Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Процедуры трансплантации костного мозга у мышей для изучения клонального кроветворения

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/61875

Summary

Описаны три метода трансплантации костного мозга (ТКМ): ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с экранированной облучающей и метод ТКМ без предварительного кондиционирования (адютивная ТКМ) для изучения клонального кроветворения на мышиных моделях.

Abstract

Клональный кроветворение является распространенным возрастным состоянием, которое является результатом накопления соматических мутаций в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках (HSPC). Мутации в генах-драйверах, которые придают клеточную пригодность, могут привести к развитию расширяющихся клонов HSPC, которые все чаще приводят к появлению лейкоцитов потомства, скрывающих соматическую мутацию. Поскольку клональное кроветворение было связано с сердечными заболеваниями, инсультом и смертностью, разработка экспериментальных систем, моделируемых эти процессы, является ключом к пониманию механизмов, лежащих в основе этого нового фактора риска. Процедуры трансплантации костного мозга, включающие миелоаблативное кондиционирование у мышей, такие как облучение всего тела (ЧМТ), обычно используются для изучения роли иммунных клеток в сердечно-сосудистых заболеваниях. Тем не менее, одновременное повреждение ниши костного мозга и других интересных мест, таких как сердце и мозг, неизбежно при этих процедурах. Таким образом, наша лаборатория разработала два альтернативных метода, чтобы свести к минимуму или избежать возможных побочных эффектов, вызванных ЧМТ: 1) трансплантация костного мозга с экранированием облучения и 2) приемная ТКМ неусловным мышам. В экранированных органах сохраняется местная среда, позволяющая проводить анализ клонального кроветворения, в то время как функция резидентных иммунных клеток невозмутима. Напротив, приемная ТКМ для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, за которое сохраняются как местные среды органов, так и кроветворная ниша. Здесь мы сравним три различных подхода к восстановлению кроветворных клеток и обсудим их сильные и слабые стороны для исследований клонального кроветворения при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Introduction

Клональное кроветворение (CH) - это состояние, которое часто наблюдается у пожилых людей и возникает в результате расширенного клона гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC), несущего генетическую мутацию1. Было высказано предположение, что к 50 годам большинство людей приобретут в среднем пять экзонических мутаций в каждом HSPC2,но большинство из этих мутаций приведут к небольшим фенотипическим последствиям для человека или вообще не приведут к ним. Однако, если случайно одна из этих мутаций дает конкурентное преимущество HSPC, например, способствуя его распространению, самообновлению, выживанию или некоторой комбинации из них, это может привести к предпочтительному расширению мутантного клона по сравнению с другими HSPC. В результате мутация будет все больше распространяться через кроветворную систему, поскольку мутированный HSPC дает начало зрелым клеткам крови, что приводит к отчетливой популяции мутировавших клеток в периферической крови. В то время как мутации в десятках различных генов-драйверов-кандидатов были связаны с клональными событиями в кроветворной системе, среди них мутации в ДНК-метилтрансферазе 3 альфа(DNMT3A)и десяти одиннадцати транслокации 2(TET2)являются наиболее распространенными3. Несколько эпидемиологических исследований показали, что лица, которые несут эти генетические мутации, имеют значительно более высокий риск сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), инсульта и всей причинной смертности3,4,5,6,7. Хотя эти исследования выявили, что существует связь между СН и повышенной частотой сердечно-сосудистых заболеваний и инсульта, мы не знаем, является ли эта связь причинно-следственной или общей эпифеноменом с процессом старения. Чтобы лучше понять эту ассоциацию, требуются надлежащие животные модели, которые правильно резюмируют состояние СН человека.

Несколько моделей животных CH были установлены нашей группой и другими с использованием рыбок данио, мышей и нечеловеческих приматов8,9,10, 11,12,13,14. Эти модели часто используют методы восстановления кроветворения путем трансплантации генетически модифицированных клеток, иногда с использованием рекомбинации Cre-lox или системы CRISPR. Этот подход позволяет проанализировать специфическую мутацию гена в кроветворных клетках, чтобы оценить, как она способствует развитию заболевания. Кроме того, эти модели часто используют конгенные или репортерные клетки, чтобы отличить эффекты мутантных клеток от нормальных или диких клеток. Во многих случаях требуется режим предварительного кондиционирования для успешного приживирования донорских гемопоэтических стволовых клеток.

