Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Knoglemarvstransplantationsprocedurer hos mus til undersøgelse af klonisk hæmatopoiesis

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/61875
Automatic Translation
1, 4, 4, 4, 4, 4, 2, 3,4, 1,4
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

Summary

Vi beskriver tre metoder til knoglemarvstransplantation (BMT): BMT med total kropsbestråling, BMT med afskærmet bestråling og BMT-metode uden prækonditionering (adoptiv BMT) til undersøgelse af klonisk hæmatopoiesis i musemodeller.

Abstract

Clonal hæmatopoiesis er en udbredt aldersrelateret tilstand, der skyldes akkumulering af somatiske mutationer i hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSC'er). Mutationer i førergener, der giver cellulær fitness, kan føre til udvikling af ekspanderende HSPC-kloner, der i stigende grad giver anledning til afkom leukocytter, der huser den somatiske mutation. Fordi klonisk hæmatopoiesis har været forbundet med hjertesygdomme, slagtilfælde og dødelighed, er udviklingen af eksperimentelle systemer, der modellerer disse processer, nøglen til at forstå de mekanismer, der underly denne nye risikofaktor. Knoglemarvstransplantationsprocedurer, der involverer myeloablativ konditionering hos mus, såsom bestråling af hele kroppen (TBI), anvendes ofte til at studere immuncellernes rolle i hjerte-kar-sygdomme. Men samtidig skade på knoglemarvsnicher og andre steder af interesse, såsom hjerte og hjerne, er uundgåelig med disse procedurer. Således har vores laboratorium udviklet to alternative metoder til at minimere eller undgå mulige bivirkninger forårsaget af TBI: 1) knoglemarvstransplantation med bestrålingsafskærmning og 2) adoptiv BMT til ikke-konditionerede mus. I afskærmede organer bevares det lokale miljø, hvilket giver mulighed for analyse af klonisk hæmatopoiesis, mens funktionen af bosiddende immunceller er uforstyrret. I modsætning hertil har den adoptiv BMT til ikke-betingede mus den yderligere fordel, at både de lokale miljøer af organerne og den hæmatopoietiske niche bevares. Her sammenligner vi tre forskellige hæmatopoietiske cellerekonstruktionsmetoder og diskuterer deres styrker og begrænsninger for undersøgelser af klonisk hæmatopoiesis i hjerte-kar-sygdomme.

Introduction

Clonal hematopoiesis (CH) er en tilstand, der ofte observeres hos ældre personer og opstår som følge af en udvidet hæmatopoietisk stamcelle- og stamcelleklon (HSPC), der bærer en genetisk mutation1. Det er blevet foreslået, at i en alder af 50, de fleste individer vil have erhvervet et gennemsnit på fem exonic mutationer i hver HSPC2, men de fleste af disse mutationer vil resultere i ringe eller ingen fænotypiske konsekvenser for den enkelte. Men hvis en af disse mutationer ved en tilfældighed giver HSPC en konkurrencemæssig fordel – f.eks. ved at fremme dens spredning, selvfornyelse, overlevelse eller en kombination af disse – kan dette føre til præferenceudvidelsen af den mutante klon i forhold til de andre HSC'er. Som følge heraf vil mutationen i stigende grad sprede sig gennem det hæmatopoietiske system, da det muterede HSPC giver anledning til modne blodlegemer, hvilket fører til en tydelig population af muterede celler i det perifere blod. Mens mutationer i snesevis af forskellige kandidat driver gener har været forbundet med kloniske begivenheder inden for hæmatopoietiske system, blandt disse, mutationer i DNA methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) og ti elleve translokation 2 (TET2) er de mest udbredte3. Flere epidemiologiske undersøgelser har vist, at personer, der bærer disse genetiske mutationer, har en betydeligt højere risiko for hjerte-kar-sygdom (CVD), slagtilfælde og all-kausaldødelighed 3,4,5,6,7. Mens disse undersøgelser har identificeret, at der er en sammenhæng mellem CH og øget forekomst af CVD og slagtilfælde, ved vi ikke, om dette forhold er årsagssammenhæng eller en fælles epiphenomenon med aldringsprocessen. For at få en bedre forståelse af denne forening kræves der korrekte dyremodeller, der korrekt opsummerer CH's menneskelige tilstand.

Flere CH dyremodeller er blevet etableret af vores gruppe og andre ved hjælp af zebrafisk, mus og ikke-menneskelige primater8,9,10,11,12,13,14. Disse modeller anvender ofte hæmatopoietiske rekonstitutionsmetoder ved transplantation af genetisk modificerede celler, nogle gange ved hjælp af Cre-lox rekombination eller CRISPR-systemet. Denne tilgang giver mulighed for analyse af en specifik genmutation i hæmatopoietiske celler for at vurdere, hvordan det bidrager til sygdomsudvikling. Derudover anvender disse modeller ofte congeniske eller reporterceller til at skelne virkningerne af mutantceller fra normale eller vilde celler. I mange tilfælde er en pre-conditioning regime er forpligtet til at kunne engraft donor hæmatopoietiske stamceller.

