Summary
骨髄移植(BMT)の3つの方法について、全体照射によるBMT、シールド照射を伴うBMT、マウスモデルにおけるクローナル造頭法の研究のための予備調整なし(養子BMT)を用いたBMT法について述べた。
Abstract
クローン造血は、造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)における体細胞突然変異の蓄積に起因する一般的な年齢関連状態である。細胞の適合性を与えるドライバー遺伝子の突然変異は、体細胞突然変異を抱える子孫白血球をますます生じさせるHSPCクローンの拡大につながる可能性がある。クローン造形は心臓病、脳卒中、死亡率に関連しているため、これらのプロセスをモデル化する実験システムの開発は、この新しい危険因子のメカニズムを理解する鍵です。全身照射(TBI)などのマウスにおける骨髄性調節を伴う骨髄移植手順は、心血管疾患における免疫細胞の役割を研究するために一般的に採用されている。しかし、骨髄ニッチおよび心臓や脳などの関心のある他の部位への同時損傷は、これらの手順では避けられない。このように、私たちの研究室は、TBIによって引き起こされる可能性のある副作用を最小限に抑えるか回避するための2つの代替方法を開発しました:1)照射シールドによる骨髄移植と2)非条件付きマウスへの養子BMT。シールドされた器官では、局所的な環境が保存され、常駐免疫細胞の機能が妨げられていない間、クローン造造りの分析を可能にする。対照的に、非コンディショネートマウスへの導入BMTは、臓器の局所環境と造血ニッチの両方が保存されるという付加的な利点を有する。ここでは、3つの異なる造血細胞再構成アプローチを比較し、心血管疾患におけるクローン造血の研究におけるそれらの強みと限界について議論する。
Introduction
クローン造血(CH)は、高齢の個体で頻繁に観察される状態であり、遺伝子変異を運ぶ造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)クローンの拡大の結果として生じる。50歳までに、ほとんどの個体が各HSPC2で平均5つのエキソン突然変異を獲得することが示唆されているが、これらの突然変異のほとんどは、その個体にほとんどまたは全く触知の結果をもたらすであろう。しかし、偶然にも、これらの突然変異の1つがHSPCに対して競争上の優位性を与える(例えば、HSPCの増殖、自己再生、生存、またはこれらの組み合わせ)が与える場合、これは他のHSPCsに対する変異クローンの優先的な拡大につながる可能性があります。その結果、突然変異したHSPCが成熟した血液細胞を生み出し、末梢血内の突然変異細胞の明確な集団に至るにつれて、突然変異は造血系を通じてますます広がる。数十の異なる候補ドライバ遺伝子の変異が造血系内のクローンイベントと関連している一方、これらの中で、DNAメチルトランスヴァリン酵素3α(DNMT3A)および111個の転座2(TET2)の変異が最も一般的である3。いくつかの疫学的研究では、これらの遺伝子変異を運ぶ個人は、心血管疾患(CVD)、脳卒中、および全因果死亡率のリスクが有意に高いことを発見しました3,4,5,6,7.これらの研究は、CHとCVDと脳卒中の発生率の増加との間に関連が存在することを特定したが、この関係が因果関係であるか、老化プロセスと共通のエピレプションであるかは分からない。この関連を理解するためには、CHの人間の状態を正しく再現する適切な動物モデルが必要です。
ゼブラフィッシュ、マウス、および非ヒト霊長類8、9、10、11、12、13、14を使用して、我々のグループと他の人によっていくつかのCH動物モデルが確立されています。これらのモデルは、しばしば、Cre-lox組換えまたはCRISPRシステムを用いて、遺伝子組換え細胞の移植による造血再構成法を使用する。このアプローチにより、造血細胞における特定の遺伝子変異の分析が、疾患の発症にどのように寄与するかを評価することができます。さらに、これらのモデルは、多くの場合、正常または野生型細胞から変異細胞の効果を区別するために、コンジェニックまたはレポーター細胞を採用しています。多くの場合、ドナー造血幹細胞を正常に生着させるためには、事前調整レジメンが必要です。
現在、骨髄をレシピエントマウスに移植することは、1)骨髄性調節と2)非条件付き移植の2つの主要なカテゴリーに分けることができる。骨髄性調節は、2つの方法、すなわち、全身照射(TBI)または化学療法15のいずれかによって達成することができる。TBIは、レシピエントにガンマまたはX線照射の致死量を照射することによって行われ、急速に分裂した細胞内でDNA切断またはクロスリンクを生成し、それらを取り返しのつかない16にレンダリングする。ブスルファンとシクロホスファミドは、造血ニッチを破壊し、同様に急速に分裂する細胞にDNA損傷を引き起こす2つの一般的に使用される化学療法薬である。骨髄性プレコンディショニングの結果は、レシピ細胞のアポトーシスであり、レシピエントの造血系を破壊する。