Summary
Vi beskriver tre metoder för benmärg transplantation (BMT): BMT med total-body bestrålning, BMT med skärmad bestrålning och BMT metod utan pre-conditioning (adoptiv BMT) för studier av klonurmum hematopoiesis i mus modeller.
Abstract
Klonurlig hematopoiesis är ett utbrett åldersrelaterade tillstånd som härrör från ackumulering av somatiska mutationer i hematooetiska stam- och stamceller (HSPCs). Mutationer i förargener, som ger cellulär kondition, kan leda till utvecklingen av expanderande HSPC kloner som alltmer ger upphov till avkomma leukocyter som hyser den somatiska mutationen. Eftersom klonurlig hematopoiesis har associerats med hjärtsjukdomar, stroke och dödlighet, är utvecklingen av experimentella system som modellerar dessa processer nyckeln till att förstå mekanismerna som underly denna nya riskfaktor. Benmärgstransplantationsförfaranden som involverar myeloablativ konditionering hos möss, såsom totalkropps bestrålning (TBI), används ofta för att studera immuncellernas roll i hjärt-kärlsjukdomar. Samtidiga skador på benmärgsnisch och andra intressanta platser, såsom hjärta och hjärna, är dock oundvikliga med dessa procedurer. Således har vårt labb utvecklat två alternativa metoder för att minimera eller undvika eventuella biverkningar orsakade av TBI: 1) benmärgstransplantation med bestrålningsskärmning och 2) adoptiv BMT till icke-konditionerade möss. I skärmade organ bevaras den lokala miljön så att analysen av klonurslutatopoiesis kan analyseras medan funktionen hos bosatta immunceller är ostörd. Däremot har adoptiv-BMT till icke-konditionerade möss den extra fördelen att både organens lokala miljöer och den hematopoetiska nischen bevaras. Här jämför vi tre olika hematoopoetic cell reconstitution metoder och diskutera deras styrkor och begränsningar för studier av klonurmär hematopoiesis i hjärt-kärlsjukdom.
Introduction
Klonurlig hematopoiesis (CH) är ett tillstånd som ofta observeras hos äldre individer och uppstår som ett resultat av en expanderad hematoopoetic stam och stamcell (HSPC) klon som bär en genetisk mutation1. det har föreslagits att vid 50 års ålder, de flesta individer kommer att ha förvärvat i genomsnitt fem exonic mutationer i varje HSPC2, men de flesta av dessa mutationer kommer att resultera i små eller inga fenotypiska konsekvenser för individen. Men om en av dessa mutationer av en slump ger HSPC en konkurrensfördel , till exempel genom att främja dess spridning, självförnyelse, överlevnad eller någon kombination av dessa - kan detta leda till förmånlig expansion av mutantklonen i förhållande till de andra HSPC: erna. Som ett resultat kommer mutationen i allt högre grad att spridas genom det hematopoetiska systemet eftersom den muterade HSPC ger upphov till mogna blodkroppar, vilket leder till en distinkt population av muterade celler i perifert blod. Medan mutationer i dussintals olika kandidatdriva gener har associerats med klonurläppliga händelser inom hematopoetiska systemet, bland dessa, mutationer i DNA metyltransferas 3 alfa (DNMT3A) och tio elva flyttning 2 (TET2) är de vanligaste3. Flera epidemiologiska studier har funnit att individer som bär dessa genetiska mutationer har en betydligt högre risk för hjärt-kärlsjukdom (CVD), stroke och all-kausaldödlighet 3,4,5,6,7. Medan dessa studier har identifierat att det finns ett samband mellan CH och ökad incidens av CVD och stroke, vet vi inte om detta samband är orsakssamband eller en delad epiphenomenon med åldrandeprocessen. För att få en bättre förståelse för denna associering krävs lämpliga djurmodeller som korrekt rekapitulerar ch:s mänskliga tillstånd.
Flera CH djurmodeller har fastställts av vår grupp och andra med zebrafisk, möss och icke-mänskliga primater8,9,10,11,12,13,14. Dessa modeller använder ofta hematopoetiska rekonstitutionsmetoder genom transplantation av genetiskt modifierade celler, ibland med Cre-lox rekombination eller CRISPR-systemet. Detta tillvägagångssätt möjliggör analys av en specifik genmutation i hematopoetiska celler för att bedöma hur det bidrar till sjukdomsutveckling. Dessutom använder dessa modeller ofta congenic eller reporterceller för att skilja effekterna av mutanta celler från normala eller vilda celler. I många fall krävs en prekonditionering regim för att framgångsrikt engraft givare hematopoetiska stamceller.
