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Immunology and Infection

Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/61875
Automatic Translation
1, 4, 4, 4, 4, 4, 2, 3,4, 1,4
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

Summary

Descriviamo tre metodi di trapianto di midollo osseo (BMT): BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione schermata e metodo BMT senza precondi condizionamento (BMT adottivo) per lo studio dell'ematopoiesi clonale nei modelli di topo.

Abstract

L'ematopoiesi clonale è una condizione prevalente associata all'età che deriva dall'accumulo di mutazioni somatiche nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Le mutazioni nei geni dei driver, che conferiscono forma fisica cellulare, possono portare allo sviluppo di cloni HSPC in espansione che danno sempre più origine a leucociti progenie che ospitano la mutazione somatica. Poiché l'ematopoiesi clonale è stata associata a malattie cardiache, ictus e mortalità, lo sviluppo di sistemi sperimentali che modellano questi processi è fondamentale per comprendere i meccanismi che sottinero a questo nuovo fattore di rischio. Le procedure di trapianto di midollo osseo che coinvolgono il condizionamento mieloablativo nei topi, come l'irradiazione totale del corpo (TBI), sono comunemente utilizzate per studiare il ruolo delle cellule immunitarie nelle malattie cardiovascolari. Tuttavia, il danno simultaneo alla nicchia del midollo osseo e ad altri siti di interesse, come il cuore e il cervello, è inevitabile con queste procedure. Pertanto, il nostro laboratorio ha sviluppato due metodi alternativi per ridurre al minimo o evitare possibili effetti collaterali causati da TBI: 1) trapianto di midollo osseo con schermatura di irradiazione e 2) BMT adottivo a topi non condizionati. Negli organi schermati, l'ambiente locale è preservato consentendo l'analisi dell'ematopoiesi clonale mentre la funzione delle cellule immunitarie residenti non è perturbata. Al contrario, il BMT adottivo per topi non condizionati ha l'ulteriore vantaggio che sia gli ambienti locali degli organi che la nicchia ematopoietica sono conservati. Qui, confrontiamo tre diversi approcci di ricostituzione delle cellule ematopoietiche e discutiamo i loro punti di forza e limiti per gli studi sull'ematopoiesi clonale nelle malattie cardiovascolari.

Introduction

L'ematopoiesi clonale (CH) è una condizione che si osserva frequentemente negli individui anziani e si verifica come risultato di un fusto ematopoietico espanso e di un clone della cellula progenitrice (HSPC) che porta una mutazione genetica1. È stato suggerito che all'età di 50 anni, la maggior parte degli individui avrà acquisito una media di cinque mutazioni esoniche in ogni HSPC2, ma la maggior parte di queste mutazioni comporterà poche o nessuna conseguenza fenotipica per l'individuo. Tuttavia, se per caso una di queste mutazioni conferisce un vantaggio competitivo all'HSPC, ad esempio promuovendone la proliferazione, l'autorinovità, la sopravvivenza o qualche combinazione di queste, ciò potrebbe portare all'espansione preferenziale del clone mutante rispetto agli altri HSPC. Di conseguenza, la mutazione si diffonderà sempre più attraverso il sistema ematopoietico poiché l'HSPC mutato dà origine a cellule del sangue mature, portando a una distinta popolazione di cellule mutate all'interno del sangue periferico. Mentre mutazioni in dozzine di diversi geni driver candidati sono stati associati a eventi clonali all'interno del sistema ematopoietico, tra questi, le mutazioni nel DNA metiltransferasi 3 alfa (DNMT3A) e dieci undici traslocazioni 2 (TET2) sono le più prevalenti3. Diversi studi epidemiologici hanno scoperto che gli individui che portano queste mutazioni genetiche hanno un rischio significativamente più elevato di malattie cardiovascolari (CVD), ictus e mortalità per cause3,4,5,6,7. Mentre questi studi hanno identificato che esiste un'associazione tra CH e aumento dell'incidenza di CVD e ictus, non sappiamo se questa relazione sia causale o un epifenomeno condiviso con il processo di invecchiamento. Per ottenere una migliore comprensione di questa associazione, sono necessari modelli animali adeguati che ricapitolano correttamente la condizione umana di CH.

Diversi modelli di animali CH sono stati stabiliti dal nostro gruppo e altri utilizzando zebrafish, topi e primati non umani8,9,10,11,12,13,14. Questi modelli utilizzano spesso metodi di ricostituzione ematopoietica mediante trapianto di cellule geneticamente modificate, a volte utilizzando la ricombinazione Cre-lox o il sistema CRISPR. Questo approccio consente l'analisi di una specifica mutazione genica nelle cellule ematopoietiche per valutare come contribuisce allo sviluppo della malattia. Inoltre, questi modelli spesso impiegano cellule congeniche o reporter per distinguere gli effetti delle cellule mutanti dalle cellule normali o di tipo selvaggio. In molti casi, è necessario un regime di precondizione per innestare con successo le cellule staminali ematopoietiche del donatore.

