Summary
우리는 골수 이식의 세 가지 방법을 설명 (BMT): 총 몸 조사와 BMT, 차폐 조사와 BMT, 그리고 마우스 모델에서 클로날 조혈의 연구를위한 사전 컨디셔닝 (입양 BMT)와 BMT 방법.
Abstract
클론 조혈은 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)에서 체세포 돌연변이의 축적에서 유래 널리 퍼지는 연령 관련 상태입니다. 드라이버 유전자에 있는 돌연변이, 그 세포 적합성을 부여하는, 점점 체세포 돌연변이를 품고 자손 백혈구를 초래하는 HSPC 클론확장의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 클로날 조혈은 심장 질환, 뇌졸중 및 사망률과 관련이 있기 때문에 이러한 프로세스를 모델링하는 실험 시스템의 개발은 이 새로운 위험 요소의 밑에 있는 메커니즘을 이해하는 데 핵심적입니다. 총 신체 조사 (TBI)와 같은 마우스에서 골수 이식 과 관련된 골수 이식 절차는 일반적으로 심혈관 질환에서 면역 세포의 역할을 연구하기 위해 사용됩니다. 그러나, 골수 틈새 시장 및 관심의 다른 사이트에 동시 손상, 심장과 두뇌 등, 이러한 절차와 피할 수. 따라서, 우리의 실험실은 TBI에 기인한 가능한 부작용을 최소화하거나 피하기 위하여 2개의 다른 방법을 개발했습니다: 1) 조사 차폐를 가진 골수 이식 및 2) 비 조건화 마우스에 입양 BMT. 보호 된 기관에서, 지역 환경은 상주 면역 세포의 기능이 흔들리지 않는 동안 클로날 혈종의 분석을 허용 보존된다. 대조적으로, 비조건 마우스에 대한 채택 BMT는 장기와 조혈 틈새 시장이 모두 보존된다는 추가적인 이점이 있다. 여기에서, 우리는 3개의 다른 조혈 세포 재구성 접근을 비교하고 심장 혈관 질병에 있는 클론 조혈의 연구 결과를 위한 그들의 강점 그리고 한계를 토론합니다.
Introduction
클로날 조혈(CH)은 노인 개인에서 자주 관찰되는 상태이며,유전돌연변이를운반하는 확장된 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC) 클론의 결과로 발생한다. 그것은 50의 나이에 의해, 대부분의 개별은 각 HSPC2에있는 5개의 엑소닉 돌연변이의 평균을 취득할 것이라는 점을 건의되었습니다, 그러나 이 돌연변이의 대부분은 개별에 거의 또는 전혀 현상상 결과를 초래할 것입니다. 그러나, 우연히 이러한 돌연변이 중 하나가 HSPC에 경쟁 우위를 부여하는 경우-이러한 확산을 촉진 하 여, 자기 갱신, 생존, 또는 이들의 일부 조합-이 다른 HSPC에 비해 돌연변이 클론의 우대 확장으로 이어질 수 있습니다. 그 결과, 돌연변이는 돌연변이된 HSPC가 성숙한 혈액 세포를 초래하기 때문에 조혈 계통을 통해 점점 더 퍼질 것이고, 말초 혈액 내의 돌연변이 된 세포의 뚜렷한 인구로 이끌어 냅니다. 수십 개의 상이한 후보 운전자 유전자에서 돌연변이가 조혈 시스템 내의 클로날 이벤트와 연관되어 있지만, 이들 중 DNA 메틸트랜스퍼라제 3알파(DNMT3A)와1011개의 전좌2(TET2)의돌연변이가 가장 널리 퍼진3이다. 몇몇 역학 연구는 이 유전 돌연변이를 전송하는 개별이 심장 혈관 질병 (CVD), 치기 및 모든 인과 사망률3,4,5,6,7의현저하게 더 높은 리스크가 있다는 것을것을을 발견했습니다. 이 연구 결과는 CH와 CVD와 치기의 증가한 부각 사이 협회가 존재한다는 것을 확인했습니다, 우리는 이 관계가 인과 관계인지 또는 노화 과정과 공유 된 epi현상인지 모릅니다. 이 협회를 더 잘 이해하려면 CH의 인체 상태를 올바르게 재구성하는 적절한 동물 모델이 필요합니다.
몇몇 CH 동물 모형은 제브라피쉬, 마우스 및 비인간 영장류를사용하여 우리 그룹 및 그 외에 의해 설치되었습니다8,9,10, 11,12,13,14. 이 모형은 수시로 유전자 변형된 세포의 이식에 의하여 조혈 재구성 방법을, 때때로 Cre-lox 재조합 또는 CRISPR 시스템을 사용하여 이용합니다. 이 접근은 질병 발달에 기여하는 방법을 평가하기 위하여 조혈 세포에 있는 특정 유전자 돌연변이의 분석을 허용합니다. 또한, 이러한 모델은 종종 정상 또는 야생 형 세포에서 돌연변이 세포의 효과를 구별하기 위해 자생 또는 리포터 세포를 사용합니다. 많은 경우에, 사전 조절 식이요법은 성공적으로 기증자 조혈 줄기 세포를 이식하는 데 필요합니다.