I øjeblikket kan transplantationen af knoglemarv til recipientmus opdeles i to hovedkategorier: 1) myeloablativ konditionering og 2) ikke-betinget transplantation. Myeloablativ konditionering kan opnås ved en af to metoder, nemlig total kropsbestråling (TBI) eller kemoterapi15. TBI udføres ved at udsætte modtageren for en dødelig dosis gamma- eller røntgenbestråling, generere DNA-brud eller krydsforbindelser i hurtigt dividere celler, hvilket gør dem uoprettelige16. Busulfan og cyclophosphamide er to almindeligt anvendte kemoterapi lægemidler, der forstyrrer den hæmatopoietiske niche og ligeledes forårsage DNA-skader på hurtigt at opdele celler. Nettoresultatet af myeloablativ forudsætning er apoptose af hæmatopoietiske celler, som ødelægger modtagerens hæmatopoietiske system. Denne strategi giver ikke kun mulighed for en vellykket engraftment af donor HSC'er, men kan også forhindre graft afvisning ved at undertrykke modtagerens immunsystem. Men myeloablative forudsætninger har alvorlige bivirkninger såsom skader på væv og organer og deres hjemmehørende immunceller samt ødelæggelse af den indfødte knoglemarvsnicher17. Der er derfor foreslået alternative metoder til at overvinde disse uønskede bivirkninger, navnlig med hensyn til skader på organer af interesse. Disse metoder omfatter afskærmet bestråling af recipientmus og adoptiv-BMT til ikke-betingede mus9,17. Afskærmning af brystkassen, bughulen, hovedet eller andre regioner mod bestråling ved placering af blybarrierer beskytter væv af interesse mod de skadelige virkninger af bestråling og opretholder deres bosiddende immuncellepopulation. På den anden side har den adoptiv BMT af HSC'er til ikke-betingede mus en yderligere fordel, fordi den bevarer den indfødte hæmatopoietiske niche. I dette manuskript beskriver vi protokollerne og resultaterne af HSPC-engraftment efter flere transplantationsregimer hos mus, specifikt levering af HSPC til TBI-mus, til mus, der delvist er afskærmet mod bestråling, og til ikke-betingede mus. Det overordnede mål er at hjælpe forskerne med at forstå de forskellige fysiologiske virkninger af hver metode samt hvordan de påvirker eksperimentelle resultater i fastsættelsen af CH og hjerte-kar-sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med forsøgspersoner er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Virginia.

1. Forud for forkonditionering

  1. Sæt recipientmusene på antibiotisk suppleret vand (5 mM sulfamethoxazol, 0,86 mM trimethoprim) ~24 timer før bestråling. Dette er nødvendigt for at forhindre infektion, da immunsystemet vil blive undertrykt efter bestråling og opretholdt i 2 uger efter bestråling. På dette tidspunkt supplere mus med en ernæringsmæssig / hydrering gel for at tilskynde til fodring og for at forhindre vægttab og dehydrering efter bestråling.

Figure 1
Figur 1: Billeder, der viser forskellige forkonditioneringsopsætninger. (A) Opsætning af den samlede bestråling af pieburet ved hjælp af gammastråle (Cæsium-137): Strålingsstrålen kommer fra bestrålingsanlæggets bagende i y-aksens retning (horisontal stråling). (B) Opsætning af museburets samlede bestråling ved hjælp af røntgen: Museburet anbringes i det reflekterende kammer. Strålingsstrålen kommer fra toppen af bestrålingsanlægget i form af en kegle (lodret stråling). Afstanden fra strålingskilden til buret er 530 mm. (C) Justerbar bakke i røntgenbestråling: Denne opsætning bruges til delvis afskærmet bestråling ved hjælp af røntgen. Strålingsstrålen kommer fra toppen af bestrålingsanlægget i form af en kegle (lodret stråling). Afstanden fra strålingskilden til bakken er 373 mm, og radius er 250 mm. (D) Thorax-afskærmning: Bedøvede mus placeres på en bakke. Musene er placeret omvendt til hinanden i liggende positioner med arme og ben fuldt udstrakte. Den nederste ende af blyskjoldet er justeret med xiphisternumbenet og den øvre ende med thymus. (E) Abdominal-afskærmning: Bedøvede mus er placeret som i brystkasse-afskærmning set-up med den nederste ende af bly-skjoldet justeret med anus og den øvre ende under mellemgulvet. (F) Opsætning af hovedafskærmning ved hydrering ved hjælp af gammastråle (Cæsium-137): Den bedøvede muss forepaws tapes ned, og musen anbringes i en konisk fastholdelsesvogn. Det sorte blyskjold (mærket) dækker musens hoved og ører. Strålingsstrålen kommer fra bagsiden af bestrålingsanlægget i retning af Y-aksen (vandret stråling). Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Forkonditionering af recipientmus (valgfrit)