Attualmente, il trapianto di midollo osseo ai topi riceventi può essere diviso in due categorie principali: 1) condizionamento mieloablativo e 2) trapianto non condizionato. Il condizionamento mieloablativo può essere ottenuto con uno dei due metodi seguenti, vale a dire l'irradiazione totale del corpo (TBI) o la chemioterapia15. Il TBI viene effettuato sottopose il ricevente a una dose letale di irradiazione gamma o a raggi X, generando rotture di DNA o collegamenti incrociati all'interno di cellule che si dividono rapidamente, rendendoleirreparabili 16. Busulfan e ciclofosfamide sono due farmaci chemioterapici comunemente usati che interrompono la nicchia ematopoietica e allo stesso modo causano danni al DNA alle cellule che si dividono rapidamente. Il risultato netto della precondizione mieloablativa è l'apoptosi delle cellule ematopoietiche, che distrugge il sistema ematopoietico del ricevente. Questa strategia non solo consente il successo dell'innesto degli HSPC donatori, ma può anche prevenire il rifiuto dell'innesto sopprimendo il sistema immunitario del ricevente. Tuttavia, la precondizione mieloablativa ha gravi effetti collaterali come danni a tessuti e organi e alle loro cellule immunitarie residenti, nonché distruzione della nicchia nativa del midollo osseo17. Pertanto, sono stati proposti metodi alternativi per superare questi effetti collaterali indesiderati, in particolare per quanto riguarda i danni agli organi di interesse. Questi metodi comprendono l'irradiazione protetta dei topi riceventi e il BMT adottivo per i topinon condizionati 9,17. La protezione del torace, della cavità addominale, della testa o di altre regioni dall'irradiazione mediante il posizionamento di una barriera di piombo protegge i tessuti di interesse dagli effetti dannosi dell'irradiazione e mantiene la loro popolazione di cellule immunitarie residenti. D'altra parte, il BMT adottivo degli HSPC per i topi non condizionati ha un ulteriore vantaggio perché preserva la nicchia ematopoietica nativa. In questo manoscritto, descriviamo i protocolli e i risultati dell'innesto HSPC dopo diversi regimi di trapianto nei topi, in particolare la consegna di HSPC ai topi TBI, ai topi parzialmente schermati dall'irradiazione e ai topi non condizionati. L'obiettivo generale è quello di aiutare i ricercatori a comprendere i diversi effetti fisiologici di ogni metodo e come influenzano i risultati sperimentali nella definizione di CH e malattie cardiovascolari.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia.

1. Prima della precondizione

  1. Posizionare i topi ricevente sull'acqua integrata da antibiotici (5 mM di sulfamethoxazolo, 0,86 mM trimetooprim) ~24 ore prima dell'irradiazione. Ciò è necessario per prevenire l'infezione, poiché il sistema immunitario verrà soppresso dopo l'irradiazione e mantenuto per 2 settimane dopo l'irradiazione. A questo punto, integrare i topi con un gel nutrizionale / idratazione per incoraggiare l'alimentazione e prevenire la perdita di peso e la disidratazione dopo l'irradiazione.

Figure 1
Figura 1: Immagini che mostrano varie configurazioni di precondizione. (A) Impostazione dell'irradiazione totale del corpo a gabbia a torta mediante raggi gamma (Cesio-137): il fascio di radiazioni proviene dalla parte posteriore dell'irradiatore nella direzione dell'asse y (radiazione orizzontale). (B) Configurazione totale dell'irradiazione del corpo della gabbia del topo mediante raggi X: la gabbia del topo è posizionata nella camera riflettente. Il fascio di radiazioni proviene dalla parte superiore dell'irradiatore a forma di cono (radiazione verticale). La distanza dalla sorgente di radiazioni alla gabbia è di 530 mm (C) Vassoio regolabile nell'irradiatore a raggi X: questa configurazione viene utilizzata per l'irradiazione parzialmente schermata utilizzando raggi X. Il fascio di radiazioni proviene dalla parte superiore dell'irradiatore a forma di cono (radiazione verticale). La distanza dalla sorgente di radiazioni al vassoio è di 373 mm, e il raggio è di 250 mm. (D) Schermatura del torace: i topi anestetizzati sono posizionati su un vassoio. I topi sono posti l'uno verso l'altro in posizioni supine con braccia e gambe completamente estese. L'estremità inferiore dello scudo di piombo è allineata con l'osso xiphisternum e l'estremità superiore con il timo. (E) Schermatura addominale: i topi anestetizzati sono collocati come nell'impianto di schermatura del torace con l'estremità inferiore dello scudo di piombo allineata con l'ano e l'estremità superiore sotto il diaframma. (F) Impostazione dell'irradiazione di schermatura della testa mediante raggi gamma (Cesio-137): le prole del mouse anestetizzato sono annoate verso il basso e il mouse è posto in un limitatore conico. Lo scudo nero di piombo (marcato) copre la testa e le orecchie del topo. Il fascio di radiazioni proviene dalla parte posteriore dell'irradiatore nella direzione dell'asse Y (radiazione orizzontale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Precondizione dei topi riceventi (facoltativo)