현재, 수취인 마우스에 골수의 이식은 두 가지 주요 범주로 나눌 수 있습니다: 1) 골수 조절 및 2) 비조건 이식. 골수성 컨디셔닝은 두 가지 방법 중 하나에 의해 달성 될 수있다, 즉, 총 신체 조사 (TBI) 또는 화학 요법(15. TBI는 수신자에게 감마 또는 X선 조사의 치명적인 복용량을 복종하여 급속하게 분할하는 세포 내에서 DNA 나누기 또는 교차 링크를 생성하여 돌이킬 수 없는16을렌더링하여 수행됩니다. Busulfan과 사이클로포스파미드는 조혈 틈새 시장을 방해하고 유사하게 세포를 급속하게 분할하는 DNA 손상을 일으키는 두 개의 일반적으로 사용되는 화학요법 약물입니다. 골수성 사전 조절의 결과는 조혈 세포의 세포, 수령인의 조혈 시스템을 파괴. 이 전략은 기증자 HSPC의 성공적인 이식을 허용할 뿐만 아니라 수령인의 면역 체계를 억제하여 이식 거부를 방지할 수 있습니다. 그러나, 골수성 전조는 조직 및 장기 및 그들의 상주 면역 세포에 손상 과 같은 가혹한 부작용을 가지고 있고 토착 골수 틈새 시장17의파괴. 따라서, 이러한 바람직하지 않은 부작용을 극복하기 위해 대안 적 방법이 제안되었습니다, 특히 관심기관의 손상에 관한. 이러한 방법은 비조건마우스9,17에받는 마우스와 입양 BMT의 차폐 조사를 포함한다. 납 장벽의 배치에 의해 조사에서 흉부, 복강, 머리 또는 다른 영역을 차폐하는 것은 조사의 손상 효과로부터 보호 관심의 조직을 유지하고 거주 면역 세포 인구를 유지합니다. 한편, 비조건 마우스에 대한 HSPC의 BMT는 토착 조혈 틈새 시장을 보존하기 때문에 추가적인 이점이 있다. 이 원고에서, 우리는 마우스에 있는 몇몇 이식 식이요법 후에 HSPC 이식의 프로토콜 그리고 결과를 기술합니다, 특히 TBI 마우스에 HSPC의 납품, 방사선으로부터 부분적으로 차폐된 마우스에, 및 비 조건화마우스에. 전반적인 목표는 연구원이 CH와 심장 혈관 질병의 설정에 있는 실험 결과에 어떻게 영향을 미치는지 뿐만 아니라 각 방법의 다른 생리적인 효력을 이해하는 것을 돕는 것입니다.
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Protocol
동물 과목과 관련된 모든 절차는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 사전 조정 하기 전에
- 수신자 마우스를 항생제 보충 수역(5m 설페스토사졸, 0.86 mM trimethoprim)에 배치하여 조사 전에 ~24시간. 이것은 감염을 방지하기 위하여 필요합니다, 면역 계통은 조사 다음 억압될 것이고, 조사 다음 2 주 동안 유지될 것이기 때문에. 이 시점에서, 먹이 를 장려 하 고 조사 후 체중 감량과 탈수 방지 하기 위해 영양/수분 젤으로 마우스를 보충.
그림 1: 다양한 사전 컨디셔닝 설정을 보여주는 이미지입니다. (A)감마선(Cesium-137)을 이용한 파이케이지 총 신체 조사 설정): 방사선 빔은 y축 방향(수평 방사선)에서 조사자의 뒤쪽에서 나온다. (B)마우스 케이지 엑스레이를 이용한 마우스 케이지 총 신체 조사 설정: 마우스 케이지가 반사 챔버에 배치된다. 방사선 빔은 원뿔 (수직 방사선)의 모양으로 조사자의 상단에서 온다. 방사선 소스에서 케이지까지의 거리는 X선 조사기의 530mm.(C) 조절 가능한 트레이입니다: 이 설정은 X-ray를 사용하여 부분적으로 차폐된 조사에 사용됩니다. 방사선 빔은 원뿔 (수직 방사선)의 모양으로 조사자의 상단에서 온다. 방사선 소스에서 트레이까지의 거리는 373mm이고 반경은 250mm(D) 흉부 차폐: 마취마우스가 트레이위에 놓입니다. 마우스는 팔과 다리가 완전히 확장된 척추 위치에서 서로 반전됩니다. 리드 쉴드의 하부는 시피스테넘 뼈와 상단과 흉선과 정렬됩니다. (E)복부 차폐: 마취마우스는 탄문과 다이어프램 아래의 상부 엔드와 정렬된 납 쉴드의 하부 끝을 가진 흉부 차폐 셋업에서와 같이 배치된다. (F)감마선(세슘-137)을 이용한 헤드 차폐 조사 설정: 마취된 마우스의 앞발포진이 아래로 테이핑되고 마우스는 원추형 제지제에 배치됩니다. 검은 색 납 쉴드(표시된 표시)가 마우스의 머리와 귀를 덮습니다. 방사선 빔은 Y축(수평 방사선)의 방향으로 조사자의 뒤쪽에서 나온다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 받는 쥐의 사전 조정 (선택 사항)
- 총 신체 조사
- 수신자 마우스를 균일하게 얇게 썬 파이 케이지 또는 계산된 반경 내의 반사 챔버에 마우스 케이지를 배치하여 동일한 조사 용량을 받는 경우; 그러나, 파이 케이지 당 최대 8 마우스와 마우스 케이지 당 5 마우스는 균일 한 조사를 보장하는 것이 좋습니다(그림 1A, B).
- 완전한 골수 절제술을 달성하기 위해, 수령마우스가 4-24 h 간격으로 분리된 2개의 5.5 Gy 분획에서 11Gy의 총 방사선 량을 수신하도록 합니다.
참고: 분수 사이의 4시간 간격을 구현하여 최적의 이식을 얻을 수 있지만, 이는 24h 간격으로 확장될 수 있으며, 이는 노동 및/또는 조사자가 사용할 수 없을 때 도움이 될 수 있습니다.
- 부분적으로 차폐된 조사
- 케타민(80-100 mg/kg)과 자일라진(5-10 mg/kg)의 인계 주사로 받는 마우스를 마취시킵니다. 마우스 이동의 구속은 차폐 과정에서 표적 기관의 균일한 조사와 효과적인 보호를 보장하는 데 중요합니다.
- 흉부 및 복부 차폐의 경우 X 선 조사자의 방사선 빔을 마우스로 수직으로 방향을 지정합니다(도1C).
- 마취된 마우스를 평평한 접시에 배치하여 위에서 방사선 원을 중심으로 합니다. 마우스를 팔과 다리가 완전히 확장한 척추 위치에 서로 반전된 마우스를 놓습니다(그림1D, E).