  1. Bestråling af kroppen i alt
    1. Anbringe modtagermus i et ensartet skiveskåret tærtebur eller et musebur i det reflekterende kammer inden for den beregnede radius for at modtage samme bestrålingsdosis det anbefales dog højst 8 mus pr. tærtebur og 5 mus pr. musebur at sikre ensartet bestråling (figur 1A,B).
    2. For at opnå fuldstændig myeloablation skal du sikre dig, at recipientmus får en samlet strålingsdosis på 11 Gy i to 5,5 Gy-fraktioner adskilt af et interval på 4-24 timer.
      BEMÆRK: Selvom optimal engraftment kan opnås ved at implementere et 4 timers interval mellem fraktioner, kan dette udvides til et interval på 24 timer, hvilket kan være nyttigt, når arbejdskraft og / eller bestrålingsanlægget ikke er tilgængeligt.
  2. Delvist afskærmet bestråling
    1. Bedøve modtagermusene ved intraperitoneal injektion af ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (5-10 mg/kg). Fastholdelsesanordningen for musens bevægelse er afgørende for at sikre ensartet bestråling og effektiv beskyttelse af målorganerne under afskærmningsprocessen.
    2. For thorax og maveafskærmning orienteres røntgenbestrålingsstrålens strålingsstråle lodret til musen (Figur 1C).
      1. Placer de bedøvede mus på en flad plade, centreret strålingskilden ovenfra. Placer musene omvendt til hinanden i en liggende stilling med arme og ben fuldt udstrakte(figur 1D,E).
        BEMÆRK: Røntgenbestrålingsanlæg giver mulighed for dette forsøg, at to mus ad gangen kan placeres inden for den effektive radius, der muliggør ensartet bestråling. Mens den effektive radius beregnes på grundlag af afstanden mellem strålingskilden og bakken, vil antallet af dyr, der samtidig kan bestråles, afhænge af den specifikke bestrålingsradiator.
      2. Fastgør musenes poter på pladen ved hjælp af tape for at sikre, at musene immobiliseres under bestrålingsproceduren. Placer blyafskærmning, så den dækker områder, der kræver beskyttelse.
      3. Til brystkasseafskærmning skal blyskjoldet forberedes ved at måle længden fra musens xiphisternumben til thymus og beregne den tykkelse, der vil give tilstrækkelig beskyttelse mod bestrålingskilden. Placer blyafskærmningen, så den nederste ende flugter med xiphisternumbenet. Den øverste ende af blybarrieren passer i nærheden af thymus (Figur 1D).
      4. Til afskærmning af maven skal blyskjoldet forberedes ved at måle længden fra musens anus til mellemgulvet og beregne den tykkelse, der vil give tilstrækkelig beskyttelse mod bestrålingskilden. Placer blyafskærmningen, så den nederste ende flugter med anus. Den øverste ende af blyskjoldet vil passe under mellemgulvet (Figur 1E).
        BEMÆRK: Lokalisering af blyskjoldet for at være konsistent blandt kohorter kan reducere en vis variation med hensyn til musenes størrelse.
    3. Til hovedafskærmning orienteres strålingsstrålen på cæsiumbestrålingsanlægget vandret til musen.
      1. Tape forsigtigt forepaws af en bedøvet mus til maven. Dette sikrer, at armene får en fuld dosis bestråling og ikke er dækket af skjoldet.
      2. Til hovedafskærmning skal du placere musen i en konisk fastholdelsesplads, der passer ind i et blyskjold. Når musen er inde i den koniske fastholdelsesplads, skal du skubbe fastholderen ind i åbningen i blyskjoldet (Figur 1F). Blyskjoldet skal helt dække musens hoved og ører (~3,2 cm), hvilket efterlader resten af musens krop udsat for bestråling. Holderens position inde i skjoldet kan justeres, så den passer til dyr af forskellig størrelse ved at skubbe den længere ind i eller uden for skjoldet.
      3. Placer mus inde i bestrålingsanlægget, vinkelret på kilden til bestråling.
    4. Udsætte mus for to 5,5 Gy-fraktioner bestråling (samlet dosis på 11 Gy) adskilt af et interval på 4-24 timer.
    5. Efter hver bestrålingsfraktion skal burene anbringes med bedøvede mus på opvarmede måtter eller under røde varmelamper for at forhindre hypotermi og hjælpe med at komme sig efter anæstesi.
      BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for ikke at overophede den bedøvede mus, når du bruger en lampe, da de ikke kan slippe ud af varmen. Som beskrevet ovenfor kan dyrenes placering og tykkelsen af blyskjoldet variere mellem undersøgelser baseret på bestrålingsanlæggets særlige karakteristika (strålingstype/stråleretning osv.). Forskere bliver nødt til at justere deres eksperimenter i overensstemmelse hermed.

3. Knogleisolation

BEMÆRK: Ideelt set bør donormus og recipientmus være ens i alder og inden for 8-12 uger gamle. Brug af mindst 3 mus som donorer (i stedet for enkeltdonor) foretrækkes at minimere for heterogenitet (selv når du bruger mus med samme genotype). Ca. 40 millioner ikke-brydnings knoglemarvsceller kan fås fra seks knogler (to lårben, to skinneben og to humeri) af en enkelt mus. Transplantation af 5 millioner knoglemarvsceller til hver modtagermus vil typisk sikre engraftment.

  1. Aflive donormus ved livmoderhalskræft dislokation uden anæstesi (foretrukken metode til at undgå kemisk forurening af celler) og placere hver mus på en absorberende pad.
  2. Desinficere huden ved hjælp af en 70% ethanol spray.
  3. Lav en lille tværgående snit i huden under brystkassen og hold huden tæt på hver side af snittet, rive i modsatte retninger mod hoved og fødder. Skræl huden af alle lemmerne.
  4. Skær over skuldrene og albueleddene, og fjern de vedhæftede muskler og bindevæv ved hjælp af en Kimwipe for at opnå humeri.
  5. Forsigtigt forvrænge hofteleddene mellem lårbenet og hoftebenene. Brug stump saks til at skære langs lårbenet hovedet og løsne benene. Skær over knæleddet for at adskille lårbenet og skinnebenet, og fjern forsigtigt de vedhæftede muskler og bindevæv ved hjælp af en Kimwipe for at høste lårbenet og skinnebenet.
    BEMÆRK: Vær særlig opmærksom på at holde knoglefisen intakt under dette trin. Kassér eventuelle brækkede knogler på grund af tab af sterilitet. Hofteben og rygsøjleben kan indsamles ud over lårbenet, skinnebenet og humerus. For at indsamle rygsøjlen knogler, en mørtel og en støder kan bruges til at knuse knoglerne i stykker og høste knoglemarvsceller.
  6. De isolerede knogler fra mus af samme genotype anbringes i tilsvarende 50 mL konisk rør, der indeholder 20 mL iskold steril PBS, og den opbevares på is indtil videre. Vær særlig opmærksom på korrekt at placere knoglerne i rør med matchede genotyper.
  7. Gentag ovenstående trin for hvert donordyr, der skifter handsker mellem hver mus. Også, ren saks og andre instrumenter med 70% ethanol mellem hver mus.

4. Knoglemarvscelleisolation

BEMÆRK: Udfør følgende trin i et biosikkerhedsskab i klasse II.

