Summary
हम बोन मैरो प्रत्यारोपण (बीएमटी) के तीन तरीकों का वर्णन करते हैं: कुल शरीर विकिरण के साथ बीएमटी, परिरक्षित विकिरण के साथ बीएमटी, और माउस मॉडल में क्लोनल हेमेटोपोइसिस के अध्ययन के लिए कोई पूर्व कंडीशनिंग (दत्तक बीएमटी) के साथ बीएमटी विधि।
Abstract
क्लोनल हेमेटोपोसिस एक प्रचलित उम्र से जुड़ी स्थिति है जो हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) में दैहिक उत्परिवर्तनों के संचय से परिणाम देती है। ड्राइवर जीन में उत्परिवर्तन, जो सेलुलर फिटनेस प्रदान करते हैं, एचएसपीसी क्लोन के विस्तार के विकास का कारण बन सकते हैं जो तेजी से दैहिक उत्परिवर्तन को शरण देने वाली संतान ल्यूकोसाइट्स को जन्म देते हैं। क्योंकि क्लोनल हेमेटोपोसिस हृदय रोग, स्ट्रोक और मृत्यु दर से जुड़ा हुआ है, प्रयोगात्मक प्रणालियों का विकास जो इन प्रक्रियाओं को मॉडल करता है, उस तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है जो अंतर्निहित रूप से इस नए जोखिम कारक को समझते हैं। बोन मैरो प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं चूहों में myeloablative कंडीशनिंग शामिल है, जैसे कुल शरीर विकिरण (टीबीआई), आमतौर पर हृदय रोगों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए नियोजित कर रहे हैं । हालांकि, बोन मैरो आला और ब्याज की अन्य साइटों, जैसे दिल और मस्तिष्क को एक साथ नुकसान, इन प्रक्रियाओं के साथ अपरिहार्य है। इस प्रकार, हमारी प्रयोगशाला ने टीबीआई के कारण संभावित दुष्प्रभावों को कम करने या बचने के लिए दो वैकल्पिक तरीके विकसित किए हैं: 1) विकिरण परिरक्षण के साथ अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण और 2) गैर-वातानुकूलित चूहों को दत्तक बीएमटी। परिरक्षित अंगों में, स्थानीय पर्यावरण क्लोनल हेमेटोपोइसिस के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जबकि निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं का कार्य बेफिक्र होता है। इसके विपरीत, गैर-वातानुकूलित चूहों के लिए दत्तक बीएमटी को अतिरिक्त लाभ है कि अंगों के स्थानीय वातावरण और हेमेटोपोइटिक आला दोनों संरक्षित हैं। यहां, हम तीन अलग-अलग हेमेटोपोइटिक सेल पुनर्गठन दृष्टिकोणों की तुलना करते हैं और हृदय रोग में क्लोनल हेमेटोपोइसिस के अध्ययन के लिए उनकी ताकत और सीमाओं पर चर्चा करते हैं।
Introduction
क्लोनल हेमेटोपोइसिस (सीएच) एक ऐसी स्थिति है जो अक्सर बुजुर्ग व्यक्तियों में देखी जाती है और एक विस्तारित हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनकलि कोशिका (एचएसपीसी) क्लोन के परिणामस्वरूप होती है जो आनुवंशिक उत्परिवर्तन1ले जाती है। यह सुझाव दिया गया है कि 50 की उम्र तक, अधिकांश व्यक्तियों ने प्रत्येक एचएसपीसी 2 में औसतन पांच एक्सोनिक म्यूटेशन हासिल कर लिए होंगे, लेकिनइनमेंसे अधिकांश उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप व्यक्ति को कम या कोई फेनोटाइपिक परिणाम नहीं होंगे। हालांकि, यदि संयोग से इन उत्परिवर्तनों में से एक एचएसपीसी को प्रतिस्पर्धी लाभ प्रदान करता है- जैसे कि यह प्रसार, आत्म-नवीकरण, अस्तित्व या इनमें से कुछ संयोजन को बढ़ावा देकर- इससे अन्य एचएसपीसी के सापेक्ष उत्परिवर्ती क्लोन का तरजीही विस्तार हो सकता है। नतीजतन, उत्परिवर्तन तेजी से हेमेटोपोइटिक प्रणाली के माध्यम से फैल जाएगा क्योंकि उत्परिवर्तित एचएसपीसी परिपक्व रक्त कोशिकाओं को जन्म देता है, जिससे परिधीय रक्त के भीतर उत्परिवर्तित कोशिकाओं की एक अलग आबादी होती है। जबकि दर्जनों विभिन्न उम्मीदवार ड्राइवर जीन में उत्परिवर्तन हेमेटोपोइटिक सिस्टम के भीतर क्लोनल घटनाओं से जुड़े हुए हैं, इनमें से डीएनए मिथाइलट्रांसफेरेज 3 अल्फा(DNMT3A)और दस ग्यारह ट्रांसलोकेशन 2(TET2)में उत्परिवर्तन सबसे प्रचलित3हैं । कई महामारी विज्ञान के अध्ययनों में पाया गया है कि जो व्यक्ति इन आनुवंशिक उत्परिवर्तनों को ले जाते हैं,उनमें हृदय रोग (सीवीडी), स्ट्रोक और सभी कारण मृत्यु दर3,4,5,6, 7का खतरा काफी अधिक होता है। हालांकि इन अध्ययनों से यह पहचान की गई है कि सीएच और सीवीडी और स्ट्रोक की बढ़ी हुई घटनाओं के बीच एक संघ मौजूद है, हम नहीं जानते कि यह संबंध उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के साथ कारण या साझा एपिफेनोमेनन है या नहीं। इस संघ की बेहतर समझ हासिल करने के लिए, उचित पशु मॉडल जो सीएच की मानव स्थिति को सही ढंग से पुन: रीकैपिटेट करते हैं, की आवश्यकता होती है।
हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा जेब्राफिश, चूहों औरगैर-मानव वानरों8, 9,10, 11, 12, 13,14का उपयोग करके कई सीएच पशु मॉडलस्थापित किएगए हैं। ये मॉडल अक्सर आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के प्रत्यारोपण द्वारा हेमेटोपोइटिक पुनर्गठन विधियों का उपयोग करते हैं, कभी-कभी क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन या CRISPR प्रणाली का उपयोग करते हैं। यह दृष्टिकोण हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं में एक विशिष्ट जीन उत्परिवर्तन के विश्लेषण के लिए यह आकलन करने की अनुमति देता है कि यह रोग के विकास में कैसे योगदान देता है। इसके अलावा, ये मॉडल अक्सर सामान्य या जंगली प्रकार की कोशिकाओं से उत्परिवर्ती कोशिकाओं के प्रभाव को अलग करने के लिए कॉन्जेनिक या रिपोर्टर कोशिकाओं को नियोजित करते हैं। कई मामलों में, एक पूर्व कंडीशनिंग आहार सफलतापूर्वक दाता हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं को engraft करने के लिए आवश्यक है ।
