Summary
Describimos tres métodos de trasplante de la médula (BMT): BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación blindada, y método de BMT sin el pre-condicionamiento (BMT adoptivo) para el estudio de la hematopoyesis clónica en modelos del ratón.
Abstract
La hematopoyesis clónica es una condición edad-asociada frecuente que resulta de la acumulación de mutaciones somáticas en las células hematopoyéticas del vástago y del progenitor (HSPCs). Las mutaciones en los genes impulsores, que confieren aptitud celular, pueden conducir al desarrollo de clones de HSPC en expansión que cada vez más dan lugar a leucocitos de progenie que albergan la mutación somática. Porque la hematopoyesis clónica se ha asociado a enfermedad cardíaca, al movimiento, y a mortalidad, el desarrollo de los sistemas experimentales que modelan estos procesos es dominante a entender los mecanismos que subly este nuevo factor de riesgo. Los procedimientos del trasplante de la médula que implican el condicionamiento myeloablative en ratones, tales como irradiación de cuerpo entero (TBI), se emplean comúnmente para estudiar el papel de células inmunes en enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, el daño simultáneo al nicho de la médula ósea y otros sitios de interés, como el corazón y el cerebro, es inevitable con estos procedimientos. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha desarrollado dos métodos alternativos para minimizar o evitar los posibles efectos secundarios causados por la LCT: 1) trasplante de médula ósea con blindaje de irradiación y 2) BMT adoptivo a ratones no acondicionados. En órganos blindados, el ambiente local se preserva permitiendo el análisis de la hematopoyesis clónica mientras que la función de células inmunes residentes es imperturbable. Por el contrario, el BMT adoptivo a ratones no acondicionados tiene la ventaja adicional de que tanto los ambientes locales de los órganos como el nicho hematopoyético se conservan. Aquí, comparamos tres diversos acercamientos hematopoyéticos de la reconstitución de la célula y discutimos sus fuerzas y limitaciones para los estudios de la hematopoyesis clónica en enfermedad cardiovascular.
Introduction
La hematopoyesis clonal (CH) es una condición que se observa con frecuencia en individuos mayores y ocurre como resultado de un clon expandido de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) portador de una mutación genética1. Se ha sugerido que a la edad de 50 años, la mayoría de los individuos habrán adquirido un promedio de cinco mutaciones exónicas en cada HSPC2,pero la mayoría de estas mutaciones resultarán en pocas o ninguna consecuencia fenotípica para el individuo. Sin embargo, si por casualidad una de estas mutaciones confiere una ventaja competitiva al HSPC, por ejemplo, promoviendo su proliferación, auto-renovación, supervivencia o alguna combinación de estos, esto puede conducir a la expansión preferencial del clon mutante en relación con los otros HSPCs. Como consecuencia, la mutación se extenderá cada vez más a través del sistema hematopoyético mientras que el HSPC transformado da lugar a las células de sangre maduras, llevando a una población distinta de células transformadas dentro de la sangre periférica. Mientras que las mutaciones en docenas de genes conductores candidatos diferentes se han asociado con eventos clonales dentro del sistema hematopoyético, entre estos, las mutaciones en el ADN metiltransferasa 3 alfa(DNMT3A)y diez once translocaciones 2(TET2)son las más prevalentes3. Varios estudios epidemiológicos han encontrado que los individuos que llevan estas mutaciones genéticas tienen un riesgo perceptiblemente más alto de la enfermedad cardiovascular (CVD), del movimiento, y de la mortalidad todo-causal3,4,5,6,7. Mientras que estos estudios han identificado que existe una asociación entre el CH y la incidencia creciente del CVD y del movimiento, no sabemos si esta relación es causal o un epiphenomenon compartido con el proceso del envejecimiento. Para obtener una mejor comprensión de esta asociación, se requieren modelos animales adecuados que recapitulan correctamente la condición humana del CH.
Varios modelos animales ch han sido establecidos por nuestro grupo y otros utilizando pez cebra, ratones y primates no humanos8,9,10,11,12,13,14. Estos modelos a menudo utilizan métodos de reconstitución hematopoyética mediante trasplante de células modificadas genéticamente, a veces utilizando la recombinación Cre-lox o el sistema CRISPR. Este enfoque permite el análisis de una mutación genética específica en células hematopoyéticas para evaluar cómo contribuye al desarrollo de la enfermedad. Además, estos modelos emplean a menudo las células congénicas o del reportero para distinguir los efectos de células del mutante de las células normales o del salvaje-tipo. En muchos casos, se requiere un régimen de precondicionamiento para injerir con éxito las células madre hematopoyéticas donantes.