  1. Forberedelse af rørsæt: Lav et lille hul i bunden af et sterilt mikrocentrifugerør på 0,5 mL ved hjælp af en 18 G nål og læg det i et sterilt mikrocentrifugerør på 1,5 mL, som indeholder 100 μL iskold steril PBS i bunden.
    BEMÆRK: Da der kun kan være seks knogler i mikrocentrifugerøret på 0,5 mL, anbefales det at forberede tilstrækkelige rørsæt til at behandle alle knoglerne på samme tid.
  2. Indsug PBS og overfør de isolerede knogler til en steril 100 mm cellekulturskål. Hold hver knogle ved hjælp af fine pincet, forsigtigt skære epifyser fra hver ende ved hjælp af en lille saks, der blev steriliseret i en autoklave. Placer de udskårne knogler i de forberedte rørsæt.
  3. Rørene centrifuges ved 10.000 x g for 35 s ved 4 °C.
  4. Efter centrifugering skal du bekræfte, at knoglemarven er blevet fjernet fra knoglerne. Knoglerne skal fremstå hvide og gennemskinnelige med en relativt stor rød pellet i bunden af 1,5 mL mikrocentrifugerøret. 0,5 mL mikrocentrifugerøret kasseres.
    BEMÆRK: Hvis den visuelle inspektion ikke registrerer knoglemarven i bunden af 1,5 mL-røret, skal knoglen skæres over og gentages trin 4.3.
  5. Resuspend knoglemarven i 1 mL iskold PBS, og overfør derefter celleaffjedringen fra samme genotype til et matchende 50 mL konisk rør.
  6. Dissociere cellerne ved at passere dem gennem en 18 G nål med en 10 mL sprøjte 10 gange.
  7. Filtrer enkeltcelleaffjedring gennem en 70 μm celle si. Tilsæt yderligere iskold PBS til et slutvolumen på 10 mL, og genbrug cellerne ved hjælp af pipettestøtte.
  8. Centrifuge ved 310 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  9. Aspirere supernatant og genbruge celle pellet med 10 mL serum-fri RPMI medier. Ekstra 30 μL af dette materiale til celletælling.
  10. Bestem cellekoncentrationen med en celletæller, og beregn den mængde celleaffjedring, der kræves til transplantationen. For eksempel på en 100% BMT kræves der 5 x 106 knoglemarvsceller for hver modtagermus.
    BEMÆRK: For en konkurrencedygtig BMT skal der udarbejdes i alt 5 x 106 knoglemarvsceller bestående af en blanding af donorceller (f.eks. Det anbefales stærkt at forberede ekstra knoglemarvsceller. For eksempel, hvis der er 10 modtagermus pr. eksperimentel gruppe, forbereder vi typisk nok celler til 12 recipientmus.
  11. Det beregnede volumen af celleaffjedringen overføres til et nyt 50 mL konisk rør. Centrifuge ved 310 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  12. Aspirere supernatanten og opsætte cellerne igen ved hjælp af den beregnede mængde serumfrit RPMI-medium for at opnå den rette celletæthed og -volumen. Typisk er 200 μL det optimale volumen for en retro-orbital injektion.

5. Transplantation af knoglemarvsceller til bestrålede mus

  1. Bedøve modtageren mus med 5% isoflurane.
  2. Mens mus bedøves, injiceres der langsomt 200 μL knoglemarvsceller i retro-orbital venen ved hjælp af en 28-30 G nål med en insulinsprøjte.
    1. Alternativt kan donorcellerne leveres ved intravenøs injektion i haleåren og femoral intramedullær injektion med et maksimalt volumen på henholdsvis 0,2 mL og 25 μL.
  3. Når cellerne er injiceret, placere en dråbe proparacain-holdige øjendråber på overfladen af øjet for smertelindring. Dyret kan derefter få lov til at genvinde bevidstheden.

6. Transplantation af knoglemarvsceller til ikke-betingede mus

  1. Bedøve modtagermusene ved indånding af 5% isoflurane.
  2. Injicere 5 x 106 ikke-bedragede knoglemarvsceller fra enten genotype retro-orbitally i ikke-bestrålede recipientmus med 28-30 G insulinsprøjte.
  3. Gentag trin 6.1 og 6.2 over 3 på hinanden følgende dage, således at recipientmusene transplanteres med i alt 1,5 x 107 knoglemarvsceller.
    BEMÆRK: Da den adoptiv-BMT uden forkonditioneringsprocedure kræver knoglemarvstransplantation i 3 på hinanden følgende dage, bør man forsøge at skifte øjne for hver injektion.
  4. Efter injektionen gives en dråbe proparacainholdige øjendråber til det berørte øje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at sammenligne effekten af tre BMT/pre-conditioning metoder på donor celle engraftment, fraktioner af donorceller i perifere blod og hjertevæv blev analyseret af flow cytometry på 1-måneders post-BMT. Isolerede celler blev farvet for specifikke leukocyt markører til at identificere de forskellige delmængder af leukocytter. I disse forsøg blev donor knoglemarvsceller af vild type(WT) C57BL/6 (CD45.2) leveret til WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) modtagermus for at skelne donorceller fra modtagerens celler. De anvendte flowcytometristrategier er tidligere beskrevet af Wang et al.9 i supplerende figur 1.

Den samlede gruppe af kropsbestråling (TBI) modtog 5 x 106 knoglemarvsceller efter en samlet dødelig strålingsdosis på 11 Gy i to 5,5 Gy-fraktioner adskilt af et interval på 4 timer. I det perifere blod hos recipientmus blev monocytter, neutrofiler og B-celler stort set ablated og erstattet af afkom af donor knoglemarvs-afledte celler. Derudover blev den bosiddende hjertemon monocyt- og neutrofilpopulation i hjerter hos recipientmus næsten fuldstændig erstattet af donor-afledte celler (Figur 2A).