В настоящее время трансплантацию костного мозга мышам-реципиенцистам можно разделить на две основные категории: 1) миелоаблативное кондиционирование и 2) неусловная трансплантация. Миелоаблативное кондиционирование может быть достигнуто одним из двух методов, а именно, общим облучением тела (ЧМТ) или химиотерапией15. ЧМТ проводят путем подвергания реципиента смертельной дозе гамма- или рентгеновского облучения, генерирующего разрывы ДНК или поперечные связи внутри быстро делящихся клеток, делая их непоправимыми16. Бусульфан и циклофосфамид являются двумя широко используемыми химиотерапевтическими препаратами, которые нарушают кроветворную нишу и аналогичным образом вызывают повреждение ДНК быстро делящихся клеток. Конечным результатом миелоаблативного прекондиционирования является апоптоз кроветворных клеток, который разрушает кроветворную систему реципиента. Эта стратегия не только позволяет успешно приживить донорские HSPC, но также может предотвратить отторжение трансплантата путем подавления иммунной системы реципиента. Тем не менее, миелоаблативная прекондиционирование имеет серьезные побочные эффекты, такие как повреждение тканей и органов и их резидентных иммунных клеток, а также разрушение родной ниши костного мозга17. Поэтому были предложены альтернативные методы преодоления этих нежелательных побочных эффектов, особенно в отношении повреждения органов, представляющих интерес. Эти методы включают экранированное облучение мышей-реципиентов и приемную ТКМ для неусловленных мышей9,17. Защита грудной клетки, брюшной полости, головы или других областей от облучения путем размещения свинцовых барьеров защищает интересующие ткани от повреждающего воздействия облучения и поддерживает их резидентную популяцию иммунных клеток. С другой стороны, приемная ТКМ HSPC для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, поскольку она сохраняет нативную кроветворную нишу. В этой рукописи мы описываем протоколы и результаты приживления HSPC после нескольких схем трансплантации у мышей, в частности доставки HSPC мышам ЧМТ, мышам, частично защищенным от облучения, и неусловным мышам. Общая цель состоит в том, чтобы помочь исследователям понять различные физиологические эффекты каждого метода, а также то, как они влияют на экспериментальные результаты в условиях СН и сердечно-сосудистых заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Вирджинии.

1. Перед предварительным кондиционированием

  1. Поместите мышей-реципиентов на воду, дополненную антибиотиками (5 мМ сульфаметоксазола, 0,86 мМ триметоприма) ~ 24 ч до облучения. Это необходимо для предотвращения инфекции, так как иммунная система будет подавлена после облучения и поддерживаться в течение 2 недель после облучения. На этом этапе дополняйте мышей питательным / гидратационным гелем, чтобы стимулировать кормление и предотвратить потерю веса и обезвоживание после облучения.

Figure 1
Рисунок 1: Изображения, показывающие различные настройки предварительной подготовки. (A)Установка облучения всего тела с использованием гамма-излучения (цезий-137): пучок излучения исходит от задней части облучателя в направлении оси Y (горизонтальное излучение). (B) Установка облучения всего тела в клетке мыши с помощью рентгеновского излучения: клетка мыши помещается в отражающую камеру. Пучок излучения исходит от верхней части облучателя в форме конуса (вертикальное излучение). Расстояние от источника излучения до клетки составляет 530 мм. (C) Регулируемый лоток в рентгеновском облучателье: Эта установка используется для частично экранированного облучения с использованием рентгеновского излучения. Пучок излучения исходит от верхней части облучателя в форме конуса (вертикальное излучение). Расстояние от источника излучения до лотка составляет 373 мм, а радиус 250 мм.(D)Защита грудной клетки: Обезболивающих мышей помещают на лоток. Мышей помещают перевернутыми друг к другу в лежачих положениях с полностью вытянутыми руками и ногами. Нижний конец свинцового щита выровнен с костью xiphisternum, а верхний конец с тимусом. (E) Абдоминальная защита: Анестезированные мыши помещаются как в защитную грудную клетку установку с нижним концом свинцового щита, выровненным с анусом, и верхним концом под диафрагмой. (F)Установка облучения головы с использованием гамма-излучения (цезий-137): носовые лапы анестезированной мыши заклеиваются, а мышь помещается в конический ограничитель. Черный свинцовый щит (обозначенный) закрывает голову и уши мыши. Пучок излучения исходит от задней части облучателя в направлении оси Y (горизонтальное излучение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Предварительная подготовка мышей-реципиентов (необязательно)

