيض من مجموعة TBI، كانت مساهمة الخلايا المشتقة من المانحين في الخلايا المناعية القلبية متواضعة، مما يعكس على الأرجح الآثار المشتركة لحماية الخلايا المناعية المحلية في قلوب الفئران المتلقية وإعادة السكان الفسيولوجية للخلايا المانحة المشتقة من نخاع العظم من الدم المحيطي. من المرجح أيضا أن تكون خلايا نخاع العظم الماوس المتلقي في المناطق المحمية قد ساهمت في إعادة تشكيل الدم المحيطي ، مما يقلل من النسبة المئوية للخلايا المشتقة من المتبرع في الدم المحيطي مقارنة بالمجموعة المعالجة TBI(الشكل 2B).
في المجموعة التي لا تحتوي على تكييف مسبق BMT (BMT بالتبني) ، تم زرع الفئران المتلقية بخلايا نخاع العظم 5 ×10 6 على مدى 3 أيام متتالية. في 4 أسابيع بعد BMT، كان الجزء من الخلايا المشتقة من المتبرعين في الدم المحيطي والقلب يمكن اكتشافه. (حوالي 5٪) (الشكل 2C).
لتوضيح كيفية تطبيق نموذج BMT بالتبني على دراسة نموذج CH ، تم زرع CD45.2+ خلايا نخاع العظم المانحة(WT أو Tet2-/-) في CD45.1+ الفئران المتلقية. تم زرع المتلقين دون تكييف مع 5 × 106 خلايا نخاع العظام كل يوم لمدة 3 أيام متتالية (لما مجموعه 1.5 × 107، ن = 5-6 لكل مجموعة). تم إجراء تحليل التدفق الخلوي للدم المحيطي بعد 4 و8 و12 و16 أسبوعا بعد الزرع. وقد منحت الخلايا المانحة التي تعاني من نقص في Tet2 ميزة تنافسية وتوسعت تدريجيا مع مرور الوقت؛ WBCs، monocytes، Ly6Cمرحبا monocytes، العدلات، الخلايا التائية، والخلايا B زادت بشكل كبير مع مرور الوقت. بالمقارنة مع الخلايا المانحة Tet2 ناقصة المحتقن في الفئران المتلقية، وأظهرت الفئران المتلقية المحتقن مع الخلايا المانحة WT التوسع التخفي أقل أهمية من الخلايا المانحة (الشكل 3). بما يتفق مع النموذج السريري للهيماتوبويز الكلونال ، فإن توسع الخلايا الناقصة Tet2 لا يؤثر على الأرقام المطلقة لمختلف أنواع خلايا الدم9 (البيانات غير المعروضة).
الشكل 2: تحليل التدفق الخلوي للدم والقلب باستخدام طرق مختلفة من الشروط المسبقة. تم إجراء تحليل تدفق الخلايا للدم المحيطي والقلب بعد شهر واحد من زرع نخاع العظم. لتمييز الخلايا المانحة عن خلايا المستلمين، تم زرع فئران CD45.1+ متلقية مع CD45.2+ خلايا نخاع العظم المانحة. (أ) 5 × 106 خلايا نخاع العظم وزرعت بعد جزئين من مجموع تشعيع الجسم (2 × 5.5 غراي، 4 ساعة الفاصل الزمني، ن = 3). (ب) 5 × 106 خلايا نخاع العظم وزرعت بعد جزئين من مجموع تشعيع الجسم مع درع الصدر (2 × 5.5 غراي، 4 ساعة الفاصل الزمني، ن = 10). (ج) تم زرع متلقين بدون تكييف بخلايا نخاع العظم 5 ×10 6 لمدة 3 أيام متتالية (بإجمالي 1.5 × 107، ن = 4). يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM. يتم تعريف إجمالي WBCs على أنه CD45+؛ العدلات كما Ly6G+; Ly6Cمرحبا monocytes كما CD115+، Ly6G--، وLy6C+؛ Ly6Cلو monocytes كما CD115+، Ly6G--، وLy6C--؛ خلايا B ك CD45R+; CD4+ T خلايا كما CD3e+ وCD4+؛ CD8+ الخلايا التائية كما CD3e+ وCD8+؛ والماكروفاجز كما CD64+، Ly6G--، وLy6C--. (البنك الدولي: خلايا الدم البيضاء، نيوت: العدلات، مونو: monocytes، ماك: الضامة). الشكل 2A,C تم تعديل من وانغ وآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التوسع الكلونالي للخلايا التي تعاني من نقص Tet2 باستخدام BMT بالتبني للفئران غير المكيفة. CD45.2+ خلايا نخاع العظم المانحة (WT أو Tet2-/-) تم زرعها في CD45.1+ الفئران المتلقية. تم زرع المتلقين دون تكييف مع 5 × 106 خلايا نخاع العظام كل يوم لمدة 3 أيام متتالية (لما مجموعه 1.5 × 107، ن = 5-6 لكل مجموعة). تم إجراء تحليل التدفق الخلوي للدم المحيطي بعد 4 و 8 و 12 و 16 أسبوعا بعد الزرع. يظهر جزء من CD45.2+ الخلايا المانحة في كل مجموعة سكانية. (أ) WBCs (ب) أحادية (C) Ly6Cمرحبا أحادية (D) B خلايا (E) T الخلايا. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± يتم تعريف SEM. WBCs على أنها CD45+؛ العدلات كما Ly6G+; Ly6Cمرحبا monocytes كما CD115+، Ly6G--، وLy6C+؛ Ly6Cلو monocytes كما CD115+، Ly6G--، وLy6C--؛ خلايا B ك CD45R+; CD4+ T خلايا كما CD3e+ (WT: البرية من نوع، WBCs: خلايا الدم البيضاء، مونو: monocytes) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لدراسات الهيماتوبويز الكلوة، وصفنا ثلاث طرق لBMT: BMT مع تشعيع الجسم الكلي، BMT مع التشعيع مع التدريع الجزئي، وطريقة BMT أقل استخداما التي لا تنطوي على تكييف مسبق (BMT بالتبني). وقد استخدمت هذه الأساليب لتقييم تأثير الهيماتوبويزات اللاستنساخية على أمراض القلب والأوعية الدموية. يمكن للباحثين تعديل هذه الطرق وفقا لذلك لتناسب الغرض المحدد من دراستهم.
نماذج كلونال للدم
الهيماتوبويز الكلوي هو الظاهرة التي تتنافس فيها الخلايا الدموية المتحولة مع الخلايا البرية والحصول على هيمنة كلونية مع مرور الوقت. لإنشاء نموذج لهذه المسابقة ، يمكن إعطاء الفئران نخاع العظم ، والذي يتكون من خليط من خلايا مختلفة وراثيا. وعموما، سيشمل هذا الخليط خلايا متحولة وبرية، وصفت بعلامة فلورية أو علامات مختلفة للكريات البيض (أي CD45.1 وCD45.2). على سبيل المثال، عند إنشاء نماذج تحاكي Tet2-بوساطة CH، نقوم بإجراء زراعة نخاع عظمي تنافسية في متلقين مشععين بشكل قاتل والتي تنطوي عادة على خلط 90٪ من الخلايا التي تنشأ من CD45.1 Tet2+/+ المتبرعين و 10٪ من الخلايا التي تنشأ من CD45.2 Tet2-/-، Tet2+/- أو التحكم Tet2+/+ المتبرعين8. تدفق كشف قياس الخلايا من المتغيرات CD45 باستخدام أجسام مضادة أحادية النسيلة محددة تمكن المرء من التمييز بين الخلايا المانحة (CD45.1-/ CD45.2+) من الخلايا المنافسة (CD45.1+/ CD45.2- -) داخل الدم ، وتقييم الديناميات اللاستنساخية للخلايا الاختبار مع مرور الوقت. من خلال القيام بذلك ، تمكنا من ملاحظة زيادة تدريجية في الشهم المانح للخلايا التي تعاني من نقص Tet2 ، في حين أن النسبة المئوية للخلايا البرية لا تزال عند حوالي 10٪. يحاكي هذا الإعداد التجريبي السيناريو البشري للأفراد الذين يحملون طفرة جسدية TET2 ، لأن هذه الطفرات يتم حملها في البداية من قبل عدد صغير من HSPCs ، والتي ستتوسع تدريجيا بمرور الوقت. وقد أدى استخدام هذا النهج في نماذج أمراض القلب والأوعية الدموية من تصلب الشرايين وفشل القلب إلى توثيق وجود علاقة سببية محتملة بين Tet2-بوساطة CH وCVD8,9,10.