Actualmente, el trasplante de médula ósea a ratones receptores se puede dividir en dos categorías principales: 1) condicionamiento mieloablativo y 2) trasplante no condicionado. El condicionamiento mieloablativo puede lograrse por uno de dos métodos, a saber, la irradiación corporal total (LCT) o la quimioterapia15. La LCT se lleva a cabo sometiendo al receptor a una dosis letal de irradiación gamma o de rayos X, generando roturas de ADN o enlaces cruzados dentro de células que se dividen rápidamente, haciéndolas irreparables16. Busulfán y ciclofosfamida son dos medicamentos de quimioterapia de uso común que interrumpen el nicho hematopoyético y causan de manera similar daño en el ADN a las células que se dividen rápidamente. El resultado neto del preacondicionamiento mieloablativo es la apoptosis de las células hematopoyéticas, que destruye el sistema hematopoyético del receptor. Esta estrategia no sólo permite el engraftment acertado del HSPCs dispensador de aceite, pero puede también prevenir el rechazo del injerto suprimiendo el sistema inmune del recipiente. Sin embargo, el preacondicionamiento mieloablativo tiene efectos secundarios graves, como daño a los tejidos y órganos y a sus células inmunitarias residentes, así como la destrucción del nicho de médula ósea nativa17. Por lo tanto, se han propuesto métodos alternativos para superar estos efectos secundarios indeseables, particularmente en lo que respecta al daño a los órganos de interés. Estos métodos incluyen la irradiación blindada de ratones receptores y el BMT adoptivo a ratones no acondicionados9,17. El blindaje del tórax, la cavidad abdominal, la cabeza u otras regiones de la irradiación mediante la colocación de barreras de plomo mantiene los tejidos de interés protegidos de los efectos perjudiciales de la irradiación y mantiene su población de células inmunes residentes. Por otro lado, el BMT adoptivo de HSPCs a ratones no acondicionados tiene una ventaja adicional porque preserva el nicho hematopoyético nativo. En este manuscrito, se describen los protocolos y resultados de la injerto de HSPC después de varios regímenes de trasplante en ratones, específicamente la entrega de HSPC a ratones TBI, a ratones parcialmente protegidos de la irradiación, y a ratones no acondicionados. El objetivo general es ayudar a los investigadores a comprender los diferentes efectos fisiológicos de cada método, así como cómo afectan los resultados experimentales en el contexto del CH y las enfermedades cardiovasculares.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia.
1. Antes del preacondicionamiento
- Coloque los ratones receptores en agua suplementada con antibióticos (5 mM de sulfametoxazol, 0,86 mM de trimetoprima) ~ 24 h antes de la irradiación. Esto es necesario para prevenir la infección, ya que el sistema inmunológico se suprimirá después de la irradiación y se mantendrá durante 2 semanas después de la irradiación. En este punto, complemente a los ratones con un gel nutricional / hidratante para fomentar la alimentación y prevenir la pérdida de peso y la deshidratación después de la irradiación.
Figura 1: Imágenes que muestran varias configuraciones de preacondicionamiento. (A) Configuración de irradiación corporal total en jaula circular utilizando rayos gamma (Cesio-137): El haz de radiación proviene de la parte posterior del irradiador en la dirección del eje Y (radiación horizontal). (B)Configuración de irradiación corporal total de la jaula del ratón mediante rayos X: La jaula del ratón se coloca en la cámara reflectante. El haz de radiación proviene de la parte superior del irradiador en forma de cono (radiación vertical). La distancia desde la fuente de radiación hasta la jaula es de 530 mm. (C) Bandeja ajustable en irradiador de rayos X: Esta configuración se utiliza para la irradiación parcialmente blindada mediante rayos X. El haz de radiación proviene de la parte superior del irradiador en forma de cono (radiación vertical). La distancia desde la fuente de radiación hasta la bandeja es de 373 mm, y el radio es de 250 mm. (D) Blindaje de tórax: Los ratones anestesiados se colocan en una bandeja. Los ratones se colocan invertidos entre sí en posiciones supinas con los brazos y las piernas completamente extendidos. El extremo inferior del escudo de plomo está alineado con el hueso xiphisternum y el extremo superior con el timo. (E) Blindaje abdominal: Los ratones anestesiados se colocan como en la configuración de blindaje del tórax con el extremo inferior del escudo de plomo alineado con el ano y el extremo superior debajo del diafragma. (F) Configuración de irradiación de protección de la cabeza utilizando rayos gamma (Cesio-137): Las sierras de los antepesos del ratón anestesiado se graban hacia abajo y el ratón se coloca en un sujeción cónica. El escudo de plomo negro (marcado) cubre la cabeza y las orejas del ratón. El haz de radiación proviene de la parte posterior del irradiador en la dirección del eje Y (radiación horizontal). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
2. Preacondicionamiento de ratones receptores (opcional)
- Irradiación corporal total
- Coloque los ratones receptores en una jaula de pastel uniformemente cortada, o en una jaula de ratón en la cámara reflectante dentro del radio calculado para recibir la misma dosis de irradiación; sin embargo, se recomienda un máximo de 8 ratones por jaula de pastel y 5 ratones por jaula de ratón para garantizar una irradiación uniforme (Figura 1A,B).
- Para lograr la mieloablación completa, asegúrese de que los ratones receptores reciban una dosis total de radiación de 11 Gy en dos fracciones de 5,5 Gy separadas por un intervalo de 4-24 h.
NOTA: Mientras que el engraftment óptimo se puede obtener implementando un intervalo de 4 h entre las fracciones, éste se puede extender a un intervalo de 24 h, que puede ser provechoso cuando el trabajo y/o el irradiador no están disponibles.
- Irradiación parcialmente blindada
- Anestesiar a los ratones receptores mediante inyección intraperitoneal de ketamina (80–100 mg/kg) y xilazina (5–10 mg/kg). La restricción del movimiento del ratón es fundamental para garantizar la irradiación uniforme y la protección eficaz de los órganos diana durante el proceso de blindaje.
- Para el blindaje de tórax y abdomen, oriente el haz de radiación del irradiador de rayos X verticalmente al ratón (Figura 1C).
- Coloque los ratones anestesiados en una placa plana, centrando la fuente de radiación desde arriba. Coloque los ratones invertidos entre sí en una posición supina con los brazos y las piernas completamente extendidos (Figura 1D,E).
NOTA: La instalación de irradiador de rayos X, para este experimento, permite que dos ratones a la vez se puedan colocar dentro del radio efectivo que permite una irradiación uniforme. Mientras que el radio efectivo se calcula sobre la base de la distancia entre la fuente de radiación y la bandeja, el número de animales que pueden ser irradiados simultáneamente dependerá del irradiador específico. - Suba las patas de los ratones a la placa usando cinta adhesiva para asegurarse de que los ratones estén inmovilizados durante el procedimiento de irradiación. Coloque el blindaje de plomo para que cubra las regiones que requieren protección.