この戦略は、ドナーHSPの生着を成功させるだけでなく、レシピエントの免疫系を抑制することによって移植片拒絶反応を防ぐこともできる。しかし、骨髄性プレコンディショニングは、組織および器官およびそれらの常駐免疫細胞への損傷ならびに天然骨髄ニッチ17の破壊などの重篤な副作用を有する。したがって、これらの望ましくない副作用を克服する代替方法が提案されているが、特に目的の器官への損傷に関してである。これらの方法は、受容マウスのシールド照射及び非条件マウス9、17への養子BMTを含む。リードバリアの配置による胸郭、腹腔、頭部または他の領域を照射から遮蔽し、照射の有害な影響から保護された目的の組織を維持し、その常駐免疫細胞集団を維持する。一方、非コンディションマウスにHSPCの採用BMCは、天然造血ニッチを維持するため、追加の利点を有する。本稿では、マウスにおけるいくつかの移植レジメン、特にTBIマウスへのHSPCの送達、部分的に照射から遮蔽されたマウス、および非調整マウスへのHSPC生着のプロトコルおよび結果について述べる。全体的な目標は、研究者が各方法の異なる生理学的影響だけでなく、CHと心血管疾患の設定における実験的成果にどのような影響を与えるかを理解するのを助けるものです。
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Protocol
動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア大学の制度的動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 事前調整の前に
- レシピエントマウスを抗生物質補充水(5 mMスルファメトキサゾール、0.86 mMトリメトプリム)~24時間前に照射する。これは、感染を予防するために必要であり、免疫系は照射後に抑制され、照射後2週間維持される。この時点で、栄養/水和ゲルでマウスを補い、摂食を促し、照射後の体重減少や脱水を防ぎます。
図1:さまざまなプリコンディショニングの設定を示す画像。(A)ガンマ線を用いたパイケージ全身照射設定(セシウム-137):放射線ビームは、照射器の背面からy軸方向(水平放射線)から来る。(B)X線を用いたマウスケージ全身照射設定:マウスケージは反射チャンバに配置される。放射ビームは、コーン(垂直放射)の形をした照射器の上部から来ます。放射線源からケージまでの距離は530mm(C)X線照射器の調節可能なトレイ:このセットアップはX線を用いた部分的にシールドされた照射に使用される。放射ビームは、コーン(垂直放射)の形をした照射器の上部から来ます。放射源からトレイまでの距離は373mmで、半径は250mm(D)胸郭シールド:麻酔をかけられたマウスはトレイに置かれる。マウスは、腕と脚を完全に伸ばした後、互いに逆に座り込む。リードシールドの下端は、キシヒステルナム骨と胸腺と上端に揃えられます。(E)腹部シールド: 麻酔付きマウスは、リードシールドの下端がアヌスに合わせ、上端が横隔膜の下に揃えて胸郭シールドセットアップのように配置されます。(F)ガンマ線を用いたヘッドシールド照射設定(セシウム-137):麻酔マウスの前足をテーピングダウンし、マウスを円錐型の拘束剤に配置する。黒いリードシールド(マーク)は、マウスの頭と耳を覆います。放射ビームは、照射器の背面からY軸(水平放射)の方向に向かって照射されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. レシピエントマウスのプレコンディショニング(オプション)
- 全身照射
- 受け取ったマウスを均一にスライスしたパイケージに置くか、計算された半径内の反射チャンバーにマウスケージを置き、同じ照射線量を受け取ります。ただし、均一な照射を確実にするために、パイケージあたり最大8匹のマウスとマウスケージあたり5匹のマウスが推奨されます(図1A,B)。
- 完全な骨髄切れを達成するために、レシピエントマウスは4-24時間間隔で分離された2つの5.5 Gy画分で11 Gyの総放射線量を受け取ることを確認します。
注:分数間の4時間間隔を実装することで最適な生着を得ることができますが、これは24時間間隔に拡張することができ、これは労働および/または照射器が利用できない場合に役立ちます。
- 部分的にシールドされた照射
- ケタミン(80〜100mg/kg)およびキシラジン(5〜10mg/kg)の腹腔内注射によってレシピエントマウスを麻酔する。マウスの動きの拘束は、シールドプロセス中に均一な照射と標的臓器の効果的な保護を確保するために重要です。
- 胸部および腹部遮蔽の場合、X線照射器の放射線ビームをマウスに垂直に向ける(図1C)。
- 麻酔をしたマウスを平らなプレートに配置し、上から放射線源を中心に配置します。腕と脚を完全に伸ばした後、互いに反転したマウスを、両端を上に置きます(図1D,E)。