  1. Irradiazione totale del corpo
    1. Posizionare i topi riceventi in una gabbia a fette uniformi o in una gabbia per topi nella camera riflettente entro il raggio calcolato per ricevere la stessa dose di irradiazione; si raccomanda tuttavia un massimo di 8 topi per gabbia per torta e 5 topi per gabbia per topi per garantire un'irradiazione uniforme (figura 1A,B).
    2. Per ottenere una mieloablazione completa, assicurarsi che i topi riceventi ricevano una dose totale di radiazioni di 11 Gy in due frazioni di Gy 5.5 separate da un intervallo di 4-24 ore.
      NOTA: Sebbene sia possibile ottenere un innesto ottimale implementando un intervallo di 4 ore tra le frazioni, questo può essere esteso a un intervallo di 24 ore, che può essere utile quando il travaglio e /o l'irradiatore non è disponibile.
  2. Irradiazione parzialmente schermata
    1. Anestetizzare i topi riceventi per iniezione intraperitoneale di chetamina (80-100 mg/kg) e xilaazina (5-10 mg/kg). Il contenimento del movimento del topo è fondamentale per garantire l'irradiazione uniforme e l'efficace protezione degli organi di puntamento durante il processo di schermatura.
    2. Per la schermatura del torace e dell'addome, orientare verticalmente il fascio di radiazioni dell'irradiatore a raggi X verso il topo (figura 1C).
      1. Posizionare i topi anestetizzati su una piastra piatta, centrando la sorgente di radiazioni dall'alto. Posizionare i topi invertiti l'uno all'altro in posizione supina con braccia e gambe completamente estese(figura 1D,E).
        NOTA: L'impianto di irraggiamento a raggi X, per questo esperimento, consente di posizionare due topi alla volta entro il raggio effettivo che consente un'irradiazione uniforme. Mentre il raggio effettivo è calcolato in base alla distanza tra la sorgente di radiazioni e il vassoio, il numero di animali che possono essere simultaneamente irradiati dipenderà dall'irradiatore specifico.
      2. Fissare le zampe dei topi sulla piastra usando il nastro adesivo per garantire che i topi siano immobilizzati durante la procedura di irradiazione. Posizionare la schermatura del piombo in modo che copra le aree che richiedono protezione.
      3. Per la schermatura del torace, preparare lo scudo di piombo misurando la lunghezza dall'osso xiphisternum del topo al timo e calcolando lo spessore che fornirà una protezione sufficiente dalla fonte di irradiazione. Posizionare la schermatura del piombo in modo che l'estremità inferiore si allinei all'osso xiphisternum. L'estremità superiore della barriera al piombo si adatta vicino al timo(Figura 1D).
      4. Per la schermatura dell'addome, preparare lo scudo di piombo misurando la lunghezza dall'ano del topo al diaframma e calcolando lo spessore che fornirà una protezione sufficiente dalla fonte di irradiazione. Posizionare la schermatura del piombo in modo che l'estremità inferiore si allinei all'ano. L'estremità superiore dello scudo di piombo si adatterà al diaframma (Figura 1E).
        NOTA: Localizzare lo scudo di piombo per essere coerente tra le coorti può ridurre alcune variazioni per quanto riguarda le dimensioni dei topi.
    3. Per la schermatura della testa, orientare il fascio di radiazioni dell'irradiatore del Cesio orizzontalmente verso il topo.
      1. Rastremi attentamente le sopracciglia di un topo anestetizzato all'addome. Ciò garantisce che le braccia otteniamo una dose completa di irradiazione e non sono coperte dallo scudo.
      2. Per la schermatura della testa, posizionare il mouse in un limitatore conico, che si inserisce all'interno di uno scudo di piombo. Una volta che il mouse si trova all'interno del limitatore conico, far scorrere il trattino nello slot all'interno dello scudo di piombo (Figura 1F). Lo scudo di piombo dovrebbe coprire completamente la testa e le orecchie del topo (~ 3,2 cm), lasciando il resto del corpo del topo esposto all'irradiazione. La posizione del limitatore all'interno dello scudo può essere regolata per adattarsi ad animali di diverse dimensioni facendola scorrere più all'interno o all'esterno dello scudo.
      3. Posizionare i topi all'interno dell'irradiatore, perpendicolare alla fonte per l'irradiazione.
    4. Esporre i topi a due frazioni di irradiazione 5.5 Gy (dose totale di 11 Gy) separate da un intervallo di 4-24 ore.
    5. Dopo ogni frazione di irradiazione, posizionare le gabbie con topi anestetizzati su tappetini riscaldati o sotto lampade a calore rosso per prevenire l'ipotermia e aiutare nel recupero dall'anestesia.
      NOTA: Si deve fare attenzione a non surriscaldare il mouse anestetizzato quando si utilizza una lampada poiché non possono sfuggire al calore. Come descritto in precedenza, il posizionamento degli animali e lo spessore dello scudo di piombo possono differire tra gli studi basati sulle caratteristiche specifiche del radiatore (tipo di radiazione/direzione del fascio, ecc.). I ricercatori dovranno adeguare di conseguenza i loro esperimenti.

3. Isolamento osseo

NOTA: Idealmente, i topi donatori e i topi ricevente dovrebbero avere un'età simile e entro 8-12 settimane. L'uso di almeno 3 topi come donatori (piuttosto che come singolo donatore) è preferito per ridurre al minimo l'eterogeneità (anche quando si usano topi con lo stesso genotipo). Approssimativamente, 40 milioni di cellule del midollo osseo nonfrazionate possono essere ottenute da sei ossa (due femminicidi, due tibia e due humeri) di un singolo topo. Il trapianto di 5 milioni di cellule del midollo osseo in ogni topo ricevente garantirà in genere l'innesto.

  1. Eutanasia dei topi donatori mediante lussazione cervicale senza anestesia (metodo preferito per evitare la contaminazione chimica delle cellule) e posizionare ogni topo su un cuscinetto assorbente.
  2. Disinfettare la pelle con uno spray al 70% di etanolo.
  3. Fai un piccolo taglio trasversale nella pelle sotto la gabbia toracica e tieni la pelle saldamente su entrambi i lati dell'incisione, strappa in direzioni opposte verso la testa e i piedi. Stacca la pelle da tutti gli arti.
  4. Tagliare sulle spalle e sulle articolazioni del gomito e rimuovere i muscoli attaccati e i tessuti connettivi con l'aiuto di un Kimwipe per ottenere l'humeri.
  5. Dislocare con cura le articolazioni dell'anca tra il femore e le ossa dell'anca. Usa forbici smussate per tagliare lungo la testa del femore e staccare le gambe. Tagliare sopra l'articolazione del ginocchio per separare il femore e la tibia e rimuovere con cura i muscoli attaccati e i tessuti connettivi con l'aiuto di un Kimwipe per raccogliere il femore e la tibia.
    NOTA: Prestare particolare attenzione a mantenere intatta l'epifisi ossea durante questo passaggio. Scartare eventuali ossa rotte a causa della perdita di sterilità. Ossa dell'anca e ossa della colonna vertebrale possono essere raccolte oltre al femore, alla tibia e all'omero. Per raccogliere ossa della colonna vertebrale, un mortaio e un pestello possono essere usati per schiacciare le ossa a pezzi e raccogliere le cellule del midollo osseo.
  6. Posizionare le ossa isolate dai topi dello stesso genotipo in un tubo conico di 50 ml contenente PBS sterile a freddo ghiaccio da 20 ml e tenerlo sul ghiaccio fino a un ulteriore utilizzo. Prestare particolare attenzione a posizionare correttamente le ossa in tubi con genotipi abbinati.
  7. Ripetere i passaggi precedenti per ogni animale donatore che cambia guanti tra ogni topo. Inoltre, forbici pulite e altri strumenti con 70% di etanolo tra ogni topo.

4. Isolamento delle cellule del midollo osseo

NOTA: eseguire i passaggi seguenti in un archivio di classe II per la biosicurezza.