I den delvist afskærmede bestrålingsgruppe blev recipientmus bestrålet med et brystkasseskjold og transplanteret med 5 x 106 knoglemarvsceller efter en samlet strålingsdosis på 11 Gy i to 5,5 Gy-fraktioner adskilt af et interval på 4 timer. I modsætning til TBI-gruppen var donor-afledte cellers bidrag til hjerte immunceller beskedent, hvilket sandsynligvis afspejler de kombinerede virkninger af at beskytte de lokale immunceller i modtagermusens hjerter og den fysiologiske genpopulation af knoglemarvsafledte donorceller fra det perifere blod. Recipientmus knoglemarvsceller i afskærmede områder vil sandsynligvis også have bidraget til perifer blodrekonstruktion, hvilket reducerer procentdelen af donorafledte celler i perifert blod sammenlignet med den TBI-behandlede gruppe (Figur 2B).

I gruppen uden BMT pre-conditioning (adoptiv BMT) blev recipientmus transplanteret med 5 x 106 knoglemarvsceller over 3 på hinanden følgende dage. På 4 uger efter BMT, den del af donor-afledte celler i perifere blod og hjerte kunne påvises. (ca. 5 %) (Figur 2C).

For at illustrere, hvordan den adoptiv BMT-model kan anvendes på studiet af CH-modellen, blev CD45.2+ donor knoglemarvsceller (WT eller Tet2-/-) transplanteret til CD45.1+ recipientmus. Modtagere uden konditionering blev transplanteret med 5 x 106 knoglemarvsceller hver dag i 3 på hinanden følgende dage (i alt 1,5 x 107, n = 5-6 pr. gruppe). Flow cytometrisk analyse af perifert blod blev udført 4, 8, 12 og 16 uger efter transplantation. De Tet2-mangelfulde donorceller gav en konkurrencemæssig fordel og blev gradvist udvidet med tiden. WBCs, monocytter, Ly6Chi monocytter, neutrofiler, T-celler og B-celler steg betydeligt over tid. Sammenlignet med de Tet2-mangelfulde donorceller, der er indgraveret i recipientmus, viste recipientmus, der var indgraveret med WT-donorceller, mindre signifikant klonisk udvidelse af donorceller ( figur3). I overensstemmelse med det kliniske paradigme for kloniske hæmatopoiesier påvirker udvidelsen af Tet2-mangelfulde celler ikke det absolutte antal af de forskellige blodcelletyper9 (data vises ikke).

Figure 2
Figur 2: Flow cytometrisk analyse af blod og hjerte ved hjælp af forskellige metoder til forkonditionering. Flow cytometrisk analyse af perifert blod og hjerte blev udført 1 måned efter knoglemarvstransplantation. For at skelne donorceller fra modtagernes celler blev CD45.1+ recipientmus transplanteret med CD45.2+ donor knoglemarvsceller. (A) 5 x 106 knoglemarvsceller blev transplanteret efter to fraktioner af den samlede bestråling af kroppen (2 x 5,5 Gy, 4 timer interval, n = 3). (B) 5 x 106 knoglemarvsceller blev transplanteret efter to fraktioner af den samlede kropsbestråling med thoraxafskærmning (2 x 5,5 Gy, 4 h interval, n = 10). (C) Modtagere uden konditionering blev transplanteret med 5 x 106 knoglemarvsceller i 3 på hinanden følgende dage (i alt 1,5 x 107, n = 4). Data udtrykkes som middelværdi ± SEM. WBCs i alt defineres som CD45+; Neutrofiler som Ly6G+; Ly6Chi monocytter som CD115+, Ly6G-og Ly6C+; Ly6Clo monocytter som CD115+, Ly6G-og Ly6C-; B-celler som CD45R+; CD4+ T-celler som CD3e+ og CD4+; CD8+ T-celler som CD3e+ og CD8+; og Makrofager som CD64+, Ly6G-og Ly6C-. (WBCs: hvide blodlegemer, Neut: neutrofiler, Mono: monocytter, Mac: makrofager). Figur 2A,C er blevet ændret fra Wang et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Clonal ekspansion af Tet2-mangelfulde celler ved hjælp af adoptiv BMT til ikke-betingede mus. CD45.2+ donor knoglemarvsceller (WT eller Tet2-/-) blev transplanteret til CD45.1+ recipientmus. Modtagere uden konditionering blev transplanteret med 5 x 106 knoglemarvsceller hver dag i 3 på hinanden følgende dage (i alt 1,5 x 107, n = 5-6 pr. gruppe). Flow cytometrisk analyse af perifert blod blev udført efter 4, 8, 12 og 16 uger efter transplantationen. Fraktionen af CD45.2+ donorceller i hver population vises. (A) WBCs (B) Mono (C) Ly6Chi mono (D) B-celler (E) T-celler. Data udtrykkes som middelværdi ± SEM. WBCs defineres som CD45+; Neutrofiler som Ly6G+; Ly6Chi monocytter som CD115+, Ly6G-og Ly6C+; Ly6Clo monocytter som CD115+, Ly6G-og Ly6C-; B-celler som CD45R+; CD4+ T-celler som CD3e+ (WT: wild-type, WBCs: hvide blodlegemer, Mono: monocytter) Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til undersøgelser af blodlegemer beskrev vi tre metoder til BMT: BMT med total kropsbestråling, BMT med bestråling med delvis afskærmning og en mindre almindeligt anvendt BMT-metode, der ikke involverer prækonditionering (adoptiv BMT). Disse metoder er blevet brugt til at vurdere virkningen af klonisk hæmatopoies på hjerte-kar-sygdomme. Forskere kan ændre disse metoder i overensstemmelse hermed, så de passer til det specifikke formål med deres undersøgelse.