注:X線照射器施設は、この実験のために、一度に2匹のマウスを均一な照射を可能にする有効半径内に配置することを可能にする。有効半径は放射線源とトレイの距離に基づいて計算されますが、同時に照射できる動物の数は特定の照射器によって異なります。 - マウスの足をテープでプレートに固定し、照射手順中にマウスが固定化されるようにします。保護が必要な領域をカバーするように、鉛シールドを配置します。
- 胸部シールドの場合、マウスのキシスターナム骨から胸腺までの長さを測定し、照射源から十分な保護を提供する厚さを計算して、リードシールドを準備します。下端がキシヒステルナム骨に合うようにリードシールドを配置します。リードバリアの上端は胸腺の近くに収まります(図1D)。
- 腹部のシールドのために、マウスのアヌスから横隔膜までの長さを測定し、照射源から十分な保護を提供する厚さを計算することによって、リードシールドを準備します。リードシールドを配置して、下端がアヌスと揃うようにします。リードシールドの上端はダイヤフラムの下に収まります(図1E)。
注: コホート間で一貫性のあるリードシールドをローカライズすると、マウスのサイズに関してある程度の変動が減少する可能性があります。
- 麻酔をしたマウスを平らなプレートに配置し、上から放射線源を中心に配置します。腕と脚を完全に伸ばした後、互いに反転したマウスを、両端を上に置きます(図1D,E)。
- ヘッドシールドの場合は、セシウムの放射ビームをマウスに水平に向けます。
- 麻酔付きマウスの前足を腹部に慎重にテープで貼ります。これにより、腕は完全な照射を受け、シールドで覆われないようにします。
- ヘッドシールドの場合は、リードシールドの内側に収まる円錐型の拘束器にマウスを置きます。マウスが円錐型の拘束器の内側に入ったら、リードシールド内のスロットに拘束器を差し込みます(図1F)。リードシールドは、マウスの頭部と耳(約3.2cm)を完全に覆い、残りのマウスの体を照射のために露出させる必要があります。シールド内部の拘束剤の位置は、シールドの内側または外側にさらにスライドさせることによって、異なるサイズの動物に合うように調整することができます。
- 照射器の内側にマウスを置き、照射源に垂直に置く。
- マウスを4~24時間間隔で分離した2つの5.5 Gy分光(合計11 Gyの線量)に曝露する。
- 各照射分数の後、加熱されたマットの上または赤いヒートランプの下に麻酔をしたマウスでケージを置き、低体温症を防ぎ、麻酔からの回復を助けます。
注:ランプを使用する場合は、熱を逃れることができないため、麻酔マウスを過熱しないように注意してください。前述のように、動物の位置決めと鉛シールドの厚さは、照射器の特定の特徴(ビームの放射タイプ/方向など)に基づいて研究によって異なる場合があります。研究者はそれに応じて実験を調整する必要があります。
3. 骨の分離
注:理想的には、ドナーマウスとレシピエントマウスは、年齢が8〜12週以内に似ているはずです。少なくとも3匹のマウスをドナーとして使用する(単一ドナーではなく)不均一性を最小限に抑えることが好ましい(同じ遺伝子型のマウスを用いた場合でも)。1匹のマウスの6つの骨(2つの大腿骨、2つの脛骨、2つの上腕骨)から約4000万個の未分離骨髄細胞を得ることができる。500万個の骨髄細胞を各レシピエントマウスに移植することは、通常、生着を保証する。
- 麻酔をせずに子宮頸部脱臼(細胞の化学的汚染を避ける好ましい方法)によってドナーマウスを安楽死させ、各マウスを吸収パッドに置く。
- 70%エタノールスプレーを使用して皮膚を消毒する。
- 小さな横方向を肋骨ケージの下の皮膚に切り取り、切開の両側で皮膚をしっかりと保持し、頭と足に向かって反対方向に引き裂きます。すべての手足から皮膚を剥がします。
- 肩と肘の関節を切り取り、キンワイプの助けを借りて取り付けられた筋肉と結合組織を取り除き、上腕取りを得る。
- 大腿骨と股関節の間の股関節を慎重に外します。大腿骨の頭に沿ってカットし、脚を取り外すために鈍いはさみを使用してください。膝関節を切って大腿骨と脛骨を分離し、キムワイプの助けを借りて取り付けられた筋肉と結合組織を慎重に取り除き、大腿骨と脛骨を収穫する。
注:このステップ中に骨の骨の状態をそのまま維持するために特別な注意を払ってください。無菌性の損失による骨折を捨てます。股関節の骨や脊椎の骨は、大腿骨、脛骨、上腕骨に加えて収集することができます。脊椎骨を収集するには、モルタルと害虫を使用して骨を粉々に粉砕し、骨髄細胞を収穫することができます。 - 同じ遺伝子型のマウスから単離された骨を、20 mL氷冷滅菌PBSを含む50mLの円錐状チューブに入れ、さらに使用するまで氷の上に保管します。一致した遺伝子型を持つチューブに骨を正しく配置するために特別な注意を払ってください。
- 各マウスの間に各ドナー動物の変更手袋について上記の手順を繰り返します。また、各マウスの間に70%エタノールを使用して、清潔なはさみや他の器具。
4. 骨髄細胞の分離
メモ:バイオセーフティクラスIIキャビネットで次の手順を実行します。