वर्तमान में, प्राप्तकर्ता चूहों के लिए अस्थि मज्जा के प्रत्यारोपण को दो मुख्य श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: 1) myeloablative कंडीशनिंग और 2) गैर वातानुकूलित प्रत्यारोपण । Myeloablative कंडीशनिंग दो तरीकों में से एक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, अर्थात्, कुल शरीर विकिरण (टीबीआई) या कीमोथेरेपी15। टीबीआई प्राप्तकर्ता को गामा या एक्स-रे विकिरण की घातक खुराक के अधीन करके किया जाता है, तेजी से विभाजित कोशिकाओं के भीतर डीएनए ब्रेक या क्रॉस-लिंक उत्पन्न करता है, जिससे उन्हें अपूरणीय16प्रदान किया जाता है। बुसुलफान और साइक्लोफोस्फामाइड दो आमतौर पर इस्तेमाल कीमोथेरेपी दवाएं हैं जो हेमेटोपोइटिक आला को बाधित करती हैं और इसी तरह तेजी से विभाजित कोशिकाओं को डीएनए क्षति पहुंचाती हैं। मायलोएब्लेटिव प्रीकंडीशनिंग का शुद्ध परिणाम हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं का एपोप्टोसिस है, जो प्राप्तकर्ता की हेमेटोपोइटिक सिस्टम को नष्ट कर देता है। यह रणनीति न केवल दाता HSPCs के सफल engraftment के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी प्राप्तकर्ता की प्रतिरक्षा प्रणाली को दबाने से भ्रष्टाचार अस्वीकृति को रोका जा सकता है । हालांकि, myeloablative प्रीकंडीशनिंग में गंभीर दुष्प्रभाव होते हैं जैसे ऊतकों और अंगों और उनके निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को नुकसान के साथ-साथ देशी अस्थि मज्जा आला17का विनाश। इसलिए, विशेष रूप से ब्याज के अंगों को नुकसान पहुंचाने के संबंध में इन अवांछनीय दुष्प्रभावों को दूर करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का प्रस्ताव किया गया है । इन तरीकों में प्राप्तकर्ता चूहों का परिरक्षित विकिरण और गैर-वातानुकूलित चूहों को दत्तक बीएमटी9,17शामिल हैं । एक सीसा बाधाओं के प्लेसमेंट द्वारा विकिरण से छाती, पेट गुहा, सिर या अन्य क्षेत्रों को बचाना विकिरण के हानिकारक प्रभावों से संरक्षित ब्याज के ऊतकों को रखता है और उनके निवासी प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को बनाए रखता है। दूसरी ओर, गैर वातानुकूलित चूहों के लिए HSPCs के दत्तक BMT एक अतिरिक्त लाभ है क्योंकि यह देशी हेमेटोपोइटिक आला को बरकरार रखता है । इस पांडुलिपि में, हम चूहों में कई प्रत्यारोपण आहार के बाद एचएसपीसी एनग्रफ्टमेंट के प्रोटोकॉल और परिणामों का वर्णन करते हैं, विशेष रूप से टीबीआई चूहों को एचएसपीसी की डिलीवरी, चूहों को आंशिक रूप से विकिरण से परिरक्षित, और गैर-वातानुकूलित चूहों के लिए। समग्र लक्ष्य शोधकर्ताओं को प्रत्येक विधि के विभिन्न शारीरिक प्रभावों को समझने में मदद करना है और साथ ही वे सीएच और हृदय रोग की स्थापना में प्रयोगात्मक परिणामों को कैसे प्रभावित करते हैं।
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Protocol
वर्जीनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा पशु विषयों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी गई है ।
1. प्रीकंडीशनिंग से पहले
- प्राप्तकर्ता चूहों को विकिरण से पहले एंटीबायोटिक-पूरक पानी (5 एमएम सल्फामेथॉक्साजोल, 0.86 m trimethoprim) ~ 24 घंटे पर रखें। संक्रमण को रोकने के लिए यह आवश्यक है, क्योंकि प्रतिरक्षा प्रणाली को विकिरण के बाद दबा दिया जाएगा, और विकिरण के बाद 2 सप्ताह तक बनाए रखा जाएगा। इस बिंदु पर, भोजन को प्रोत्साहित करने और विकिरण के बाद वजन घटाने और निर्जलीकरण को रोकने के लिए पोषण/हाइड्रेशन जेल के साथ चूहों को पूरक करें।
चित्रा 1: विभिन्न प्रीकंडीशनिंग सेटअप दिखाने वाली छवियां। (A)पाई-पिंजरे कुल शरीर विकिरण सेटअप गामा-रे (सीज़ियम-१३७) का उपयोग कर: विकिरण बीम वाई-एक्सिस दिशा (क्षैतिज विकिरण) में विकिरण के पीछे से आता है । (ख)माउस पिंजरे कुल शरीर विकिरण सेटअप एक्स-रे का उपयोग कर: माउस पिंजरे चिंतनशील कक्ष में रखा गया है । विकिरण बीम एक शंकु (ऊर्ध्वाधर विकिरण) के आकार में विकिरण के शीर्ष से आता है। विकिरण स्रोत से पिंजरे की दूरी 530 मिमी है।(सी)एक्स-रे विकिरण में समायोज्य ट्रे: इस सेटअप का उपयोग एक्स-रे का उपयोग करके आंशिक रूप से परिरक्षित विकिरण के लिए किया जाता है। विकिरण बीम एक शंकु (ऊर्ध्वाधर विकिरण) के आकार में विकिरण के शीर्ष से आता है। विकिरण स्रोत से ट्रे तक की दूरी 373 मिमी है, और त्रिज्या 250 मिमी है।(D)छाती-परिरक्षण: एनेस्थेटाइज्ड चूहों को ट्रे पर रखा जाता है। चूहों को हाथ और पैर पूरी तरह से विस्तारित के साथ रीढ़ की स्थिति में एक दूसरे के लिए उलटा रखा जाता है। लीड-शील्ड का निचला सिरा शीफिस्टरनम हड्डी और थाइमस के साथ ऊपरी छोर के साथ गठबंधन किया गया है। (ई)पेट-परिरक्षण: एनेस्थेटाइज्ड चूहों को छाती-परिरक्षण सेट-अप में गुदा के साथ गठबंधन और डायाफ्राम के नीचे ऊपरी छोर के साथ नेतृत्व-परिरक्षण सेट-अप के रूप में रखा जाता है । (एफ)गामा-रे (सीज़ियम-137) का उपयोग करके हेड-परिरक्षण विकिरण सेटअप: एनेस्थेटाइज्ड माउस के फोर्पाव्स को टेप किया जाता है और माउस को शंकु निरोधक में रखा जाता है। काले सीसा ढाल (चिह्नित) माउस के सिर और कान को शामिल किया गया । विकिरण बीम वाई-एक्सिस (क्षैतिज विकिरण) की दिशा में विकिरण के पीछे से आता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
2. प्राप्तकर्ता चूहों की पूर्व शर्त (वैकल्पिक)
- कुल शरीर विकिरण
- एक समान रूप से कटा हुआ पाई-पिंजरे में प्राप्तकर्ता चूहों, या गणना त्रिज्या के भीतर चिंतनशील कक्ष में एक माउस पिंजरे में एक ही विकिरण खुराक प्राप्त करने के लिए जगह; हालांकि, एक समान विकिरण(चित्रा 1ए, बी)सुनिश्चित करने के लिए प्रति पाई-पिंजरे और 5 चूहों प्रति चूहों की अधिकतम सिफारिश की जाती है।
- पूर्ण myeloablation प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि प्राप्तकर्ता चूहों को 4-24 घंटे के अंतराल से अलग दो 5.5 Gy अंशों में 11 Gy की कुल विकिरण खुराक प्राप्त होती है।
नोट: जबकि इष्टतम engraftment अंशों के बीच एक 4 घंटे के अंतराल को लागू करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, यह एक 24 घंटे के अंतराल के लिए बढ़ाया जा सकता है, जो उपयोगी हो सकता है जब श्रम और/या विकिरण अनुपलब्ध है ।
- आंशिक रूप से परिरक्षित विकिरण
- प्राप्तकर्ता चूहों को केटामाइन (80-100 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (5-10 मिलीग्राम/किलो) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटाइज करें। परिरक्षण प्रक्रिया के दौरान लक्षित अंगों की एक समान विकिरण और प्रभावी सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए माउस आंदोलन का संयम महत्वपूर्ण है।
- छाती और पेट परिरक्षण के लिए, एक्स-रे विकिरण के विकिरण बीम को माउस(चित्रा 1C)के लिए खड़ी उन्मुख करें।
- ऊपर से विकिरण स्रोत को केंद्रित करते हुए, एक फ्लैट प्लेट पर एनेस्थेटाइज्ड चूहों को रखें। चूहों को एक दूसरे के लिए उलटा रखें हाथ और पैर पूरी तरह से विस्तारित(चित्रा 1डी, ई)के साथ एक रीढ़ की स्थिति में।