- Para el blindaje del tórax, prepare el escudo de plomo midiendo la longitud desde el hueso xiphisternum del ratón hasta el timo y calculando el grosor que proporcionará suficiente protección contra la fuente de irradiación. Coloque el blindaje de plomo para que el extremo inferior se alinee con el hueso xiphisternum. El extremo superior de la barrera de plomo se ajustará cerca del timo (Figura 1D).
- Para el blindaje del abdomen, prepare el escudo de plomo midiendo la longitud desde el ano del ratón hasta el diafragma y calculando el grosor que proporcionará suficiente protección contra la fuente de irradiación. Coloque el blindaje de plomo para que el extremo inferior se alinee con el ano. El extremo superior del escudo de plomo se ajustará debajo del diafragma (Figura 1E).
NOTA: Localizar el escudo de plomo para que sea consistente entre las cohortes puede reducir alguna variación con respecto al tamaño de los ratones.
- Coloque los ratones anestesiados en una placa plana, centrando la fuente de radiación desde arriba. Coloque los ratones invertidos entre sí en una posición supina con los brazos y las piernas completamente extendidos (Figura 1D,E).
- Para el blindaje de la cabeza, oriente el haz de radiación del irradiador de cesio horizontalmente al ratón.
- Pegue cuidadosamente las sierras de anteoje de un ratón anestesiado al abdomen. Esto asegura que los brazos reciban una dosis completa de irradiación y no estén cubiertos por el escudo.
- Para el blindaje de la cabeza, coloque el ratón en un sujeción cónica, que cabe dentro de un escudo de plomo. Una vez que el ratón está dentro del sujeción cónica, deslice el sujeción en la ranura dentro del escudo de plomo (Figura 1F). El escudo de plomo debe cubrir completamente la cabeza y las orejas del ratón (~ 3,2 cm), dejando el resto del cuerpo del ratón expuesto para la irradiación. La posición del sujetador dentro del escudo se puede ajustar para adaptarse a los animales de diferentes tamaños deslizándolo más dentro o fuera del escudo.
- Coloque ratones dentro del irradiador, perpendicularmente a la fuente para la irradiación.
- Exponga a los ratones a dos fracciones de irradiación de 5,5 Gy (dosis total de 11 Gy) separadas por un intervalo de 4-24 h.
- Después de cada fracción de irradiación, coloque las jaulas con ratones anestesiados en esteras calentadas o debajo de lámparas de calor rojas para prevenir la hipotermia y ayudar en la recuperación de la anestesia.
NOTA: Se debe tener precaución para no sobrecalentar el ratón anestesiado cuando se utiliza una lámpara, ya que no pueden escapar del calor. Como se ha descrito anteriormente, la posición de los animales y el espesor del escudo de plomo pueden diferir entre los estudios basados en las características específicas del irradiador (tipo de radiación/dirección del haz, etc.). Los investigadores tendrán que ajustar sus experimentos en consecuencia.
3. Aislamiento óseo
NOTA: Idealmente, los ratones donantes y los ratones receptores deben ser similares en edad, y dentro de las 8-12 semanas de edad. Se prefiere usar al menos 3 ratones como donantes (en lugar de un solo donante) para minimizar la heterogeneidad (incluso cuando se usan ratones con el mismo genotipo). Aproximadamente, se pueden obtener 40 millones de células de médula ósea no fraccionadas de seis huesos (dos fémures, dos tibias y dos hómemos) de un solo ratón. El trasplante de 5 millones de células de médula ósea a cada ratón receptor normalmente asegurará el injerto.
- Eutanasiar ratones donantes por dislocación cervical sin anestesia (método preferido para evitar la contaminación química de las células) y colocar cada ratón en una almohadilla absorbente.
- Desinfecte la piel con un spray de etanol al 70%.
- Haga un pequeño corte transversal en la piel debajo de la caja torácica y sostenga la piel firmemente a cada lado de la incisión, desgarre en direcciones opuestas hacia la cabeza y los pies. Desprenda la piel de todas las extremidades.
- Corte sobre los hombros y las articulaciones del codo, y retire los músculos unidos y los tejidos conectivos con la ayuda de un Kimwipe para obtener los húmedos.
- Dislote cuidadosamente las articulaciones de la cadera entre el fémur y los huesos de la cadera. Use tijeras romas para cortar a lo largo de la cabeza del fémur y despegar las piernas. Corte sobre la articulación de la rodilla para separar el fémur y la tibia, y retire cuidadosamente los músculos unidos y los tejidos conectivos con la ayuda de un Kimwipe para cosechar el fémur y la tibia.
NOTA: Preste especial atención para mantener la epífisis ósea intacta durante este paso. Deseche cualquier hueso roto debido a la pérdida de esterilidad. Los huesos de la cadera y los huesos de la columna vertebral se pueden recolectar además del fémur, la tibia y el húmero. Para recoger los huesos de la columna vertebral, se puede utilizar un mortero y un pestle para aplastar los huesos en pedazos y cosechar las células de la médula ósea. - Coloque los huesos aislados de ratones del mismo genotipo en un tubo cónico correspondientemente de 50 mL que contenga PBS estéril helado de 20 mL, y manténgalo en hielo hasta su posterior uso. Preste especial atención a colocar correctamente los huesos en tubos con genotipos emparejados.
- Repita los pasos anteriores para cada animal donante cambiando los guantes entre cada ratón. Además, limpie las tijeras y otros instrumentos con etanol al 70% entre cada ratón.