Clonal hæmatopoiesis modeller
Klonisk hæmatopoiesis er det fænomen, hvor mutante hæmatopoietiske celler konkurrerer med celler af vild type og opnår klonisk dominans over tid. For at skabe en model af denne konkurrence kan mus administreres knoglemarv, som består af en blanding af genetisk forskellige celler. Generelt vil denne blanding omfatte mutante og vilde celler, som er mærket med et fluorescerende mærke eller forskellige pan-leukocytmarkører (dvs. CD45.1 og CD45.2). Når vi f.eks. opretter modeller, der efterligner Tet2-medieretCH, udfører vi en konkurrencedygtig knoglemarvstransplantation i letforædlede modtagere, der typisk involverer blanding af 90 % af celler, der stammer fra CD45.1 Tet2+/+ donorer, og 10 % af celler, der stammer fra CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- eller control Tet2+/+ donorer8. Flowcytometridetektion af CD45-varianterne ved hjælp af specifikke monoklonale antistoffer gør det muligt for en at skelne donorceller (CD45.1-/CD45.2+) fra konkurrerende celler (CD45.1+/CD45.2-) i blodet og vurdere testcellernes klondynamik over tid. Dermed har vi været i stand til at observere en gradvis stigning i donor kimærisme af Tet2-mangelfulde celler, mens procentdelen af vilde celler forbliver på ca. 10%. Denne eksperimentelle indstilling efterligner det menneskelige scenario af personer, der bærer en TET2 somatisk mutation, da disse mutationer i første omgang bæres af et lille antal HSC'er, som gradvist vil udvide sig over tid. Anvendelse af denne tilgang i hjerte-kar-sygdom modeller af åreforkalkning og hjertesvigt har ført til dokumentation af en potentiel årsagssammenhæng mellem Tet2-medieretCH og CVD8,9,10.

Ved anvendelsen af disse tilgange bør forskerne tage hensyn til de mulige forvirrende virkninger, som TBI genererer. Selvom TBI før transplantation muliggør en høj grad af HSPC-engraftment, vil denne prækonditionering føre til flere uønskede virkninger uden for det hæmatopoietiske system. Det er blevet dokumenteret, at TBI kan føre til betændelse, skade og fibrose i flere organsystemer, herunder hud, lever, nyrer, lunger, knoglemarv, hjerte, hjerne osv.18,19,20. Disse bivirkninger kan have en negativ indvirkning på de undersøgte kardiovaskulære organer, og de ændrer også sygdomspatogenese21,22. Et bemærkelsesværdigt eksempel er virkningen af bestråling på bosiddende makrofager i hjertet. Bestråling af brystkassen resulterer i en markant udskiftning af hjerte-residente makrofager med cirkulerende monocyt-afledte makrofager. Undersøgelser har vist, at hjerte-residente makrofager viser forskellige egenskaber i forhold til cirkulerende monocyt-afledte makrofager, der vil engraft i hjertet efter strålingsskade. I sygdomsindstillinger menes hjerte-residente makrofager at spille en kardiobeskyttende rolle, mens infiltrerende blodbårne makrofager er blevet rapporteret for at fremme skade ogbetændelse 23. Derfor er det tænkeligt, at udskiftning af residente hjerte immunceller med blodbårne celler vil ændre de patologiske processer, der undersøges, hvilket bidrager til hjerte-kar-sygdom24,25,26. Tilsvarende resulterer TBI i hjernen i udtømning af resident mikroglia og udskiftning af perifert afledte makrofager27,28. Mens perifert afledte makrofager kan opføre sig som mikrogliale celler, opretholder de en unik funktionel og transskriptionel identitet sammenlignet med monocyt-afledt mikroglia28. Derfor er det muligt, at sygdommen sequela kan ændres, især når man studerer sygdomme som iskæmiske slagtilfælde. For at undgå disse forvirrende virkninger kan afskærmning af brystkassen og hovedet anbefales. Dette er fordelagtigt, fordi det giver beskyttelse til henholdsvis hjerte og hjerne; og det opretholder også deres hjemmehørende immunceller intakt, bedre at opsummere den menneskelige tilstand af CH. Men som tidligere nævnt resulterer afskærmning i en lavere kimærisme sammenlignet med TBI pre-conditioning, hvilket i det væsentlige eliminerer alle værtens hæmatopoietiske celler.

En anden vigtig hindring i pre-conditioning er dens skadelige virkning på knoglemarvsnicheren. Selv om bestrålingsfremkaldte skader på BM-nichen kan genoprettes i suboptimalt omfang, er det uklart, om naiv hæmatopoiesis genvindes i disse beskadigede mikromiljøer. Hertil kommer, at transplantation af blandede HSC'er i tomme BM indleder et kapløb om spredning mellem kloner, snarere end den simple "konkurrence" for en niche, der er besat af en vild-type HSPC-hvilket formentlig er, hvad der sker i CH. En potentielt foretrukken tilgang til at studere CH kan således være den adoptiv BMT-metode, hvorved BM-celler overføres til recipientmus uden prækonditionering. Denne adoptiv BMT uden prækonditioneringsmetode påvirker minimalt den igangværende naive hæmatopoiesis, mest trofast opsummerer CH observeret hos mennesker29. Figur 2C viser kimærismens niveau ved 1 måneds posttransplantation uden forbehandling. Mens donor kimærisme er lav på dette tidlige tidspunkt, finder vi en gradvist stigende brøkdel af Tet2-mangelfuld kloner over tid, som præsenteret i figur 3. Det skal bemærkes, at denne model er mest nyttig, når de mutante celler har en konkurrencefordel i forhold til vilde celler under homeostatiske forhold som Tet2-mangelfulde celler. Når Tet2-mangelfulde celler er engrafted, der er en markant ekspansion i forskellige leukocyt populationer såsom neutrofiler, monocytter, NK celler, og B-celler. En langsommere ekspansion blev bemærket i T-celler, formentlig på grund af den længere halveringstid af denne befolkning.