참고: X선 조사시설(X선 조사시설)은 이 실험을 위해 한 번에 두 마리의 마우스를 균일한 조사를 허용하는 효과적인 반경 내에 배치할 수 있도록 합니다. 유효 반경은 방사선 원과 트레이 사이의 거리에 따라 계산되지만, 동시에 조사 할 수있는 동물의 수는 특정 조사에 따라 달라집니다. - 마우스의 발을 테이프를 사용하여 접시에 고정하여 마우스가 조사 절차 중에 고정되도록 합니다. 보호가 필요한 영역을 커버하도록 리드 차폐를 배치합니다.
- 흉부 차폐의 경우 마우스의 xiphisternum 뼈에서 흉선까지의 길이를 측정하고 조사 소스로부터 충분한 보호를 제공하는 두께를 계산하여 납 보호막을 준비하십시오. 아래쪽 끝이 xiphisternum 골격과 정렬되도록 리드 차폐를 배치합니다. 리드 장벽의 상부 끝은 흉선(그림 1D)근처에 맞습니다.
- 복부 차폐의 경우 마우스의 항문에서 다이어프램까지의 길이를 측정하고 조사 소스로부터 충분한 보호를 제공하는 두께를 계산하여 리드 쉴드를 준비합니다. 아래쪽 끝이 항문과 정렬되도록 리드 차폐를 배치합니다. 리드 쉴드의 상부 끝이 다이어프램(도1E)아래에 맞습니다.
참고: 코호트 들 사이에서 일관되는 납 방패를 국소화하는 것은 마우스의 크기에 관한 약간 변이를 감소시킬 수 있습니다.
- 마취된 마우스를 평평한 접시에 배치하여 위에서 방사선 원을 중심으로 합니다. 마우스를 팔과 다리가 완전히 확장한 척추 위치에 서로 반전된 마우스를 놓습니다(그림1D, E).
- 헤드 차폐의 경우 세슘 세슘 세디에이터의 방사선 빔을 마우스로 수평으로 방향을 지정합니다.
- 마취 된 마우스의 앞발을 복부에 조심스럽게 테이프로 테이프로 두습니다. 이것은 무기가 조사의 전체 복용량을 얻고 방패에 의해 커버되지 않습니다 보장합니다.
- 헤드 차폐의 경우 마우스를 리드 쉴드 내부에 맞는 원내 억제제에 넣습니다. 마우스가 원물 억제제 내부에 있으면 구속제는 리드 쉴드 내의 슬롯에 밀어 넣습니다(도1F). 리드 쉴드는 마우스의 머리와 귀(~3.2cm)를 완전히 가려야 하며, 마우스의 나머지 시체는 조사를 위해 노출되어야 합니다. 방패 내부의 구속제의 위치는 방패 내부 또는 외부로 더 슬라이딩하여 다른 크기의 동물에 맞게 조정할 수 있습니다.
- 조사를 위해 소스에 수직으로 마우스를 조사사 내부에 배치합니다.
- 4-24h 간격으로 분리된 조사(총 투여량 11Gy)에 마우스를 노출시한다.
- 각 조사 분수 후, 저체온증을 방지하고 마취에서 회복에 도움이 되는 가열 된 매트 또는 붉은 열 램프 아래에 마취 마우스와 케이지를 배치합니다.
참고: 열을 피할 수 없기 때문에 램프를 사용할 때 마취 마우스를 과열하지 않도록 주의해야 합니다. 전술한 바와 같이, 동물의 위치와 납 방패의 두께는 조사자의 특정 특징(빔의 방사선 유형/방향 등)에 기초한 연구마다 다를 수 있다. 연구원은 그에 따라 그들의 실험을 조정 해야 합니다.
3. 뼈 격리
참고: 이상적으로, 기증자 마우스와 수령마우스는 나이에 유사해야 하고, 8-12 주 안에. 적어도 3개의 마우스를 기증자로 사용하는 것이 바람직하다(단일 기증자가 아닌) 이질성을 최소화하는 것이 바람직하다(동일한 유전자형을 가진 마우스를 사용하는 경우에도). 대략, 4천만 개의 분금되지 않은 골수 세포는 단일 마우스의 6개의 뼈 (2개의 대퇴골, 2개의 tibias 및 2개의 상완골)에서 얻을 수 있습니다. 각 수령마우스에 5백만 개의 골수 세포를 이식하면 전형적으로 이식을 보장합니다.
- 마취 없이 자궁 경부 탈구에 의해 기증자 마우스를 안락사시키고 각 마우스를 흡수 패드에 놓습니다.
- 70% 에탄올 스프레이를 사용하여 피부를 소독합니다.
- 흉곽 아래 피부에 작은 횡방향 컷을 만들고 절개 의 양쪽에 피부를 단단히 잡고 머리와 발을 향해 반대 방향으로 찢어. 모든 팔다리에서 피부를 벗겨냅니다.
- 어깨와 팔꿈치 관절을 잘라, 상미를 얻기 위해 김스 와이프의 도움으로 부착 된 근육과 결합 조직을 제거합니다.
- 대퇴골과 엉덩이 뼈 사이에 엉덩이 관절을 조심스럽게 탈바니다. 무딘 가위를 사용하여 대퇴골 머리를 따라 자르고 다리를 분리하십시오. 대퇴골과 경골을 분리하기 위해 무릎 관절을 잘라 조심스럽게 대퇴골과 경골을 수확하는 김와이프의 도움으로 부착 된 근육과 결합 조직을 제거합니다.
참고: 이 단계에서 뼈 에피피시스를 그대로 유지하기 위해 특별한 주의를 기울이십시오. 불임의 손실로 인해 부러진 뼈를 버리십시오. 엉덩이 뼈와 척추 뼈는 대퇴골, 경골 및 상완골 이외에 수집 될 수 있습니다. 척추 뼈를 수집하기 위해 박격포와 유봉을 사용하여 뼈를 조각으로 분쇄하고 골수 세포를 수확할 수 있습니다. - 동일한 유전자형의 마우스로부터 분리된 뼈를 20mL 얼음-차가운 멸균 PBS를 포함하는 해당 50mL 원추형 튜브에 넣고 추가 사용이 이루어질 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 일치하는 유전자형으로 뼈를 튜브에 올바르게 배치하려면 특별한주의를 기울이십시오.