नोट: एक्स-रे विकिरण सुविधा, इस प्रयोग के लिए, अनुमति देता है कि एक समय में दो चूहों प्रभावी त्रिज्या है कि एक समान विकिरण की अनुमति देता है के भीतर तैनात किया जा सकता है । जबकि प्रभावी त्रिज्या विकिरण स्रोत और ट्रे के बीच की दूरी के आधार पर गणना की जाती है, जानवरों की संख्या जिसे एक साथ विकिरणित किया जा सकता है, विशिष्ट विकिरण पर निर्भर करेगा। - चूहों को विकिरण प्रक्रिया के दौरान स्थिर करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए टेप का उपयोग करके प्लेट पर चूहों के पंजे जकड़ें। लीड परिरक्षण रखें ताकि यह सुरक्षा की आवश्यकता वाले क्षेत्रों को कवर करे।
- छाती परिरक्षण के लिए, माउस की xiphisternum हड्डी से थाइमस के लिए लंबाई को मापने और विकिरण के स्रोत से पर्याप्त सुरक्षा प्रदान करेगा कि मोटाई की गणना करके नेतृत्व ढाल तैयार करते हैं । लीड परिरक्षण रखें ताकि निचला छोर xiphisternum हड्डी के साथ संरेखित हो। लीड बैरियर का ऊपरी छोर थाइमस(चित्रा 1डी)के पास फिट होगा।
- पेट परिरक्षण के लिए, माउस के गुदा से डायाफ्राम तक की लंबाई को मापकर और विकिरण के स्रोत से पर्याप्त सुरक्षा प्रदान करने वाली मोटाई की गणना करके लीड शील्ड तैयार करें। लीड परिरक्षण रखें ताकि निचला छोर गुदा के साथ संरेखित हो। लीड शील्ड का ऊपरी छोर डायाफ्राम(चित्रा 1E)के नीचे फिट होगा।
नोट: साथियों के बीच सुसंगत होने के लिए लीड शील्ड का स्थानीयकरण चूहों के आकार के संबंध में कुछ भिन्नता को कम कर सकता है।
- ऊपर से विकिरण स्रोत को केंद्रित करते हुए, एक फ्लैट प्लेट पर एनेस्थेटाइज्ड चूहों को रखें। चूहों को एक दूसरे के लिए उलटा रखें हाथ और पैर पूरी तरह से विस्तारित(चित्रा 1डी, ई)के साथ एक रीढ़ की स्थिति में।
- सिर परिरक्षण के लिए, सीज़ियम विकिरण के विकिरण बीम को क्षैतिज रूप से माउस पर उन्मुख करें।
- ध्यान से पेट के लिए एक एनेस्थेटाइज्ड माउस के forepaws टेप। यह सुनिश्चित करता है कि हथियारों को विकिरण की पूरी खुराक मिलती है और ढाल द्वारा कवर नहीं किए जाते हैं।
- सिर परिरक्षण के लिए, माउस को एक शंकु निरोधक में रखें, जो एक लीड शील्ड के अंदर फिट बैठता है। एक बार माउस शंकु निरोधक के अंदर है, लीड शील्ड(चित्रा 1F)के भीतर स्लॉट में निरोधक स्लाइड। लीड शील्ड को माउस के सिर और कानों (~ 3.2 सेमी) को पूरी तरह से कवर करना चाहिए, जिससे माउस के बाकी शरीर विकिरण के लिए उजागर हो जाते हैं। ढाल के अंदर निरोधक की स्थिति को ढाल के अंदर या बाहर फिसलने से विभिन्न आकार के जानवरों को फिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
- विकिरण के लिए स्रोत के लिए लंबवत, विकिरण के अंदर चूहों रखें।
- चूहों को विकिरण के दो 5.5 Gy अंशों (11 जीवाई की कुल खुराक) को 4-24 घंटे के अंतराल से अलग किया गया।
- प्रत्येक विकिरण अंश के बाद, पिंजरों को गर्म मैट पर या लाल गर्मी लैंप के नीचे एनेस्थेटाइज्ड चूहों के साथ रखें ताकि हाइपोथर्मिया को रोका जा सके और संज्ञाहरण से वसूली में सहायता की जा सके।
नोट: दीपक का उपयोग करते समय एनेस्थेटाइज्ड माउस को ओवरहीट न करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए क्योंकि वे गर्मी से बच नहीं सकते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित है, जानवरों की स्थिति और सीसा ढाल की मोटाई विकिरण (विकिरण प्रकार/बीम की दिशा, आदि) की विशिष्ट विशेषताओं के आधार पर अध्ययनों के बीच भिन्न हो सकती है। शोधकर्ताओं को तदनुसार अपने प्रयोगों को समायोजित करने की आवश्यकता होगी ।
3. हड्डी अलगाव
नोट: आदर्श रूप में, दाता चूहों और प्राप्तकर्ता चूहों उम्र में समान होना चाहिए, और 8-12 सप्ताह के भीतर पुराना होना चाहिए। दानदाताओं के रूप में कम से कम 3 चूहों का उपयोग करना (एकल दाता के बजाय) विषमता के लिए कम करने के लिए पसंद किया जाता है (यहां तक कि जब एक ही जीनोटाइप के साथ चूहों का उपयोग करते हैं)। लगभग, एक माउस की छह हड्डियों (दो फीमर, दो टिबिया, और दो ह्यूमरी) से 40 मिलियन बिना उल्लंघन वाली अस्थि मज्जा कोशिकाओं को प्राप्त किया जा सकता है। प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस के लिए 5 मिलियन बोन मैरो कोशिकाओं का प्रत्यारोपण आमतौर पर एनग्रफ्टमेंट सुनिश्चित करेगा।
- संज्ञाहरण के बिना गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा दाता चूहों इच्छामृत्यु (कोशिकाओं के रासायनिक संदूषण से बचने के लिए पसंदीदा विधि) और प्रत्येक माउस को एक शोषक पैड पर रखें।
- 70% इथेनॉल स्प्रे का उपयोग करके त्वचा को कीटाणुरहित करें।
- रिब पिंजरे के नीचे त्वचा में एक छोटा सा ट्रांसवर्स कट बनाएं और त्वचा को चीरा के दोनों ओर कसकर पकड़ें, सिर और पैरों की ओर विपरीत दिशाओं में आंसू। सभी अंगों से त्वचा को छील लें।
- कंधों और कोहनी के जोड़ों पर काटें, और ह्यूमरी प्राप्त करने के लिए किमवाइप की सहायता से संलग्न मांसपेशियों और संयोजी ऊतकों को हटा दें।
- फीमर और कूल्हे की हड्डियों के बीच कूल्हे के जोड़ों को सावधानी से विस्थापित करें। फीमर सिर के साथ काटने और पैरों को अलग करने के लिए कुंद कैंची का उपयोग करें। फीमर और टिबिया को अलग करने के लिए घुटने के जोड़ पर काटें, और फीमर और टिबिया को फसल करने के लिए किमवाइप की सहायता से संलग्न मांसपेशियों और संयोजी ऊतकों को ध्यान से हटा दें।
नोट: इस चरण के दौरान हड्डी एपिफिसिस को बरकरार रखने के लिए विशेष ध्यान दें। बंध्यता के नुकसान के कारण किसी भी टूटी हुई हड्डियों को त्यागें। फीमर, टिबिया और ह्यूमरस के अलावा कूल्हे की हड्डियों और रीढ़ की हड्डियों को एकत्र किया जा सकता है। रीढ़ की हड्डियों को इकट्ठा करने के लिए, एक मोर्टार और मूसल का उपयोग हड्डियों को टुकड़ों में कुचलने और अस्थि मज्जा कोशिकाओं को फसल करने के लिए किया जा सकता है। - एक ही जीनोटाइप के चूहों से अलग हड्डियों को तदनुसार 50 एमएल शंकु नली में रखें जिसमें 20 एमएल बर्फ-ठंडे बाँझ पीबीएस होते हैं, और इसे आगे के उपयोग तक बर्फ पर रखें। हड्डियों को सही ढंग से मिलान जीनोटाइप के साथ ट्यूबों में रखने के लिए विशेष ध्यान दें।
- प्रत्येक माउस के बीच में प्रत्येक दाता पशु बदलने दस्ताने के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं। इसके अलावा, प्रत्येक माउस के बीच 70% इथेनॉल के साथ साफ कैंची और अन्य उपकरण।
4. बोन मैरो सेल अलगाव
नोट: एक जैवसेफ्टी द्वितीय श्रेणी के मंत्रिमंडल में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें।