وعند استخدام هذه النهج، ينبغي للباحثين أن يأخذوا في الاعتبار الآثار المحيرة المحتملة الناجمة عن ال TBI. على الرغم من أن TBI قبل زرع تمكن درجة عالية من engraftment HSPC، وهذا ما قبل تكييف يؤدي إلى عدة آثار غير مرغوب فيها خارج نظام الدم. وقد تم توثيق أن TBI يمكن أن يؤدي إلى التهاب, إصابة, والتليف في أنظمة الجهاز متعددة بما في ذلك الجلد, كبد, الكلى, الرئتين, نخاع العظام, قلب, الدماغ,إلخ. هذه الآثار الجانبية يمكن أن تؤثر سلبا على أجهزة القلب والأوعية الدموية قيد الدراسة، وأنها تغير أيضا مرض الأمراض المسببة للأمراض21،22. ومن الأمثلة البارزة على ذلك تأثير التشعيع على الضامة المقيمة في القلب. يؤدي تشعيع الصدر إلى استبدال ملحوظ لل الضامة المقيمة في القلب مع الضامة المشتقة من monocyte المتداولة. وقد أظهرت الدراسات أن الضامة المقيمة في القلب تظهر خصائص متميزة بالنسبة لل الضامة المشتقة من monocyte المتداولة التي سوف تغرم في القلب بعد إصابة الإشعاع. في إعدادات المرض ، يعتقد أن الضامة المقيمة في القلب تلعب دورا في حماية القلب ، في حين تم الإبلاغ عن تسلل الضامة المنقولة بالدم لتعزيز الإصابة والالتهاب23. لذلك ، من المتصور أن استبدال الخلايا المناعية القلبية المقيمة بخلايا محمولة بالدم سيغير العمليات المرضية قيد الدراسة ، والتي تساهم في أمراض القلب والأوعيةالدموية24و25و26. وبالمثل ، في الدماغ ، يؤدي TBI إلى استنفاد microglia المقيم واستبداله بالبوابير المشتقة من المحيطية27،28. في حين أن الضامة المشتقة من المحيطية يمكن أن تتصرف مثل الخلايا المجهرية ، فإنها تحافظ على هوية وظيفية ونسخية فريدة مقارنة بالميكروجليا المشتقة من monocyte28. لذلك ، من الممكن أن يتم تغيير تتمة المرض ، خاصة عند دراسة أمراض مثل السكتات الدماغية. من أجل تجنب هذه الآثار المحيرة، يمكن التوصية بحماية الصدر والرأس. وهذا مفيد لأنه يوفر الحماية للقلب والدماغ، على التوالي. ويحافظ أيضا على خلايا المناعة المقيمة سليمة ، وتلخيص أفضل للحالة البشرية لCH. ومع ذلك ، كما لوحظ سابقا ، فإن التدريع يؤدي إلى انخفاض معدل الشهم مقارنة بالتكييف المسبق ل TBI ، والذي يقضي بشكل أساسي على جميع خلايا الدم في المضيف.
عائق مهم آخر في مرحلة ما قبل التكييف هو تأثيره الضار على مكانة نخاع العظم. وعلى الرغم من أنه يمكن استعادة الضرر الناجم عن الإشعاع في مكانة BM إلى حد دون المستوى الأمثل، فمن غير الواضح ما إذا كان يتم استرداد حالات الهيماتوبويز الساذجة في هذه البيئات الدقيقة التالفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن زرع مركبات الكربون الهيدروفلورية المختلطة في BM فارغة يبدأ سباقا للانتشار بين المستنسخين، بدلا من "المنافسة" البسيطة على مكانة تحتلها HSPC من النوع البري - وهو ما يحدث على ما يفترض في CH. وهكذا، قد يكون النهج الأفضل لدراسة CH هو طريقة BMT بالتبني، حيث يتم نقل خلايا BM إلى الفئران المتلقية دون تكييف مسبق. هذا BMT بالتبني دون طريقة ما قبل تكييف يؤثر الحد الأدنى من الدم السذاجة الجارية، الأكثر بأمانة تلخيص CH لوحظ في البشر29. يظهر الشكل 2C مستوى الشهم في 1 شهر بعد الزرع دون تكييف مسبق. في حين أن chimerism المانحة منخفضة في هذه النقطة الزمنية المبكرة ، نجد جزءا متزايدا تدريجيا من المستنسخين Tet2 ناقصة مع مرور الوقت ، كما هو معروض في الشكل 3. وتجدر الإشارة إلى أن هذا النموذج هو الأكثر فائدة عندما يكون للخلايا المتحولة ميزة تنافسية على الخلايا البرية في ظل ظروف الهوديستاتيكي مثل الخلايا التي تعاني من نقص Tet2. عندما يتم إصابة الخلايا الناقصة Tet2 ، هناك توسع ملحوظ في مجموعات الكريات البيض المختلفة مثل العدلات والخلايا الأحادية وخلايا NK والخلايا B. ولوحظ توسع أبطأ في الخلايا التائية، ويفترض أن ذلك يرجع إلى طول نصف عمر هذه الفئة من السكان.