4. Aislamiento de células de la médula ósea
NOTA: Realice los siguientes pasos en un gabinete de clase II de bioseguridad.
- Preparación de conjuntos de tubos: Haga un pequeño agujero en la parte inferior de un tubo estéril de microcentrífuga de 0,5 mL usando una aguja de 18 G y colóquelo en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL, que contiene 100 μL de PBS estéril helado en la parte inferior.
NOTA: Como solo seis huesos pueden caber en el tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, se recomienda preparar suficientes conjuntos de tubos para procesar todos los huesos al mismo tiempo. - Aspirar el PBS y transferir los huesos aislados en un plato estéril de cultivo celular de 100 mm. Sosteniendo cada hueso usando fórceps finos, corte cuidadosamente las epífidas de cada extremo usando pequeñas tijeras que fueron esterilizadas en un autoclave. Coloque los huesos cortados en los juegos de tubos preparados.
- Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 35 s a 4 °C.
- Después de la centrifugación, confirme que la médula ósea se ha eliminado con éxito de los huesos. Los huesos deben aparecer blancos y translúcidos con un pellet rojo relativamente grande en la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Deseche el tubo de microcentrífuga de 0,5 mL.
NOTA: Si la inspección visual no detecta la médula ósea en la parte inferior del tubo de 1,5 mL, vuelva a cortar el hueso y repita el paso 4.3. - Resuspend la médula ósea en 1 mL de PBS helado, luego transfiera la suspensión celular del mismo genotipo a un tubo cónico de 50 mL emparejado.
- Disociar las células pasándolas a través de una aguja de 18 G con una jeringa de 10 ml 10 veces.
- Filtre las suspensiones unicelulares a través de un colador de células de 70 μm. Agregue PBS helado adicional a un volumen final de 10 mL y vuelva apentir las células mediante el uso suave de pipeta-aid.
- Centrífuga a 310 x g durante 10 min a 4 °C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspend el pellet celular con 10 mL de medios RPMI sin suero. Repuesto 30 μL de este material para el conteo celular.
- Determinar la concentración celular con un contador celular y calcular el volumen de suspensión celular necesario para el trasplante. Para el ejemplo de un 100% BMT, se requieren 5 x 106 células de médula ósea para cada ratón receptor.
NOTA: Para un BMT competitivo, prepare un total de 5 x 106 células de la médula que comprenden una mezcla de células dispensadoras de aceite (e.g., CD45.2+)y de células de la competidor (e.g., CD45.1+). La preparación de células adicionales de la médula ósea es muy recomendable. Por ejemplo, si hay 10 ratones receptores por grupo experimental, normalmente preparamos suficientes células para 12 ratones receptores. - Transfiera el volumen calculado de suspensión celular a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Centrífuga a 310 x g durante 10 min a 4 °C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspend las células utilizando la cantidad calculada de medio RPMI sin suero para lograr la densidad y el volumen celulares apropiados. Típicamente, 200 μL es el volumen óptimo para una inyección retro-orbital.
5. Trasplante de células de médula ósea a ratones irradiados
- Anestesiar los ratones receptores con isoflurano al 5%.
- Mientras los ratones son anestesiados, inyecte lentamente 200 μL de células de médula ósea en la vena retro-orbital usando una aguja de 28-30 G con una jeringa de insulina.
- Alternativamente, realizar la entrega de las células donantes por inyección intravenosa de vena de cola e inyección intramedular femoral, con un volumen máximo de 0,2 mL y 25 μL, respectivamente.
- Una vez que se inyectan las células, coloque una gota de gotas para los ojos que contienen proparacaína en la superficie del ojo para aliviar el dolor. Entonces se puede permitir que el animal recupere la conciencia.
6. Trasplante de células de médula ósea a ratones no acondicionados
- Anestesiar los ratones receptores por inhalación de isoflurano al 5%.
- Inyecte 5 x 106 células de médula ósea no fraccionadas de cualquiera de los genotipos retro-orbitalmente en ratones receptores no irradiados con jeringa de insulina de 28-30 G.
- Repita los pasos 6.1 y 6.2 durante 3 días consecutivos, de modo que los ratones receptores serán trasplantados con un total de 1,5 x 107 células de médula ósea.
NOTA: Debido a que el BMT adoptivo sin procedimiento de precondicionamiento requiere el trasplante de médula ósea durante 3 días consecutivos, uno debe intentar alternar los ojos para cada inyección. - Después de la inyección, administrar una gota de gotas para los ojos que contienen proparacaína al ojo afectado.
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Representative Results
Para comparar el efecto de tres métodos de BMT/pre-conditioning sobre el engraftment dispensador de aceite de la célula, las fracciones de células dispensadoras de aceite en sangre periférica y tejido del corazón eran analizadas por cytometry de flujo en el poste-BMT de 1 mes. Las células aisladas fueron manchadas para que los marcadores específicos del leucocito identifiquen los diversos subconjuntos de leucocitos. En estos experimentos, el salvaje-tipo(PESO) C57BL/6 (CD45.2) las células dispensadoras de aceite de la médula fueron entregadas al PESO B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) ratones receptores para distinguir las células donantes de las células del receptor. Las estrategias de gating de citometría de flujo que se utilizaron son descritas previamente por Wang et al.9 en la Figura Suplementaria 1.
La irradiación de cuerpo entero (TBI) trató a grupo recibido 5 x 106 células de la médula que seguían una dosis mortal total de la radiación de 11 GY en dos fracciones de 5,5 GY separadas por un intervalo de 4 h. En la sangre periférica de ratones receptores, los monocitos, los neutrófilos y las células B fueron en gran parte ablacionados y reemplazados por la progenie de células derivadas de la médula ósea del donante. Además, la población residente de monocitos cardíacos y neutrófilos en corazones de ratones receptores fueron reemplazadas casi por completo por células derivadas de donantes(Figura 2A).