För närvarande kan transplantation av benmärg till mottagande möss delas in i två huvudkategorier: 1) myeloablativ konditionering och 2) icke-konditionerad transplantation. Myeloablative konditionering kan uppnås med en av två metoder, nämligen total kropps bestrålning (TBI) eller kemoterapi15. TBI utförs genom att utsätta mottagaren för en dödlig dos gamma- eller röntgenstrålning, generera DNA-brott eller korslänkar i snabbt dela celler, vilket gör dem irreparabla16. Busulfan och cyclophosphamide är två vanliga kemoterapi läkemedel som stör hematopoetisk nisch och på samma sätt orsakar DNA-skador på snabbt dela celler. Nettoresultatet av myeloablative förkonditionering är apoptos av hematopoetiska celler, som förstör mottagarens hematopoetiska system. Denna strategi möjliggör inte bara framgångsrik engraftment av givaren HSPCs, men kan också förhindra graft avstötning genom att undertrycka mottagarens immunsystem. Myeloablativeförkonditionering har dock allvarliga biverkningar såsom skador på vävnader och organ och deras bosatta immunceller samt förstörelse av den inhemska benmärgsnisch17. Därför har alternativa metoder föreslagits för att övervinna dessa oönskade biverkningar, särskilt när det gäller skador på organ av intresse. Dessa metoder inkluderar skärmad bestrålning av mottagarmöss och adoptiv-BMT till icke-konditionerade möss9,17. Att skydda bröstkorgen, bukhålan, huvudet eller andra regioner från bestrålning genom placering av blybarriärer håller vävnader av intresse skyddade från de skadliga effekterna av bestrålning och upprätthåller sin bosatta immuncellspopulation. Å andra sidan har den adoptiva BMT av HSPCs till icke-konditionerade möss en ytterligare fördel eftersom det bevarar den inhemska hematopoetiska nischen. I detta manuskript beskriver vi protokoll och resultat av HSPC engraftment efter flera transplantation regimer hos möss, särskilt leverans av HSPC till TBI möss, till möss delvis skyddade från bestrålning och till icke-konditionerade möss. Det övergripande målet är att hjälpa forskare att förstå de olika fysiologiska effekterna av varje metod samt hur de påverkar experimentella resultat vid fastställandet av CH och hjärt-kärlsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Virginia.
1. Före förkonditionering
- Placera mottagarmössen på antibiotikakomperat vatten (5 mM sulfamethoxazole, 0,86 mM trimethoprim) ~ 24 h före bestrålning. Detta är nödvändigt för att förhindra infektion, eftersom immunsystemet kommer att undertryckas efter bestrålning och bibehållas i 2 veckor efter bestrålning. Vid denna tidpunkt, komplettera möss med en näringsmässig / hydrering gel för att uppmuntra utfodring och förhindra viktminskning och uttorkning efter bestrålning.
Bild 1: Bilder som visar olika förkonditioneringsinställningar. ( A) Pie-cage total kroppsbestrålning med gammastrålning (Cesium-137): Strålningsstrålen kommer från baksidan av bestrålaren i y-axelriktningen (horisontell strålning). (B) Musburens totala kroppsbestrålningsinställning med hjälp av röntgen: Musburen placeras i reflexkammaren. Strålningsstrålen kommer från toppen av bestrålaren i form av en kon (vertikal strålning). Avståndet från strålkällan till buret är 530 mm. (C) Justerbar bricka i röntgenstrålning: Denna inställning används för delvis avskärmad bestrålning med röntgen. Strålningsstrålen kommer från toppen av bestrålaren i form av en kon (vertikal strålning). Avståndet från strålkällan till brickan är 373 mm och radien är 250 mm. (D) Bröstkorgsskärmning: Sövd möss placeras på en bricka. Mössen placeras inverterade till varandra i supinpositioner med armar och ben helt utsträckta. Den nedre änden av blyskölden är i linje med xiphisternumbenet och den övre änden med tymusen. (E) Bukskärmning: Bedövade möss placeras som i bröstkorgssköldsuppsättningen med den nedre änden av blyskölden i linje med anusen och den övre änden under membranet. (F) Huvudskyddande bestrålningsinstallation med gammastrålning (Cesium-137): Den sövda musens framtänder tejpas fast och musen placeras i en konisk fasthållningsmaskin. Den svarta blyskölden (markerad) täcker musens huvud och öron. Strålningsstrålen kommer från baksidan av bestrålaren i riktning mot Y-axeln (horisontell strålning). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
2. Förkonditionering av mottagarmöss (frivillig uppgift)
- Total kropps bestrålning
- Placera mottagarmössen i en jämnt skivad pajbur eller en musbur i reflexkammaren inom den beräknade radien för att få samma bestrålningsdos. Högst 8 möss per pajbur och 5 möss per musbur rekommenderas dock för att säkerställa enhetlig bestrålning(figur 1A,B).
- För att uppnå fullständig myeloablation, se till att mottagarmössen får en total stråldos på 11 Gy i två 5,5 Gy-fraktioner åtskilda med ett intervall på 4–24 timmar.
OBS: Även om optimal ingraftment kan erhållas genom att implementera ett 4 h intervall mellan fraktioner, kan detta förlängas till ett 24 h intervall, vilket kan vara till hjälp när arbete och / eller bestrålaren inte är tillgänglig.
- Delvis avskärmad bestrålning
- Bedöva mottagarmössen genom intraperitoneal injektion av ketamin (80–100 mg/kg) och xylazin (5–10 mg/kg). Fasthållningen av musrörelsen är avgörande för att säkerställa en enhetlig bestrålning och ett effektivt skydd av målorganen under avskärmningsprocessen.
- För bröstkorg och bukskärmning, orientera strålningsstrålen på röntgenstrålningsstrålningen vertikalt mot musen (figur 1C).
- Placera de sövliga mössen på en platt tallrik och centrera strålkällan ovanifrån. Placera mössen inverterade mot varandra i ett överläge med armar och ben helt utsträckta(figur 1D,E).