- ट्यूब सेट की तैयारी: एक बाँझ 0.5 मिलीएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के नीचे एक 18 जी सुई का उपयोग करके एक छोटा छेद करें और इसे एक बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें, जिसमें नीचे 100 माइक्रोल बर्फ-ठंडे बाँझ पीबीएस शामिल हैं।
नोट: चूंकि केवल छह हड्डियां 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में फिट हो सकती हैं, इसलिए एक ही समय में सभी हड्डियों को संसाधित करने के लिए पर्याप्त ट्यूब सेट तैयार करने की सिफारिश की जाती है। - पीबीएस को एस्पिरेट करें और अलग हड्डियों को बाँझ 100 मिमी सेल कल्चर डिश पर स्थानांतरित करें। प्रत्येक हड्डी को ठीक संदंश का उपयोग करके पकड़े हुए, एक ऑटोक्लेव में निष्फल किए गए छोटे कैंची का उपयोग करके प्रत्येक छोर से एपिफिसिस को सावधानीपूर्वक काट लें। कटी हुई हड्डियों को तैयार ट्यूब सेट में रखें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 35 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
- अपकेंद्रित्र के बाद इस बात की पुष्टि करें कि अस्थि मज्जा को हड्डियों से सफलतापूर्वक हटा दिया गया है। हड्डियों को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के तल पर अपेक्षाकृत बड़े लाल गोली के साथ सफेद और पारदर्शी दिखाई देना चाहिए। 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को छोड़ दें।
नोट: दृश्य निरीक्षण 1.5 एमएल ट्यूब के तल पर अस्थि मज्जा का पता लगाने में विफल रहता है, तो हड्डी को फिर से काटें और चरण 4.3 दोहराएं। - बर्फ-ठंडे पीबीएस के 1 एमएल में बोन मैरो को फिर से खर्च करें, फिर सेल सस्पेंशन को उसी जीनोटाइप से मिलान 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
- कोशिकाओं को 10 एमएल सिरिंज के साथ 18 जी सुई से 10 बार पास करके अलग करें।
- 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से एकल सेल निलंबन फ़िल्टर करें। 10 एमएल की अंतिम मात्रा में अतिरिक्त बर्फ-ठंडे पीबीएस जोड़ें, और पिपेट-सहायता के कोमल उपयोग के माध्यम से कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 310 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- सुपरनेट को एस्पिरेट करें और सीरम-मुक्त आरपीएमआई मीडिया के 10 एमएल के साथ सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। सेल काउंटिंग के लिए इस सामग्री का स्पेयर 30 माइक्रोन।
- सेल काउंटर के साथ सेल एकाग्रता निर्धारित करें, और प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना करें। 100% बीएमटी के उदाहरण के लिए, प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस के लिए 5 x10 6 बोन मैरो कोशिकाओं की आवश्यकता होती है।
नोट: प्रतिस्पर्धी बीएमटी के लिए, कुल 5 x 106 बोन मैरो कोशिकाओं को तैयार करें जिसमें दाता कोशिकाओं (जैसे, सीडी 45.2+)और प्रतियोगी कोशिकाओं (जैसे, सीडी 45.1+)का मिश्रण शामिल है। अतिरिक्त बोन मैरो कोशिकाओं को तैयार करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। उदाहरण के लिए, यदि प्रति प्रायोगिक समूह 10 प्राप्तकर्ता चूहे हैं, तो हम आम तौर पर 12 प्राप्तकर्ता चूहों के लिए पर्याप्त कोशिकाएं तैयार करते हैं। - सेल निलंबन की गणना की मात्रा को एक नए 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 310 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- उपयुक्त सेल घनत्व और मात्रा प्राप्त करने के लिए सीरम-मुक्त आरपीएमआई माध्यम की गणना की गई राशि का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से बढ़ाएं और कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। आमतौर पर, 200 माइक्रोन रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के लिए इष्टतम मात्रा है।
5. विकिरणित चूहों के लिए अस्थि मज्जा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण
- प्राप्तकर्ता चूहों को 5% आइसोफ्लुनाणे के साथ एनेस्थेटाइज करें।
- जबकि चूहों को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है, धीरे-धीरे इंसुलिन सिरिंज के साथ 28-30 जी सुई का उपयोग करके रेट्रो-ऑर्बिटल नस में बोन मैरो कोशिकाओं के 200 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
- वैकल्पिक रूप से, क्रमशः 0.2 मिलील और 25 माइक्रोन की अधिकतम मात्रा के साथ पूंछ नस नसों में इंजेक्शन और फेमोरल इंट्रामेड्री इंजेक्शन द्वारा दाता कोशिकाओं की डिलीवरी करें।
- एक बार कोशिकाओं को इंजेक्शन दिए जाने के बाद, दर्द से राहत के लिए आंखों की सतह पर प्रोपैराकेन युक्त आंखों की बूंदों की एक बूंद रखें। जानवर तो होश में आने की अनुमति दी जा सकती है।
6. गैर वातानुकूलित चूहों के लिए अस्थि मज्जा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण
- प्राप्तकर्ता चूहों को 5% आइसोफ्लुनान की साँस लेने से एनेस्थेटाइज करें।
- 28-30 जी इंसुलिन सिरिंज के साथ गैर-विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों में या तो जीनोटाइप रेट्रो-ऑर्बिटली से 5 x 106 बिना उल्लंघन अस्थि मज्जा कोशिकाओं को इंजेक्ट करें।
- लगातार 3 दिनों में 6.1 और 6.2 चरणों को दोहराएं, जैसे कि प्राप्तकर्ता चूहों को कुल 1.5 x 107 बोन मैरो कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया जाएगा।
नोट: क्योंकि पूर्व कंडीशनिंग प्रक्रिया के बिना दत्तक BMT लगातार 3 दिनों के लिए अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण की आवश्यकता है, एक प्रत्येक इंजेक्शन के लिए वैकल्पिक आंखों का प्रयास करना चाहिए । - इंजेक्शन के बाद, प्रभावित आंखों के लिए प्रोपैराकेन युक्त आंख बूंदों की एक बूंद प्रशासन।
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Representative Results
डोनर सेल एनग्रेफ्टमेंट पर तीन बीएमटी/प्री-कंडीशनिंग विधियों के प्रभाव की तुलना करने के लिए, परिधीय रक्त और हृदय ऊतक में दाता कोशिकाओं के अंशों का विश्लेषण बीएमटी के बाद 1 महीने के बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था । ल्यूकोसाइट्स के विभिन्न सबसेट की पहचान करने के लिए विशिष्ट ल्यूकोसाइट मार्कर के लिए अलग कोशिकाओं को दाग दिया गया था। इन प्रयोगों में, जंगली प्रकार(WT) C57BL/6 (सीडी 45.2) दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं WT B6 को दिया गया । एसजेएल-पीटीपीआरसीएकपीआरपीसीबी/बॉयज(सीडी 45.1) प्राप्तकर्ता की कोशिकाओं से दाता कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्राप्तकर्ता चूहों । फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीतियों का उपयोग पहले वांग एट अल द्वारा अनुपूरक चित्रा 1में9 द्वारा वर्णित किया गया है ।