En el grupo parcialmente blindado de la irradiación, los ratones receptores fueron irradiados con un protector del tórax y trasplantados con 5 x 106 células de la médula que seguían una dosis total de la radiación de 11 GY en dos fracciones de 5,5 GY separadas por un intervalo de 4 h. En contraste con el grupo TBI, la contribución de células donante-derivadas a las células inmunes cardiacas era modesta, que refleja probablemente los efectos combinados de proteger las células inmunes locales en los corazones de ratones receptores y la repoblación fisiológica de células dispensadoras de aceite médula-derivadas de la sangre periférica. Las células receptoras de médula ósea de ratón en regiones blindadas también es probable que hayan contribuido a la reconstitución de la sangre periférica, lo que reduce el porcentaje de células derivadas de donantes en sangre periférica en comparación con el grupo tratado conLCT (Figura 2B).
En el grupo sin el pre-condicionamiento de BMT (BMT adoptivo), los ratones receptores fueron trasplantados con 5 x 106 células de médula ósea durante 3 días consecutivos. En 4 semanas poste-BMT, la porción de células donante-derivadas en sangre periférica y corazón era perceptible. (aproximadamente el 5%) (Figura 2C).
Para ilustrar cómo el modelo adoptivo de BMT se puede aplicar al estudio del modelo del CH, CD45.2+ las células dispensadoras de médula ósea(WT o Tet2-/-) fueron trasplantadas en CD45.1+ ratones receptores. Los receptores sin acondicionamiento fueron trasplantados con 5 x10 6 células de médula ósea cada día durante 3 días consecutivos (para un total de 1,5 x 107,n = 5-6 por grupo). El análisis cytometric del flujo de la sangre periférica fue realizado 4, 8, 12, y 16 semanas de poste-trasplante. Las células dispensadoras de aceite de Tet2-deficient confirieron una ventaja competitiva y se ampliaron gradualmente en un cierto plazo; WBCs, monocitos, monocitos de Ly6Chi, neutrófilos, células de T, y células de B aumentó perceptiblemente en un cierto plazo. En comparación con las células donantes deficientes en Tet2 injertados en ratones receptores, los ratones receptores injertados con células donantes WT mostraron una expansión clonal menos significativa de las células donantes(Figura 3). De acuerdo con el paradigma clínico de la hematopoyesis clonal, la expansión de las células deficientes en Tet2 no afecta los números absolutos de los diversos tipos de células sanguíneas9 (datos no mostrados).
Figura 2: Análisis citométrico de flujo de sangre y corazón utilizando diferentes métodos de preacondicionamiento. El análisis cytometric del flujo de la sangre y del corazón periféricos fue realizado 1 mes después del trasplante de la médula. Para distinguir las células dispensadoras de aceite de las células de los recipientes, CD45.1+ ratones receptores fueron trasplantados con CD45.2+ las células dispensadoras de aceite de la médula. (A)5 x 106 células de médula ósea fueron trasplantadas después de dos fracciones de irradiación corporal total (2 x 5,5 GY, intervalo de 4 h, n = 3). (B)5 x 106 células de médula ósea fueron trasplantadas después de dos fracciones de irradiación corporal total con tórax-blindaje (2 x 5,5 GY, intervalo de 4 h, n = 10). (C)Los receptores sin condicionamiento fueron trasplantados con 5 x 106 células de médula ósea durante 3 días consecutivos (para un total de 1,5 x 107,n = 4). Los datos se expresan como media ± SEM. Los WBCs totales se definen como CD45+; Neutrófilos como Ly6G+; Ly6Chi monocitos como CD115+, Ly6G-, y Ly6C+; Monocitos Ly6Clo como CD115+,Ly6G-, y Ly6C-; Células B como CD45R+; CD4+ células T como CD3e+ y CD4+; CD8+ células T como CD3e+ y CD8+; y Macrófagos como CD64+,Ly6G-, y Ly6C-. (WBCs: glóbulos blancos, Neut: neutrófilos, Mono: monocitos, Mac: macrófagos). Figura 2A,C han sido modificados de Wang et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Expansión clonal de células deficientes en Tet2 utilizando BMT adoptivo a ratones no acondicionados. CD45.2+ las células dispensadoras de aceite de la médula(WT o Tet2-/-) fueron trasplantadas en CD45.1+ ratones receptores. Trasplantaron a los recipientes sin el condicionamiento con 5 x10 6 células de la médula cada día por 3 días consecutivos (para un total de 1,5 x 107,n = 5-6 por grupo). El análisis cytometric del flujo de la sangre periférica fue realizado después del poste-trasplante de 4, 8, 12, y 16 semanas. Se muestra la fracción de CD45.2+ células donantes en cada población. (A)WBCs(B)Mono(C)Ly6Chi mono(D)B cells(E)T cells. Los datos se expresan como media ± SEM. LosWBCs se definen como CD45+; Neutrófilos como Ly6G+; Ly6Chi monocitos como CD115+, Ly6G-, y Ly6C+; Monocitos Ly6Clo como CD115+,Ly6G-, y Ly6C-; Células B como CD45R+; CD4+ células T como CD3e+ (WT: tipo salvaje, WBCs: glóbulos blancos, Mono: monocitos) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para los estudios de la hematopoyesis clónica, describimos tres métodos de BMT: BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación con el blindaje parcial, y un método menos de uso general de BMT que no implique ningún pre-condicionamiento (BMT adoptivo). Estos métodos se han utilizado para evaluar el impacto de la hematopoyesis clónica en la enfermedad cardiovascular. Los investigadores pueden modificar estos métodos en consecuencia para adaptarse al propósito específico de su estudio.