  1. Preparazione dei set di tubi: Fare un piccolo foro nella parte inferiore di un tubo sterile di microcentrifugo da 0,5 ml utilizzando un ago da 18 G e posizionarlo in un tubo sterile a microcentrifugo da 1,5 ml, che contiene 100 μL di PBS sterile ghiacciato nella parte inferiore.
    NOTA: Poiché solo sei ossa possono adattarsi al tubo di microcentrifugo da 0,5 ml, si consiglia di preparare set di tubi sufficienti per elaborare tutte le ossa contemporaneamente.
  2. Aspirare il PBS e trasferire le ossa isolate su un piatto sterile di coltura cellulare da 100 mm. Tenendo ogni osso usando forcep fini, tagliare accuratamente le epifisi ad ogni estremità usando piccole forbici che sono state sterilizzate in autoclave. Posizionare le ossa tagliate nei set di tubi preparati.
  3. Centrifugare i tubi a 10.000 x g per 35 s a 4 °C.
  4. Dopo la centrifugazione, confermare che il midollo osseo è stato rimosso con successo dalle ossa. Le ossa dovrebbero apparire bianche e traslucide con un pellet rosso relativamente grande nella parte inferiore del tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Scartare il tubo di microcentrifugo da 0,5 ml.
    NOTA: Se l'ispezione visiva non riesce a rilevare il midollo osseo nella parte inferiore del tubo da 1,5 ml, tagliare nuovamente l'osso e ripetere il passaggio 4.3.
  5. Rimossare il midollo osseo in 1 ml di PBS ghiacciato, quindi trasferire la sospensione cellulare dallo stesso genotipo a un tubo conico da 50 ml abbinato.
  6. Dissociare le cellule passandole attraverso un ago da 18 G con una siringa da 10 ml 10 volte.
  7. Filtrare le sospensioni a cella singola attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Aggiungere ulteriore PBS ghiacciato a un volume finale di 10 mL e rimorsi le cellule attraverso l'uso delicato dell'ausilio per pipette.
  8. Centrifuga a 310 x g per 10 min a 4 °C.
  9. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con 10 mL di supporti RPMI senza siero. Risparmiare 30 μL di questo materiale per il conteggio delle celle.
  10. Determinare la concentrazione cellulare con un contatore cellulare e calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto per il trapianto. Per l'esempio di un BMT al 100%, sono necessarie 5 x 106 cellule del midollo osseo per ogni mouse ricevente.
    NOTA: Per un BMT competitivo, preparare un totale di 5 x 106 cellule del midollo osseo comprendenti una miscela di cellule donatrici (ad esempio, CD45.2+) e cellule concorrenti (ad esempio, CD45.1+). Si consiglia vivamente di preparare cellule extra del midollo osseo. Ad esempio, se ci sono 10 topi ricevente per gruppo sperimentale, in genere prepariamo abbastanza cellule per 12 topi ricevente.
  11. Trasferire il volume calcolato della sospensione cellulare in un nuovo tubo conico da 50 ml. Centrifuga a 310 x g per 10 min a 4 °C.
  12. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule utilizzando la quantità calcolata di mezzo RPMI privo di siero per ottenere la densità e il volume delle cellule appropriati. Tipicamente, 200 μL è il volume ottimale per un'iniezione retro-orbitale.

5. Trapianto di cellule del midollo osseo a topi irradiati

  1. Anestetizzare i topi riceventi con il 5% di isoflurane.
  2. Mentre i topi vengono anestetizzati, iniettare lentamente 200 μL di cellule del midollo osseo nella vena retro-orbitale usando un ago da 28-30 G con una siringa per insulina.
    1. In alternativa, eseguire il parto delle cellule donatrici per iniezione endovenosa della vena di coda e iniezione endogeno femorale, con un volume massimo rispettivamente di 0,2 mL e 25 μL.
  3. Una volta iniettate le cellule, posizionare una goccia di collirio contenente proparacaina sulla superficie dell'occhio per alleviare il dolore. L'animale può quindi essere autorizzato a riprendere conoscenza.

6. Trapianto di cellule del midollo osseo a topi non condizionati

  1. Anestetizzare i topi riceventi per inalazione del 5% di isoflurane.
  2. Iniettare 5 x 106 cellule nonfractionate del midollo osseo da entrambi i genotipi retrò orbitalmente in topi ricevente non irradiati con siringa per insulina da 28-30 G.
  3. Ripetere i passaggi 6.1 e 6.2 in 3 giorni consecutivi, in modo che i topi ricevente verranno trapiantati con un totale di 1,5 x 107 cellule del midollo osseo.
    NOTA: Poiché il BMT adottivo senza procedura di precondizione richiede il trapianto di midollo osseo per 3 giorni consecutivi, si dovrebbe tentare di alternare gli occhi per ogni iniezione.
  4. Dopo l'iniezione, somministrare una goccia di collirio contenente proparacaina all'occhio interessato.

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Representative Results

Per confrontare l'effetto di tre metodi BMT/precondizionamento sull'innesto cellulare del donatore, le frazioni di cellule donatrici nel sangue periferico e nel tessuto cardiaco sono state analizzate dalla citometria a flusso a 1 mese dopo la BMT. Le cellule isolate sono state macchiate per specifici marcatori di leucociti per identificare i diversi sottoinsiemi di leucociti. In questi esperimenti, le cellule del midollo osseo donatrici di tipo selvatico(WT) C57BL/6 (CD45.2) sono state consegnate al WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) topi ricevente per distinguere le cellule donatrici dalle cellule del ricevente. Le strategie di gating citometrica del flusso utilizzate sono descritte in precedenza da Wang et al.

Il gruppo trattato di irradiazione totale del corpo (TBI) ha ricevuto 5 x 106 cellule del midollo osseo a seguito di una dose totale di radiazioni letali di 11 Gy in due frazioni di Gy 5,5 separate da un intervallo di 4 ore. Nel sangue periferico di topi riceventi, monociti, neutrofili e cellule B erano in gran parte ablati e sostituiti dalla progenie delle cellule derivate dal midollo osseo donatore. Inoltre, la popolazione di monociti cardiaci e neutrofili residenti nei cuori dei topi riceventi è stata quasi completamente sostituita da cellule derivate da donatori (Figura 2A).