وقد لوحظ توسع الخلايا التي تعاني من نقص Tet2 ليس فقط في الدم المحيطي ولكن أيضا في العديد من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك نخاع العظام والكبد والكلى، مع ديناميات مختلفة من إعادة تشكيل الخلايا الدموية9. على سبيل المثال، وصفت ورقة مختبرنا المنشورة السابقة الشهم خلايا نخاع العظم من WT و Tet2-ناقص الخلايا المانحة المحفورة في الفئران المتلقي CD45.1 8 أشهر بعد BMT9بالتبني . أظهرت الخلايا المانحة الناقصة Tet2 المزروعة في فئران CD45.1 المتلقية ميزة تنافسية على النسب غير الناضج-خلايا Sca1+c-Kit+ (LSK) ، وخلايا HSC قصيرة الأجل وطويلة الأجل ، وسلف متعددة القدرات (MPPs) مقارنة بخلايا WT المانحة المزروعة في الفئران المتلقية CD45.1. وبالإضافة إلى ذلك، كما Tet2-نقصالخلايا المانحة الفئران المتلقية المحتقن، فإنها تتطور النمط الظاهري اعتلال عضلة القلب المرتبطة بالعمر دون عوامل خارجية تسبب خلل القلب، وبالتالي تلخيص تأثير الهيماتوبويز الكلوية بطريقة مماثلة لتلك التي من البشر الشيخوخة. ورافق هذه الملاحظة مع زيادة درجة من الشيميرية في العدلات القلبية وLy6Cمرحبا monocytes. بشكل جماعي ، يمكن تطبيق نظام BMT بالتبني هذا على الدراسات المستقبلية التي يمكن أن توسع فهمنا للارتباط بين تطور أمراض القلب والأوعية الدموية وداء الدم الشهني على مستوى أكثر تقدما.
باختصار، وصفنا ثلاث طرق BMT وناقشنا تطبيقها في توليد نماذج CH. ويرتبط CH مع التكهنات أفقر في أمراض القلب والأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين وفشل القلب. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير، فإن دراسة الروابط السببية بين CH وCVD لا تزال في مراحلها الأولى، ويلزم إجراء مزيد من التحقيقات من خلال استخدام نماذج حيوانية محسنة. نأمل أن تسمح هذه البروتوكولات للباحثين باختيار طريقة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية ل BMT ، والتي تعمل على الحد الأدنى من الآثار المحيرة المحتملة على نظام القلب والأوعية الدموية ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى دراسات توسع فهمنا لكيفية مساهمة CH في أمراض القلب والأوعية الدموية.
تصميم التدريع الرصاص
سمك الدرع الرصاص سوف تمليه نوع من الإشعاع المستخدمة للحث على النقوي. تستخدم الأشعة السينية أو أشعة غاما بشكل متكرر في النقوي التجريبي ولكنها تختلف من حيث تواترها وطول موجتها وطاقتها الفوتونية. عندما يتعلق الأمر التدريع، طاقة الفوتون، الذي يصف الطاقة أو السرعة التي تنتقل الأشعة، هو المعلمة الأكثر أهمية. وعادة ما تكون طاقة الأشعة السينية مصدر الإشعاع 160 كيلوفولت في حين أن مصادر السيزيوم-137، التي تنبعث منها أشعة غاما، لديها طاقة تبلغ 662 كيلوفولت. الطاقة المنبعثة من هذه المصادر الإشعاعية يعادل قوتها الاختراق، مع الطاقات العالية لديها قوة اختراق أكبر. ولذلك، يلزم زيادة سمك درع الرصاص عند استخدام مشعات مصدر السيزيوم بالمقارنة مع استخدام المشعات القائمة على الأشعة السينية. يتطلب التشعيع القائم على الأشعة السينية، والذي نستخدمه عند إجراء التدريع الصدري والبطني، درعا رصاصيا سميكا يبلغ سمكه 7 مم لتوفير حماية كافية. ومع ذلك ، بالنسبة لمصادر السيزيوم 137 ، والتي نستخدمها عندما نقوم بحماية الرأس ، تتطلب أن تكون دروع الرصاص سميكة على الأقل 1 بوصة لتوفير حماية كافية.