Modelos clonales de hematopoyesis
La hematopoyesis clonal es el fenómeno en el que las células hematopoyéticas mutantes compiten con las células de tipo salvaje y obtienen dominancia clonal con el tiempo. Para crear un modelo de esta competencia, a los ratones se les puede administrar médula ósea, que consiste en una mezcla de células genéticamente diferentes. En general, esta mezcla incluirá células mutantes y de tipo salvaje, que han sido etiquetadas con una etiqueta fluorescente o diferentes marcadores pan-leucocitocitos (es decir, CD45.1 y CD45.2). Por ejemplo, al crear modelos que imitan el CH mediado por Tet2,realizamos un trasplante competitivo de médula ósea en receptores irradiados letalmente que típicamente implica mezclar el 90% de las células que se originan en donantes de CD45.1 Tet2+/+ y el 10% de las células que se originan en CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- o controlar a los donantes de Tet2+/+ 8. La detección de citometría de flujo de las variantes CD45 utilizando anticuerpos monoclonales específicos permite distinguir las células donantes (CD45.1-/CD45.2+) de las células competidoras (CD45.1+/CD45.2-) dentro de la sangre, y evaluar la dinámica clonal de las células de prueba a lo largo del tiempo. Al hacerlo, hemos podido observar un aumento gradual en el quimerismo de donantes de células deficientes en Tet2, mientras que el porcentaje de células de tipo salvaje permanece en aproximadamente el 10%. Este entorno experimental imita el escenario humano de individuos portadores de una mutación somática TET2, ya que estas mutaciones son inicialmente transportadas por un pequeño número de HSPCs, que se expandirán gradualmente con el tiempo. El empleo de este enfoque en modelos de enfermedades cardiovasculares de aterosclerosis e insuficiencia cardíaca ha llevado a la documentación de un posible vínculo causal entre el CH mediado por Tet2y la ECV8,9,10.
Al emplear estos enfoques, los investigadores deben tener en cuenta los posibles efectos de confusión generados por la LCT. Aunque TBI antes del trasplante permita un alto grado de engraftment de HSPC, este pre-acondicionamiento llevará a varios efectos indeseables fuera del sistema hematopoyético. Se ha documentado que la LCT puede conducir a inflamación, lesión y fibrosis en múltiples sistemas de órganos, incluyendo piel, hígado, riñones, pulmones, médula ósea, corazón, cerebro, etc.18,19,20. Estos efectos secundarios pueden afectar negativamente a los órganos cardiovasculares en estudio, y también alteran la patogénesis de la enfermedad21,22. Un ejemplo notable es el efecto de la irradiación sobre los macrófagos residentes en el corazón. La irradiación del tórax da lugar a un reemplazo marcado de macrófagos cardiaco-residentes por los macrófagos monocitos-derivados de circulación. Los estudios han mostrado que los macrófagos cardiaco-residentes exhiben características distintas en relación con los macrófagos monocitos-derivados de circulación que engraft en el corazón después de lesión de radiación. En los entornos de enfermedades, se cree que los macrófagos residentes en el cardíaco desempeñan un papel cardioprotector, mientras que los macrófagos infiltrados transmitidos por la sangre se han reportado para promover lesiones e inflamación23. Por lo tanto, es concebible que la sustitución de las células inmunes cardíacas residentes por células transmitidas por la sangre alterará los procesos patológicos en estudio, que contribuyen a la enfermedad cardiovascular24,25,26. Del mismo modo, en el cerebro, el TBI resulta en el agotamiento de la microglía residente y el reemplazo por macrófagos de origen periférico27,28. Mientras que los macrófagos de origen periférico pueden comportarse como células microgliales, mantienen una identidad funcional y transcripcional única en comparación con la microglía derivada de monocitos28. Por lo tanto, es posible que la secuela de la enfermedad pueda verse alterada, particularmente cuando se estudian enfermedades como los accidentes cerebrovasculares isquémicos. Para evitar estos efectos de confusión, se puede recomendar blindar el tórax y la cabeza. Esto es ventajoso porque proporciona protección al corazón y al cerebro, respectivamente; y también mantiene intactas sus células inmunes residentes, recapitulando mejor la condición humana del CH. Sin embargo, como se señaló anteriormente, el blindaje resulta en una tasa más baja de quimerismo en comparación con el pre-condicionamiento de TBI, que esencialmente elimina todas las células hematopoyéticas del huésped.
Otro impedimento importante en el pre-condicionamiento es su efecto perjudicial sobre el nicho de la médula ósea. Aunque el daño irradiación-inducido del lugar del BM se pueda restaurar a un grado subóptimo, es confuso si la hematopoyesis ingenua está recuperada en estos microambientes dañados. Además, el trasplante de HSPCs mezclados en BM vacío inicia una carrera para la proliferación entre los clones, bastante que la "competición" simple para un nicho que es ocupado por un salvaje-tipo HSPC-que es probablemente qué ocurre en el CH. Así, un acercamiento potencialmente preferible a estudiar el CH puede ser el método adoptivo de BMT, por el que las células del BM se transfieran en ratones receptores sin el pre-condicionamiento. Este TMO adoptivo sin método de precondicionamiento afecta mínimamente a la hematopoyesis ingenua en curso, recapitulando más fielmente el CH observado en humanos29. La Figura 2C muestra el nivel de quimerismo a 1 mes post-trasplante sin pre-acondicionamiento. Si bien el quimerismo del donante es bajo en este punto de tiempo temprano, encontramos una fracción progresivamente creciente de clones deficientes en Tet2 a lo largo del tiempo, como se presenta en la Figura 3. Cabe señalar que este modelo es más útil cuando las células mutantes tienen una ventaja competitiva sobre las células de tipo salvaje en condiciones homeostáticas como las células deficientes en Tet2. Cuando se injertan las células de Tet2-deficient, hay una extensión marcada en varias poblaciones del leucocito tales como neutrófilos, monocitos, células de NK, y células de B. Una extensión más lenta fue observada en células de T, probablemente debido a la vida media más larga de esta población.