Udvidelsen af Tet2-mangelfulde celler er blevet observeret ikke kun i det perifere blod, men også i flere andre væv, herunder knoglemarv, lever og nyre, med forskellige dynamikker i hæmatopoietisk cellerekonstitution9. For eksempel beskrev vores lab's tidligere offentliggjorte papir knoglemarvscelle kimærismen i WT og Tet2-mangelfulde donorceller, der er indgraveret i CD45.1-modtagermus 8 måneder efter adoptiv BMT9. Tet2-mangelfulde donorceller transplanteret i CD45.1 modtagermus har vist en konkurrencemæssig fordel i forhold til umodne afstamning–Sca1+c-Kit+ (LSK) celler, kortsigtede og langsigtede HSC-celler og multipotente forfædre (MPP'er) sammenlignet med WT-donorceller, der transplanteres i CD45.1-modtagermusene. Hertil kommer, som Tet2-deficient donor celle engrafted modtager mus, de udvikler en aldersrelateret kardiomyopati fænotype uden udefrakommende faktorer, der forårsager hjerte dysfunktion, og dermed opsummere effekten af kloniske hæmatopoiesis på en måde, der svarer til den aldrende mennesker. Denne observation blev ledsaget af øget grad af kimærisme hos hjerte neutrofiler og Ly6Chi monocytter. Kollektivt, denne adoptiv BMT regime kan anvendes til fremtidige undersøgelser, der kan udvide vores forståelse af sammenhængen mellem hjerte-kar-sygdom udvikling og kloniske hæmatopoiesis på et mere avanceret niveau.

Sammenfattende beskrev vi tre BMT-metoder og diskuterede deres anvendelse i generering af CH-modeller. CH er forbundet med dårligere prognoser i hjerte-kar-sygdomme som åreforkalkning og hjertesvigt. Selv om der er gjort betydelige fremskridt, er undersøgelsen af årsagssammenhængen mellem CH og CVD stadig i sin vorden, og der er behov for yderligere undersøgelser ved hjælp af optimerede dyremodeller. Vi håber, at disse protokoller giver forskerne mulighed for at vælge en mere fysiologisk passende metode til BMT, som minimaliserer potentielle forvirrende virkninger på hjerte-kar-systemet, hvilket i sidste ende giver undersøgelser, der udvider vores forståelse af, hvordan CH bidrager til hjerte-kar-sygdomme.

Design af blyafskærmning
Tykkelsen af blyskjoldet vil blive dikteret af den type bestråling, der bruges til at fremkalde myeloablationen. Røntgen- eller gammastråletyper af stråling bruges ofte til eksperimentel myeloablation, men adskiller sig med hensyn til deres frekvens, bølgelængde og fotonenergi. Når det kommer til afskærmning, er fotonenergien, der beskriver den energi eller hastighed, hvormed strålerne bevæger sig, den vigtigste parameter. Typisk, stråling kilde X-stråler har en energi på 160 kVp mens cæsium-137 kilder, som udsender gammastråler, har en energi på 662 KeV. Den energi, der udsendes af disse strålingskilder, svarer til deres indtrængningskraft, hvor højere energier har en større penetrationskraft. Derfor kræves en større tykkelse af blyskjoldet ved brug af cæsiumkildebaserede bestrålingsanlæg i forhold til anvendelse af røntgenbaserede bestrålingsanlæg. Røntgenbaseret bestråling, som vi bruger, når vi udfører brystkasse og abdominal afskærmning, kræver et 7 mm tykt blyskjold for at give tilstrækkelig beskyttelse. Men for cæsium 137 kilder, som vi bruger, når vi udfører hoved-afskærmning, kræver bly skjolde at være mindst 1 tommer tyk til at yde tilstrækkelig beskyttelse.

Blyskjolde til brug i røntgenbestrålingsanlæg kan købes hos kommercielle leverandører. Alternativt kan blyplader skæres i størrelse, så de enten passer rundt om dyrets krop eller passer omkring et fastholdelsesværn (se figur 1). Når du bruger en cæsiumbaseret bestråling, skal blysten, som er betydeligt tykkere, anvendes og kan specialfremstilles af virksomheder, der specialiserer sig i at fremstille disse typer skjolde. For hovedskiftet har vi f.eks. specialdesignet en blyklods til at holde en 50 mL konisk rørholder (se figur 1F). Dyret er i stand til at passe ind i restrainer, som derefter slidses ind i et hul lavet i mursten for at give 1,5 tommer beskyttelse mod bestråling. Det er vigtigt, at alle blyskjolde belægges enten med maling eller tape for at forhindre udsættelse for blystøv, hvilket kan være giftigt.

Baseret på udstyret og dets parametre kan forskere designe deres egne blyskjolde til deres interessante steder. Her introducerede vi brystkasse, mave og hovedafskærmning; Andre steder som f.eks. lemmer eller flanker kan dog også komme i betragtning til afskærmning. Hertil kommer, at mens både strålingskilder (Cæsium-137 og X-ray) er egnede til knoglemarvsabblation og vellykket engraftment, er der observeret variabilitet i rekonstitueringen af lymfoide og myeloidcellepopulationer mellem cæsium-137 og røntgenstrålingskilder30. Forskere bør således tage hensyn til de forskellige fysiologiske reaktioner på strålingskilden til brug i undersøgelser.

Doseringsintervaller
Doserings- og doseringsintervaller kan påvirke effektiviteten af donorcelleindskrivning og overlevelsesrater. Hos mennesker kan højdosisbestråling forårsage idiopatisk interstitiel lungebetændelse, gastrointestinale skader og grå stærdannelse. I musemodeller kan enkelt højdosisbestråling efterfulgt af knoglemarvstransplantation give lignende resultater og kan også påvirke overlevelsesraten31. Derfor anbefales fraktioneret bestråling stærkt til BMT-museundersøgelser. Derudover kan doseringsintervallerne for fraktioner påvirke musens overlevelsesrate og rekonstitutionshastighed, hvilket fører til forskellige fraktioner af donorcelle kimærisme i hæmatologiske organer såvel som andet væv31. Forskere bør således være forsigtige med at udforme en fraktioneret bestrålingsdæmningsplan for BMT-undersøgelser.