OBS: Röntgenstrålningsanläggningen gör det möjligt att placera två möss åt gången inom den effektiva radien som möjliggör enhetlig bestrålning. Även om den effektiva radien beräknas baserat på avståndet mellan strålkällan och brickan, beror antalet djur som kan bestrålas samtidigt på den specifika bestrålaren. - Fäst mössens tassar på plattan med tejp för att säkerställa att mössen är immobiliserade under bestrålningsproceduren. Placera blyskärmning så att den täcker regioner som behöver skydd.
- För bröstkorgsskärmning, förbered blyskölden genom att mäta längden från musens xiphisternumben till tymus och beräkna tjockleken som ger tillräckligt skydd mot strålningskällan. Placera blyskyddet så att den nedre änden ligger i linje med xiphisternumbenet. Den övre änden av blybarriären passar nära tymusen (figur 1D).
- För bukskärmning, förbered blyskölden genom att mäta längden från musens anus till membranet och beräkna tjockleken som ger tillräckligt skydd mot strålkällan. Placera blyskyddet så att den nedre änden ligger i linje med anusen. Blysköldens övre ände får plats under membranet (bild 1E).
OBS: Att lokalisera blyskölden för att vara konsekvent bland kohorter kan minska viss variation när det gäller mössens storlek.
- Placera de sövliga mössen på en platt tallrik och centrera strålkällan ovanifrån. Placera mössen inverterade mot varandra i ett överläge med armar och ben helt utsträckta(figur 1D,E).
- För huvudskärmning, orientera strålningsstrålen på Cesium-bestrålaren horisontellt mot musen.
- Tejpa försiktigt frampaws av en bedövad mus till buken. Detta säkerställer att armarna får en full dos bestrålning och inte täcks av skölden.
- För huvudskärmning, placera musen i en konisk fasthållningshållare, som passar inuti en blysköld. När musen är inne i den koniska fasthållningshjulet, skjut in fasthållningshjulet i öppningen i blyskölden(bild 1F). Blyskölden ska helt täcka musens huvud och öron (~ 3,2 cm), vilket lämnar resten av musens kropp exponerad för bestrålning. Fasthållningsplatsen inuti skölden kan justeras för att passa djur av olika storlek genom att skjuta den längre in i eller utanför skölden.
- Placera möss inuti bestrålaren, vinkelrätt mot källan för bestrålning.
- Exponera möss för två 5,5 Gy fraktioner av bestrålning (total dos av 11 Gy) separerade med ett intervall på 4–24 timmar.
- Efter varje bestrålningsfraktion, placera burarna med sövda möss på uppvärmda mattor eller under röda värmelampor för att förhindra hypotermi och hjälpa till att återhämta sig från anestesi.
OBS: Försiktighet måste iakttas för att inte överhetta den sövda musen när du använder en lampa eftersom de inte kan undkomma värmen. Som beskrivits ovan kan djurens placering och blysköldens tjocklek skilja sig åt mellan studier baserade på strålningsstrålningsens särdrag (strålningstyp/strålriktning osv.). Forskare kommer att behöva justera sina experiment i enlighet därmed.
3. Benisolering
OBS: Helst bör donatormöss och mottagarmöss vara likartade i ålder och inom 8–12 veckor. Att använda minst 3 möss som donatorer (snarare än en enda donator) föredras för att minimera för heterogenitet (även vid användning av möss med samma genotyp). Ungefär 40 miljoner orfraktionsrelaterade benmärgsceller kan erhållas från sex ben (två lårben, två skenben och två humeri) av en enda mus. Transplantation av 5 miljoner benmärgsceller till varje mottagarmus säkerställer vanligtvis engraftment.
- Avliva donatormöss genom livmoderhalscancer utan anestesi (föredragen metod för att undvika kemisk förorening av celler) och placera varje mus på en absorberande kudde.
- Desinficera huden med en 70% etanolspray.
- Gör ett litet tvärgående snitt i huden under revbenskorgen och håll huden tätt på vardera sidan av snittet, riv i motsatta riktningar mot huvud och fötter. Skala av huden från alla lemmar.
- Skär över axlarna och armbågsfogarna och ta bort de bifogade musklerna och bindväven med hjälp av en Kimwipe för att få humeri.
- Ur leden mellan lårbenet och höftbenen är försiktigt ur led. Använd trubbig sax för att skära längs lårbenshuvudet och lossa benen. Skär över knäleden för att separera lårbenet och skenbenet och ta försiktigt bort de bifogade musklerna och bindväven med hjälp av en Kimwipe för att skörda lårbenet och skenbenet.
OBS: Var särskilt uppmärksam på att hålla benepysen intakt under detta steg. Kassera eventuella brutna ben på grund av förlust av sterilitet. Höftben och ryggradsben kan samlas in förutom lårben, skenben och humerus. För att samla ryggradsben kan en mortel och en mortel användas för att krossa benen i bitar och skörda benmärgscellerna. - Placera de isolerade benen från möss av samma genotyp i motsvarande 50 ml koniskt rör som innehåller 20 ml iskallt sterilt PBS och håll det på is tills vidare. Var särskilt uppmärksam på att korrekt placera benen i rör med matchade genotyper.
- Upprepa ovanstående steg för varje donatordjur som byter handskar mellan varje mus. Rengör också sax och andra instrument med 70% etanol mellan varje mus.
4. Isolering av benmärgsceller
OBS: Utför följande steg i ett biosäkerhetsklass II-skåp.