La expansión de las células deficientes en Tet2 se ha observado no sólo en la sangre periférica, sino también en varios otros tejidos, incluyendo médula ósea, hígado y riñón, con diferentes dinámicas de reconstitución de células hematopoyéticas9. Por ejemplo, el artículo publicado anterior de nuestro laboratorio describió el quimerismo de células de médula ósea de wt y células donantes deficientes en Tet2 injertado en ratones receptores CD45.1 8 meses después de BMT adoptivo9. Las células donantes deficientes en Tet2 trasplantadas a ratones receptores CD45.1 han demostrado una ventaja competitiva sobre el linaje inmaduro:células Sca1+c-Kit+ (LSK), células HSC a corto y largo plazo y progenitores multipotentes (MPPs) en comparación con la de las células donantes WT trasplantadas a los ratones receptores CD45.1. Además, como Tet2-deficient células donantes engrafted ratones receptores, desarrollan un fenotipo de cardiomiopatía relacionada con la edad sin factores exógenos que causan disfunción cardíaca, de tal modo recapitulando el efecto de la hematopoyesis clonal de una manera similar a la de los seres humanos que envejecen. Esta observación fue acompañada con el grado creciente de chimerism en neutrófilos cardiacos y monocitosdel hi de Ly6C. Colectivamente, este régimen adoptivo de BMT se puede aplicar a los estudios futuros que podrían ampliar nuestra comprensión de la asociación entre el desarrollo de la enfermedad cardiovascular y la hematopoyesis clónica en un nivel más avanzado.
En resumen, se describen tres métodos BMT y se discutió su aplicación en la generación de modelos ch. El CH se asocia a pronósticos más pobres en enfermedades cardiovasculares tales como ateroesclerosis e paro cardíaco. Aunque se han realizado progresos considerables, el estudio de los vínculos causales entre el CH y la ECV todavía está en pañales, y se requieren más investigaciones mediante el uso de modelos animales optimizados. Esperamos que estos protocolos permitan a investigadores seleccionar un método fisiológico más apropiado de BMT, que reduce al mínimo efectos de confusión potenciales sobre el sistema cardiovascular, rindiendo en última instancia los estudios que amplían nuestra comprensión de cómo el CH contribuye a la enfermedad cardiovascular.
Diseño de blindaje de plomo
El espesor del escudo de plomo vendrá dictado por el tipo de irradiación utilizado para inducir la mieloablación. Los tipos de radiación de rayos X o rayos gamma se utilizan con frecuencia para la mieloablación experimental, pero difieren en términos de su frecuencia, longitud de onda y energía de fotones. Cuando se trata de blindaje, la energía de fotones, que describe la energía o velocidad a la que viajan los rayos, es el parámetro más importante. Típicamente, las fuentes de radiación de rayos X tienen una energía de 160 kVp, mientras que las fuentes de cesio-137, que emiten rayos gamma, tienen una energía de 662 KeV. La energía emitida por estas fuentes de radiación equivale a su poder de penetración, con energías más altas que tienen un mayor poder de penetración. Por lo tanto, se requiere un mayor espesor de protección de plomo cuando se utilizan irradiadores basados en fuentes de cesio en comparación con el uso de irradiadores basados en rayos X. La irradiación basada en rayos X, que utilizamos cuando realizamos el blindaje del tórax y el abdomen, requiere un escudo de plomo de 7 mm de espesor para proporcionar suficiente protección. Sin embargo, para las fuentes de cesio 137, que usamos cuando realizamos el blindaje de la cabeza, requiere que los escudos de plomo sean de al menos 1 pulgada de espesor para proporcionar suficiente protección.
Los escudos de plomo para su uso en irradiadores de rayos X se pueden comprar a proveedores comerciales. Alternativamente, las hojas de plomo se pueden cortar a su tamaño para que quepan alrededor del cuerpo del animal o para que quepan alrededor de un sujetador (ver Figura 1). Cuando se utiliza un irradiador a base de cesio, se deben usar ladrillos de plomo, que son considerablemente más gruesos, y pueden ser hechos a medida por empresas que se especializan en la fabricación de este tipo de escudos. Por ejemplo, para el headshield, diseñamos a medida un ladrillo de plomo para sostener un sujeción de tubo cónico de 50 mL (ver Figura 1F). El animal es capaz de caber dentro del sujetador, que luego se coloca en un agujero hecho en el ladrillo, para proporcionar 1,5 pulgadas de protección contra la irradiación. Es importante destacar que todos los escudos de plomo deben estar recubiertos con pintura o cinta adhesiva para evitar la exposición al polvo de plomo, que puede ser tóxico.
Basándose en el equipo y sus parámetros, los investigadores pueden diseñar sus propios escudos de plomo para sus sitios de interés. Aquí, introdujimos el tórax, abdominal, y el blindaje principal; sin embargo, otros sitios tales como miembro o flanco se pueden considerar para el blindaje también. Además, si bien ambas fuentes de radiación (Cesio-137 y rayos X) son adecuadas para la ablación de la médula ósea y el injerto exitoso, se ha observado variabilidad en la reconstitución de las poblaciones de células linfoides y mieloides entre el Cesio-137 y las fuentes de irradiación de rayos X30. Por lo tanto, los investigadores deben tener en cuenta las respuestas fisiológicas dispares a la fuente de radiación para su uso en estudios.
Intervalos de dosificación
La dosis y los intervalos de dosificación pueden afectar la eficiencia del injerto de células donantes y las tasas de supervivencia. En pacientes humanos, la irradiación de la alto-dosis puede causar pulmonía intersticial idiopática, lesión gastrointestinal, y la formación de la catarata. En los modelos de ratón, la irradiación única de dosis altas seguida de un trasplante de médula ósea puede producir resultados similares y también puede afectar a las tasas de supervivencia31. Por lo tanto, la irradiación fraccionada es muy recomendable para los estudios de BMT en ratón. Además, los intervalos de dosificación de fracciones pueden afectar la tasa de supervivencia de los ratones y la tasa de reconstitución, dando lugar a diferentes fracciones de quimerismo celular donante en los órganos hematológicos, así como en otros tejidos31. Por lo tanto, los investigadores deben tener cuidado al diseñar un programa de dosificación de irradiación fraccionada para los estudios de BMT.
En el contexto de la tasa de supervivencia y la reconstitución de células inmunes, nuestro pequeño estudio mostró que un grupo de ratones que recibieron irradiación corporal total con una dosis de radiación letal de 11 Gy en dos fracciones de 5,5 Gy separadas por un grupo de intervalo de 24 h no tuvo resultados significativamente diferentes que el grupo que recibió la misma dosis de TBI en un intervalo de 4 h (ver Tabla 1). Sin embargo, con el tórax-blindaje BMT, el grupo del intervalo de 24 h aparecía mostrar menos eficacia del chimerism dispensador de aceite de la célula en comparación con el grupo del intervalo de 4 h. Una explicación posible para este resultado es que la irradiación con el intervalo de 24 h pudo no haber sido suficiente quitar las células inmunocompetentes del recipiente porque los intervalos prolongados dieron a ratones receptores suficiente tiempo para reparar las células dañadas. Además, el blindaje del tórax protege los huesos parciales de la columna vertebral que también contienen los HSC del receptor. Así, las células receptoras inmunocompetentes restantes y recuperadas pueden haber atacado las células donante-derivadas e inducido un resultado que mostró una eficacia más baja del engraftment.
| CMB (%) | Célula B (%) | Células T (%) | Mono (%) | Ly6Chi mono (%) | Ly6Clo mono (%) | Neutrófilo (%) | ||
| TBI-BMT | Intervalo de 4h | 97,4 ± 1,0 | 100 ± 0 | 59,1 ± 18,7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| Intervalo de 24h | 97,2 ± 2,2 | 100 ± 0 | 79,0 ± 8,1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| BMT de blindaje de tórax | Intervalo de 4h | 56,2 ± 4,0 | 54,2 ± 6,2 | 0,5 ± 0,1 | 66,7 ± 6,1 | 63,8 ± 6,3 | 70,8 ± 5,7 | 82,0 ± 3,8 |
| Intervalo de 24h | 34,4 ± 3,1 | 34,8 ± 3,1 | 2,9 ± 1,7 | 45,0 ± 3,2 | 34,2 ± 3,6 | 56,2 ± 4,9 | 56 ± 10,0 | |
Tabla 1: La eficiencia del injerto de células donantes utilizando diferentes intervalos de dosificación. El análisis cytometric del flujo de la sangre periférica fue realizado 1 mes después del trasplante de la médula. PESO CD45.2+ las células dispensadoras de aceite de la médula fueron trasplantadas en CD45.1+ ratones receptores. 5 x 106 células de la médula fueron trasplantadas después de dos fracciones de la irradiación de cuerpo entero (2 x 5,5 GY) con o sin el tórax-blindaje separado por un intervalo de 4 h o un intervalo de 24 h. (n = 3–4 por grupo).
Cuidado de animales
Se requieren múltiples pasos con ratones para el éxito de este experimento. Por lo tanto, se requiere atención adicional en los siguientes puntos: En primer lugar, la entrega de células donantes viables es crucial para el injerto exitoso. Uno debe ser entrenado adecuadamente en la colección de células BM intactas y su inyección en ratones receptores. Las consecuencias de la entrega pobre de células incluyen la falta de HSPCs dispensador de aceite para reconstituir la médula ósea receptora que lleva a la mortalidad. En segundo lugar, el cuidado se debe tomar después del trasplante para evitar la infección, particularmente después de terapia myeloablative. El contacto con patógenos puede ser fatal, ya que los ratones se vuelven transitoriamente inmunodeficientes después de la irradiación. Como se indicó anteriormente, complementar el agua potable con antibióticos puede reducir el riesgo de infección fatal. Además, proporcionar a los animales receptores gel nutricional/hidratante puede minimizar la deshidratación y las deficiencias nutricionales que pueden ocurrir después de la irradiación, ya que la irradiación puede alterar el epitelio intestinal que conduce a la diarrea32. Las jaulas también deben reemplazarse con frecuencia para reducir el riesgo de contaminación por bacterias fecales, los animales deben manipularse en una estación de transferencia de animales adecuada y los ratones receptores deben ser monitoreados cuidadosamente para la pérdida de peso y cualquier signo de angustia o dolor.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos a K. Walsh (HL131006, HL138014 y HL132564), a S. Sano (HL152174), la subvención de la Asociación Americana del Corazón a M. A. Evans (20POST35210098) y una subvención de la Japan Heart Foundation a H. Ogawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
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