- 각 마우스 사이에 각 기증자 동물 변경 장갑에 대한 위의 단계를 반복합니다. 또한 각 마우스 사이에 70 %의 에탄올이있는 깨끗한 가위 및 기타 악기.
4. 골수 세포 격리
참고: 생물 안전 클래스 II 캐비닛에서 다음 단계를 수행합니다.
- 튜브 세트 준비: 18G 바늘을 사용하여 멸균 0.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브의 바닥에 작은 구멍을 만들고 바닥에 100 μL의 얼음 냉멸 PBS를 포함하는 멸균 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브에 넣습니다.
참고: 6개의 뼈만이 0.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 들어갈 수 있으므로 모든 뼈를 동시에 처리하기에 충분한 튜브 세트를 준비하는 것이 좋습니다. - PBS를 흡인시키고 격리된 뼈를 멸균 100mm 세포 배양 접시에 옮기. 미세 한 집게를 사용하여 각 뼈를 잡고, 조심스럽게 오토 클레이브에서 살균 된 작은 가위를 사용하여 각 끝에서 표피를 잘라. 절단 된 뼈를 준비 된 튜브 세트에 놓습니다.
- 4°C에서 35s의 경우 튜브를 10,000 x g로 원심분리합니다.
- 원심 분리 후 골수가 뼈에서 성공적으로 제거되었는지 확인합니다. 뼈는 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브의 바닥에 상대적으로 큰 빨간 펠릿흰색과 반투명하게 나타나야 한다. 0.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브를 폐기하십시오.
참고: 육안 검사가 1.5mL 튜브 의 바닥에서 골수를 감지하지 못하면 뼈를 다시 자르고 4.3 단계를 반복하십시오. - 1mL의 얼음-감기 PBS에서 골수를 다시 중단한 다음 동일한 유전자형에서 일치하는 50mL 원추형 튜브로 세포 현탁액을 전달합니다.
- 10mL 주사기10회로 18G 바늘을 통과하여 세포를 분리한다.
- 70 μm 세포 여과기를 통해 단일 셀 서스펜션을 필터링합니다. 10mL의 최종 부피에 얼음 차가운 PBS를 추가하고 파이펫 보조제의 부드러운 사용을 통해 세포를 다시 중단합니다.
- 4°C에서 10분 동안 310 x g의 원심분리기.
- 수퍼내티드를 흡인하고 10mL의 혈청 없는 RPMI 미디어로 셀 펠릿을 재보페한다. 셀 계수에 대한 이 물질의 30 μL을 예비하십시오.
- 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 결정하고 이식에 필요한 세포 현탁액의 양을 계산합니다. 100% BMT의 예를 들어, 각 받는 사람 마우스에 대해 5 x 106 골수 세포가 필요합니다.
참고: 경쟁 BMT의 경우, 기증자 세포의 혼합물(예를 들어, CD45.2+)및 경쟁 세포(예: CD45.1+)의혼합물을 포함하는 총 5 x 106 골수 세포를 준비한다. 여분의 골수 세포를 준비하는 것은 매우 좋습니다. 예를 들어, 실험 군당 10명의 수신자 마우스가 있는 경우, 우리는 전형적으로 12명의 수령인 마우스를 위한 충분한 세포를 준비합니다. - 계산된 셀 서스펜션의 볼륨을 새로운 50mL 원문 튜브로 옮기다. 4°C에서 10분 동안 310 x g의 원심분리기.
- 상체를 흡인하고 적절한 세포 밀도 및 부피를 달성하기 위해 세럼이 없는 RPMI 배지의 계산된 양을 사용하여 세포를 재분리한다. 일반적으로, 200 μL은 레트로 궤도 주입을 위한 최적 부피이다.
5. 조사 된 마우스에 골수 세포의 이식
- 5%의 이소플루란으로 받는 마우스를 마취시화합니다.
- 마우스는 마취되는 동안, 인슐린 주사기를 가진 28-30 G 바늘을 사용하여 골수 세포의 200 μL을 레트로 궤도 정맥에 천천히 주입합니다.
- 대안적으로, 꼬리 정맥 정맥 내 주입 및 대퇴정맥 주사에 의해 기증자 세포의 전달을 수행, 각각 0.2 mL 및 25 μL의 최대 부피와.
- 일단 세포가 주입되면, 통증 완화를 위해 눈 표면에 프로파라카인 함유 안약방울한 방울을 놓습니다. 동물은 의식을 되찾을 수 있습니다.
6. 골수 세포의 이식을 비조건 마우스로 이식
- 5%의 이소플루란을 흡입하여 받는 마우스를 마취시한다.
- 28-30 G 인슐린 주사기를 가진 비 조사 받는 마우스로 유전자형 레트로 궤도에서 5 x 106 의 분별되지 않은 골수 세포를 주입하십시오.
- 3일 연속 6.1 및 6.2를 반복하여, 수취인 마우스는 총 1.5 x 10 7골수세포로 이식된다.
참고: 사전 컨디셔닝 절차가 없는 입양 BMT는 3일 연속 골수 이식이 필요하기 때문에 각 주사에 대해 눈을 번갈아 가려고 시도해야 합니다. - 주사 후, 영향을받는 눈에 프로 파라카인 함유 점안액의 방울을 투여.
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Representative Results
기증자 세포 이식에 대한 3개의 BMT/사전 컨디셔닝 방법의 효력을 비교하기 위하여는, 말초 혈액 및 심장 조직에 있는 기증자 세포의 분획은 BMT 후 1 달에서 혈류 세포측정에 의해 분석되었습니다. 분리된 세포는 백혈구의 상이한 하위 집합을 확인하기 위해 특정 백혈구 마커를 위해 염색하였다. 이러한 실험에서,야생형(WT) C57BL/6(CD45.2) 기증자 골수 세포는 WT B6로 전달되었다. SJL-Ptprc는 수신자의세포로부터 기증자 세포를 구별하기 위해 Prpcb/BoyJ(CD45.1) 받는 마우스를 구별한다. 사용된 유동 세포측정제 게이팅 전략은 이전에 왕외9에 의해 설명되어 있다.