- チューブセットの準備:18G針を使用して無菌0.5 mLマイクロ遠心分離管の底に小さな穴を開け、底部に100 μLの氷冷滅菌PBSを含む無菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。
注:6つの骨だけが0.5 mLマイクロ遠心分離管に収まるので、すべてのボーンを同時に処理するのに十分なチューブセットを準備することをお勧めします。 - PBSを吸引し、単離した骨を無菌100mm細胞培養皿に移す。細かい鉗子を使用して各骨を保持し、慎重にオートクレーブで滅菌された小さなはさみを使用して各端から骨端を切断します。準備したチューブ セットに切断したボーンを配置します。
- 4°Cで 35s の10,000 x gでチューブを遠心分離します。
- 遠心分離後、骨から骨髄が正常に除去されたことを確認します。骨は、1.5 mLマイクロ遠心チューブの下部に比較的大きな赤いペレットで白と半透明に表示される必要があります。0.5 mLマイクロ遠心チューブを廃棄します。
注: 目視検査で 1.5 mL チューブの下部にある骨髄の検出に失敗した場合は、ボーンを再度切断し、ステップ 4.3 を繰り返します。 - 骨髄を氷冷PBSの1mLで再懸濁し、同じ遺伝子型から一致した50 mL円錐形チューブに細胞懸濁液を移す。
- 細胞を18Gの針に10mLの注射器で10回通して解約する。
- 70 μmのセルストレーナーを通して単一細胞の懸濁液をフィルターします。10 mLの最終体積に追加の氷冷PBSを追加し、ピペットエイドの穏やかな使用を通じて細胞を再中断します。
- 遠心分離機 310 x g で 4 °C で 10 分間
- 上清を吸引し、細胞ペレットを10 mLの無血清RPMI培地で再懸濁する。セルカウント用にこの材料の30 μLをスペアします。
- 細胞カウンターで細胞濃度を決定し、移植に必要な細胞懸濁液の量を計算する。100%BMTの例では、各レシピエントマウスに5 x 106骨髄 細胞が必要です。
注:競合するBMTの場合は、ドナー細胞(例えば、CD45.2+)および競合細胞(例えば、CD45.1+)の混合物を含む合計5 x 106骨髄細胞を調製する。余分な骨髄細胞を準備することは強くお勧めします.例えば、実験群ごとに10匹のレシピエントマウスがある場合、我々は通常、12匹のレシピエントマウスに十分な細胞を準備する。 - 計算されたセル懸濁液の体積を新しい50 mL円錐形チューブに移します。遠心分離機 310 x g で 4 °C で 10 分間
- 上清を吸引し、計算された無血清RPMI培地量を用いて細胞を再懸濁し、適切な細胞密度および体積を達成する。通常、200 μL は、レトロ軌道射出に最適なボリュームです。
5. 照射マウスへの骨髄細胞の移植
- 5%のイオブルランでレシピエントマウスを麻酔する。
- マウスは麻酔を受けているが、インスリン注射器を用いた28~30G針を用いて、200μLの骨髄細胞をレトロ軌道静脈にゆっくりと注入する。
- あるいは、尾静脈静脈注射および大腿骨内髄内注射によりドナー細胞の送達を行い、最大体積はそれぞれ0.2mL及び25μLである。
- 細胞が注入されたら、痛みを和らげるために、プロパラカイン含有点眼薬を目の表面に滴下します。その後、動物は意識を取り戻すことができます。
6. 無条件マウスへの骨髄細胞移植
- 5%イオブルランを吸入することにより、レシピエントマウスを麻酔する。
- 5 x 106 の未分離骨髄細胞を、28~30 G のインスリン注射器を用いて、いずれかの遺伝子型からレトロ軌道上に非照射されたレシピエント マウスに注入します。
- 3日間連続してステップ6.1と6.2を繰り返し、レシピエントマウスを合計1.5 x 107骨髄 細胞で移植する。
注:事前調整手順のない養子のBMTは3日間連続して骨髄移植を必要とするため、注射ごとに目を交互に試みる必要があります。 - 注射後、プロパラカイン含有点眼薬の滴を罹患した眼に投与する。
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Representative Results
ドナー細胞の生着に対する3つのBMT/プレコンディショニング方法の効果を比較するために、末梢血および心臓組織におけるドナー細胞の分画を、1ヶ月後のBMT後のフローサイトメトリーによって分析した。特定の白血球マーカーについて分離細胞を染色し、白血球の異なるサブセットを同定した。これらの実験では、野生型(WT)C57BL/6(CD45.2)ドナー骨髄細胞をWT B6に送達した。SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) レシピエントマウスは、ドナー細胞とレシピエントの細胞を区別する。使用されたフローサイトメトリーの測定法は、前に、補足図1のWang et al.9で説明した。