- Förberedelse av rörsatser: Gör ett litet hål i botten av ett sterilt 0,5 ml mikrocentrifugrör på 18 G med en 18 G-nål och placera det i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör på 100 μL iskallt sterilt PBS i botten.
OBS: Eftersom endast sex ben får plats i 0,5 ml mikrocentrifugröret rekommenderas att man förbereder tillräckligt med rörsatser för att bearbeta alla ben samtidigt. - Aspirera PBS och överför de isolerade benen till en steril 100 mm cellkulturrätt. Håll varje ben med fina tångar, skär försiktigt epifyserna av varje ände med hjälp av små saxar som steriliserades i en autoklav. Placera de skurna benen i de beredda rörsatserna.
- Centrifugera rören vid 10 000 x g i 35 s vid 4 °C.
- Efter centrifugation, bekräfta att benmärgen har framgångsrikt avlägsnats från benen. Ben ska verka vita och genomskinliga med en relativt stor röd pellet längst ner på 1,5 ml mikrocentrifugrör. Kassera mikrocentrifugröret på 0,5 ml.
OBS: Om den visuella inspektionen inte detekterar benmärgen längst ner på 1,5 ml-röret, skär benet igen och upprepa steg 4.3. - Återanvänd benmärgen i 1 ml iskallt PBS och överför sedan cellfjädringen från samma genotyp till ett matchat 50 ml koniskt rör.
- Dissociera cellerna genom att passera dem genom en 18 G nål med en 10 ml spruta 10 gånger.
- Filtrera encellsfjädring genom en 70 μm cellsil. Tillsätt ytterligare iskall PBS till en slutlig volym på 10 ml och återanvänd cellerna genom skonsam användning av pipetthjälpmedel.
- Centrifugera vid 310 x g i 10 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och återanvänd cellpelleten med 10 ml serumfria RPMI-medier. Spara 30 μL av detta material för cellräkning.
- Bestäm cellkoncentrationen med en cellräknare och beräkna volymen av cellsuspension som krävs för transplantationen. Till exempel en 100% BMT krävs 5 x 106 benmärgsceller för varje mottagarmus.
OBS: För en konkurrenskraftig BMT, förbered totalt 5 x 106 benmärgsceller som består av en blandning av donatorceller (t.ex. CD45.2+) och konkurrentceller (t.ex. CD45.1+). Att förbereda extra benmärgsceller rekommenderas starkt. Om det till exempel finns 10 mottagarmöss per experimentell grupp förbereder vi vanligtvis tillräckligt med celler för 12 mottagarmöss. - Överför den beräknade volymen cellfjädring till ett nytt koniskt rör på 50 ml. Centrifugera vid 310 x g i 10 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och återanvänd cellerna med hjälp av den beräknade mängden serumfritt RPMI-medium för att uppnå lämplig celltäthet och volym. Vanligtvis är 200 μL den optimala volymen för en retro-orbital injektion.
5. Transplantation av benmärgsceller till bestrålade möss
- Söv mottagarmössen med 5% isofluran.
- Medan möss bedövas injicerar du långsamt 200 μL benmärgsceller i retro-orbitalvenen med en 28-30 G nål med en insulinspruta.
- Alternativt, utför leveransen av donatorcellerna genom svansvena injektion och femoral intramedullary injektion, med en maximal volym på 0,2 ml respektive 25 μL.
- När cellerna injiceras, placera en droppe proparakaininnehållande ögondroppar på ögonytan för smärtlindring. Djuret kan då tillåtas att återfå medvetandet.
6. Transplantation av benmärgsceller till icke-konditionerade möss
- Bedöva mottagarmössen genom inandning av 5% isofluran.
- Injicera 5 x 106 ofraktionerade benmärgsceller från antingen genotyp retro-orbitally i icke-bestrålade mottagarmöss med 28–30 G insulinspruta.
- Upprepa steg 6.1 och 6.2 under 3 på varandra följande dagar, så att mottagarmössen kommer att transplanteras med totalt 1,5 x 107 benmärgsceller.
OBS: Eftersom adoptiv BMT utan förkonditionering kräver benmärgstransplantation i 3 på varandra följande dagar, bör man försöka alternera ögon för varje injektion. - Efter injektionen, administrera en droppe proparakaininnehållande ögondroppar till det drabbade ögat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att jämföra effekten av tre BMT/pre-conditioning metoder på donator cellen engraftment, fraktioner av donatorceller i perifert blod och hjärtvävnad analyserades av flöde cytometri vid 1 månad post-BMT. Isolerade celler var färgade för specifika leukocyt markörer att identifiera de olika delmängderna av leukocyter. I dessa experiment levererades vilda (WT) C57BL/6 (CD45.2) givaren benmärgsceller till WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) mottagarmöss för att skilja donatorceller från mottagarens celler. De strategier för flödescytometri som användes beskrivs tidigare av Wang et al.9 i kompletterande figur 1.
Den totala behandlade gruppen för kropps bestrålning (TBI) fick 5 x 106 benmärgsceller efter en total dödlig stråldos på 11 Gy i två 5, 5 Gy-fraktioner åtskilda med 4 h intervall. I perifert blod av mottagande möss, monocyter, neutrofiler och B-celler var till stor del ablated och ersatt av avkomman av donator benmärg-härledda celler. Dessutom ersattes den bosatta hjärtmonomcyt- och neutrofilpopulationen i hjärtat hos mottagarmöss nästan helt av donatorbaserade celler(figur 2A).
I den delvis avskärmade bestrålningsgruppen bestrålades mottagarmöss med en bröstkorgssköld och transplanterades med 5 x 106 benmärgsceller efter en total stråldos på 11 Gy i två 5, 5 Gy-fraktioner åtskilda med 4 h intervall. I motsats till TBI-gruppen var bidraget från donatorbaserade celler till hjärtimmunceller blygsamt, vilket förmodligen återspeglar de kombinerade effekterna av att skydda de lokala immuncellerna i hjärtat på mottagarmöss och den fysiologiska återpopulationen av benmärgsbaserade donatorceller från perifert blod. Mottagarmusbenmärgsceller i skyddade områden kommer sannolikt också att ha bidragit till perifer blodberedning, vilket minskar andelen donatorbaserade celler i perifert blod jämfört med den TBI-behandlade gruppen (figur 2B).
I gruppen utan BMT prekonditionering (adoptiv BMT) transplanterades mottagarmöss med 5 x 106 benmärgsceller under 3 på varandra följande dagar. Vid 4 veckor efter BMT kunde den del av donatorbaserade cellerna i perifert blod och hjärta detekteras. (cirka 5 %) (Figur 2C).
För att illustrera hur den adoptiva BMT-modellen kan tillämpas på studien av CH-modellen transplanterades CD45.2+ donatorbenmärgsceller (WT eller Tet2-/-) till CD45.1 +mottagarmöss. Mottagare utan konditionering transplanterades med 5 x 106 benmärgsceller varje dag i 3 på varandra följande dagar (totalt 1,5 x 107, n = 5-6 per grupp). Flöde cytometrisk analys av perifert blod utfördes 4, 8, 12 och 16 veckor efter transplantation. De Tet2-bristfälliga givarcellerna gav en konkurrensfördel och expanderade gradvis med tiden. WBC, monocyter, Ly6Chi monocyter, neutrofiler, T-celler och B-celler ökade avsevärt med tiden. Jämfört med de Tet2-bristfälliga donatorceller som ingraferats i mottagarmöss visade mottagarmöss som var instärkta med WT-donatorceller mindre signifikant klonurförökning av donatorceller ( figur3). I överensstämmelse med det kliniska paradigmet för klonurmär hematopoiesis påverkar expansionen av Tet2-bristfälliga celler inte det absoluta antalet av de olika blodcellstyperna9 (data visas inte).
Figur 2: Flödescytometrisk analys av blod och hjärta med olika metoder för förkonditionering. Flöde cytometrisk analys av perifert blod och hjärta utfördes 1 månad efter benmärg transplantation. För att skilja donatorceller från mottagarnas celler transplanterades CD45,1+ mottagarmöss med CD45, 2 + donatorbenmärgsceller. (A) 5 x 106 benmärgsceller transplanterades efter två fraktioner av total kropps bestrålning (2 x 5, 5 Gy, 4 h intervall, n = 3). (B) 5 x 106 benmärgsceller transplanterades efter två bråkdelar av total kroppsbestrålning med bröstkorgsskärmning (2 x 5, 5 Gy, 4 h intervall, n = 10). (C) Mottagare utan konditionering transplanterades med 5 x 106 benmärgsceller i 3 på varandra följande dagar (totalt 1, 5 x 107, n = 4). Uppgifterna uttrycks som ± SEM. Totala WBC definieras som CD45+; Neutrofiler som Ly6G+; Ly6Chi monocyter som CD115+, Ly6G-och Ly6C+; Ly6Clo monocyter som CD115+, Ly6G-, och Ly6C-; B-celler som CD45R+; CD4+ T-celler som CD3e+ och CD4+; CD8+ T-celler som CD3e+ och CD8+; makrofager som CD64+, Ly6G-och Ly6C-. (WBC: vita blodkroppar, neut: neutrofiler, mono: monocyter, Mac: makrofager). Figur 2A,C har modifierats från Wang et al.9. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Klonurför expansion av Tet2-bristfälliga celler med adoptiv BMT till icke-konditionerade möss. CD45.2+ donator benmärgsceller (WT eller Tet2-/-) transplanterades till CD45.1+ mottagande möss. Mottagare utan konditionering transplanterades med 5 x 106 benmärgsceller varje dag i 3 på varandra följande dagar (totalt 1,5 x 107, n = 5-6 per grupp). Flöde cytometrisk analys av perifert blod utfördes efter 4, 8, 12 och 16 veckor efter transplantation. Fraktionen av CD45,2+ donatorceller i varje population visas. a)WBC(B) Mono (C) Ly6Chi mono (D) B-celler(E)T-celler. Uppgifterna uttrycks som ± SEM. WBCs definieras som CD45+; Neutrofiler som Ly6G+; Ly6Chi monocyter som CD115+, Ly6G-och Ly6C+; Ly6Clo monocyter som CD115+, Ly6G-, och Ly6C-; B-celler som CD45R+; CD4+ T-celler som CD3e+ (WT: wild-type, WBCs: vita blodkroppar, Mono: monocyter) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För studier av klonurmär hematopoiesis beskrev vi tre metoder för BMT: BMT med totalkropps bestrålning, BMT med bestrålning med partiell avskärmning och en mindre vanlig BMT-metod som inte innebär någon förkonditionering (adoptiv BMT). Dessa metoder har använts för att bedöma effekten av klonurlig hematopoiesis på hjärt-kärlsjukdom. Forskare kan ändra dessa metoder i enlighet därmed för att passa det specifika syftet med deras studie.
Kloniska hematopoiesis modeller
Klonurlig hematopoiesis är det fenomen där mutanta hematooetiska celler konkurrerar med vilda celler och får klonisk dominans över tid. För att skapa en modell av denna tävling kan möss administreras benmärg, som består av en blandning av genetiskt olika celler. I allmänhet kommer denna blandning att omfatta mutanta celler och celler av vildtyp, som har märkts med en fluorescerande tagg eller olika pan-leukocytmarkörer (dvs. CD45.1 och CD45.2). När vi till exempel skapar modeller som efterliknar Tet2-medieradCH utför vi en konkurrenskraftig benmärgstransplantation till dödligt bestrålade mottagare som vanligtvis innebär att blanda 90% av cellerna som kommer från CD45.1 Tet2+/+ givare och 10% av cellerna som kommer från CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- eller control Tet2+/+ donatorer8. Flöde cytometri detektion av CD45 varianter med specifika monoklonala antikroppar gör det möjligt att skilja donatorceller (CD45.1-/ CD45.2+) från konkurrentceller (CD45.1+/ CD45.2-) i blodet och bedöma klonurdynamiken i testcellerna över tiden. Genom att göra det har vi kunnat observera en gradvis ökning av donator chimerism av Tet2-bristfälliga celler, medan andelen vilda celler förblir på cirka 10%. Denna experimentella inställning efterliknar det mänskliga scenariot av individer som bär en TET2 somatiska mutation, eftersom dessa mutationer ursprungligen bärs av ett litet antal HSPCs, som gradvis kommer att expandera med tiden. Att använda detta tillvägagångssätt i kardiovaskulära sjukdomsmodeller av åderförkalkning och hjärtsvikt har lett till dokumentation av en potentiell orsakssamband mellan Tet2-medieradCH och CVD8,9,10.
När forskare använder dessa metoder bör de ta hänsyn till de möjliga förvirrande effekter som TBI upplever. Även om TBI före transplantation möjliggör en hög grad av HSPC engraftment, kommer denna pre-conditioning att leda till flera oönskade effekter utanför det hematopoetiska systemet. Det har dokumenterats att TBI kan leda till inflammation, skada och fibros i flera organsystem inklusive hud, lever, njurar, lungor, benmärg, hjärta, hjärna, etc.18,19,20. Dessa biverkningar kan negativt påverka de kardiovaskulära organ som studeras, och de förändrar också sjukdomspatogenes21,22. Ett anmärkningsvärt exempel är effekten av bestrålning på bosatta makrofager i hjärtat. Bestrålning av bröstkorgen resulterar i en markant ersättning av hjärt-resident makrofager med cirkulerande monocyt-härledda makrofager. Studier har visat att hjärt-resident makrofager visar tydliga egenskaper i förhållande till cirkulerande monocyt-härledda makrofager som kommer att instår i hjärtat efter strålningsskada. I sjukdomsmiljöer tros hjärt-residenta makrofager spela en kardioprotektiv roll, medan infiltrera blodburna makrofager har rapporterats för att främja skada och inflammation23. Därför är det tänkbart att ersätta bosatta hjärt immunceller med blodburna celler kommer att förändra de patologiska processer som studeras, vilket bidrar tillhjärt-kärlsjukdom 24,25,26. På samma sätt, i hjärnan, TBI resulterar i utarmning av bosatta mikroglia och ersättning av perifert härledda makrofager27,28. Medan perifert härledda makrofager kan bete sig som mikrogliaceller, upprätthåller de en unik funktionell och transkriptionell identitet jämfört med monocyt-härledda mikroglia28. Därför är det möjligt att sjukdomen och sviterna kan ändras, särskilt när man studerar sjukdomar som ischemiska stroke. För att undvika dessa förvirrande effekter kan du rekommendera att man skyddar bröstkorgen och huvudet. Detta är fördelaktigt eftersom det ger skydd till hjärtat respektive hjärnan; och det upprätthåller också deras bosatta immunceller intakta, bättre rekapitituering av det mänskliga tillståndet för CH. Men som nämnts tidigare resulterar avskärmning i en lägre frekvens av chimerism jämfört med TBI-förkonditionering, vilket i huvudsak eliminerar alla värdens hematopoetiska celler.
Ett annat viktigt hinder i förkonditionering är dess skadliga effekt på benmärgsnisch. Även om bestrålnings-inducerad skada av BM nischen kan återställas i en suboptimal utsträckning, är det oklart om naiva hematopoiesis återvinns i dessa skadade mikromiljö. Dessutom initierar transplantation av blandade HSPCs till tom BM en kapplöpning om spridning mellan kloner, snarare än den enkla "konkurrensen" för en nisch som upptas av en vild typ HSPC - vilket förmodligen är vad som händer i CH. Ett potentiellt bättre tillvägagångssätt för att studera CH kan således vara den adoptiva BMT-metoden, varigenom BM-celler överförs till mottagarmöss utan förkonditionering. Denna adoptiva BMT utan prekonditioneringsmetod påverkar minimalt den pågående naiva hematopoiesis, mest troget rekapitituerande CH observeras hos människor29. Figur 2C visar chimerismen vid 1 månad efter transplantation utan förkonditionering. Medan donator chimerismen är låg vid denna tidiga tidpunkt, finner vi en gradvis ökande andel av Tet2-bristfälliga kloner över tiden, som presenteras i figur 3. Det bör noteras att denna modell är mest användbar när de mutanta cellerna har en konkurrensfördel jämfört med celler av vildtyp under homeostatiska förhållanden som Tet2-bristfälliga celler. När Tet2-bristfälliga celler är instärkade, finns det en markant expansion i olika leukocytpopulationer som neutrofiler, monocyter, NK-celler och B-celler. En långsammare expansion noterades i T-celler, förmodligen på grund av den längre halveringstid av denna befolkning.