총 신체 조사(TBI) 처리군은 총 치명적인 방사선량 11Gy의 총 치명적인 방사선량에 따라 5 x 106 골수 세포를 수신하여 4시간 간격으로 분리된 2개의 5.5 Gy 분획에서. 수령마우스의 말초 혈액에서, 단핵구, 호중구 및 B 세포는 기증자 골수 유래 세포의 자손에 의해 크게 절단되고 대체되었다. 또한, 상주심장 단세포 및 호중구 집단은 거의 완전히 기증자 유래세포(도 2A)에의해 대체되었다.
부분적으로 차폐된 조사 그룹에서, 수령마우스는 흉부 방패로 조사되었고, 총 방사선량 에 따라 5 x 106 골수 세포로 이식되었고, 4시간 간격으로 분리된 2개의 5.5Gy 분획에서 11Gy의 총 방사선량에 따라. TBI 그룹과는 달리, 기증자 유래 세포가 심장 면역 세포에 기여하는 것은 겸손했으며, 이는 아마도 수령인 마우스의 심장에 있는 국소 면역 세포를 보호하고 말초 혈액으로부터 골수 유래 기증자 세포의 생리적 재집단을 반영하는 것입니다. 차폐된 지역에서 마우스 골수 세포는 또한 TBI 처리된 단에 비해 말초 혈액에서 기증자 유래 세포의 비율을 감소시키는 말초 혈액 재구성에 기여할 가능성이 높습니다(도 2B).
BMT 사전 컨디셔닝(입양 BMT)이 없는 그룹에서, 수령마우스는 3일 동안 5 x 10 6골수세포로 이식되었다. BMT 후 4주, 말초 혈액 및 심장에서 기증자 유래 세포의 일부가 검출가능하였다. (약 5%) (그림2C).
채택 BMT 모델이 CH 모델의 연구에 어떻게 적용될 수 있는지 를 설명하기 위해, CD45.2+ 기증자 골수 세포(WT 또는 Tet2-/-) CD45.1+ 받는 마우스로 이식하였다. 컨디셔닝이 없는 수령인은 3일 연속 매일 5 x106개의 골수 세포로 이식되었습니다(그룹당 총 1.5 x 107,n =5-6). 말초 혈액의 유동 세포 측정 분석은 이식 후 4, 8, 12 및 16 주를 수행했다. Tet2 결핍 기증자 세포는 경쟁 우위를 부여하고 점차적으로 시간이 지남에 따라 확장; WbCs, 단세포, Ly6Chi monocytes, 호중구, T 세포 및 B 세포는 시간이 지남에 따라 크게 증가했습니다. 수령마우스에 이식된 Tet2-결핍 기증자 세포에 비해, WT 기증자 세포로 이식된 수령마우스는 기증자 세포의 덜 중요한 클론 확장을 보였다(도3). 클로날 혈토포이증의 임상 패러다임과 일치, Tet2 결핍 세포의 확장은 다양한 혈액 세포유형의 절대 숫자에 영향을 미치지 않습니다 9 (데이터는 표시되지 않음).
그림 2: 다양한 조건부 방법을 사용하여 혈액과 심장의 혈류 세포 측정 분석. 말초 혈액과 심장의 흐름 세포 측정 분석은 골수 이식 후 1 개월 수행되었다. 기증자 세포를 수령인의 세포로부터 구별하기 위해 CD45.1+ 수령마우스는 CD45.2+ 기증자 골수 세포로 이식되었습니다. (A)5 x 106 골수 세포는 총 신체 조사의 두 분획에 따라 이식되었다 (2 x 5.5 Gy, 4 시간 간격, n = 3). (B)5 x 106 골수 세포는 흉부 차폐(2 x 5.5 Gy, 4h 간격, n = 10)로 총 신체 조사의 2분획에 따라 이식하였다. (C)컨디셔닝없이 수령인은 3 일 동안 5 x 106 골수 세포로 이식되었습니다 (총 1.5 x 107,n = 4). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. 총 CWB는 CD45+로 정의됩니다. Ly6G+호중구; CD115+ ,Ly6G-및 Ly6C+로 Ly6C하이 모노 사이클; CD115+, Ly6G-및 Ly6C로 Ly6Clo monocytes-; CD45R+B 셀; CD4+ T 셀CD3e+ 및 CD4+; CD8+ T 셀CD3e+ 및 CD8+; CD64+, Ly6G - 및 Ly6C로 대식세포-. (WbCs: 백혈구, 호중구: 호중구, 모노: 단세포, 맥: 대식세포). 그림 2A, C는 왕 외9에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 비조건 마우스에 입양 BMT를 사용하여 Tet2 결핍 세포의 클론 확장. CD45.2+ 기증자 골수 세포(WT 또는 Tet2-/-)CD45.1+ 받는 마우스로 이식되었다. 컨디셔닝이 없는 수령인은 3일 연속 매일 5 x106골수 세포로 이식하였다(그룹당 총 1.5 x 107,n =5-6). 말초 혈액의 유동 세포 측정 분석은 이식 후 4, 8, 12 및 16 주 후에 수행되었다. 각 집단에서 CD45.2+ 기증자 세포의 분수가 표시됩니다. (A)WbCs(B)모노(C)Ly6Chi mono(D) B 셀(E)T 셀. 데이터는 평균 ± SEM. CBC는 CD45+로정의됩니다. Ly6G+호중구; CD115+ ,Ly6G-및 Ly6C+로 Ly6C하이 모노 사이클; CD115+, Ly6G-및 Ly6C로 Ly6Clo monocytes-; CD45R+B 셀; CD4+ T 세포CD3e+ (WT: 야생 형, WbCs : 백혈구, 모노 : 모노 세포)이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
클로날 조혈의 연구를 위해, 우리는 BMT의 세 가지 방법을 설명: 총 몸 조사와 BMT, 부분 차폐와 조사와 BMT, 그리고 더 사전 컨디셔닝을 포함 덜 일반적으로 사용되는 BMT 방법 (입양 BMT). 이 방법은 심혈관 질병에 대한 클로날 혈토포이의 영향을 평가하기 위해 사용되었습니다. 연구원은 그들의 연구 결과의 특정 목적에 맞게 이 방법을 그에 따라 수정할 수 있습니다.