全体照射(TBI)処置群は、4時間間隔で分離された2つの5.5 Gy画分において11Gyの総致死量量に続いて5 x106骨髄細胞を受けた。レシピエントマウスの末梢血において、単球、好中球、およびB細胞は、主に失禁し、ドナー骨髄由来細胞の子孫に置換された。また、レシピエントマウスの心臓内の常駐性単球および好中球集団は、ドナー由来細胞にほぼ完全に置換された(図2A)。
部分的にシールドされた照射群では、レシピエントマウスに胸郭シールドを照射し、4時間間隔で分離された2つの5.5 Gy画分で11Gyの総放射線量に続いて5 x 106骨髄細胞を移植した。TBI群とは対照的に、ドナー由来細胞の心臓免疫細胞への寄与は控えめであり、これはおそらくレシピエントマウスの心臓における局所免疫細胞を保護することと、末梢血からの骨髄由来ドナー細胞の生理学的再集団化の組み合わせ効果を反映していた。シールド領域におけるレシピエントマウス骨髄細胞も末梢血再構成に寄与している可能性が高く、これはTBI処置群と比較して末梢血中のドナー由来細胞の割合を減少させる(図2B)。
BMT予備調整(養子BMT)を含まない群では、レシピエントマウスを3日間連続して5 x 106骨髄細胞で移植した。BMT後4週間で、末梢血および心臓におけるドナー由来細胞の部分を検出可能とした。(約5%)(図2C)。
採用したBMTモデルをCHモデルの研究に適用する方法を説明するために、CD45.2+ドナー骨髄細胞(WTまたはTet2-/-)をCD45.1+レシピエントマウスに移植した。コンディショニングを行わないレシピエントは、3日間連続して毎日5 x 106個の骨髄細胞を移植した(合計1.5 x 10 7、n=5〜6個のグループ)。末梢血のフローサイトメトリック解析は、移植後4、8、12、および16週行った。Tet2欠損ドナー細胞は競争上の優位性を与え、徐々に拡大し、徐々に拡大した。WBCs、単球、Ly6Cハイ単球、好中球、T細胞、およびB細胞は、時間の経過とともに有意に増加した。レシピエントマウスに生着したTet2欠損ドナー細胞と比較して、WTドナー細胞を有するレシピエントマウスはドナー細胞の有意なクローン拡張をあまり有意に示さなかった(図3)。クローン造血の臨床パラダイムと一致して、Tet2欠損細胞の拡張は、種々の血球型9の絶対数に影響を与えない(データは示さない)。
図2:血液と心臓のフローサイトメトリック分析は、プレコンディショニングの異なる方法を用いた。末梢血および心臓のフローサイトメトリック解析を、骨髄移植後1ヶ月間行った。ドナー細胞とレシピエント細胞を区別するために、CD45.1+レシピエントマウスをCD45.2+ドナー骨髄細胞で移植した。(A)5x 106骨髄細胞を全体照射の2画分(2x5.5Gy、4時間間隔、n=3)に続いて移植した。(B)5×106骨髄細胞を、胸郭シールド(2 x 5.5 Gy、4時間間隔、n=10)で全体照射の2分の1に続いて移植した。(C)コンディショニングを行わないレシピエントを、3日間連続して5 x 106骨髄細胞で移植した(合計1.5 x 10 7、n=4)。データは平均± SEM. 合計 WBC は CD45+として定義されます。Ly6Gとしての好中球+;Ly6CはCD115+として単球をハイ , Ly6G-, Ly6C+;LY6Clo単球として CD115+, Ly6G-, Ly6C-;CD45RとしてのB細胞+;CD4+ T 細胞として CD3e+および CD4+;CD8+ T 細胞として CD3e+および CD8+;とマクロファージとして CD64+, Ly6G-, Ly6C-.(WBC:白血球、中性球:好中球、モノ:単球、マック:マクロファージ)。図2A,CはWangら 9から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:非コンディショニングマウスに対する養子BMTを用いたTet2欠損細胞のクローン拡張CD45.2+ドナー骨髄細胞(WTまたはTet2-/-)をCD45.1+レシピエントマウスに移植した。コンディショニングを行わないレシピエントは、3日間連続して毎日5 x 106個の骨髄細胞を移植した(合計1.5 x 10 7、n=5-6グループ)。末梢血のフローサイトメトリック解析は、移植後4、8、12、および16週間後に行った。各集団におけるCD45.2+ドナー細胞の割合が示されている。(A) BPC (B) モノラル (C) Ly6Cハイモノ (D) B セル (E) T 細胞データは平均± SEM として表現され、WBCs は CD45+ として定義されます。Ly6Gとしての好中球+;Ly6CはCD115+として単球をハイ , Ly6G-, Ly6C+;LY6Clo単球として CD115+, Ly6G-, Ly6C-;CD45RとしてのB細胞+;CD3eとしてCD4+ T細胞 +(WT:野生型, WBCs: 白血球, モノ: 単球)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください.
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Discussion
クローン造造の研究では、総ボディ照射を伴うBMT、部分シールドによる照射を伴うBMT、およびプレコンディショニングを伴わないあまり一般的に使用されないBMT法(養子BMT)の3つの方法について説明した。これらの方法は、クローン造造が心血管疾患に及ぼす影響を評価するために使用されてきた。研究者は、研究の特定の目的に合わせてこれらの方法を変更することができます。
クローン造造機モデル
クローン造血は、突然変異造血細胞が野生型細胞と競合し、時間の経過とともにクローン性優位を得る現象です。この競争のモデルを作成するために、マウスは、遺伝的に異なる細胞の混合物からなる骨髄を投与することができる。一般的に、この混合物は、蛍光タグまたは異なる汎白血球マーカー(すなわち、CD45.1およびCD45.2)で標識された変異型および野生型細胞を含むであろう。例えば、Tet2-mediaedCHを模倣するモデルを作成する場合、CD45.1 Tet2++ドナーから生まれた細胞の90%とCD45.2 Tet2--、Tet2 +/-または制御Tet2+8+++を混合することを含む致死的に照射されたレシピエントへの競合的な骨髄移植を行う。特定のモノクローナル抗体を用いたCD45変異体のフローサイトメトリー検出により、血液中の競合細胞(CD45.1+/CD45.2)からドナー細胞(CD45.1-/CD45.2+)を区別し、試験細胞のクローンダイナミクスを経時に評価することができます。そうすることで、Tet2型欠損細胞のドナーキメラリズムの漸進的増加を観察することができ、野生型細胞の割合は約10%にとどまっています。この実験設定は、TET2体細胞突然変異を担う個体の人間のシナリオを模倣しており、これらの突然変異は当初少数のHSPPCによって運ばれ、時間の経過とともに徐々に拡大する。アテローム性動脈硬化症および心不全の心血管疾患モデルにおいてこのアプローチを採用することは、Tet2-介在CHおよびCVD8、9、10との間の潜在的な因果関係の文書化につながっている。
これらのアプローチを採用する場合, 研究者は、TBI によって生成される可能性のある交論効果を考慮する必要があります。.移植前のTBIは高度なHSPC生着を可能にするが、この事前調整は造血系外のいくつかの望ましくない影響をもたらす。TBIは、皮膚、肝臓、腎臓、肺、骨髄、心臓、脳などの多臓器系において炎症、傷害、および線維症を引き起こす可能性が文書化されている。これらの副作用は、研究中の心血管器官に悪影響を及ぼし、疾患病態21,22を変化させる。顕著な例は、心臓の居住マクロファージに対する照射の効果である。胸郭の照射は、循環単球由来マクロファージに心臓居住マクロファージの顕著な置換をもたらす。研究は、心臓居住者マクロファージは、放射線損傷後に心臓に生着する循環単球由来マクロファージに対して明確な特性を示すことを示している。疾患の設定では、心臓居住者マクロファージは心保護的な役割を果たすと考えられているが、血液媒介マクロファージの浸潤は傷害および炎症を促進すると報告されている。従って、常駐心臓免疫細胞を血液媒介細胞に置き換えることは、研究中の病理学的プロセスを変えることと考えられる。同様に、脳において、TBIは、末梢由来マクロファージ27、28による居住ミクログリアおよび置換の枯渇をもたらす。末梢由来マクロファージはミクログリア細胞のように振る舞うことができるが、それらは単球由来ミクログリア28と比較して独特の機能的および転写的同一性を維持する。したがって、特に虚血性脳卒中などの疾患を研究する場合に、後遺症が変化する可能性がある。これらの交交する効果を避けるために、胸部と頭部を遮蔽することを推奨できる。これは、それぞれ心臓と脳に保護を提供するので有利です。また、その常駐免疫細胞をそのまま維持し、CHの人間の状態をよりよく再現します。しかし、前述のように、シールドはTBIプレコンディショニングと比較してキメラリズムの割合が低くなり、本質的に宿主の造血細胞はすべて排除される。
プレコンディショニングにおけるもう一つの重要な障害は、骨髄ニッチに対する有害な影響である。BMニッチの照射による損傷は最適でない程度に回復することができるが、これらの損傷した微小環境でナイーブ造成が回復するかどうかは不明である。さらに、混合HSpfcを空のBMに移植すると、野生型HSPCによって占有されているニッチ(おそらくCHで起こる)のための単純な「競争」ではなく、クローン間の増殖の競争が始まる。したがって、CHを研究するための潜在的に好ましいアプローチは、BMT法を採用し、それによってBM細胞がプレコンディショニングなしでレシピエントマウスに移される。この導入済みBMTは、事前調整法を用いない場合、進行中のナイーブ造成に最小限の影響を及ぼし、ヒト29で観察されるCHを最も忠実に再現する。図2Cは、プレコンディショニングを行わない1ヶ月の移植後のキメラリズムのレベルを示す。ドナーのキメラリズムはこの初期の時点では低いが、図3に示すように、時間の経過とともにTet2欠損クローンの割合が徐々に増加していることがわかります。このモデルは、変異細胞がTet2欠損細胞などのホメオスタティック状態下で野生型細胞よりも競争上の優位性を有する場合に最も有用である。Tet2欠損細胞が生着すると、好中球、単球、NK細胞、B細胞などの様々な白血球集団に顕著な増殖が見られます。T細胞では、おそらくこの集団の半減期が長いため、より遅い増殖が指摘された。