कुल शरीर विकिरण (टीबीआई) उपचारित समूह को 4 घंटे के अंतराल से अलग दो 5.5 Gy अंशों में 11 Gy की कुल घातक विकिरण खुराक के बाद 5 x 106 अस्थि मज्जा कोशिकाएं प्राप्त हुईं। प्राप्तकर्ता चूहों, मोनोसाइट्स, न्यूट्रोफिल और बी कोशिकाओं के परिधीय रक्त में काफी हद तक एब्लेटेड थे और दाता बोन मैरो-व्युत्पन्न कोशिकाओं की संतान द्वारा प्रतिस्थापित किए गए थे। इसके अलावा, प्राप्तकर्ता चूहों के दिलों में निवासी कार्डियक मोनोसाइट और न्यूट्रोफिल आबादी को लगभग पूरी तरह से दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं(चित्रा 2A)द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था।
आंशिक रूप से परिरक्षित विकिरण समूह में, प्राप्तकर्ता चूहों को एक छाती ढाल के साथ विकिरणित किया गया था और 5 x 106 बोन मैरो कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया था, जो 4 घंटे के अंतराल से अलग दो 5.5 Gy अंशों में 11 Gy की कुल विकिरण खुराक के बाद किया गया था। टीबीआई समूह के विपरीत, हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं का योगदान मामूली था, जो शायद प्राप्तकर्ता चूहों के दिलों में स्थानीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रक्षा करने और परिधीय रक्त से अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न दाता कोशिकाओं की शारीरिक पुनर्आबादी के संयुक्त प्रभाव को दर्शाता है। परिरक्षित क्षेत्रों में प्राप्तकर्ता माउस बोन मैरो कोशिकाओं ने परिधीय रक्त पुनर्गठन में योगदान दिया है, जो टीबीआई उपचारित समूह(चित्रा 2B)की तुलना में परिधीय रक्त में दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रतिशत को कम करता है ।
बीएमटी प्री-कंडीशनिंग (दत्तक बीएमटी) के बिना समूह में, प्राप्तकर्ता चूहों को लगातार 3 दिनों में 5 x 106 बोन मैरो कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया था। बीएमटी के बाद 4 सप्ताह में, परिधीय रक्त और हृदय में दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं का हिस्सा पता लगाने योग्य था। (लगभग 5%) (चित्रा 2C)।
यह समझाने के लिए कि सीएच मॉडल के अध्ययन में दत्तक बीएमटी मॉडल को कैसे लागू किया जा सकता है, सीडी 45.2+ दाता बोन मैरो कोशिकाओं(डब्ल्यूटी या टेट2-/-) को CD45.1+ प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था। कंडीशनिंग के बिना प्राप्तकर्ताओं को लगातार 3 दिनों के लिए प्रत्येक दिन 5 x10 6 अस्थि मज्जा कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया (कुल 1.5 x 107,एन = 5-6 प्रति समूह) के लिए। परिधीय रक्त का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण 4, 8, 12 और 16 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण किया गया था। Tet2-कमी दाता कोशिकाओं को एक प्रतिस्पर्धी लाभ प्रदान की और धीरे से समय के साथ विस्तार; समय के साथ डब्ल्यूबीसी, मोनोसाइट्स, Ly6Cहाय मोनोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं में काफी वृद्धि हुई। Tet2-कमी दाता कोशिकाओं प्राप्तकर्ता चूहों में engrafted की तुलना में, प्राप्तकर्ता चूहों WT दाता कोशिकाओं के साथ engrafted दाता कोशिकाओं के कम महत्वपूर्ण क्लोनल विस्तारदिखाया (चित्रा 3)। क्लोनल हेमेटोपोइसिस के नैदानिक प्रतिमान के अनुरूप, Tet2-कमी कोशिकाओं का विस्तार विभिन्न रक्त कोशिका प्रकार9 (डेटा नहीं दिखाया गया) की पूर्ण संख्या को प्रभावित नहीं करता है।
चित्रा 2: पूर्वकंडीशनिंग के विभिन्न तरीकों का उपयोग करके रक्त और हृदय का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। बोन मैरो प्रत्यारोपण के 1 महीने बाद परिधीय रक्त और हृदय का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया था। प्राप्तकर्ताओं की कोशिकाओं से दाता कोशिकाओं को अलग करने के लिए, CD45.1+ प्राप्तकर्ता चूहों CD45.2+ दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया । (A)5 x 106 बोन मैरो कोशिकाओं को कुल शरीर विकिरण के दो अंशों (2 x 5.5 Gy, 4 h अंतराल, एन = 3) के बाद प्रत्यारोपित किया गया। (ख)5 x 106 बोन मैरो कोशिकाओं को छाती-परिरक्षण (2 x 5.5 Gy, 4 h अंतराल, एन = 10) के साथ कुल शरीर विकिरण के दो अंशों के बाद प्रत्यारोपित किया गया। (ग)बिना कंडीशनिंग प्राप्तकर्ताओं को लगातार 3 दिनों के लिए 5 x 106 बोन मैरो कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया (कुल 1.5 x 107,एन = 4) । डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में व्यक्त किया जाता है। कुल डब्ल्यूबीसी को CD45 + के रूप में परिभाषित किया गयाहै; Ly6G+के रूप में न्यूट्रोफिल्स ; Ly6Cहाय मोनोसाइट्स के रूप में CD115+,Ly6G-और Ly6C+। Ly6Cलो मोनोसाइट्स के रूप में CD115+,Ly6G-और Ly6C- सीडी 45आर+के रूप में बी कोशिकाएं; CD3e + और CD4+ के रूप में CD4+टी कोशिकाओं ; CD3e+ और CD8+ के रूप में CD8+टी कोशिकाओं ; और सीडी 64+, Ly6G - और Ly6Cकेरूप में मैक्रोफेज। (WBCs: सफेद रक्त कोशिकाओं, Neut: न्यूट्रोफिल, मोनो: मोनोसाइट्स, मैक: मैक्रोफेज)। चित्रा 2ए, सी वांग एट अल9से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: गैर वातानुकूलित चूहों के लिए दत्तक BMT का उपयोग कर Tet2-कमी कोशिकाओं के क्लोनल विस्तार । CD45.2+ दाता बोन मैरो कोशिकाओं(WT या Tet2-/-)CD45.1+ प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया । कंडीशनिंग के बिना प्राप्तकर्ताओं को लगातार 3 दिनों के लिए प्रत्येक दिन 5 x10 6 अस्थि मज्जा कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया (कुल 1.5 x 107,एन = 5-6 प्रति समूह) के लिए। परिधीय रक्त का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण 4, 8, 12 और 16 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण के बाद किया गया था। प्रत्येक आबादी में CD45.2+ दाता कोशिकाओं का अंश दिखाया गया है। (ए)डब्ल्यूबीसी(बी)मोनो(सी)Ly6Cहाय मोनो(D)B सेल(ई)टी कोशिकाएं । डेटा को मतलब के रूप में व्यक्त किया जाता है ± एसईएम. डब्ल्यूबीसी को CD45+के रूप में परिभाषित किया गया है; Ly6G+के रूप में न्यूट्रोफिल्स ; Ly6Cहाय मोनोसाइट्स के रूप में CD115+,Ly6G-और Ly6C+। Ly6Cलो मोनोसाइट्स के रूप में CD115+,Ly6G-और Ly6C- सीडी 45आर+के रूप में बी कोशिकाएं; CD3e+ के रूप में CD4+ टी कोशिकाओं(WT:जंगली प्रकार, WBCs: सफेद रक्त कोशिकाओं, मोनो: मोनोसाइट्स) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
क्लोनल हेमेटोपॉयसिस के अध्ययन के लिए, हमने बीएमटी के तीन तरीकों का वर्णन किया: कुल शरीर विकिरण के साथ बीएमटी, आंशिक परिरक्षण के साथ विकिरण के साथ बीएमटी, और कम आमतौर पर उपयोग की जाने वाली बीएमटी विधि जिसमें कोई प्री-कंडीशनिंग (दत्तक बीएमटी) शामिल नहीं है। इन तरीकों का इस्तेमाल हृदय रोग पर क्लोनल हेमेटोपोइसिस के प्रभाव का आकलन करने के लिए किया गया है। शोधकर्ता अपने अध्ययन के विशिष्ट उद्देश्य के अनुरूप इन तरीकों को तदनुसार संशोधित कर सकते हैं।
क्लोनल हेमेटोपोइस मॉडल
क्लोनल हेमेटोपोसिस वह घटना है जिसमें उत्परिवर्ती हेमेटोपोइटिक कोशिकाएं जंगली प्रकार की कोशिकाओं के साथ प्रतिस्पर्धा करती हैं और समय के साथ क्लोनल प्रभुत्व प्राप्त करती हैं। इस प्रतियोगिता का एक मॉडल बनाने के लिए, चूहों को बोन मैरो प्रशासित किया जा सकता है, जिसमें आनुवंशिक रूप से विभिन्न कोशिकाओं का मिश्रण होता है। आम तौर पर, इस मिश्रण में उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार की कोशिकाएं शामिल होंगी, जिन्हें फ्लोरोसेंट टैग या विभिन्न पैन-ल्यूकोसिटे मार्कर (यानी, सीडी 45.1 और सीडी 45.2) के साथ लेबल किया गया है। उदाहरण के लिए, Tet2-मध्यस्थतासीएच की नकल करने वाले मॉडल बनाते समय, हम घातक रूप से विकिरणित प्राप्तकर्ताओं में एक प्रतिस्पर्धी बोन मैरो प्रत्यारोपण करते हैं जिसमें आमतौर पर सीडी 45.1 Tet2+/+ दाताओं से उत्पन्न होने वाली कोशिकाओं का 90% और सीडी 45.2 Tet2से उत्पन्न होनेवालीकोशिकाओं का 10%मिलाना शामिल है । विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके सीडी 45 वेरिएंट का फ्लो साइटोमेट्री डिटेक्शन एक दाता कोशिकाओं (CD45.1-/CD45.2+)को प्रतियोगी कोशिकाओं (CD45.1+ /CD45.2-)से रक्त के भीतर अलग करने में सक्षम बनाता है, और समय के साथ परीक्षण कोशिकाओं की क्लोनल गतिशीलता का आकलन करता है। ऐसा करके, हम Tet2-कमी कोशिकाओं के दाता कल्पना में एक क्रमिक वृद्धि का पालन करने में सक्षम है, जबकि जंगली प्रकार की कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग 10% पर रहते हैं । यह प्रयोगात्मक सेटिंग TET2 दैहिक उत्परिवर्तन वाले व्यक्तियों के मानव परिदृश्य की नकल करती है, क्योंकि ये उत्परिवर्तन शुरू में एचएसपीसी की एक छोटी संख्या द्वारा किए जाते हैं, जो समय के साथ धीरे-धीरे विस्तारित होंगे। एथेरोस्क्लेरोसिस और हार्ट फेलियर के हृदय रोग मॉडल में इस दृष्टिकोण को नियोजित करने से टीईटी 2मध्यस्थता वाले सीएच और सीवीडी 8 , 9,10के बीच संभावित कारण लिंक का दस्तावेजीकरण हुआ है ।
इन दृष्टिकोणों को नियोजित करते समय, शोधकर्ताओं को टीबीआई द्वारा उत्पन्न संभावित भ्रामक प्रभावों को ध्यान में रखना चाहिए। हालांकि प्रत्यारोपण से पहले टीबीआई एचएसपीसी एनग्रेफ्टमेंट की उच्च डिग्री को सक्षम बनाता है, इस प्री-कंडीशनिंग से हेमेटोपोइटिक सिस्टम के बाहर कई अवांछनीय प्रभाव पैदा होंगे। यह प्रलेखित किया गया है कि टीबीआई त्वचा, यकृत, गुर्दे, फेफड़े, अस्थि मज्जा, हृदय, मस्तिष्क, आदि सहित कई अंग प्रणालियों में सूजन, चोट और फाइब्रोसिस का कारण बन सकताहै। ये दुष्प्रभाव अध्ययन के तहत हृदय अंगों को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं, और वे रोग रोगजनकता21, 22को भी बदलदेतेहैं। एक उल्लेखनीय उदाहरण दिल में निवासी मैक्रोफेज पर विकिरण का प्रभाव है। छाती के विकिरण के परिणामस्वरूप कार्डियक-निवासी मैक्रोफेज का एक चिह्नित प्रतिस्थापन होता है जिसमें मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज घूमते हैं। अध्ययनों से पता चला है कि कार्डियक-निवासी मैक्रोफेज मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज परिसंचारी के सापेक्ष अलग विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं जो विकिरण की चोट के बाद दिल में engraft होगा। रोग सेटिंग्स में, हृदय-निवासी मैक्रोफेज को कार्डियोप्रोटेक्टिव भूमिका निभाने के लिए सोचाजाताहै, जबकि चोट और सूजन को बढ़ावा देने के लिए रक्त जनित मैक्रोफेज में घुसपैठ करने की सूचना दी गई है । इसलिए, यह बोधगम्य है कि निवासी हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को रक्त जनित कोशिकाओं के साथ प्रतिस्थापित करने से अध्ययन के तहत रोग प्रक्रियाओं में परिवर्तन होगा, जो हृदय रोग24,25, 26में योगदानदेतेहैं। इसी प्रकार, मस्तिष्क में, टीबीआई के परिणामस्वरूप निवासी माइक्रोग्लिया की कमी होती है और परिधीय रूप से व्युत्पन्न मैक्रोफेज27,28 द्वारा प्रतिस्थापन होताहै। जबकि परिधीय रूप से व्युत्पन्न मैक्रोफेज माइक्रोग्लियल कोशिकाओं की तरह व्यवहार कर सकते हैं, वे मोनोसाइट-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया28की तुलना में एक अद्वितीय कार्यात्मक और ट्रांसक्रिप्शनल पहचान बनाए रखते हैं। इसलिए, यह संभव है कि रोग सीक्वेल को बदल दिया जाए, खासकर जब इस्कीमिक स्ट्रोक जैसी बीमारियों का अध्ययन किया जाए। इन भ्रामक प्रभावों से बचने के लिए, छाती और सिर को बचाने की सिफारिश की जा सकती है। यह लाभप्रद है क्योंकि यह क्रमशः दिल और मस्तिष्क को सुरक्षा प्रदान करता है; और यह भी अपने निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को बरकरार रखता है, बेहतर CH की मानव स्थिति का पुनर्मूल्यांकन । हालांकि, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, टीबीआई प्री-कंडीशनिंग की तुलना में चिमरिज्म की कम दर में परिणाम परिरक्षण, जो अनिवार्य रूप से सभी मेजबान की हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को समाप्त करता है।
पूर्व कंडीशनिंग में एक और महत्वपूर्ण बाधा अस्थि मज्जा आला पर इसका हानिकारक प्रभाव है । यद्यपि बीएम आला के विकिरण-प्रेरित क्षति को एक उप-क्षतक सीमा तक बहाल किया जा सकता है, यह स्पष्ट नहीं है कि इन क्षतिग्रस्त माइक्रोएनवायरमेंट में भोली हेमेटोपोइसिस बरामद की जाती है या नहीं। इसके अलावा, खाली बीएम में मिश्रित एचएसपीसी का प्रत्यारोपण क्लोन के बीच प्रसार के लिए एक दौड़ शुरू करता है, बजाय एक आला के लिए सरल "प्रतियोगिता" जो एक जंगली प्रकार एचएसपीसी द्वारा कब्जा कर लिया जाता है-जो संभवतः सीएच में होता है। इस प्रकार, सीएच का अध्ययन करने के लिए एक संभावित बेहतर दृष्टिकोण दत्तक बीएमटी विधि हो सकती है, जिससे बीएम कोशिकाओं को पूर्व-कंडीशनिंग के बिना प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित कर दिया जाता है। पूर्व कंडीशनिंग विधि के बिना यह दत्तक बीएमटी न्यूनतम रूप से चल रहे भोले हेमेटोपोइसिस को प्रभावित करता है, सबसे ईमानदारी से मनुष्यों में मनाए गए सीएच2 9को फिर से पंजीकरण करता है। चित्रा 2C पूर्व कंडीशनिंग के बिना 1 महीने के बाद प्रत्यारोपण पर कल्पना के स्तर से पता चलता है । जबकि दाता कल्पना इस प्रारंभिक समय बिंदु पर कम है, हम समय के साथ Tet2-कमी क्लोन के एक उत्तरोत्तर बढ़ती अंश मिल जाए, के रूप में चित्रा 3में प्रस्तुत किया । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह मॉडल सबसे उपयोगी है जब उत्परिवर्ती कोशिकाओं को टीईटी 2-कमी कोशिकाओं जैसी होमोस्टेटिक स्थितियों के तहत जंगली प्रकार की कोशिकाओं पर प्रतिस्पर्धी लाभ होता है। जब Tet2-कमी कोशिकाओं को संलग्न किया जाता है, तो विभिन्न ल्यूकोसिट आबादी जैसे न्यूट्रोफिल, मोनोसाइट्स, एनके कोशिकाओं और बी कोशिकाओं में एक चिह्नित विस्तार होता है। टी कोशिकाओं में एक धीमी विस्तार का उल्लेख किया गया था, संभवतः इस आबादी के लंबे आधे जीवन के कारण।
Tet2-कमी कोशिकाओं का विस्तार न केवल परिधीय रक्त में बल्कि बोन मैरो, लिवर और किडनी सहित कई अन्य ऊतकों में भी देखा गया है, जिसमें हेमेटोपोइटिक सेल पुनर्गठन9की विभिन्न गतिशीलता है । उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला के पिछले प्रकाशित कागज WT और Tet2 की कमी दाता कोशिकाओं के अस्थि मज्जा सेल कल्पना वर्णित CD45.1 प्राप्तकर्ता चूहों में संलग्न 8 महीने दत्तक BMT9के बाद । TET2-कमी दाता कोशिकाओं CD45.1 प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित अपरिपक्व वंश पर एक प्रतिस्पर्धी लाभ दिखाया गयाहै-Sca1+सी किट+ (LSK) कोशिकाओं, अल्पकालिक और दीर्घकालिक एचएससी कोशिकाओं, और बहुपॉटेंट जनक (MPPs) की तुलना में है कि WT दाता कोशिकाओं CD45.1 प्राप्तकर्ता प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित । इसके अलावा, Tet2के रूप में -deficienटी दाता सेल प्राप्तकर्ता चूहों engrafted, वे एक उम्र से संबंधित कार्डियोमायोपैथी फेनोटाइप हृदय रोग के कारण एक्सोजेनस कारकों के बिना विकसित, जिससे उम्र बढ़ने वाले मनुष्यों के समान तरीके से क्लोनल हेमेटोपोइसिस के प्रभाव को पुनः बढ़ा दिया जाता है। यह अवलोकन कार्डियक न्यूट्रोफिल और Ly6Cहाय मोनोसाइट्स में चिमरिज्म की बढ़ी हुई डिग्री के साथ था। सामूहिक रूप से, इस दत्तक बीएमटी आहार को भविष्य के अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है जो हृदय रोग विकास और क्लोनल हेमेटोपोइसिस के बीच सहयोग की हमारी समझ को अधिक उन्नत स्तर पर विस्तारित कर सकता है।
संक्षेप में, हमने तीन बीएमटी विधियों का वर्णन किया और सीएच मॉडल उत्पन्न करने में उनके आवेदन पर चर्चा की। सीएच हृदय रोगों जैसे एथेरोस्क्लेरोसिस और दिल की विफलता में गरीब पूर्वानुमान के साथ जुड़ा हुआ है। हालांकि काफी प्रगति की गई है, CH और सीवीडी के बीच कारण संबंधों का अध्ययन अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, और आगे की जांच अनुकूलित पशु मॉडल के उपयोग के माध्यम से आवश्यक हैं । हमें आशा है कि इन प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं बीएमटी, जो हृदय प्रणाली पर संभावित भ्रामक प्रभाव ों को कम से कम की एक और अधिक शारीरिक रूप से उपयुक्त विधि का चयन करने की अनुमति देते हैं, अंततः अध्ययन है कि कैसे CH हृदय रोग के लिए योगदान के बारे में हमारी समझ का विस्तार उपज ।
लीड शील्डिंग का डिजाइन
लीड शील्ड की मोटाई myeloablation को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विकिरण के प्रकार से तय होगी। एक्स-रे या गामा-रे प्रकार के विकिरण का उपयोग अक्सर प्रयोगात्मक माइलोब्लेशन के लिए किया जाता है लेकिन उनकी आवृत्ति, तरंगदैर्ध्य और फोटॉन ऊर्जा के संदर्भ में भिन्न होता है। जब परिरक्षण की बात आती है, तो फोटॉन ऊर्जा, जो उस ऊर्जा या गति का वर्णन करती है जिस पर किरणें यात्रा कर रही हैं, सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर है। आमतौर पर, विकिरण स्रोत एक्स-रे में 160 केवीपी की ऊर्जा होती है जबकि सीज़ियम-137 स्रोत, जो गामा किरणों का उत्सर्जन करते हैं, में 662 केवी की ऊर्जा होती है। इन विकिरण स्रोतों द्वारा उत्सर्जित ऊर्जा उनकी प्रवेश शक्ति के बराबर होती है, जिसमें उच्च ऊर्जा होती है जिसमें अधिक प्रवेश शक्ति होती है। इसलिए, एक्स-रे-आधारित विकिरणों का उपयोग करने की तुलना में सीज़ियम स्रोत-आधारित विकिरणों का उपयोग करते समय लीड शील्ड की अधिक मोटाई की आवश्यकता होती है। एक्स-रे-आधारित विकिरण, जिसका उपयोग हम छाती और पेट परिरक्षण करते समय करते हैं, को पर्याप्त सुरक्षा प्रदान करने के लिए 7 मिमी मोटी लीड शील्ड की आवश्यकता होती है। हालांकि, सीज़ियम 137 स्रोतों के लिए, जिसका उपयोग हम हेड-शील्डिंग करते हैं, पर्याप्त सुरक्षा प्रदान करने के लिए लीड शील्ड को कम से कम 1 इंच मोटा होना चाहिए।
एक्स-रे में उपयोग के लिए लीड शील्ड वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदे जा सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, लीड शीट को या तो जानवर के शरीर के चारों ओर फिट करने के लिए आकार में काटा जा सकता है या एक निरोधक के आसपास फिट करने के लिए (चित्र 1देखें)। सीज़ियम आधारित विकिरण का उपयोग करते समय, सीसा ईंटों, जो काफी मोटे हैं, का उपयोग किया जाना चाहिए और उन कंपनियों द्वारा बनाया जा सकता है जो इस प्रकार की ढाल बनाने में विशेषज्ञ हैं। उदाहरण के लिए, हेडशील्ड के लिए, हम कस्टम एक 50 एमएल शंकु ट्यूब निरोधक पकड़ करने के लिए एक सीसा ईंट डिजाइन (चित्रा 1Fदेखें) । जानवर निरोधक के अंदर फिट करने में सक्षम है, जिसे फिर ईंट में बने छेद में स्लॉट किया जाता है, ताकि विकिरण से 1.5 इंच की सुरक्षा प्रदान की जा सके। महत्वपूर्ण बात, सभी सीसा ढाल या तो पेंट या टेप के साथ लेपित किया जाना चाहिए धूल का नेतृत्व करने के लिए जोखिम को रोकने के लिए, जो विषाक्त हो सकता है ।