클로날 조혈 모델
클로날 조혈은 돌연변이 조혈 세포가 야생 형 세포와 경쟁하고 시간이 지남에 따라 복제 우세를 얻는 현상입니다. 이 경쟁의 모형을 만들기 위하여는, 마우스는 유전적으로 다른 세포의 혼합물로 구성된 골수를 관리될 수 있습니다. 일반적으로, 이 혼합물은 형광 태그 또는 다른 범류 세포 마커 (즉, CD45.1 및 CD45.2)로 표지된 돌연변이 및 야생 형 세포를 포함할 것이다. 예를 들어 Tet2-매개CH를 모방한 모델을 만들 때, 우리는 일반적으로 CD45.1 Tet2+/+ 기증자에서 유래한 세포의 90%와 CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- 82+-+페더레이션에서 유래한 세포의 10%를 혼합하는 것을 포함하는 치명적인 조사받는 사람에게 경쟁적인 골수이식을수행합니다. 특정 단일 클론 항체를 사용하여 CD45 변이체의 유동 세포 측정 검출은 혈액내에서 경쟁 세포 (CD45.1+/CD45.2-) 기증자 세포를 구별하고 시간이 지남에 따라 테스트 세포의 클로날 역학을 평가 할 수 있게한다. 이렇게 함으로써, 우리는 Tet2 결핍 세포의 기증자 키머리즘에 있는 점진적인 증가를 관찰할 수 있었습니다, 야생 형 세포의 백분율은 대략 10%에 남아 있는 동안. 이 실험적인 설정은 TET2 체세포 돌연변이를 운반하는 개별의 인간적인 시나리오를 모방합니다, 이 돌연변이는 처음에 점차적으로 시간이 지남에 확장될 HSPC의 소수에 의해 전송되기 때문에. 죽상 동맥 경화증과 심부전의 심혈관 질환 모델에서 이러한 접근법을 채택하면 Tet2-매개CH와 CVD8,9,10사이의 잠재적 인과 관계에 대한 문서화가 발생했습니다.
이러한 접근 방식을 채택 하는 경우, 연구원은 고려 TBI에 의해 생성 된 가능한 혼란 효과 고려 해야. 이식 전에 TBI는 HSPC 이식의 높은 수준을 가능하게하지만, 이 사전 컨디셔닝은 조혈 시스템 외부에서 몇 가지 바람직하지 않은 효과로 이어질 것입니다. TBI는 피부, 간, 신장, 폐, 골수, 심장, 뇌 등을 포함한 여러 장기 시스템에서 염증, 부상 및 섬유증을 유발할 수 있으며18,19,20을기록하였다. 이러한 부작용은 연구 하에 심혈 관 장기에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다., 그리고 그들은 또한 질병 병 인 후21,22변경. 주목할 만한 예는 심장에 있는 상주 대식세포에 대한 조사의 효력입니다. 흉부의 조사는 순환 단핵구 유래 대식세포와 심장 거주 대식세포의 현저한 교체결과. 연구에 따르면 심장 에 상주하는 대식세포는 방사선 부상 후 심장에 이식되는 순환 하는 단핵구 유래 대식세포에 비해 뚜렷한 특성을 나타낸다. 질병 설정에서 심장 거주자 대식세포는 심장 보호 역할을 하는 것으로 생각되는 반면, 혈액 매개 대식세포에 침투하여 부상과염증(23)을촉진하는 것으로 보고되었습니다. 따라서, 상주 심장 면역 세포를 혈액 매개 세포로 대체하는 것은 심혈관 질환24,25,26에기여하는 연구 하에 병리학적 과정을 변화시킬 것이라고 생각할 수 있다. 유사하게, 뇌에서 TBI는 주변 유래대식세포(27,28)에의한 상주 미생물의 고갈 및 교체를 초래한다. 말초 유래 대식세포는 마이크로글리아세포처럼 작동할 수 있지만, 단핵구 유래마이크로글리아(28)에비해 고유한 기능적 및 전사 적 정체성을 유지한다. 따라서, 특히 허혈성 뇌졸중과 같은 질병을 연구할 때, 질병 후속편이 변경될 수 있다. 이러한 혼동 효과를 피하기 위해 흉부와 머리를 차폐하는 것이 좋습니다. 이것은 각각 심장과 뇌에 대한 보호를 제공하기 때문에 유리합니다. 그리고 그것은 또한 그들의 상주 면역 세포를 그대로 유지, 더 나은 CH의 인간의 상태를 회수. 그러나, 이전에 언급 한 바와 같이, 차폐는 본질적으로 모든 호스트의 조혈 세포를 제거하는 TBI 사전 컨디셔닝에 비해 키머리즘의 낮은 속도 귀착됩니다.