  1. Облучение всего тела
    1. Поместите мышей-реципиентов в равномерно нарезанную клетку или клетку для мыши в отражательную камеру в пределах расчетного радиуса для получения той же дозы облучения; однако для обеспечения равномерного облучения рекомендуется максимум 8 мышей на клетку и 5 мышей на клетку для мышей(рисунок 1A,B).
    2. Чтобы достичь полной миелоабляции, убедитесь, что мыши-реципиенты получают общую дозу облучения 11 Гр в двух фракциях по 5,5 Гр, разделенных интервалом 4–24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как оптимальное приживение может быть получено путем реализации 4-х ч интервала между фракциями, он может быть продлен до 24-х ч интервала, что может быть полезно, когда труд и / или облучатель недоступны.
  2. Частично экранированное облучение
    1. Обезболивание мышей-реципиентов путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (80–100 мг/кг) и ксилазина (5–10 мг/кг). Ограничение движения мыши имеет решающее значение для обеспечения равномерного облучения и эффективной защиты органов-мишеней во время процесса экранирования.
    2. Для экранирования грудной клетки и брюшной полости ориентируйте пучок излучения рентгеновского облучателя вертикально на мышь(рисунок 1С).
      1. Поместите обезболенные мыши на плоскую пластину, центрируя источник излучения сверху. Поместите перевернутых друг к другу мышей в лежачем положении с полностью вытянутыми руками и ногами(рисунок 1D,E).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рентгеновский облучатель для этого эксперимента позволяет двум мышам одновременно расположиться в пределах эффективного радиуса, что обеспечивает равномерное облучение. В то время как эффективный радиус рассчитывается на основе расстояния между источником излучения и лотком, количество животных, которые могут быть одновременно облучены, будет зависеть от конкретного облучателя.
      2. Закрепите лапы мышей на пластине с помощью ленты, чтобы обеспечить иммобилизацию мышей во время процедуры облучения. Поместите свинцовое экранирование так, чтобы оно покрывала области, требующие защиты.
      3. Для экранирования грудной клетки подготовьте свинцовый щит, измерив длину от кифистерновой кости мыши до тимуса и рассчитав толщину, которая обеспечит достаточную защиту от источника облучения. Поместите свинцовое экранирование так, чтобы нижний конец выровнявался с костью xiphisternum. Верхний конец свинцового барьера будет помещаться рядом с тимусом(рисунок 1D).
      4. Для экранирования брюшной полости подготовьте свинцовый щит, измерив длину от ануса мыши до диафрагмы и рассчитав толщину, которая обеспечит достаточную защиту от источника облучения. Поместите свинцовое экранирование так, чтобы нижний конец выровнял с анусом. Верхний конец свинцового щита будет помещаться ниже диафрагмы(рисунок 1E).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Локализация свинцового щита для согласованности между когортами может уменьшить некоторые различия в отношении размера мышей.
    3. Для экранирования головы ориентируйте пучок излучения облучателя цезия горизонтально на мышь.
      1. Осторожно приклейте цевья обезболенной мыши к брюшку. Это гарантирует, что руки получают полную дозу облучения и не покрываются щитом.
      2. Для защиты головы поместите мышь в конический ограничителю, который помещается внутри свинцового щита. Как только мышь находится внутри конического ограничителя, вставьте ограничителя в слот внутри свинцового щита(рисунок 1F). Свинцовый щит должен полностью закрывать голову и уши мыши (~ 3,2 см), оставляя остальную часть тела мыши открытой для облучения. Положение ограничителя внутри щита можно отрегулировать, чтобы он соответствовал животным разных размеров, сдвинув его дальше внутри или снаружи щита.
      3. Поместите мышей внутрь облучателя, перпендикулярно источнику облучения.
    4. Подвергайте мышей воздействию двух фракций облучения по 5,5 Гр (общая доза 11 Гр), разделенных интервалом 4–24 ч.
    5. После каждой фракции облучения поместите клетки с анестезированными мышами на нагретые маты или под красные тепловые лампы, чтобы предотвратить переохлаждение и помочь в восстановлении после анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы не перегревать обезболенную мышь при использовании лампы, так как они не могут избежать нагрева. Как описано выше, позиционирование животных и толщина свинцового щита могут различаться между исследованиями, основанными на специфических особенностях облучателя (тип излучения/направление пучка и т.д.). Исследователям необходимо будет соответствующим образом скорректировать свои эксперименты.