I forbindelse med overlevelsesraten og rekonstitutionen af immunceller viste vores lille undersøgelse, at en gruppe mus, der fik total kropsbestråling med en dødelig strålingsdosis på 11 Gy i to 5,5 Gy-fraktioner adskilt af en intervalgruppe på 24 timer, ikke havde nogen væsentligt anderledes resultater end den gruppe, der modtog den samme TBI-dosis med et interval på 4 timer (se tabel 1). Men med thorax-afskærmning BMT, de 24 timer interval gruppe syntes at vise mindre effektivitet donor celle kimærisme i forhold til de 4 timer interval gruppe. En mulig forklaring på dette resultat er, at bestråling med et interval på 24 timer muligvis ikke har været tilstrækkelig til at fjerne modtagerens immunkompetente celler, fordi de langvarige intervaller gav recipientmus tilstrækkelig tid til at reparere beskadigede celler. Derudover beskytter thorax-afskærmning delvise rygsøjleknogler, der også indeholder modtagerens HSC'er. Således kan de resterende og genvundne immunkompetente recipientceller have angrebet de donor-afledte celler og fremkaldt et resultat, der viste lavere engraftment effektivitet.

   

WBC (%) B-celle (%) T-celle (%) Mono (%) Ly6Chl mono (%) Ly6Ctil mono (%) Neutrofil (%)
TBI-BMT 4h interval 97,4 ± 1,0 100 ± 0 59.1 ± 18.7 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
24h interval 97.2 ± 2.2 100 ± 0 79.0 ± 8.1 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
brystkasse-afskærmning BMT 4h interval 56.2 ± 4.0 54.2 ± 6.2 0,5 ± 0,1 66,7 ± 6,1 63,8 ± 6,3 70,8 ± 5,7 82.0 ± 3.8
24h interval 34.4 ± 3.1 34.8 ± 3.1 2.9 ± 1.7 45.0 ± 3.2 34.2 ± 3.6 56.2 ± 4.9 56 ± 10.0

Tabel 1: Effektiviteten af donorcelleindskrivning ved hjælp af forskellige doseringsintervaller. Flow cytometrisk analyse af perifert blod blev udført 1 måned efter knoglemarvstransplantation. WT CD45.2+ donor knoglemarvsceller blev transplanteret til CD45.1+ recipientmus. 5 x 106 knoglemarvsceller blev transplanteret efter to fraktioner af den samlede bestråling af kroppen (2 x 5,5 Gy) med eller uden brystkasseafskærmning adskilt af et interval på 4 timer eller 24 timer. (n = 3-4 pr. gruppe).

Dyrepleje
Flere trin, der involverer mus, er nødvendige for dette eksperiments succes. Der kræves således ekstra opmærksomhed på følgende punkter: For det første er levering af levedygtige donorceller afgørende for en vellykket engraftment. Man bør trænes ordentligt i indsamlingen af intakte BM-celler og deres injektion i recipientmus. Konsekvenserne af dårlig levering af celler omfatter manglende donor HSC'er til at rekonstruere modtager knoglemarv, der fører til dødelighed. For det andet skal man være forsigtig efter transplantationen for at undgå infektion, især efter myeloablativ behandling. Kontakt med patogener kan være dødelig, da mus bliver forbigående immundefekt efter bestråling. Som nævnt ovenfor kan supplering af drikkevandet med antibiotika sænke risikoen for dødelig infektion. Desuden kan det at give recipientdyr ernæringsmæssig / hydrering gel minimere dehydrering og ernæringsmæssige mangler, der kan opstå efter bestråling, da bestråling kan forstyrre tarmepitelet, der fører til diarré32. Bure bør også udskiftes hyppigt for at mindske risikoen for fækal bakterieforurening, dyr bør håndteres på en ordentlig dyreoverførselsstation, og recipientmusene bør overvåges nøje for vægttab og eventuelle tegn på angst eller smerte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health tilskud til K. Walsh (HL131006, HL138014, og HL132564), til S. Sano (HL152174), American Heart Association tilskud til M. A. Evans (20POST35210098), og en Japan Heart Foundation tilskud til H. Ogawa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-121 general supply
1.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-129 general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
Absolute Ethanol (200 prfof) Fisher chemical 200559 general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle Becton Dickinson 309626 general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) Becton Dickinson 395195 general supply
Cesium-137 Irradiator J. L. Shepherd  Mark IV equipment
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10 general supply
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09 general supply
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Ketamine Zoetis 043-304 injection
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimtech Science KCC34155 general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim TEVA 0703-9526-01 injection
Xylazine Akorn 139-236 injection
X-ray irradiator Rad source RS-2000 equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
  2. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
  4. Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
  5. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  6. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  7. Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
  8. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
  9. Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
  10. Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
  11. Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
  12. Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
  13. Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
  14. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
  15. Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
  16. Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
  17. Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
  18. Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
  19. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  20. Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
  21. Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
  22. Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
  23. Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
  24. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  25. Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
  26. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  27. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  28. Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
  29. Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
  30. Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
  31. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  32. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).

Tags

Immunologi og infektion Problem 171 klonisk hæmatopoiesis myeloablativ prækonditionering ikke-myeloablativ konditionering hæmatopoietisk cellerekonstruktion knoglemarvstransplantation adoptivoverførsel
Knoglemarvstransplantationsprocedurer hos mus til undersøgelse af klonisk hæmatopoiesis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, E., Evans, M. A., Doviak, H.,… More

Park, E., Evans, M. A., Doviak, H., Horitani, K., Ogawa, H., Yura, Y., Wang, Y., Sano, S., Walsh, K. Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (171), e61875, doi:10.3791/61875 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter