Summary
我们描述了三种骨髓移植方法（BMT）：全身辐照的BMT、屏蔽辐照的BMT和无预调理（采用BMT）的BMT方法，用于研究小鼠模型中的克隆造血。
Abstract
克隆造血是一种普遍的年龄相关疾病，是造血干细胞和祖细胞（HSPCs）体细胞突变积累的结果。驱动基因的突变，赋予细胞的适应性，可以导致扩大HSPC克隆的发展，越来越多地导致后代白细胞怀有体细胞突变。由于克隆造血症与心脏病、中风和死亡率有关，因此开发模拟这些过程的实验系统是理解这一新危险因素的机制的关键。骨髓移植程序涉及小鼠骨髓移植调节，如全身照射（TBI），通常用于研究免疫细胞在心血管疾病中的作用。然而，同时损害骨髓利基和其他感兴趣的部位，如心脏和大脑，是不可避免的与这些程序。因此，我们的实验室已经开发出两种替代方法，以尽量减少或避免TBI可能造成的副作用：1） 骨髓移植与辐照屏蔽和 2） 采用BMT到非条件小鼠。在屏蔽器官中，保留局部环境，以便分析克隆造血，同时居民免疫细胞的功能不受干扰。相比之下，对无条件小鼠采用BMT具有额外的优势，即保留器官的局部环境和造血利基。在这里，我们比较了三种不同的造血细胞重组方法，并讨论了它们在心血管疾病中克隆造血症研究的长处和局限性。
Introduction
克隆造血症 （CH） 是一种在老年人中经常观察到的疾病，并且由于携带基因突变1的扩大造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 克隆而发生。有人建议，到50岁时，大多数个体在每一个HSPC2中平均会获得5个外向突变，但大多数这些突变对个体的影响很小或根本没有。然而，如果这些突变中偶然的一个给HSPC带来竞争优势，例如通过促进它的增殖、自我更新、生存或这些突变的某种组合——这可能导致突变克隆相对于其他HSC的优先扩展。因此，随着突变的HSPC产生成熟的血细胞，突变将越来越多地通过造血系统传播，导致周围血液中突变细胞的明显数量。虽然数十种不同候选驱动基因的突变与造血系统中的克隆事件有关，但其中，DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）和11个转移2（TET2）的突变是最普遍的3。一些流行病学研究发现，携带这些基因突变的个体患心血管疾病（CVD）、中风和全因死亡率的风险要高得多。虽然这些研究已经确定CH与心乳炎和中风发病率增加之间存在关联，但我们不知道这种关系是因果关系还是与衰老过程共享的表皮。为了更好地了解这种关联，需要适当的动物模型来正确地回顾CH的人类状况。
我们小组和其他使用斑马鱼、老鼠和非人类灵长类动物8、9、10、11、12、13、14建立了若干CH动物模型。这些模型通常使用造血重组方法移植转基因细胞，有时使用Cre-lox重组或CRISPR系统。这种方法允许分析造血细胞中的特定基因突变，以评估它如何促进疾病发展。此外，这些模型通常使用致癌细胞或报告细胞来区分突变细胞与正常或野生细胞的影响。在许多情况下，需要预调理方案才能成功移植供体造血干细胞。
目前，骨髓移植到受体小鼠可分为两大类：1）骨髓移植和2）无条件移植。骨髓调节可以通过两种方法之一，即全身照射（TBI）或化疗15实现。TBI是通过让接受者接受致命剂量的伽马或X射线照射，在快速分裂的细胞内产生DNA断裂或交叉链接，使它们无法弥补16。布苏尔凡和环磷酰胺是两种常用的化疗药物，它们破坏造血利基，并同样对快速分裂的细胞造成DNA损伤。骨髓疏松预制的最终结果是造血细胞凋亡，从而破坏了受体的造血系统。这一战略不仅使捐赠者HSPC能够成功获得，而且可以通过抑制接受者的免疫系统来防止移植排斥。然而，骨髓调节有严重的副作用，如损害组织和器官及其居民免疫细胞，以及破坏原生骨髓利基17。因此，提出了克服这些不良副作用的替代方法，特别是在对利益机关的损害方面。这些方法包括受体小鼠的屏蔽辐照和采用BMT对非条件小鼠9，17。通过放置铅屏障保护胸腔、腹腔、头部或其他区域免受辐照，使感兴趣的组织免受辐照的破坏性影响，并维持其常驻免疫细胞群。另一方面，HSPC对无条件小鼠的采用BMT具有额外的优势，因为它保留了原生的造血利基。在本手稿中，我们描述了在小鼠中移植几种方案后HSPC移植的协议和结果，特别是将HSPC输送给TBI小鼠、部分不受辐照的老鼠和非条件小鼠。总体目标是帮助研究人员了解每种方法的不同生理影响，以及它们如何影响CH和心血管疾病设置中的实验结果。
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Protocol
所有涉及动物学科的程序都已得到弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
1. 在先决条件之前
- 在辐照前将受助小鼠置于抗生素补充水（5m 磺酰太极，0.86 mM 三氯苯丙酮）~24h。这是预防感染所必需的，因为免疫系统在照射后会受到抑制，并在辐照后维持2周。此时，用营养/水化凝胶补充小鼠，以鼓励喂养，防止辐照后体重减轻和脱水。
图1：显示各种预制设置的图像。（A） 使用伽马射线（Cesium-137）进行饼笼全身辐照设置：辐射束来自 y 轴方向（水平辐射）的辐照器背面。（B） 使用 X 射线进行鼠标笼总体辐照设置：鼠标笼放置在反射室中。辐射束以圆锥体（垂直辐射）的形状来自辐照器的顶部。X射线辐照器中从辐射源到笼子的距离为 530 mm.（C） 可调节托盘：此设置用于使用 X 射线进行部分屏蔽辐照。辐射束以圆锥体（垂直辐射）的形状来自辐照器的顶部。从辐射源到托盘的距离为373毫米，半径为250毫米。老鼠被倒置在苏平的位置，胳膊和腿完全伸展。铅盾的下端与西菲斯特纳姆骨和上端与胸腺对齐。（E） 腹膜屏蔽：麻醉小鼠被放置在胸罩设置中，铅屏蔽的下端与肛门对齐，上端与隔膜下方对齐。（F） 使用伽马射线 （Cesium-137） 进行头部屏蔽辐照设置：麻醉鼠标的前爪被绑住，鼠标被放置在锥形约束器中。黑色铅盾（标记）覆盖鼠标的头部和耳朵。辐射束来自照射器的背面，方向为Y轴（水平辐射）。请单击此处查看此图的较大版本。
2. 接受者鼠标的前提条件（可选）
- 全身辐照
- 将受体小鼠放入均匀切片的馅饼笼中，或在计算半径内的反射室中放入小鼠笼中，以接受相同的辐照剂量：然而，建议每个馅饼笼最多8只小鼠和每个小鼠笼最多5只小鼠，以确保均匀的辐照（图1A，B）。
- 要实现完全骨髓消融，请确保受体小鼠在两个 5.5 Gy 分数中接收总辐射剂量为 11 Gy，间隔为 4–24 h。
注意：虽然可以通过在分数之间实现 4 小时间隔来获得最佳的增聚，但可以延长到 24 小时间隔，当无法使用人工和/或辐照器时，这会很有帮助。
- 部分屏蔽辐照
- 通过注射氯胺酮（80-100毫克/千克）和西拉津（5~10毫克/千克）对受体小鼠进行麻醉。限制鼠标移动对于确保在屏蔽过程中对目标器官进行统一照射和有效保护至关重要。
- 对于胸腔和腹部屏蔽，X射线辐照器的辐射束垂直定向到小鼠（图1C）。
- 将麻醉小鼠定位在平板上，从上面集中辐射源。将小鼠倒置在一个双臂和腿部完全伸展的超平位置（图1D，E）。
注：X射线辐照器设施，为这个实验，允许两只小鼠一次可以定位在有效的半径内，允许统一的辐照。虽然有效半径是根据辐射源和托盘之间的距离计算的，但可以同时照射的动物数量将取决于特定的辐照器。 - 用胶带将小鼠的爪子固定在盘子上，以确保小鼠在辐照过程中固定。放置铅屏蔽，使其覆盖需要保护的区域。
- 对于胸腔屏蔽，通过测量从小鼠的十足骨到胸腺的长度并计算厚度来准备铅盾，从而提供足够的保护，防止辐照源。放置铅屏蔽，使下端与西菲斯特纳姆骨对齐。铅屏障的上端将贴合在胸腺附近（图1D）。
- 对于腹部屏蔽，通过测量从小鼠肛门到隔膜的长度并计算厚度来准备铅屏蔽，从而提供足够的保护，防止辐照源。放置铅屏蔽，使下端与肛门对齐。铅盾的上端将安装在隔膜下面（图1E）。
注意：将铅盾定位为队列之间的一致性可能会减少小鼠大小的一些变化。
- 将麻醉小鼠定位在平板上，从上面集中辐射源。将小鼠倒置在一个双臂和腿部完全伸展的超平位置（图1D，E）。
- 为了头部屏蔽，将硅辐照器的辐射束水平定向到鼠标。
- 小心地将麻醉鼠的前爪贴在腹部。这确保了手臂获得全剂量的辐照，并且不受防护罩的覆盖。
- 对于头部屏蔽，将鼠标放入锥形约束器中，该约束器适合在铅盾内。一旦鼠标在圆锥形约束器内，将约束器滑入铅盾内的插槽（图 1F）中。铅盾应完全覆盖小鼠的头部和耳朵（约3.2厘米），使小鼠身体的其余部分暴露在照射之下。护盾内约束器的位置可以通过在护盾内部或外部进一步滑动来调整以适应不同大小的动物。
- 将鼠标放在辐照器内，垂直于辐照源。
- 将小鼠暴露在两个 5.5 Gy 的辐照分数（总剂量为 11 Gy）中，间隔为 4–24 小时。
- 每次辐照后，将带麻醉小鼠的笼子放在加热垫上或红热灯下，以防止体温过低，有助于麻醉的恢复。
注意：使用灯时必须小心不要过热麻醉的鼠标，因为它们无法逃过热。如上所述，动物的定位和铅盾的厚度可能因辐照器（辐射类型/光束方向等）的具体特征而有所不同。研究人员需要相应地调整他们的实验。
3. 骨骼分离
注：理想情况下，供体小鼠和受体小鼠的年龄应相似，在8-12周内。使用至少3只小鼠作为捐赠者（而不是单一捐赠者）是首选，以尽量减少异质性（即使使用具有相同基因型的小鼠）。大约4000万未折射的骨髓细胞可以从一只小鼠的六块骨头（两个股骨、两个头骨和两个胡梅里）中获得。将500万骨髓细胞移植到每个接受者小鼠通常可以确保移植。
- 在没有麻醉的情况下通过颈椎脱位（避免细胞化学污染的首选方法）对供体小鼠进行安乐死，并将每只小鼠放在吸水垫上。
- 使用70%的乙醇喷雾剂对皮肤进行消毒。
- 在肋骨笼下的皮肤上做一个小的横切，在切口的两边紧紧地握住皮肤，朝头部和脚部方向撕裂。从四肢剥去皮肤。
- 切开肩膀和肘关节，并在 Kimwipe 的帮助下取出附着的肌肉和结缔组织，以获得腐殖质。
- 小心地将股骨和臀部骨骼之间的臀部关节脱位。使用钝剪刀沿股骨头部切割并分离腿部。切开膝盖关节，分离股骨和头骨，并在 Kimwipe 的帮助下小心地取出附着的肌肉和结缔组织，以收获股骨和头骨。
注意：在此步骤中，请特别注意保持骨骼脱毛完好无损。丢弃因失去不育造成的任何骨折。除了股骨、头骨和腐殖质外，还可以收集臀部骨骼和脊椎骨。为了收集脊椎骨骼，可以使用砂浆和刺将骨骼粉碎成碎片并收获骨髓细胞。 - 将同一基因型小鼠分离的骨骼放入相应的50mL圆锥管中，其中含有20mL的冰冷无菌PBS，并将其保存在冰上，直到进一步使用。特别注意正确地将骨骼放入具有匹配基因型的管中。
- 在每个小鼠之间重复上述步骤，让每个供体动物更换手套。此外，清洁剪刀和其他仪器与70%乙醇之间的每个小鼠。
4. 骨髓细胞分离
注意：在生物安全 II 类柜中执行以下步骤。
- 管组的制备：使用18G针在无菌0.5 mL微中流管底部打一个小孔，将其放入无菌1.5mL微中流管中，底部含有100微L的冰冷无菌PBS。
注：由于只有六块骨骼可以放入 0.5 mL 微中微管中，因此建议准备足够的管子，同时处理所有骨骼。 - 吸气PBS，并将分离的骨骼转移到无菌的100毫米细胞培养皿中。用细钳握住每根骨头，用在高压灭菌器中消毒的小剪刀小心地切下每一端的表皮。将切骨放入准备好的管子中。
- 在 4 °C 下，将管子以 10，000 x g 的速度离心 35 s。