3. Изоляция костей

ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале мыши-доноры и мыши-реципиенты должны быть похожи по возрасту и в возрасте от 8 до 12 недель. Использование по меньшей мере 3 мышей в качестве доноров (а не одного донора) предпочтительно для минимизации гетерогенности (даже при использовании мышей с одинаковым генотипом). Приблизительно 40 миллионов нефракционированных клеток костного мозга можно получить из шести костей (двух бедренных костей, двух большеберцовой костей и двух плечевых костей) одной мыши. Трансплантация 5 миллионов клеток костного мозга каждой мыши-реципиенту обычно обеспечивает приживление.

  1. Усыплите мышей-доноров путем вывиха шейки матки без анестезии (предпочтительный метод, чтобы избежать химического загрязнения клеток) и поместите каждую мышь на абсорбивную прокладку.
  2. Дезинфицируйте кожу с помощью 70% этанолового спрея.
  3. Сделайте небольшой поперечный разрез в коже ниже грудной клетки и крепко держите кожу по обе стороны разреза, разрывая в противоположных направлениях к голове и ногам. Отклеивание кожи со всех конечностей.
  4. Разрезайте плечи и локтевые суставы и удалите прикрепленные мышцы и соединительные ткани с помощью Кимвипа, чтобы получить плечевую кость.
  5. Осторожно вывихивают тазобедренные суставы между бедренной и тазобедренной костями. Используйте тупые ножницы, чтобы разрезать вдоль головки бедренной кости и отсоедать ноги. Разрезайте коленный сустав, чтобы отделить бедренную и большеберцовую кости, и осторожно удалите прикрепленные мышцы и соединительные ткани с помощью Kimwipe, чтобы собрать бедренную и большеберцовую кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите особое внимание на то, чтобы сохранить эпифиз кости нетронутым во время этого этапа. Отбросьте все сломанные кости из-за потери стерильности. Тазобедренные кости и кости позвоночника могут быть собраны в дополнение к бедренной кости, голени и плечевой кости. Для сбора костей позвоночника можно использовать ступку и пестик, чтобы раздавить кости на куски и собрать клетки костного мозга.
  6. Поместите выделенные кости мышей того же генотипа в коническую трубку размером 50 мл, содержащую 20 мл ледяного стерильного PBS, и держите его на льду до дальнейшего использования. Обратите особое внимание, чтобы правильно поместить кости в трубки с соответствующими генотипами.
  7. Повторите описанные выше шаги для каждого животного-донора, меняющего перчатки между каждой мышью. Кроме того, очистите ножницы и другие инструменты с 70% этанолом между каждой мышью.

4. Выделение клеток костного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в шкафу класса биобезопасности II.

  1. Подготовка наборов трубок: Сделайте небольшое отверстие в нижней части стерильной микроцентрифужной трубки 0,5 мл с помощью иглы 18 Г и поместите ее в стерильную микроцентрифужную трубку 1,5 мл, которая содержит 100 мкл ледяного стерильного PBS на дне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку только шесть костей могут поместиться в трубку микроцентрифуги объемом 0,5 мл, рекомендуется подготовить достаточное количество наборов трубок для обработки всех костей одновременно.
  2. Аспирируйте PBS и перенесите изолированные кости на стерильную чашку для культивации клеток 100 мм. Удерживая каждую кость с помощью тонких щипцов, аккуратно отрежьте эпифизы с каждого конца с помощью небольших ножниц, которые были стерилизованы в автоклаве. Поместите разрезанные кости в подготовленные наборы трубок.
  3. Центрифугировать трубки при 10 000 х г в течение 35 с при 4 °C.
  4. После центрифугирования подтвердите, что костный мозг был успешно удален из костей. Кости должны казаться белыми и полупрозрачными с относительно большой красной гранулой на дне трубки микроцентрифуги 1,5 мл. Отбросьте микроцентрифужную трубку 0,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если визуальный осмотр не позволяет обнаружить костный мозг в нижней части трубки 1,5 мл, снова отрежьте кость и повторите шаг 4.3.
  5. Повторно суспендировать костный мозг в 1 мл ледяного PBS, затем перенести клеточную суспензию из того же генотипа в соответствующую коническую трубку 50 мл.
  6. Диссоциируют клетки, пропуская их через иглу 18 Г со шприцем 10 мл 10 раз.
  7. Фильтруйте одноклеточные суспензии через сетчатый фильтр 70 мкм. Добавьте дополнительный ледяной PBS к конечному объему 10 мл и повторно суспендировать клетки с помощью мягкого использования пипетки.
  8. Центрифуга при 310 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  9. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу 10 мл безсыворочной rpmI среды. Запасной 30 мкл этого материала для подсчета клеток.
  10. Определите концентрацию клеток с помощью счетчика клеток и рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для трансплантации. Для примера 100% ТКМ для каждой мыши-реципиента требуется5 x 10 6 клеток костного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для конкурентоспособной ТКМ подготовьте в общей сложности5 х 10 6 клеток костного мозга, включающих смесь донорских клеток (например, CD45.2+) и клеток конкурентов (например, CD45.1+). Настоятельно рекомендуется подготовка дополнительных клеток костного мозга. Например, если в экспериментальной группе 10 мышей-реципиентов, мы обычно готовим достаточное количество клеток для 12 мышей-реципиентов.
  11. Перенесите расчетный объем клеточной суспензии в новую коническую трубку объемом 50 мл. Центрифуга при 310 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  12. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки, используя рассчитанное количество безсыворочной rpmI среды для достижения соответствующей плотности и объема клеток. Как правило, 200 мкл является оптимальным объемом для ретроорбитальной инъекции.