ويمكن شراء دروع الرصاص للاستخدام في أجهزة الأشعة السينية من البائعين التجاريين. بدلا من ذلك، يمكن قطع أوراق الرصاص إلى الحجم لتناسب إما حول جسم الحيوان أو لتناسب حول المقيد (انظر الشكل 1). عند استخدام المشعع القائم على السيزيوم ، يجب استخدام الطوب الرصاصي ، الذي هو أكثر سمكا إلى حد كبير ويمكن أن تكون مخصصة من قبل الشركات المتخصصة في صنع هذه الأنواع من الدروع. على سبيل المثال، بالنسبة للرأس، قمنا بتصميم لبنة رصاص لعقد 50 مل من الأنابيب المخروطية (انظر الشكل 1F). الحيوان قادر على احتواء داخل المقيد، الذي يتم بعد ذلك مشقوق في حفرة مصنوعة في الطوب، لتوفير 1.5 بوصة من الحماية من التشعيع. والأهم من ذلك، ينبغي أن تكون جميع دروع الرصاص مغلفة إما بالطلاء أو الشريط لمنع التعرض لغبار الرصاص، الذي يمكن أن يكون ساما.
واستنادا إلى المعدات ومعلماتها، يمكن للباحثين تصميم دروعهم الرصاص الخاصة لمواقعهم ذات الاهتمام. هنا، قدمنا الصدر والبطن، ودرع الرأس. ومع ذلك ، يمكن اعتبار مواقع أخرى مثل الطرف أو الجناح للدرع أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن كلا من مصادر الإشعاع (سيزيوم-137 والأشعة السينية) هي مناسبة لاجتثاث نخاع العظام والغرائب الناجحة، لوحظ تباين في إعادة تشكيل مجموعات الخلايا اللمفاوية والمايلويد بين مصادر الإشعاع السيزيوم-137 والأشعة السينية30. وبالتالي، ينبغي للباحثين أن يأخذوا في الاعتبار الاستجابات الفسيولوجية المتباينة لمصدر الإشعاع لاستخدامها في الدراسات.
فترات الزواية
قد تؤثر فترات الجرعة والجرعات على كفاءة معدلات ممارسة الحرمان من الخلايا المانحة والبقاء على قيد الحياة. في المرضى البشر، يمكن أن يسبب الإشعاع بجرعة عالية الالتهاب الرئوي الخلالي مجهول السبب، وإصابات الجهاز الهضمي، وتشكيل إعتام عدسة العين. في نماذج الماوس، يمكن أن يؤدي التشعيع أحادي الجرعة العالية متبوعا بزرع نخاع العظم إلى نتائج مماثلة ويمكن أن يؤثر أيضا على معدلات البقاء على قيد الحياة31. لذلك، يوصى تشعيع مجزأة للغاية لدراسات BMT الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر فترات الغسل من الكسور معدل بقاء الماوس ومعدل إعادة تشكيل، مما يؤدي إلى كسور مختلفة من الشهم الخلية المانحة في الأعضاء الدموية، فضلا عن الأنسجة الأخرى31. وبالتالي، يجب على الباحثين توخي الحذر في تصميم جدول زمني مجزأ لتقطير الإشعاع لدراسات BMT.
في سياق معدل البقاء على قيد الحياة وإعادة تشكيل الخلايا المناعية، أظهرت دراستنا الصغيرة أن مجموعة من الفئران التي تتلقى إشعاع الجسم الكلي بجرعة إشعاع قاتلة من 11 Gy في جزئين 5.5 Gy مفصولة بمجموعة فاصلة 24 ساعة لم يكن لها نتائج مختلفة بشكل كبير عن المجموعة التي تلقت نفس جرعة TBI على فاصل زمني 4 ساعة (انظر الجدول 1). ومع ذلك، مع BMT درع الصدر، يبدو أن مجموعة الفاصل الزمني 24 ساعة لإظهار كفاءة أقل من chimerism الخلية المانحة بالمقارنة مع مجموعة الفاصل الزمني 4 ساعة. والتفسير المحتمل لهذه النتيجة هو أن التشعيع بفاصل زمني 24 ساعة قد لا يكون كافيا لإزالة الخلايا المنافسة المناعية للمستلم لأن الفواصل الزمنية المطولة أعطت الفئران المتلقية وقتا كافيا لإصلاح الخلايا التالفة. بالإضافة إلى ذلك، يحمي التدريع الصدري عظام العمود الفقري الجزئية التي تحتوي أيضا على HSCs للمستلم. وهكذا، فإن الخلايا المتلقية المتبقية والمستمدة من المناعة قد هاجمت الخلايا المشتقة من الجهات المانحة وحرضت على نتيجة أظهرت كفاءة أقل في الحرمان.