사전 컨디셔닝의 또 다른 중요한 장애물은 골수 틈새 에 대한 해로운 효과입니다. BM 틈새 시장의 조사 유발 손상은 최적 정도로 회복 될 수 있지만, 이러한 손상된 미세 환경에서 순진한 혈전이 회복되는지 여부는 불분명합니다. 또한, 혼합 HSPC를 빈 BM으로 이식하면 야생 형 HSPC가 차지하는 틈새 시장을위한 간단한 "경쟁"이 아닌 클론 사이의 확산을위한 경쟁을 시작합니다. 따라서, 잠재적으로 바람직한 CH를 연구하는 접근법은 BMT 를 채택할 수 있으며, 이에 따라 BM 세포는 사전 컨디셔닝 없이 수신자 마우스로 전달된다. 사전 컨디셔닝 방법 없이 이 입양 BMT는 인간에서 관찰된 진행 중인 순진한 혈막염에 최소한의 영향을 미치며, 가장 충실하게 CH를 재구성하여인간29에서관찰된다. 도 2C는 사전 컨디셔닝 없이 1개월 후 이식 후 키머리즘의 수준을 나타낸다. 기증자 키머리즘은 이 초기 시점에서 낮지만, 그림 3에제시된 바와 같이 시간이 지남에 따라 Tet2 결핍 클론의 점진적으로 증가하는 부분을 발견합니다. 이 모델은 돌연변이 세포가 Tet2 결핍 세포와 같은 동종 구종 조건에서 야생 형 세포에 비해 경쟁 우위를 가질 때 가장 유용하다는 점에 유의해야합니다. Tet2-결핍 세포가 이식되면 호중구, 단세포, NK 세포 및 B 세포와 같은 다양한 백혈구 집단에서 현저한 확장이 있습니다. 느린 확장은 T 세포에서 지적되었다, 아마도이 인구의 긴 반감기로 인해.
Tet2-결핍 세포의 확장은 말초 혈액뿐만 아니라 골수, 간 및 신장을 포함한 여러 다른 조직에서 관찰되었으며, 조혈 세포 재구성의 다른 역학을 갖는다9. 예를 들어, 우리 연구소의 이전 간행논문은 입양 BMT 9후 8개월 후 CD45.1 수혜자 마우스로 이식된 WT 및 Tet2 결핍 공여자 세포의 골수 세포 키머리즘을 기술하였다. CD45.1 수신자 마우스로 이식된 Tet2-결핍 공여자 세포는 미성숙 혈통에 비해 경쟁 우위를 보였습니다–Sca1+c-Kit+ (LSK) 세포, 단기 및 장기 HSC 세포, 다능성 선조자 (MPPs) CD45.1 수신자 마우스로 이식된 WT 기증자 세포의 것과 비교. 또한, Tet2-deficient 기증자 세포 이식 된 받는 마우스로, 그들은 심장 기능 장애를 일으키는 외인성 요인없이 연령 과 관련된 심근병증 표현형을 개발하여 노화 인간과 유사한 방식으로 클로날 혈토포에이시스의 효과를 다시 회수한다. 이 관찰은 심장 호중구와 Ly6Chi monocytes에 있는 키머리즘의 증가한 정도와 함께 동반되었습니다. 종합적으로, 이 입양 BMT 처방은 더 진보된 수준에 심혈관 질병 발달과 복제 조혈 사이 협회의 우리의 이해를 확장할 수 있는 미래 연구 결과에 적용될 수 있습니다.
요약하면, 우리는 세 가지 BMT 방법을 설명하고 CH 모델을 생성하는 응용 프로그램에 대해 논의했다. CH는 죽상 동맥 경화증과 심부전과 같은 심혈관 질환의 불량 한 예후와 관련이 있습니다. 상당한 진전이 있었지만 CH와 CVD 사이의 인과 관계에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있으며 최적화 된 동물 모델을 사용하여 추가 조사가 필요합니다. 우리는 이 프로토콜이 연구원이 심혈관 시스템에 잠재적인 혼란 효과를 최소한화하는 BMT의 더 생리적으로 적합한 방법을 선택할 수 있기를 바랍니다, 궁극적으로 CH가 심혈관 질환에 기여하는 방법에 대한 우리의 이해를 확장하는 연구를 산출.
납 차폐 설계
리드 쉴드의 두께는 골수 절제술을 유도하는 데 사용되는 조사 유형에 의해 결정됩니다. X선 또는 감마선 유형의 방사선은 실험적인 골수절제술에 자주 사용되지만 주파수, 파장 및 광자 에너지면에서 다릅니다. 차폐에 관해서, 광선이 이동하는 에너지 또는 속도를 설명하는 광자 에너지는 가장 중요한 매개 변수입니다. 전형적으로, 방사선원 X선은 160kVp의 에너지를 가지고 있는 반면, 감마선을 방출하는 세슘-137 소스는 662 KeV의 에너지를 가지고 있다. 이 방사선 원에 의해 방출되는 에너지는 그들의 침투 력과 동일시합니다, 더 높은 에너지는 더 중대한 침투 전력을 가진. 따라서 X선 기반 조사기와 비교하여 세슘 소스 기반 조사기를 사용할 때 더 큰 두께의 납 쉴드가 필요합니다. 흉부 및 복부 차폐를 수행할 때 사용하는 X 선 기반 조사는 충분한 보호를 제공하기 위해 7mm 두께의 납 쉴드가 필요합니다. 그러나 헤드 쉴딩을 수행할 때 사용하는 세슘 137 소스의 경우 충분한 보호를 위해 납 쉴드가 최소 1인치 두께여야 합니다.
X선 조사기에서 사용할 수 있는 납 방패는 상용 공급업체에서 구입할 수 있습니다. 또는, 납 시트는 동물의 몸 주위에 맞거나 억제제 주위에 맞게 크기로 절단 할 수 있습니다 (그림 1참조). 세슘 기반 의 조사기를 사용하는 경우, 상당히 두꺼운 리드 벽돌을 사용해야하며 이러한 유형의 방패를 만드는 전문 회사에서 맞춤 제작 할 수 있습니다. 예를 들어, 헤드 쉴드의 경우 50mL 원전 튜브 억제제(그림 1F참조)를 보유하도록 리드 브릭을 맞춤 설계했습니다. 동물은 다음 조사로부터 보호의 1.5 인치를 제공하기 위해, 벽돌에서 만든 구멍에 슬롯되는 구속제 내부에 들어갈 수 있습니다. 중요한 것은, 모든 납 방패는 독성이 있을 수 있는 납 먼지에 노출되는 것을 방지하기 위하여 페인트 또는 테이프로 코팅되어야 합니다.