Tet2欠損細胞の増殖は、末梢血だけでなく、骨髄、肝臓、腎臓を含むいくつかの他の組織においても、造血細胞再構成の異なるダイナミクスを有する9で観察されている。例えば、我々の研究室の以前に発表された論文は、移植BMT 9の8ヶ月後にCD45.1レシピエントマウスに生着したWTおよびTet2欠損ドナー細胞の骨髄細胞キメラリズムについて説明した。CD45.1レシピエントマウスに移植されたTet2欠損ドナー細胞は、未熟な系統(Sca1+c-Kit+(LSK)細胞、短期および長期HSC細胞、および多能性前駆細胞(MpP)と比較して、CD45.1レシピエントマウスに移植されたWTドナー細胞と比較して競争上の優位性を示している。また、Tet2-欠損tドナー細胞を生着させたマウスとして、心臓機能障害を引き起こす外因性因子を伴わない加齢性心筋症表現型を発症し、それによって、ヒトの老化と同様の方法で血球造血の効果を再現する。この観察は、心臓好中球およびLy6Cハイ単球におけるキメラリズムの程度の増加を伴った。総称して、この養子BMTレジメンは、心血管疾患の発症とクローン造液との関連をより高度なレベルで理解を深めることができる将来の研究に適用することができる。
要約すると、我々は3つのBMTメソッドを説明し、CHモデルを生成する際のその応用について議論した。CHは、アテローム性動脈硬化症や心不全などの心血管疾患における予後が悪いと関連している。かなりの進歩が見られましたが、CHとCVDの因果関係の研究はまだ初期段階にあり、最適化された動物モデルを使用してさらなる調査が必要です。これらのプロトコルは、研究者が心血管系に対する潜在的な交和効果を最小限に抑えるBMTのより生理学的に適切な方法を選択することを可能にし、最終的にはCHが心血管疾患にどのように寄与するかについての理解を広げる研究を生み出すことを望む。
鉛シールドの設計
リードシールドの厚さは、骨髄切れを誘導するために使用される照射の種類によって決まります。X線またはガンマ線の種類の放射線は、実験的な骨髄切れによく使用されますが、周波数、波長、光子エネルギーの点で異なります。遮蔽に関しては、光線が進行するエネルギーまたは速度を表す光子エネルギーが最も重要なパラメータです。一般的に、放射線源X線は160kVpのエネルギーを有し、セシウム-137源はガンマ線を放出し、662 KeVのエネルギーを有する。これらの放射源から放出されるエネルギーは、その貫通力に相当し、より高いエネルギーは、より大きな浸透力を有する。したがって、X線ベースの照射器を使用する場合と比較してセシウム源ベースの照射器を使用する場合は、鉛シールドの厚さが必要です。胸郭や腹部遮蔽を行う際に使用するX線系照射には、厚さ7mmのリードシールドが必要です。しかし、ヘッドシールドを行う際に使用するセシウム137ソースでは、十分な保護を提供するためにリードシールドを少なくとも1インチの厚さにする必要があります。
X線照射器で使用するための鉛の盾は商業ベンダーから購入することができる。あるいは、リードシートを、動物の体の周りに収まるサイズに、または拘束剤の周りに収まるようにカットすることもできます( 図1参照)。セシウムベースの照射器を使用する場合、かなり厚い鉛レンガを使用する必要があり、これらのタイプのシールドを作ることに特化した企業によってカスタムメイドすることができます。たとえば、ヘッドシールドの場合、50 mLの円錐状チューブの抑制剤を保持するように鉛レンガをカスタム設計しました( 図1Fを参照)。動物は、照射から保護の1.5インチを提供するために、レンガで作られた穴にスロットされる拘束剤の中に収まるようにすることができます。重要なことに、すべての鉛シールドは、有毒である可能性のある鉛ダストへの暴露を防ぐために、塗料またはテープでコーティングする必要があります。
機器とそのパラメータに基づいて、研究者は関心のあるサイトのために独自のリードシールドを設計することができます。ここでは胸郭、腹部、および頭部シールドを導入しました。ただし、リムや側面などの他の部位も同様にシールドを考慮することができます。また、両方の放射線源(セシウム-137およびX線)は骨髄アブレーションと成功した生着に適しているが、セシウム-137とX線照射源30との間にはリンパ様および骨髄細胞集団の再構成における変動が認められている。したがって、研究者は、研究で使用するための放射線源に対する異なる生理学的応答を考慮する必要があります。
ドージング間隔