Nel gruppo di irradiazione parzialmente schermato, i topi riceventi sono stati irradiati con uno scudo toracico e trapiantati con 5 x 106 cellule del midollo osseo a seguito di una dose totale di radiazioni di 11 Gy in due frazioni di Gy 5.5 separate da un intervallo di 4 ore. A differenza del gruppo TBI, il contributo delle cellule derivate dai donatori alle cellule immunitarie cardiache è stato modesto, il che probabilmente riflette gli effetti combinati della protezione delle cellule immunitarie locali nel cuore dei topi riceventi e il fisiologico ripopolamento delle cellule donatrici derivate dal midollo osseo dal sangue periferico. È probabile che anche le cellule del midollo osseo del topo ricevente nelle regioni schermate abbiano contribuito alla ricostituzione del sangue periferico, il che riduce la percentuale di cellule derivate dal donatore nel sangue periferico rispetto al gruppo trattato con TBI (Figura 2B).

Nel gruppo senza precondizione BMT (BMT adottivo), i topi riceventi sono stati trapiantati con 5 x 106 cellule del midollo osseo per 3 giorni consecutivi. A 4 settimane dopo la BMT, la porzione di cellule derivate dal donatore nel sangue e nel cuore periferici era rilevabile. (circa il 5%) (Figura 2C).

Per illustrare come il modello BMT adottivo può essere applicato allo studio del modello CH, le cellule del midollo osseo CD45.2+ donatore (WT o Tet2-/-) sono state trapiantate in topi riceventi CD45.1+. I riceventi senza condizionamento sono stati trapiantati con 5 x 106 cellule del midollo osseo ogni giorno per 3 giorni consecutivi (per un totale di 1,5 x 107, n = 5-6 per gruppo). L'analisi citometrica del flusso del sangue periferico è stata eseguita 4, 8, 12 e 16 settimane dopo il trapianto. Le cellule donatrici carenti di Tet2 conferirono un vantaggio competitivo e gradualmente si espansero nel tempo; WBC, monociti, Ly6Chi monociti, neutrofili, cellule T e cellule B sono aumentati significativamente nel tempo. Rispetto alle cellule donatrici carenti di Tet2 innestati nei topi riceventi, i topi riceventi innestati con cellule donatrici WT hanno mostrato un'espansione clonale meno significativa delle cellule donatrici (Figura 3). Coerentemente con il paradigma clinico dell'ematopoiesi clonale, l'espansione delle cellule carenti di Tet2 non intaccherà il numero assoluto dei vari tipi di celluledel sangue 9 (dati non mostrati).

Figure 2
Figura 2: Analisi citometrica del flusso del sangue e del cuore utilizzando diversi metodi di precondizione. L'analisi citometrica del flusso del sangue e del cuore periferici è stata eseguita 1 mese dopo il trapianto di midollo osseo. Per distinguere le cellule donatrici dalle cellule dei riceventi, i topi CD45.1+ riceventi sono stati trapiantati con CELLULE DEL MIDOLLO Osseo CD45.2+ donatore. (A) 5 x 106 cellule del midollo osseo sono state trapiantate a seguito di due frazioni di irradiazione totale del corpo (2 x 5,5 Gy, intervallo 4 ore, n = 3). (B) 5 x 106 cellule del midollo osseo sono state trapiantate a seguito di due frazioni di irradiazione totale del corpo con schermatura del torace (2 x 5,5 Gy, intervallo 4 ore, n = 10). (C) I riceventi senza condizionamento sono stati trapiantati con 5 x 106 cellule del midollo osseo per 3 giorni consecutivi (per un totale di 1,5 x 107, n = 4). I dati sono espressi come ±SEM. Neutrofili come Ly6G+; Ly6Chi monociti come CD115+, Ly6G-e Ly6C+; Ly6Clo monociti come CD115+, Ly6G-e Ly6C-; Celle B come CD45R+; CD4+ T celle come CD3e+ e CD4+; CELLE CD8+ T come CD3e+ e CD8+; e Macrophages come CD64+, Ly6G-e Ly6C-. (WBC: globuli bianchi, Neut: neutrofili, Mono: monociti, Mac: macrofagi). La figura 2A,C è stata modificata da Wang etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Espansione clonale delle cellule carenti di Tet2 utilizzando BMT adottivo a topi non condizionati. CD45.2+ le cellule del midollo osseo donatore (WT o Tet2-/-) sono state trapiantate in TOPIRICEVENTE CD45.1 +. I riceventi senza condizionamento sono stati trapiantati con 5 x 106 cellule del midollo osseo ogni giorno per 3 giorni consecutivi (per un totale di 1,5 x 107, n = 5-6 per gruppo). L'analisi citometrica del flusso del sangue periferico è stata eseguita dopo 4, 8, 12 e 16 settimane dopo il trapianto. Viene mostrata la frazione di celluledonatrici CD45.2 + in ogni popolazione. (A) WBC (B) Mono (C) Ly6Chi mono (D) Cellule B (E) Cellule T. I dati sono espressi come ±SEM. Neutrofili come Ly6G+; Ly6Chi monociti come CD115+, Ly6G-e Ly6C+; Ly6Clo monociti come CD115+, Ly6G-e Ly6C-; Celle B come CD45R+; CD4+ T cells as CD3e+ (WT: wild-type, WBC: globuli bianchi, Mono: monociti) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per gli studi sull'ematopoiesi clonale, abbiamo descritto tre metodi di BMT: BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione con schermatura parziale e un metodo BMT meno comunemente usato che non comporta precondi condizionamento (BMT adottivo). Questi metodi sono stati utilizzati per valutare l'impatto dell'ematopoiesi clonale sulle malattie cardiovascolari. I ricercatori possono modificare questi metodi di conseguenza per soddisfare lo scopo specifico del loro studio.

Modelli di ematopoiesi clonale
L'ematopoiesi clonale è il fenomeno in cui le cellule ematopoietiche mutanti competono con cellule di tipo selvatico e ottengono il dominio clonale nel tempo. Per creare un modello di questa competizione, ai topi può essere somministrato il midollo osseo, che consiste in una miscela di cellule geneticamente diverse. Generalmente, questa miscela includerà cellule mutanti e di tipo selvaggio, che sono state etichettate con un tag fluorescente o diversi marcatori pan-leucociti (ad esempio, CD45.1 e CD45.2). Ad esempio, quando si creano modelli che imitano ch mediato da Tet2,eseguiamo un trapianto competitivo di midollo osseo in destinatari irradiati letale che in genere comporta la miscelazione del 90% delle cellule che provengono da donatori di TET2+/+ CD45.1 e del 10% di cellule che provengono da CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- o controllano i donatori Tet2+/+ 8. Il rilevamento della citometria a flusso delle varianti CD45 utilizzando anticorpi monoclonali specifici consente di distinguere le cellule donatrici (CD45.1-/CD45.2+) dalle cellule concorrenti (CD45.1+/CD45.2-) all'interno del sangue e valutare la dinamica clonale delle cellule di prova nel tempo. In questo modo, siamo stati in grado di osservare un graduale aumento del chimerismo dei donatori di cellule carenti di Tet2, mentre la percentuale di cellule di tipo selvatico rimane a circa il 10%. Questa impostazione sperimentale imita lo scenario umano degli individui che portano una mutazione somatica TET2, poiché queste mutazioni sono inizialmente trasportate da un piccolo numero di HSPC, che si espanderanno gradualmente nel tempo. L'impiego di questo approccio nei modelli di malattie cardiovascolari di aterosclerosi e insufficienza cardiaca ha portato alla documentazione di un potenziale nesso causale tra CH mediato da Tet2e CVD8,9,10.

Nell'utilizzare questi approcci, i ricercatori dovrebbero prendere in considerazione i possibili effetti confondenti generati dalla TBI. Sebbene il TBI prima del trapianto consenta un alto grado di innesto HSPC, questo precondizione porterà a diversi effetti indesiderati al di fuori del sistema ematopoietico. È stato documentato che il TBI può portare a infiammazione, lesioni e fibrosi in più sistemi di organi tra cui pelle, fegato, reni, polmoni, midollo osseo, cuore, cervello, ecc.18,19,20. Questi effetti collaterali possono avere un impatto negativo sugli organi cardiovascolari in studio e alterano anche la patogenesidella malattia 21,22. Un esempio degno di nota è l'effetto dell'irradiazione sui macrofagi residenti nel cuore. L'irradiazione del torace si traduce in una marcata sostituzione dei macrofagi residenti cardiaci con macrofagi circolanti derivati dai monociti. Gli studi hanno dimostrato che i macrofagi residenti cardiaci mostrano caratteristiche distinte rispetto ai macrofagi derivati dai monociti circolanti che si innescheranno nel cuore a seguito di lesioni da radiazioni. In ambienti di malattia, si ritiene che i macrofagi residenti cardiaci svolgano un ruolo cardioprotettivo, mentre i macrofagi infiltrati nel sangue sono stati segnalati per promuovere lesionie infiammazioni 23. Pertanto, è concepibile che la sostituzione delle cellule immunitarie cardiache residenti con cellule trasmesse dal sangue alteri i processi patologici in studio, che contribuiscono allemalattie cardiovascolari 24,25,26. Allo stesso modo, nel cervello, la TBI si traduce nell'esaurimento delle microglia residenti e nella sostituzione con macrofagi diderivazione periferica 27,28. Mentre i macrofagi di derivazione periferica possono comportarsi come cellule microgliali, mantengono un'identità funzionale e trascrizionale unica rispetto alla microglia28derivata dai monociti. Pertanto, è possibile che la sequela della malattia possa essere alterata, in particolare quando si studiano malattie come ictus ischemico. Per evitare questi effetti confondenti, è possibile consigliare la schermatura del torace e della testa. Questo è vantaggioso perché fornisce protezione al cuore e al cervello, rispettivamente; e mantiene intatte anche le loro cellule immunitarie residenti, ricapitolando meglio la condizione umana di CH. Tuttavia, come notato in precedenza, la schermatura si traduce in un tasso inferiore di chimerismo rispetto al precondi condizionamento TBI, che essenzialmente elimina tutte le cellule ematopoietiche dell'ospite.

Un altro importante impedimento nel precondizione è il suo effetto deleterio sulla nicchia del midollo osseo. Sebbene i danni indotti dall'irradiazione della nicchia BM possano essere ripristinati in misura non ottimale, non è chiaro se l'ematopoiesi ingenua sia recuperata in questi microambientati danneggiati. Inoltre, il trapianto di HSPC misti in BM vuoti avvia una corsa alla proliferazione tra cloni, piuttosto che la semplice "competizione" per una nicchia occupata da un HSPC di tipo selvaggio , che è presumibilmente ciò che accade in CH. Pertanto, un approccio potenzialmente preferibile allo studio della CH può essere il metodo BMT adottivo, in base al quale le cellule BM vengono trasferite nei topi riceventi senza precondi condizionamento. Questo BMT adottivo senza metodo di precondizione influisce minimamente sull'ematopoiesi ingenua in corso, ricapitolando fedelmente ch osservatonell'uomo 29. La figura 2C mostra il livello di chimerismo a 1 mese dopo il trapianto senza precondizione. Mentre il chimerismo del donatore è basso in questo primo momento, troviamo una frazione progressivamente crescente di cloni carenti di Tet2 nel tempo, come presentato nella figura 3. Va notato che questo modello è molto utile quando le cellule mutanti hanno un vantaggio competitivo rispetto alle cellule di tipo selvaggio in condizioni omeostatiche come le cellule carenti di Tet2. Quando le cellule carenti di Tet2 sono innestati, c'è una marcata espansione in varie popolazioni di leucociti come neutrofili, monociti, cellule NK e cellule B. Un'espansione più lenta è stata notata nelle cellule T, presumibilmente a causa dell'emilizione più lunga di questa popolazione.

L'espansione delle cellule carenti di Tet2 è stata osservata non solo nel sangue periferico ma anche in molti altri tessuti, tra cui midollo osseo, fegato e rene, con diverse dinamiche di ricostituzione delle cellule ematopoietiche9. Ad esempio, il precedente articolo pubblicato dal nostro laboratorio descriveva il chimerismo delle cellule del midollo osseo delle cellule donatrici carenti di WT e Tet2 innestati nei topi riceventi CD45.1 8 mesi dopo l'adottivo BMT9. Le cellule donatrici carenti di Tet2 trapiantate nei topi riceventi CD45.1 hanno mostrato un vantaggio competitivo rispetto al lignaggio immaturo-cellule Sca1+c-Kit+ (LSK), cellule HSC a breve e lungo termine e progenitori multipotenti (MPP) rispetto a quello delle cellule donatrici WT trapiantate nei topi riceventi CD45.1. Inoltre, come Tet2-deficient cellule donatrici inchiodati topi riceventi, sviluppano un fenotipo di cardiomiopatia legato all'età senza fattori esogeni che causano disfunzione cardiaca, ricapitolando così l'effetto dell'ematopoiesi clonale in un modo simile a quello dell'invecchiamento umano. Questa osservazione è stata accompagnata da un aumento del grado di chimerismo nei neutrofili cardiaci e nei monociti Ly6Chi. Collettivamente, questo regime BMT adottivo può essere applicato a studi futuri che potrebbero espandere la nostra comprensione dell'associazione tra sviluppo di malattie cardiovascolari ed ematopoiesi clonale a un livello più avanzato.

In sintesi, abbiamo descritto tre metodi BMT e ne abbiamo discusso l'applicazione nella generazione di modelli CH. Ch è associato a prognosi più povere in malattie cardiovascolari come l'aterosclerosi e l'insufficienza cardiaca. Sebbene siano stati compiuti notevoli progressi, lo studio dei nessi causali tra CH e CVD è ancora agli inizi e sono necessarie ulteriori indagini attraverso l'uso di modelli animali ottimizzati. Speriamo che questi protocolli consentano ai ricercatori di selezionare un metodo più fisiologicamente appropriato di BMT, che minimizza potenziali effetti confondenti sul sistema cardiovascolare, producendo infine studi che espandono la nostra comprensione di come la CH contribuisce alle malattie cardiovascolari.

Progettazione della schermatura del piombo
Lo spessore dello scudo di piombo sarà dettato dal tipo di irradiazione utilizzata per indurre la mieloablazione. I tipi di radiazioni a raggi X o gamma sono frequentemente usati per la mieloablazione sperimentale, ma differiscono in termini di frequenza, lunghezza d'onda ed energia fotonica. Quando si tratta di schermatura, l'energia dei fotoni, che descrive l'energia o la velocità alla quale viaggiano i raggi, è il parametro più importante. Tipicamente, i raggi X sorgente di radiazioni hanno un'energia di 160 kVp mentre le sorgenti di cesio-137, che emettono raggi gamma, hanno un'energia di 662 KeV. L'energia emessa da queste sorgenti di radiazioni equivale al loro potere di penetrazione, con energie più elevate che hanno un maggiore potere di penetrazione. Pertanto, è necessario uno spessore maggiore dello scudo di piombo quando si utilizzano irradiatori a base di sorgente di cesio rispetto all'uso di irradiatori a raggi X. L'irradiazione a raggi X, che usiamo quando eseguiamo la schermatura del torace e dell'addome, richiede uno scudo di piombo spesso 7 mm per fornire una protezione sufficiente. Tuttavia, per le sorgenti di cesio 137, che usiamo quando eseguiamo la schermatura della testa, richiede che gli scudi di piombo siano spessi almeno 1 pollice per fornire una protezione sufficiente.

Gli scudi di piombo per l'uso negli irradiatori a raggi X possono essere acquistati da fornitori commerciali. In alternativa, i fogli di piombo possono essere tagliati a misura per adattarsi al corpo dell'animale o per adattarsi a un limitatore (vedere figura 1). Quando si utilizza un irradiatore a base di cesio, i mattoni di piombo, che sono considerevolmente più spessi, dovrebbero essere utilizzati e possono essere realizzati su misura da aziende specializzate nella realizzazione di questo tipo di scudi. Ad esempio, per il copricapo, abbiamo progettato su misura un mattone di piombo per contenere un limitatore di tubi conici da 50 ml (vedere figura 1F). L'animale è in grado di adattarsi all'interno del limitatore, che viene quindi inserito in un foro fatto nel mattone, per fornire 1,5 pollici di protezione dall'irradiazione. È importante sottolineare che tutti gli scudi di piombo devono essere rivestiti con vernice o nastro adesivo per evitare l'esposizione alla polvere di piombo, che può essere tossica.

In base all'attrezzatura e ai suoi parametri, i ricercatori possono progettare i propri scudi di piombo per i loro siti di interesse. Qui, abbiamo introdotto la schermatura del torace, dell'addome e della testa; tuttavia, anche altri siti come arto o fianco possono essere considerati per la schermatura. Inoltre, mentre entrambe le sorgenti di radiazioni (Cesio-137 e raggi X) sono adatte per l'ablazione del midollo osseo e l'innesto riuscito, è stata osservata variabilità nella ricostituzione delle popolazioni di cellule linfoidi e mieloidi tra il Cesio-137 e le sorgenti di irradiazione a raggi X30. Pertanto, i ricercatori dovrebbero prendere in considerazione le diverse risposte fisiologiche alla sorgente di radiazioni da utilizzare negli studi.

Intervalli di dosamento
Gli intervalli di dosaggio e dosaggio possono influire sull'efficienza dell'innesto cellulare del donatore e sui tassi di sopravvivenza. Nei pazienti umani, l'irradiazione ad alte dosi può causare polmonite interstiziale idiopatica, lesioni gastrointestinali e formazione di cataratta. Nei modelli di topo, l'irradiazione singola ad alte dosi seguita dal trapianto di midollo osseo può produrre risultati simili e può anche influenzare i tassi disopravvivenza 31. Pertanto, l'irradiazione frazionata è altamente raccomandata per gli studi BMT del topo. Inoltre, gli intervalli di dosamento delle frazioni possono influire sul tasso di sopravvivenza del topo e sul tasso di ricostituzione, portando a diverse frazioni di chimerismo cellulare donatore negli organi ematologici e in altri tessuti31. Pertanto, i ricercatori dovrebbero fare attenzione a progettare un programma di dosing di irradiazione frazionata per gli studi BMT.

Nel contesto del tasso di sopravvivenza e della ricostituzione delle cellule immunitarie, il nostro piccolo studio ha dimostrato che un gruppo di topi che ricevono l'irradiazione totale del corpo con una dose letale di radiazioni di 11 Gy in due frazioni di Gy 5.5 separate da un gruppo di intervalli di 24 ore non ha avuto risultati significativamente diversi dal gruppo che ha ricevuto lo stesso dosaggio di TBI ad un intervallo di 4 ore (cfr. tabella 1). Tuttavia, con il BMT di schermatura del torace, il gruppo a intervalli di 24 ore sembrava mostrare meno efficienza del chimerismo cellulare del donatore rispetto al gruppo a intervalli di 4 ore. Una possibile spiegazione di questo risultato è che l'irradiazione con intervallo di 24 ore potrebbe non essere stata sufficiente a rimuovere le cellule immunocompetenti del ricevente perché gli intervalli prolungati hanno dato ai topi riceventi tempo sufficiente per riparare le cellule danneggiate. Inoltre, la schermatura del torace protegge le ossa parziali della colonna vertebrale che contengono anche gli HSC del destinatario. Pertanto, le cellule riceventi immunocompetenti rimanenti e recuperate potrebbero aver attaccato le cellule derivate dal donatore e indotto un risultato che ha mostrato una minore efficienza di innesto.

   

WBC (%) Cellula B (%) Cellula T (%) Mono (%) Ly6Chi mono (%) Ly6Clo mono (%) Neutrofilo (%)
TBI-BMT Intervallo 4h 97.4 ± 1.0 100 ± 0 59.1 ± 18.7 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
Intervallo 24 ore su 24 97.2 ± 2.2 100 ± 0 79.0 ± 8.1 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
schermatura del torace BMT Intervallo 4h 56.2 ± 4.0 54.2 ± 6.2 0,5 ± 0,1 66.7 ± 6.1 63.8 ± 6.3 70.8 ± 5.7 82.0 ± 3.8
Intervallo 24 ore su 24 34.4 ± 3.1 34.8 ± 3.1 2.9 ± 1.7 45.0 ± 3.2 34.2 ± 3.6 56.2 ± 4.9 56 ± 10.0

Tabella 1: L'efficienza dell'innesto delle cellule donatrici mediante diversi intervalli di dosamento. L'analisi citometrica del flusso del sangue periferico è stata eseguita 1 mese dopo il trapianto di midollo osseo. Wt CD45.2+ le cellule del midollo osseo donatore sono state trapiantate in CD45.1 +topi ricevente. 5 x 106 cellule del midollo osseo sono state trapiantate dopo due frazioni di irradiazione totale del corpo (2 x 5,5 Gy) con o senza schermatura del torace separate da un intervallo di 4 ore o 24 ore. (n = 3–4 per gruppo).

Cura degli animali
Per il successo di questo esperimento sono necessari più passaggi che coinvolgono i topi. Pertanto, è necessaria un'attenzione supplementare nei seguenti punti: in primo luogo, la fornitura di cellule donatrici vitali è fondamentale per un'innesto di successo. Uno dovrebbe essere adeguatamente addestrato nella raccolta di cellule BM intatte e nella loro iniezione nei topi ricevente. Le conseguenze della scarsa fornitura di cellule includono l'incapacità degli HSPC donatori di ricostituire il midollo osseo ricevente che porta alla mortalità. In secondo luogo, bisogna fare attenzione dopo il trapianto per evitare l'infezione, in particolare dopo la terapia mieloablativa. Il contatto con agenti patogeni può essere fatale, poiché i topi diventano transiently immunodifescienti dopo l'irradiazione. Come indicato sopra, integrare l'acqua potabile con antibiotici può ridurre il rischio di infezione fatale. Inoltre, fornire agli animali riceventi un gel nutrizionale /idratante può ridurre al minimo la disidratazione e le carenze nutrizionali che possono verificarsi in seguito all'irradiazione, poiché l'irradiazione può interrompere l'epitelio intestinale che porta alla diarrea32. Le gabbie dovrebbero inoltre essere sostituite frequentemente per ridurre il rischio di contaminazione da batteri fecali, gli animali dovrebbero essere maneggiati in un'adeguata stazione di trasferimento degli animali e i topi riceventi dovrebbero essere monitorati attentamente per la perdita di peso e qualsiasi segno di angoscia o dolore.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni dei National Institutes of Health degli Stati Uniti a K. Walsh (HL131006, HL138014 e HL132564), a S. Sano (HL152174), sovvenzione dell'American Heart Association a M. A. Evans (20POST35210098) e una sovvenzione della Japan Heart Foundation a H. Ogawa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-121 general supply
1.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-129 general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
Absolute Ethanol (200 prfof) Fisher chemical 200559 general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle Becton Dickinson 309626 general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) Becton Dickinson 395195 general supply
Cesium-137 Irradiator J. L. Shepherd  Mark IV equipment
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10 general supply
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09 general supply
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Ketamine Zoetis 043-304 injection
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimtech Science KCC34155 general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim TEVA 0703-9526-01 injection
Xylazine Akorn 139-236 injection
X-ray irradiator Rad source RS-2000 equipment

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