Expansionen av Tet2-bristfälliga celler har observerats inte bara i perifert blod utan också i flera andra vävnader, inklusive benmärg, lever och njure, med olika dynamik av hematopoetisk cell rekonstitution9. Till exempel beskrev vårt labbs tidigare publicerade papper benmärgscells chimerismen hos WT och Tet2-bristfälliga donatorceller inskrivna i CD45.1 mottagarmöss 8 månader efter adoptiv BMT9. Tet2-bristfälliga donatorceller transplanterade till CD45.1 mottagarmöss har visat en konkurrensfördel jämfört med omogna härstamningar–Sca1+c-Kit+ (LSK) celler, kortvariga och långsiktiga HSC-celler och multipotenta stamceller (MPPs) jämfört med WT-donatorceller som transplanterats till CD45.1 mottagarmöss. Dessutom, som Tet2-deficien t donatorcellinstärkta mottagarmöss, utvecklar de en åldersrelaterad kardiomyopati fenotyp utan exogena faktorer som orsakar hjärtdysfunktion och därmed rekapitituerar effekten av klonurumär hematokies på ett sätt som liknar det hos åldrande människor. Denna observation åtföljdes av ökad grad av chimerism i hjärt neutrophils och Ly6Chi monocytes. Sammantaget kan denna adoptiva BMT-regim tillämpas på framtida studier som kan utöka vår förståelse för sambandet mellan kardiovaskulär sjukdom utveckling och klonurmär hematopoiesis på en mer avancerad nivå.
Sammanfattningsvis beskrev vi tre BMT-metoder och diskuterade deras tillämpning för att generera CH-modeller. CH är förknippat med sämre prognoser vid hjärt-kärlsjukdomar som åderförkalkning och hjärtsvikt. Även om betydande framsteg har gjorts är studien av orsakssambanden mellan CH och CVD fortfarande i sin linda, och ytterligare undersökningar krävs med hjälp av optimerade djurmodeller. Vi hoppas att dessa protokoll gör det möjligt för forskare att välja en mer fysiologiskt lämplig metod för BMT, som minimerar potentiella förvirrande effekter på hjärt-kärlsystemet, vilket i slutändan ger studier som utökar vår förståelse för hur CH bidrar till hjärt-kärlsjukdom.
Design av blyskärmning
Blysköldens tjocklek kommer att dikteras av den typ av bestrålning som används för att inducera myeloablation. Röntgen- eller gammastrålningstyper av strålning används ofta för experimentell myeloablation men skiljer sig åt när det gäller frekvens, våglängd och fotonenergi. När det gäller skärmning är fotonenergin, som beskriver energin eller hastigheten med vilken strålarna färdas, den viktigaste parametern. Vanligtvis har strålningskällan röntgen en energi på 160 kVp medan cesium-137 källor, som avger gammastrålar, har en energi på 662 KeV. Den energi som dessa strålkällor avger motsvarar deras penetrationskraft, med högre energier som har en större penetrationskraft. Därför krävs en större tjocklek av blyskölden vid användning av cesium källbaserade bestrålare i jämförelse med användning av röntgenbaserade bestrålare. Röntgenbaserad bestrålning, som vi använder när vi utför bröstkorg och bukskärmning, kräver en 7 mm tjock blysköld för att ge tillräckligt skydd. För cesium 137-källor, som vi använder när vi utför huvudskydd, krävs dock att blysköldarna är minst 1 tum tjocka för att ge tillräckligt skydd.
Blysköldar för användning i röntgenstrålningsstrålare kan köpas från kommersiella leverantörer. Alternativt kan blyplåtar skäras till storlek för att antingen passa runt djurets kropp eller för att passa runt en fasthållningshållare (se figur 1). Vid användning av en cesiumbaserad bestrålare bör blyklossar, som är betydligt tjockare, användas och kan skräddarsys av företag som specialiserar sig på att göra dessa typer av sköldar. Till exempel, för huvudskölden, specialdesignade vi en blysten för att hålla en 50 ml konisk rörhållare (se figur 1F). Djuret kan passa inuti fasthållningsbilen, som sedan slitsas in i ett hål i tegelstenen, för att ge 1,5 tum skydd mot bestrålningen. Viktigt är att alla blysköldar bör beläggas antingen med färg eller tejp för att förhindra exponering för blydamm, vilket kan vara giftigt.