- 离心后，确认骨髓已成功从骨骼中取出。骨骼应呈白色和半透明，1.5 mL 微中枢管底部有相对较大的红色颗粒。丢弃 0.5 mL 微中微管。
注意：如果目视检查未能检测到 1.5 mL 管底部的骨髓，请再次切割骨骼并重复步骤 4.3。 - 将骨髓在1mL的冰冷PBS中补充，然后将细胞悬浮从同一基因型转移到匹配的50mL圆锥管。
- 通过10mL注射器通过18G针头分离细胞10次。
- 通过 70μm 细胞过滤器过滤单细胞悬架。将额外的冰冷 PBS 添加到 10 mL 的最终体积中，并通过轻柔使用移液器辅助器来补充细胞。
- 离心机在310 x g 10分钟在4°C。
- 吸气超自然，用10mL的无血清RPMI介质重新吸收细胞颗粒。备用 30 μL 的此材料用于细胞计数。
- 用细胞计数器确定细胞浓度，并计算移植所需的细胞悬浮量。例如100%BMT，每个接受者小鼠需要5×10 6 个骨髓细胞。
注意：对于竞争激烈的 BMT，共准备 5 x 106 骨髓细胞，包括供体细胞（如 CD45.2+）和竞争对手细胞（例如 CD45.1 + ）的混合物。强烈推荐准备额外的骨髓细胞。例如，如果每个实验组有 10 只接受小鼠，我们通常为 12 只受体小鼠准备足够的细胞。 - 将计算的细胞悬架体积转移到新的 50 mL 圆锥管中。离心机在310 x g 10分钟在4°C。
- 吸气超自然物质，并使用计算的无血清RPMI介质来补充细胞，以达到适当的细胞密度和体积。通常，200 μL 是复古轨道注入的最佳体积。
5. 将骨髓细胞移植到辐照小鼠身上
- 用5%异氟兰麻醉接受者小鼠。
- 当小鼠麻醉时，使用28-30 G针头用胰岛素注射器缓慢地将200μL的骨髓细胞注射到逆轨道静脉中。
- 或者，通过尾静脉静脉注射和股骨内注射进行供体细胞的输送，最大体积分别为0.2 mL和25μL。
- 细胞注射后，将一滴含丙酸酸眼药水放在眼睛表面以缓解疼痛。然后，动物可以被允许恢复知觉。
6. 将骨髓细胞移植到无条件小鼠身上
- 麻醉接受者小鼠吸入5%的异氟素。
- 将来自任一基因型的5×10 6 未折痕骨髓细胞逆轨注射到带有28-30G胰岛素注射器的非辐照接受小鼠体内。
- 连续3天重复6.1和6.2步，使受体小鼠将移植总共1.5×107 个骨髓细胞。
注：由于没有预调理程序的采用BMT需要连续3天进行骨髓移植，因此每次注射时应尝试交替眼睛。 - 注射后，给受影响的眼睛施用一滴含丙酸酸的眼药水。
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Representative Results
为了比较三种BMT/预调理方法对供体细胞移植的影响，通过BMT后1个月的流动细胞测量分析外周血液和心脏组织中供体细胞的分数。分离细胞被染色为特定的白细胞标记物，以识别白细胞的不同子集。在这些实验中，野生型C57BL/6（CD45.2）供体骨髓细胞被输送到WT B6。SJL-Ptprc一个Prpcb/ BoyJ （CD45.1） 受体小鼠，以区分受体细胞中的供体细胞和受体细胞。王等人在补充图1中描述了以前使用的流动细胞测量门控策略。
全身辐照 （TBI） 治疗组接受 5 x 106骨髓细胞后，在两个 5.5 Gy 分数以 4 小时间隔分离的总致命辐射剂量 11 Gy 之后。在受体小鼠的外周血液中，单核细胞、嗜中性粒细胞和B细胞基本上被消融，取而代之的是供体骨髓衍生细胞的后代。此外，受体小鼠心脏中常住的心脏单核细胞和中性粒细胞种群几乎完全被供体衍生细胞所取代（图2A）。
在部分屏蔽的辐照组中，受体小鼠用胸罩照射，在两个5.5 Gy分数（相隔4小时间隔）中，在总辐射剂量为11 Gy后，用5×106骨髓细胞移植。与TBI组相比，供体衍生细胞对心脏免疫细胞的贡献不大，这可能反映了保护受体小鼠心脏中局部免疫细胞和从外周血液中提取骨髓的供体细胞的生理再填充的综合作用。受试者小鼠骨髓细胞在屏蔽区域也有可能促成外周血液重组，这降低了供体衍生细胞在外周血液中的比例相比TBI治疗组（图2B）。
在没有BMT预调（采用BMT）的组中，受体小鼠连续3天移植5×10 6 个骨髓细胞。在BMT后4周，外周血液和心脏中供体衍生细胞的部分是可检测的。（约5%）（图 2C） 。
为了说明如何将采用BMT模型应用于CH模型的研究，CD45.2+供体骨髓细胞（WT或Tet2--）被移植到CD45.1+受体小鼠中。无条件的接受者连续3天每天移植5×10 6个骨髓细胞（每组共1.5×10 7，n=5×6）。移植后4周、8周、12周和16周对周围血液进行流动细胞学分析。Tet2缺乏的供体细胞赋予了竞争优势，并随着时间的推移逐渐扩大：随着时间的推移，WBCs、单核细胞、Ly6C高单核细胞、嗜中性粒细胞、T细胞和B细胞显著增加。与移植到受体小鼠体内的Tet2缺乏供体细胞相比，与WT供体细胞相植的受体小鼠相比，受体细胞的克隆扩张程度较低（图3）。与克隆造血症的临床范式一致，Tet2缺乏细胞的扩张不会影响9型血细胞的绝对数量（数据未显示）。
图2：使用不同预置方法对血液和心脏进行流动细胞学分析。骨髓移植1个月后对周围血液和心脏进行流动细胞学分析。为了区分供体细胞和受体细胞，CD45.1+受体小鼠用CD45.2+受体骨髓细胞移植。（A） 5 x 106骨髓细胞在身体总辐照的两部分（2 x 5.5 Gy，4 小时间隔，n = 3）后移植。（B） 5 x 106骨髓细胞在通过胸膜照射身体总辐照的两部分后移植 （2 x 5.5 Gy， 4 小时间隔， n = 10）。（C） 无条件的接受者连续3天移植5×106骨髓细胞（共1.5×107，n = 4）。数据表示为平均± Sem.总 WBC 定义为 CD45+：嗜中性粒细胞作为 Ly6G+;Ly6C喜单核细胞作为CD115+，Ly6G-和Ly6C+：Ly6Clo单核细胞为CD115+、Ly6G-和Ly6C-：B细胞作为CD45R+：CD4+T单元作为CD3e+和CD4+ ： CD8+T单元作为CD3e+和CD8+ ： 和巨噬细胞作为CD64+，Ly6G-和Ly6C-。（WBCs： 白血球， 纽特： 嗜中性粒细胞， 单核细胞， Mac： 巨噬细胞）.图2A、C已由王等人修改为9。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：使用采用BMT向无条件小鼠的Tet2缺陷细胞的克隆扩张。CD45.2+供体骨髓细胞（WT或Tet2-/-）被移植到 CD45.1+受体小鼠中。没有条件的接受者连续3天每天移植5×10 6骨髓细胞（每组共1.5×10 7，n=5-6）。移植后4周、8周、12周和16周后对周围血液进行流动细胞学分析。显示了每个人群中CD45.2+供体细胞的分数。（A） WBCs （B） 单声道 （C） Ly6C喜单 （D） B 细胞 （E） T 细胞。数据表示为平均± SEM. WBC 定义为 CD45+：嗜中性粒细胞作为 Ly6G+;Ly6C喜单核细胞作为CD115+，Ly6G-和Ly6C+：Ly6Clo单核细胞为CD115+、Ly6G-和Ly6C-：B细胞作为CD45R+：CD4+ T 细胞作为 CD3e+ （WT： 野生类型， WBCs： 白血球， 单核细胞）请点击这里查看此图的更大版本。
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Discussion
对于克隆造血症的研究，我们描述了BMT的三种方法：具有全身辐照的BMT、带部分屏蔽的辐照BMT，以及一种不太常用的BMT方法，不涉及预调理（采用BMT）。这些方法已用于评估克隆血吸管对心血管疾病的影响。研究人员可以相应地修改这些方法，以适应他们研究的具体目的。
克隆造血模型
克隆造血是突变造血细胞与野生类型细胞竞争并随着时间的推移获得克隆优势的现象。为了创建这种竞争的模型，小鼠可以管理骨髓，它由基因不同的细胞的混合物组成。一般来说，这种混合物将包括突变细胞和野生型细胞，这些细胞被贴上荧光标签或不同的泛白细胞标记（即CD45.1和CD45.2）。例如，在创建模拟Tet2介导 CH 的模型时，我们会对致命辐照接受者进行竞争性骨髓移植，通常涉及混合来自 CD45.1 Tet2+/+捐赠者的 90% 的细胞和来自 CD45.2 Tet2-/-、Tet2 +/-或控制Tet2+/+捐赠者8的 10% 的细胞。使用特定单克隆抗体对CD45变异进行流动细胞检测，使人能够区分血液中的供体细胞（CD45.1-/CD45.2+）和竞争对手细胞（CD45.1+/CD45.2-），并随着时间的推移评估测试细胞的克隆动力学。通过这样做，我们能够观察到Tet2缺乏细胞的供体幻想逐渐增加，而野生细胞的比例保持在10%左右。这种实验环境模仿携带TET2体细胞突变的个体的人类情景，因为这些突变最初是由少量的HSPC携带的，这些HSPC会随着时间的推时间逐渐扩大。在动脉粥样硬化和心力衰竭的心血管疾病模型中采用这种方法，已导致Tet2介导 CH 与 CVD8、9、10之间潜在的因果关系记录。
在采用这些方法时，研究人员应考虑TBI可能产生的混淆效应。虽然移植前的 TBI 能够进行高度的 HSPC 移植，但这种预调调将导致造血系统之外的一些不良影响。据记载，TBI可导致皮肤、肝脏、肾脏、肺、骨髓、心脏、大脑等多个器官系统的炎症、损伤和纤维化。这些副作用可以对正在研究的心血管器官产生负面影响，并且它们也会改变疾病发病机能21，22。一个显著的例子是辐照对心脏中居民巨噬细胞的影响。胸腔的照射导致心脏驻地巨噬细胞与循环单细胞衍生巨噬细胞的显著替代。研究表明，心脏驻地巨噬细胞相对于辐射损伤后会移植到心脏的单核细胞衍生巨噬细胞表现出明显的特征。在疾病设置中，心脏驻留巨噬细胞被认为具有心脏保护作用，而渗透血液传播的巨噬细胞则被报告促进损伤和炎症23。因此，可以想象，用血液传播细胞取代居民心脏免疫细胞将改变正在研究的病理过程，从而导致心血管疾病24、25、26。同样，在大脑中，TBI导致居民微胶质的耗竭，并被外周衍生的巨噬细胞27，28取代。虽然外周衍生的巨噬细胞可以像微胶质细胞一样表现，但与单细胞衍生的微胶质28相比，它们保持了独特的功能和转录特性。因此，疾病后遗症有可能改变，特别是在研究缺血性中风等疾病时。为了避免这些混淆的效果，可以建议屏蔽胸腔和头部。这是有利的，因为它分别为心脏和大脑提供保护：并且它还保持其常驻免疫细胞完好无损，更好地概括了CH的人类状况。然而，如前所述，与TBI预调相比，屏蔽会导致较低的幻想率，TBI预调基本上消除了宿主的所有造血细胞。
预调的另一个重要障碍是它对骨髓利基的有害影响。虽然 BM 利基的辐照引起的损害可以恢复到次优程度，但尚不清楚在这些受损的微环境中是否恢复了天真的造血症。此外，将混合 HSPC 移植到空的 BM 中，会引发克隆人之间的增殖竞赛，而不是对被野生型 HSPC 占据的利基的简单"竞争"，这大概就是 CH 中发生的情况。因此，研究CH的一种可能更可取的方法可能是采用BMT方法，即BM细胞在没有预调理的情况下被转移到受体小鼠体内。这种采用BMT没有预调理的方法最小地影响正在进行的天真的造血症，最忠实地回顾CH观察到在人类29。图2C显示移植后1个月的无预调音的幻想水平。虽然在这个早期的点，捐赠者的幻想是低的，但我们发现，随着时间的推移，Tet2缺陷克隆的分数会逐渐增加，如图3所介绍的那样。需要注意的是，当突变细胞在静态条件下（如Tet2 缺陷细胞）中具有与野生类型细胞的竞争优势时，此模型最有用。当Tet2缺陷细胞被移植时，各种白细胞种群（如嗜中性粒细胞、单核细胞、NK细胞和B细胞）有明显的扩张。T细胞的扩张速度较慢，大概是由于这种人群的半寿命更长。
Tet2缺乏细胞的扩张不仅在外周血液中，而且在其他几个组织，包括骨髓，肝脏和肾脏，具有不同的动力学造血细胞重组9。例如，我们实验室先前发表的论文描述了WT和Tet2缺乏供体细胞的骨髓细胞的奇效性，这些细胞在采用BMT 9 8个月后移植到CD45.1受体小鼠体内。移植到CD45.1受体小鼠的Tet2缺乏供体细胞与移植到CD45.1受体小鼠的WT供体细胞相比，显示出了竞争优势——Sca1+c-Kit+ （LSK）细胞、短期和长期HSC细胞以及多能祖细胞（MPPs）与移植到CD45.1受体小鼠的WT供体细胞相比。此外，作为Tet2-缺乏t捐赠细胞包养的受体小鼠，他们开发一个年龄相关的心肌病表型，没有外源因素导致心脏功能障碍，从而以类似于衰老人类的方式回顾克隆造血症的影响。这一观察伴随着心脏嗜中性粒细胞和Ly6C高单核细胞的奇美化程度的提高。总的来说，这种采用BMT疗法可以应用于未来的研究，可以扩大我们对心血管疾病发展与克隆造血症之间在更高级水平上的关联的理解。
总之，我们描述了三种 BMT 方法，并讨论了它们在生成 CH 模型中的应用。CH 与心血管疾病（如动脉粥样硬化和心力衰竭）的预后较差有关。虽然已取得重大进展，但研究CH与CVD之间的因果关系仍处于起步阶段，需要利用优化的动物模型进行进一步调查。我们希望这些协议允许研究人员选择一种更生理上合适的BMT方法，将潜在的混淆效应降到最低，最终得出有助于我们理解CH如何导致心血管疾病的研究。
铅屏蔽设计
铅盾的厚度将由用于诱导骨髓消融的辐照类型决定。X射线或伽马射线类型的辐射经常用于实验性骨髓消融，但在频率、波长和光子能量方面有所不同。当涉及到屏蔽时，光子能量是最重要的参数，它描述了射线的能量或速度。通常，辐射源 X 射线的能量为 160 kVp，而发射伽马射线的钚-137 源的能量为 662 KeV。这些辐射源释放的能量等同于其渗透能力，而较高的能量具有更大的渗透能力。因此，与使用基于 X 射线的辐照器相比，使用基于氦源的辐照器时，需要更大的铅屏蔽厚度。X射线照射，我们使用时，我们执行胸腔和腹部屏蔽，需要一个7毫米厚的铅盾，以提供足够的保护。然而，对于137源，我们在进行头部屏蔽时使用，需要铅盾至少1英寸厚，以提供足够的保护。
可用于 X 射线辐照器的铅盾可以从商业供应商处购买。或者，铅片可以切成大小，以适应动物的身体或适合周围的约束器（见 图1）。使用基于氦的辐照器时，应使用较厚的铅砖，并且可由专门制造这些类型的防护罩的公司定制。例如，对于头挡板，我们定制设计了一个铅砖，用于容纳 50 mL 锥形管约束器（见 图 1F）。动物能够放入约束器内，然后放入砖块上的一个孔中，以提供 1.5 英寸的辐照保护。重要的是，所有铅盾都应涂上油漆或胶带，以防止暴露在铅粉中，因为铅粉尘可能是有毒的。
根据设备及其参数，研究人员可以为自己感兴趣的地点设计自己的铅盾。在这里，我们介绍了胸腔、腹部和头部屏蔽：但是，其他站点，如肢体或侧翼，也可以考虑屏蔽。此外，虽然这两种辐射源（Cesium-137和X射线）都适合骨髓消融和成功移植，但在淋巴细胞和骨髓细胞群的重组中，在30个淋巴细胞和骨髓细胞群的重组中观察到的变异性。因此，研究人员应考虑到对辐射源的不同生理反应，以便用于研究。
剂位间隔
剂量和剂量间隔可能会影响供体细胞移植的效率和存活率。在人类患者中，高剂量辐照可引起特发性间歇性肺炎、胃肠道损伤和白内障形成。在小鼠模型中，单次高剂量辐照和骨髓移植可以产生类似的结果，也会影响31的存活率。因此，对于小鼠BMT研究，强烈推荐分馏辐照。此外，分数的给药间隔会影响小鼠的存活率和重组率，导致血液器官和其他组织中不同比例的供体细胞幻想。因此，研究人员在为BMT研究设计一个分数辐照给注时间表时应小心谨慎。
在存活率和免疫细胞重组方面，我们的小研究表明，在两个5.5 Gy分数中接受全身辐照的老鼠，在24小时间隔组分离的两个5.5 Gy分数中，与在4小时间隔内接受相同TBI剂量的组没有显著差异（见 表1）。然而，与4小时间隔组相比，24小时间隔组的tharax屏蔽BMT似乎显示供体细胞幻想的效率较低。这一结果的一个可能解释是，24小时间隔的辐照可能不足以去除接受者的免疫能力细胞，因为长时间的间隔给了受体小鼠足够的时间来修复受损的细胞。此外，胸罩保护部分脊柱骨骼，其中也包含收件人的HSC。因此，剩余和恢复的免疫能力受体细胞可能攻击了供体衍生的细胞，并诱导出一种结果，显示较低的移植效率。
| WBC （%） | B 细胞 （%） | T 细胞 （%） | 单声道 （%） | Ly6C喜 单声道 （%） | Ly6C洛 单声道 （%） | 中性粒细胞 （%） | ||
| 特比 - 姆特 | 4小时间隔 | 97.4 ± 1.0 | 100± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100± 0 | 100± 0 | 100± 0 | 100± 0 |
| 24小时间隔 | 97.2 ± 2.2 | 100± 0 | 79.0 ± 8.1 | 100± 0 | 100± 0 | 100± 0 | 100± 0 | |
| 胸罩 Bmt | 4小时间隔 | 56.2 ± 4.0 | 54.2 ± 6.2 | 0.5 ± 0.1 | 66.7 ± 6.1 | 63.8 ± 6.3 | 70.8 ± 5.7 | 82.0 ± 3.8 |
| 24小时间隔 | 34.4 ± 3.1 | 34.8 ± 3.1 | 2.9 ± 1.7 | 45.0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56.2 ± 4.9 | 56 ± 10.0 | |
表1：使用不同剂次间隔的供体细胞移植效率。 骨髓移植1个月后对周围血液进行流动细胞学分析。 瓦特 CD45.2+ 供体骨髓细胞被移植到CD45.1+ 受体小鼠中。5 x 106 骨髓细胞在身体总辐照的两部分 （2 x 5.5 Gy） 后移植，有或没有胸罩，间隔为 4 小时或 24 小时间隔。（n = 每组 3–4）。
动物护理
要使这个实验成功，需要多个步骤来参与小鼠实验。因此，需要在以下几点给予额外的关注：第一，提供可行的供体细胞对于成功移植至关重要。一个人应该接受适当的训练，收集完整的BM细胞，并将其注射到受体小鼠。细胞输送不良的后果包括供体HSPC未能重组接受者骨髓，导致死亡。第二，移植后必须小心避免感染，尤其是在骨髓移植治疗之后。与病原体的接触可能是致命的，因为小鼠在照射后会暂时免疫缺陷。如上所述，用抗生素补充饮用水可以降低致命感染的风险。此外，为受助动物提供营养/水化凝胶可以最大限度地减少辐照后可能发生的脱水和营养缺乏，因为辐照会破坏肠道上皮，导致腹泻。还应经常更换笼子，以减少粪便细菌污染的风险，动物应在适当的动物转运站处理，接受者小鼠应仔细监测体重减轻和任何痛苦或疼痛的迹象。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院对K.Walsh（HL131006，HL138014和HL132564）的资助，对S.Sano（HL152174）、美国心脏协会对M.A.Evans（20POST35210098）的赠款以及日本心脏基金会对小川的赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
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