उपकरण और उसके मापदंडों के आधार पर, शोधकर्ताओं ने ब्याज की अपनी साइटों के लिए अपने स्वयं के नेतृत्व ढाल डिजाइन कर सकते हैं । यहाँ, हमने छाती, पेट और सिर परिरक्षण शुरू किया; हालांकि, अंग या पार्श्व जैसी अन्य साइटों को भी परिरक्षण के लिए माना जा सकता है। इसके अलावा, जबकि दोनों विकिरण स्रोत (सीज़ियम-137 और एक्स-रे) बोन मैरो एब्लेशन और सफल एनग्रेफ्टमेंट के लिए उपयुक्त हैं, लिम्फोइड और माइलॉयड सेल आबादी के पुनर्गठन में परिवर्तनशीलता सीज़ियम-137 और एक्स-रे विकिरणस्रोतों 30के बीच देखी गई है। इस प्रकार, शोधकर्ताओं को अध्ययन में उपयोग के लिए विकिरण स्रोत के लिए असमान शारीरिक प्रतिक्रियाओं को ध्यान में रखना चाहिए।
डोजिंग अंतराल
खुराक और खुराक अंतराल दाता सेल एनग्रफ्टमेंट और जीवित रहने की दरों की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं। मानव रोगियों में, उच्च खुराक विकिरण इडियोपैथिक इंटरस्टिटियल निमोनिया, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल चोट और मोतियाबिंद के गठन का कारण बन सकता है। माउस मॉडल में, बोन मैरो प्रत्यारोपण के बाद एकल उच्च खुराक विकिरण इसी तरह के परिणाम पैदा कर सकता है और जीवित रहने की दर31को भी प्रभावित कर सकता है। इसलिए, माउस बीएमटी अध्ययनों के लिए आंशिक विकिरण की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, अंशों के डोजिंग अंतराल माउस जीवित रहने की दर और पुनर्गठन दर को प्रभावित कर सकते हैं, जिससे हेमेटोलॉजिकल अंगों के साथ-साथ अन्य ऊतकों में दाता कोशिका कल्पना के विभिन्न अंश31हो सकते हैं। इस प्रकार, शोधकर्ताओं को बीएमटी अध्ययनों के लिए एक आंशिक विकिरण डोजिंग शेड्यूल डिजाइन करने में सावधान रहना चाहिए।
जीवित रहने की दर और प्रतिरक्षा कोशिका पुनर्गठन के संदर्भ में, हमारे छोटे अध्ययन से पता चला है कि चूहों के एक समूह के दो ५.५ Gy एक 24 घंटे अंतराल समूह द्वारा अलग अंश में 11 Gy की एक घातक विकिरण खुराक के साथ कुल शरीर विकिरण प्राप्त करने के समूह समूह है जो एक 4 घंटे के अंतराल पर एक ही टीबीआई खुराक प्राप्त की तुलना में कोई काफी अलग परिणाम था (तालिका 1देखें) । हालांकि, छाती-परिरक्षण बीएमटी के साथ, 24 घंटे अंतराल समूह 4 घंटे अंतराल समूह की तुलना में दाता सेल चिमरिज्म की कम दक्षता दिखाने के लिए दिखाई दिया । इस परिणाम के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि 24 घंटे के अंतराल के साथ विकिरण प्राप्तकर्ता की इम्यूनोसंप्यूटेंट कोशिकाओं को हटाने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है क्योंकि लंबे अंतराल ने प्राप्तकर्ता चूहों को क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की मरम्मत के लिए पर्याप्त समय दिया। इसके अलावा, छाती-परिरक्षण आंशिक रीढ़ की हड्डियों की रक्षा करता है जिसमें प्राप्तकर्ता की एचएससी भी होती है। इस प्रकार, शेष और बरामद इम्यूनोसंप्यूटेंट प्राप्तकर्ता कोशिकाओं ने दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं पर हमला किया हो सकता है और एक परिणाम को प्रेरित किया है जिसने कम एनग्रेफ्टमेंट दक्षता दिखाई है।
| डब्ल्यूबीसी (%) | बी सेल (%) | टी सेल (%) | मोनो (%) | Ly6Cहाय मोनो (%) | Ly6Cलो मोनो (%) | न्यूट्रोफिल (%) | ||
| टीबीआई-बीएमटी | 4h अंतराल | 97.4 ± 1.0 | 100 ± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| 24h अंतराल | 97.2 ± 2.2 | 100 ± 0 | 79.0 ± 8.1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| छाती-परिरक्षण बीएमटी | 4h अंतराल | 56.2 ± 4.0 | 54.2 ± 6.2 | 0.5 ± 0.1 | 66.7 ± 6.1 | 63.8 ± 6.3 | 70.8 ± 5.7 | 82.0 ± 3.8 |
| 24h अंतराल | 34.4 ± 3.1 | 34.8 ± 3.1 | 2.9 ± 1.7 | 45.0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56.2 ± 4.9 | 56 ± 10.0 | |
तालिका 1: विभिन्न डोजिंग अंतराल का उपयोग करके दाता सेल एनग्रफ्टमेंट की दक्षता। बोन मैरो प्रत्यारोपण के 1 महीने बाद परिधीय रक्त का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया था। डब्ल्यूटी CD45.2+ दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं CD45.1+ प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया । 5 x 106 बोन मैरो कोशिकाओं को कुल शरीर विकिरण (2 x 5.5 Gy) के साथ या बिना छाती-परिरक्षण के दो अंशों के बाद प्रत्यारोपित किया गया था जो 4 घंटे के अंतराल या 24 घंटे के अंतराल से अलग होते हैं। (n = 3-4 प्रति समूह)।
पशु देखभाल
इस प्रयोग की सफलता के लिए चूहों से जुड़े कई चरणों की आवश्यकता है। इस प्रकार, निम्नलिखित बिंदुओं पर अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता है: सबसे पहले, सफल एनग्रेफ्टमेंट के लिए व्यवहार्य दाता कोशिकाओं का वितरण महत्वपूर्ण है। एक ठीक से बरकरार बीएम कोशिकाओं और प्राप्तकर्ता चूहों में उनके इंजेक्शन के संग्रह में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए । कोशिकाओं के खराब वितरण के परिणामों में प्राप्तकर्ता बोन मैरो के पुनर्गठन के लिए दाता एचएसपीसी की विफलता शामिल है जिससे मृत्यु दर हो सकती है । दूसरा, संक्रमण से बचने के लिए प्रत्यारोपण के बाद देखभाल की जानी चाहिए, विशेष रूप से myeloablative चिकित्सा के बाद । रोगजनकों के साथ संपर्क घातक हो सकता है, क्योंकि चूहों को विकिरण के बाद क्षणिक रूप से इम्यूनोडिफिशिएंसी हो जाती है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पीने के पानी का पूरक घातक संक्रमण के जोखिम को कम कर सकता है। इसके अलावा, प्राप्तकर्ता जानवरों को पोषण/हाइड्रेशन जेल प्रदान करने से निर्जलीकरण और पोषण की कमी को कम किया जा सकता है जो विकिरण के बाद हो सकता है, क्योंकि विकिरण आंतों के एपिथेलियम को बाधित कर सकता है जिससे दस्त३२हो सकता है । मल बैक्टीरिया संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए पिंजरों को भी अक्सर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, जानवरों को एक उचित पशु हस्तांतरण स्टेशन में संभाला जाना चाहिए, और प्राप्तकर्ता चूहों को वजन घटाने और संकट या दर्द के किसी भी संकेत के लिए सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थानों द्वारा के वाल्श (HL131006, HL138014, और HL132564), एस सानो (HL152174), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान एम ए इवांस (20POST35210098) को समर्थन दिया गया था, और एच ओगावा को जापान हार्ट फाउंडेशन अनुदान ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
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