Baserat på utrustningen och dess parametrar kan forskare designa sina egna blysköldar för sina intressanta platser. Här introducerade vi bröstkorg, buk och huvudskärmning; Andra platser som lem eller flank kan dock också övervägas för avskärmning. Dessutom, medan båda strålkällorna (Cesium-137 och röntgen) är lämpliga för benmärgsablation och framgångsrik engraftment, har variationer i beredningen av lymfoida och myeloiska cellpopulationer observerats mellan Cesium-137 och röntgenstrålningskällor30. Forskarna bör därför ta hänsyn till de olika fysiologiska reaktionerna på strålkällan för användning i studier.
Dosintervall
Doserings- och doseringsintervall kan påverka effektiviteten hos donatorcellstransplantation och överlevnadsgrad. Hos mänskliga patienter kan hög dos bestrålning orsaka idiopatisk interstitiell lunginflammation, gastrointestinal skada och katarakt bildas. I musmodeller kan en engångsbestrålning med hög dos följt av benmärgstransplantation ge liknande resultat och kan också påverka överlevnadsgraden31. Därför rekommenderas fraktionerad bestrålning starkt för musens BMT-studier. Dessutom kan dosintervallen för fraktioner påverka musens överlevnadsgrad och rekonstitutionshastighet, vilket leder till olika fraktioner av donatorcells chimerism i de hematologiska organen samt andravävnader 31. Forskare bör därför vara försiktiga med att utforma ett fraktionerat irradiationsdreringsschema för BMT-studier.
I samband med överlevnad och immuncellsrekonstitution visade vår lilla studie att en grupp möss som fick total kropps bestrålning med en dödlig stråldos på 11 Gy i två 5, 5 Gy-fraktioner åtskilda av en 24 h intervallgrupp inte hade något signifikant annorlunda resultat än gruppen som fick samma TBI dosering med 4 h intervall (se tabell 1). Men med bröstkorg-avskärmning BMT, verkade 24 h intervall gruppen visa mindre effektivitet av donator cell chimerism i jämförelse med 4 h intervall gruppen. En möjlig förklaring till detta resultat är att bestrålning med 24 h intervall kanske inte var tillräcklig för att ta bort mottagarens immunkompetenta celler eftersom de långvariga intervallen gav mottagarmössen tillräckligt med tid för att reparera skadade celler. Dessutom skyddar bröstkorgsskärmning partiella ryggradsben som också innehåller mottagarens HSCs. Således kan de återstående och återhämtade immunkompetenta mottagarcellerna ha attackerat de givar-härledda cellerna och inducerat ett resultat som visade lägre engraftment effektivitet.
| WBC (%) | B-cell (%) | T-cell (%) | Mono (%) | Ly6Chi mono (%) | Ly6Clo mono (%) | Neutrofil (%) | ||
| TBI-BMT (TBI-BMT) | 4h intervall | 97.4 ± 1.0 | 100 ± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| 24h intervall | 97.2 ± 2.2 | 100 ± 0 | 79,0 ± 8,1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| bröstkorgsskärmning BMT | 4h intervall | 56.2 ± 4.0 | 54,2 ± 6,2 | 0,5 ± 0,1 | 66,7 ± 6,1 | 63,8 ± 6,3 | 70,8 ± 5,7 | 82,0 ± 3,8 |
| 24h intervall | 34.4 ± 3.1 | 34,8 ± 3,1 | 2.9 ± 1.7 | 45.0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56,2 ± 4,9 | 56 ± 10.0 | |
Tabell 1: Effektiviteten hos donatorcellstransplantation med olika dosintervall. Flöde cytometrisk analys av perifert blod utfördes 1 månad efter benmärg transplantation. WT (på andra) CD45.2+ donator benmärgsceller transplanterades till CD45.1+ mottagare möss. 5 x 106 benmärgsceller transplanterades efter två fraktioner av total kroppsbestrålning (2 x 5, 5 Gy) med eller utan bröstkorgsskärmning åtskilda med 4 h intervall eller 24 h intervall. (n = 3–4 per grupp).
Djurvård
Flera steg som involverar möss krävs för att detta experiment ska lyckas. Således krävs extra uppmärksamhet vid följande punkter: För det första är leveransen av livskraftiga donatorceller avgörande för framgångsrik engraftment. Man bör tränas ordentligt i insamlingen av intakta BM-celler och deras injektion i mottagarmöss. Konsekvenserna av dålig leverans av celler inkluderar misslyckandet av givaren HSPCs att rekonstruera mottagare benmärg leder till dödlighet. För det andra måste man vara försiktig efter transplantation för att undvika infektion, särskilt efter myeloablativ behandling. Kontakt med patogener kan vara dödlig, eftersom möss blir övergående immunbrist efter bestrålning. Som nämnts ovan, komplettera dricksvattnet med antibiotika kan minska risken för dödlig infektion. Dessutom kan förser mottagardjur med närings-/hydreringsgel minimera uttorkning och näringsbrist som kan uppstå efter bestrålning, eftersom bestrålning kan störa tarmepiteleriet som leder till diarré32. Burar bör också bytas ut ofta för att minska risken för fekal bakterieförorening, djur bör hanteras på en lämplig djuröverföringsstation och mottagarmössen bör övervakas noggrant för viktminskning och eventuella tecken på ångest eller smärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health-bidrag till K. Walsh (HL131006, HL138014 och HL132564), till S. Sano (HL152174), American Heart Association-bidrag till M. A. Evans (20POST35210098) och ett Japan Heart Foundation-bidrag till H. Ogawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