장비와 그 매개 변수를 기반으로, 연구원은 관심의 자신의 사이트에 대한 자신의 리드 쉴드를 설계 할 수 있습니다. 여기에서 흉부, 복부 및 머리 차폐를 소개했습니다. 그러나 사지 나 측면과 같은 다른 사이트도 차폐로 간주 될 수 있습니다. 또한, 두 방사선 원(세슘-137 및 X선)이 골수 절제 및 성공적인 이식에 적합하지만, 림프구와 골로이드 세포 집단의 재구성에 대한 가변성은 세슘-137 및 X선 조사원(30)사이에서 관찰되었다. 따라서, 연구원은 연구에서 사용하기 위해 방사선 소스에 이질적인 생리적 반응을 고려해야합니다.
도징 간격
복용량 및 투여 간격 기증자 세포 이식 및 생존율의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 인간 환자에서 고용량 조사는 특발성 간질 폐렴, 위장 손상 및 백내장 형성을 일으킬 수 있습니다. 마우스 모델에서, 골수 이식에 이어 단일 고용량 조사는 유사한 결과를 생성할 수 있고 또한 생존율31에영향을 미칠 수 있다. 따라서, 분획 된 조사는 마우스 BMT 연구에 대 한 매우 권장. 또한, 분획의 투약 간격은 마우스 생존율및 재구성속도에 영향을 미칠 수 있으며, 혈액학 기관뿐만 아니라 다른조직(31)에서기증자 세포 키머리즘의 상이한 분수로 이어질 수 있다. 따라서, 연구원은 BMT 연구를 위한 분수된 조사 투약 일정을 디자인에 주의해야 합니다.
생존율 및 면역 세포 재구성의 맥락에서, 우리의 작은 연구는 24 h 간격 그룹으로 분리된 2개의 5.5 Gy 분획에서 11Gy의 치명적인 방사선 량으로 총 체사 조사를 수신하는 마우스의 단이 4 시간 간격으로 동일한 TBI 복용량을 수신한 단과 현저하게 다른 결과가 없었다는 것을 보여주었습니다 (표 1참조). 그러나, 흉부 차폐 BMT를 사용하면, 24h 간격 그룹은 4h 간격 단에 비해 기증자 세포 키머리즘의 효율이 떨어지는 것으로 나타났다. 이 결과에 대한 가능한 설명은 24h 간격으로 조사가 수신자의 면역 능력 세포를 제거하기에 충분하지 않았을 수 있다는 것입니다 장기간 간격은 수령인 마우스에게 손상된 세포를 복구하기에 충분한 시간을 주었기 때문이다. 또한 흉부 차폐는 받는 사람의 HSC를 포함하는 부분 척추 뼈를 보호합니다. 따라서, 나머지 및 회수된 면역능력 수용자 세포는 기증자 유래 세포를 공격하고 더 낮은 이식 효율을 보인 결과를 유도했을 수 있다.
| WBC (%) | B 셀(%) | T 셀(%) | 모노 (%) | Ly6C하이모노 (%) | Ly6C로 모노 (%) | 호중구 (%) | ||
| TBI-BMT | 4시간 간격 | 97.4 ± 1.0 | 100 ± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| 24시간 간격 | 97.2 ± 2.2 | 100 ± 0 | 79.0 ± 8.1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| 흉부 차폐 BMT | 4시간 간격 | 56.2 ± 4.0 | 54.2 ± 6.2 | 0.5 ± 0.1 | 66.7 ± 6.1 | 63.8 ± 6.3 | 70.8 ± 5.7 | 82.0 ± 3.8 |
| 24시간 간격 | 34.4 ± 3.1 | 34.8 ± 3.1 | 2.9 ± 1.7 | 45.0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56.2 ± 4.9 | 56 ± 10.0 | |
표 1: 다른 주입 간격을 사용하여 기증자 세포 이식의 효율. 말초 혈액의 유동 세포 측정 분석은 골수 이식 후 1 개월 수행되었다. WT CD45.2+ 기증자 골수 세포는 CD45.1+ 받는 쥐로 이식되었다. 5 x 106 골수 세포는 4 시간 간격 또는 24 시간 간격으로 분리 된 흉부 차폐의 유무에 관계없이 총 신체 조사 (2 x 5.5 Gy)의 두 분획에 따라 이식되었다. (n = 그룹당 3-4).
동물 관리
마우스를 포함하는 다중 단계는 이 실험의 성공을 위해 요구됩니다. 따라서, 다음 지점에서 추가주의가 필요합니다: 첫째, 실행 가능한 기증자 세포의 전달은 성공적인 이식에 중요합니다. 하나는 제대로 그대로 BM 세포의 수집에 훈련해야하고 받는 사람 마우스로 자신의 주입. 세포의 가난한 납품의 결과는 사망으로 이끌어 내는 수령인 골수를 재구성하기 위하여 기증자 HSPC의 실패를 포함합니다. 둘째, 특히 골수 치료 다음, 감염을 피하기 위해 이식 후 주의를 기울여야합니다. 병원균과의 접촉은 치명적일 수 있습니다, 마우스는 조사 다음 일시적으로 면역 결핍이될 때. 위에서 언급 한 바와 같이, 항생제로 식수를 보충하면 치명적인 감염의 위험을 낮출 수 있습니다. 또한, 영양/수화 젤을 받는 동물에게 영양/수분 겔을 제공하면설사(32)로이어지는 장 상피(inthethelium)를 방해할 수 있기 때문에 조사 후 발생할 수 있는 탈수 및 영양 결핍을 최소화할 수 있다. 케이지는 또한 배설물 박테리아 오염의 위험을 줄이기 위해 자주 교체되어야하며, 동물은 적절한 동물 이송 스테이션에서 처리되어야하며, 수령인 마우스는 체중 감량과 고민이나 통증의 징후를 주의 깊게 모니터링해야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 K. 월시 (HL131006, HL138014 및 HL132564), S. 사노 (HL152174), M. A. 에반스 (20POST35210098) 및 일본 심장 재단에 대한 미국 심장 보조금에 대한 미국 국립 보건 원에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
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