投与量および投与間隔は、ドナー細胞の生着および生存率の効率に影響を及ぼす可能性がある。ヒト患者では、高線量照射は特発性間質性肺炎、胃腸障害、白内障形成を引き起こす可能性がある。マウスモデルでは、単一の高線量照射に続いて骨髄移植が行われ、同様の結果を生じることができ、生存率31にも影響を及ぼす可能性がある。そのため、分画照射はマウスBMT研究に強く推奨される。また、分画の分数の添加間隔はマウスの生存率および再構成率に影響を及ぼし、他の組織31と同様に、造型器官におけるドナー細胞キメラリズムの異なる画分を導く。したがって、研究者は、BMT研究のための分画照射ドージングスケジュールを設計する際に注意する必要があります。
生存率と免疫細胞再構成の文脈において、我々の小さな研究は、24時間間隔群で分離された2つの5.5Gy画分で11Gyの致死放射線量で総体照射を受けたマウスのグループが、4時間間隔で同じTBI投与量を受けた群と有意に異なる結果を示さなかったことを示した( 表1参照)。しかし、胸郭シールドBMTでは、24時間間隔群は、4時間間隔群と比較してドナー細胞キメラリズムの効率が低いように見えた。この結果の考えられる説明は、24時間間隔での照射は、長い間隔が損傷した細胞を修復するのに十分な時間を受け取ったマウスを受け取るマウスを与えたので、レシピエントの免疫担当細胞を除去するのに十分ではなかった可能性があるということです。さらに、胸郭シールドは、受信者のHSCを含む部分的な脊椎骨を保護します。したがって、残りおよび回復した免疫担当レシピエント細胞は、ドナー由来細胞を攻撃し、より低い生着効率を示す結果を誘導した可能性がある。
| WBC (%) | Bセル (%) | Tセル (%) | モノ (%) | Ly6Cハイ モノ (%) | Ly6Cロ モノ (%) | 好中球 (%) | ||
| TBI-BMT | 4時間間隔 | 97.4 ± 1.0 | 100 ± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| 24時間間隔 | 97.2 ± 2.2 | 100 ± 0 | 79.0 ± 8.1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| 胸郭シールドBMT | 4時間間隔 | 56.2 ± 4.0 | 54.2 ± 6.2 | 0.5 ± 0.1 | 66.7 ± 6.1 | 63.8 ± 6.3 | 70.8 ± 5.7 | 82.0 ± 3.8 |
| 24時間間隔 | 34.4 ± 3.1 | 34.8 ± 3.1 | 2.9 ± 1.7 | 45.0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56.2 ± 4.9 | 56 ± 10.0 | |
表1:異なる注入間隔を用いたドナー細胞生着の効率。末梢血のフローサイトメトリック解析を、骨髄移植後1ヶ月間行った。WTCD45.2+ドナー骨髄細胞をCD45.1+レシピエントマウスに移植した。5 x 106骨髄細胞は、4時間間隔または24時間間隔で分離した胸郭シールドの有無にかかわらず、全体照射の2つの画分(2 x 5.5 Gy)に続いて移植した。(n = グループあたり 3 – 4)。
動物ケア
この実験を成功させるためには、マウスを含む複数のステップが必要です。したがって、次の点で特別な注意が必要です:まず、生存可能なドナー細胞の送達は、生着の成功のために重要です。1つは、無傷のBM細胞の収集およびレシピエントマウスへの注射において適切に訓練されるべきである。細胞の不十分な送達の結果としては、ドナーHSPCが死亡をもたらすレシピエント骨髄を再構成できなかったことが含まれる。第二に、特に骨髄性療法に続いて、感染を避けるために移植後に注意を払わなければならない。マウスが照射後に一過性免疫不全になるため、病原体との接触は致命的であり得る。上記のように、抗生物質で飲料水を補うことは、致命的な感染のリスクを下げる可能性があります。さらに、レシピエント動物に栄養/水和ゲルを与えることにより、照射後に起こり得る脱水および栄養不足を最小限に抑えることができ、照射は下痢32に至る腸上皮を破壊する可能性がある。ケージはまた、便細菌汚染のリスクを減らすために頻繁に交換する必要があり、動物は適切な動物移動ステーションで処理されるべきであり、レシピエントマウスは減量および苦痛や痛みの兆候について注意深く監視する必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、K.ウォルシュ(HL131006、HL138014、HL132564)、S.サノ(HL152174)、M.A.エバンス(20POST35210098)への米国心臓協会助成金、および小川への日本心臓財団への米国国立衛生研究所の助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
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