| WBC (٪) | الخلية B (٪) | خلية T (٪) | أحادية (٪) | Ly6Cمرحبا أحادية (٪) | Ly6Cلو مونو (٪) | العدلات (٪) | ||
| TBI-BMT | فاصل زمني 4h | 97.4 ± 1.0 | 100 ± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| فاصل زمني 24h | 97.2 ± 2.2 | 100 ± 0 | 79.0 ± 8.1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| الصدر التدريع BMT | فاصل زمني 4h | 56.2 ± 4.0 | 54.2 ± 6.2 | 0.5 ± 0.1 | 66.7 ± 6.1 | 63.8 ± 6.3 | 70.8 ± 5.7 | 82.0 ± 3.8 |
| فاصل زمني 24h | 34.4 ± 3.1 | 34.8 ± 3.1 | 2.9 ± 1.7 | 45.0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56.2 ± 4.9 | 56 ± 10.0 | |
الجدول 1: كفاءة ممارسة الحرمان من خلايا المانحين باستخدام فترات زمنية مختلفة للتعاطي. تم إجراء تحليل التدفق الخلوي للدم المحيطي بعد شهر واحد من زرع نخاع العظم. WT CD45.2+ تم زرع خلايا نخاع العظم المانحة في CD45.1+ الفئران المتلقية. 5 x 106 تم زرع خلايا نخاع العظم بعد كسرين من إجمالي تشعيع الجسم (2 × 5.5 Gy) مع أو بدون حماية الصدر مفصولة بفاصل زمني 4 ساعات أو 24 ساعة. (ن = 3-4 لكل مجموعة).
العناية بالحيوانات
هناك حاجة إلى خطوات متعددة تنطوي على الفئران لنجاح هذه التجربة. وبالتالي، يلزم إيلاء اهتمام إضافي في النقاط التالية: أولا، إن تسليم خلايا مانحة قابلة للحياة أمر بالغ الأهمية لنجاح الإغراء. وينبغي تدريب واحد بشكل صحيح في جمع خلايا BM سليمة وحقنها في الفئران المتلقي. وتشمل عواقب سوء ولادة الخلايا فشل الجهات المانحة HSPCs في إعادة تشكيل نخاع العظم المتلقي مما يؤدي إلى الوفاة. ثانيا، يجب توخي الحذر بعد الزرع لتجنب العدوى، لا سيما بعد العلاج النقوي. يمكن أن يكون الاتصال بمسببات الأمراض قاتلا ، حيث تصبح الفئران مصابة بمناعة عابرة بعد التشعيع. وكما هو مبين أعلاه، فإن تكميل مياه الشرب بالمضادات الحيوية يمكن أن يقلل من خطر الإصابة بالعدوى القاتلة. وعلاوة على ذلك، يمكن تزويد الحيوانات المتلقية مع هلام التغذية / الترطيب تقليل الجفاف ونقص التغذية التي قد تحدث بعد التشعيع، كما يمكن للإشعاع تعطيل ظهارة الأمعاء مما يؤدي إلى الإسهال32. كما ينبغي استبدال الأقفاص في كثير من الأحيان للحد من خطر تلوث بكتيريا البراز، وينبغي التعامل مع الحيوانات في محطة نقل الحيوانات المناسبة، وينبغي مراقبة الفئران المتلقية بعناية لفقدان الوزن وأي علامات على الضيق أو الألم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة المنح إلى ك. والش (HL131006، HL138014، وHL132564)، إلى سانو (HL152174)، منحة جمعية القلب الأمريكية إلى م. أ. إيفانز (20POST35210098)، ومنحة مؤسسة القلب اليابانية إلى H. Ogawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