5. Трансплантация клеток костного мозга облученным мышам

  1. Обезболить мышей-реципиентов 5% изофлураном.
  2. Пока мышей анестезируют, медленно вводят 200 мкл клеток костного мозга в ретроорбитальную вену, используя иглу 28-30 Г с инсулиновым шприцем.
    1. Альтернативно, выполняют доставку донорских клеток путем внутривенной инъекции в хвостовую вену и интрамедуллярной инъекции бедренной кости с максимальным объемом 0,2 мл и 25 мкл соответственно.
  3. Как только клетки будут введены, поместите каплю глазных капель, содержащих пропаракаин, на поверхность глаза для облегчения боли. Затем животному можно позволить прийти в сознание.

6. Трансплантация клеток костного мозга неусловным мышам

  1. Обезболивают мышей-реципиентов путем вдыхания 5% изофлурана.
  2. Вводят 5 x 106 нефракционированных клеток костного мозга из ретро-орбитального генотипа необлученным мышам-реципиенциям с помощью инсулинового шприца 28-30 г.
  3. Повторите шаги 6.1 и 6.2 в течение 3 последовательных дней, так что мышам-реципиентам будет пересажено в общей сложности 1,5 х10 7 клеток костного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку приемная ТКМ без процедуры предварительного кондиционирования требует трансплантации костного мозга в течение 3 дней подряд, следует попытаться чередовать глаза для каждой инъекции.
  4. После инъекции ввести каплю пропаракаин-содержащих глазных капель пораженный глаз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы сравнить влияние трех методов ТКМ/предварительного кондиционирования на приживение донорских клеток, фракции донорских клеток в периферической крови и сердечной ткани были проанализированы методом проточной цитометрии через 1 месяц после ТКМ. Изолированные клетки окрашивали для специфических маркеров лейкоцитов для идентификации различных подмножеств лейкоцитов. В этих экспериментах донорские клетки костного мозга дикого типа(WT) C57BL/6 (CD45.2) доставлялись в WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/ BoyJ (CD45.1) мыши-реципиенты для различения донорских клеток от клеток реципиента. Используемые стратегии проточной цитометрии описаны ранее Wang et al.9 на дополнительном рисунке 1.

Группа, получавшую общее облучение тела (ЧМТ), получала 5 х 106 клеток костного мозга после общей смертельной дозы облучения 11 Гр в двух фракциях 5,5 Гр, разделенных интервалом 4 ч. В периферической крови мышей-реципиентов моноциты, нейтрофилы и В-клетки были в значительной степени абляции и заменены потомство донорских клеток, полученных из костного мозга. Кроме того, резидентная популяция сердечных моноцитов и нейтрофилов в сердцах мышей-реципиентов была почти полностью заменена клетками донорского происхождения(рисунок 2А).

В группе частично экранированного облучения мышей-реципиентов облучали щитом грудной клетки и пересаживали 5 х10 6 клеток костного мозга после общей дозы облучения 11 Гр в двух фракциях 5,5 Гр, разделенных интервалом 4 ч. В отличие от группы ЧМТ, вклад донорских клеток в сердечные иммунные клетки был скромным, что, вероятно, отражает комбинированные эффекты защиты местных иммунных клеток в сердцах мышей-реципиентов и физиологическую репопуляцию донорских клеток костного мозга из периферической крови. Клетки костного мозга мыши-реципиента в экранированных областях также, вероятно, способствовали восстановлению периферической крови, что снижает процент донорских клеток в периферической крови по сравнению с группой, получаемой ЧМТ(рисунок 2B).

В группе без предварительного кондиционирования ТКМ (приемная ТКМ) мышам-реципиентам пересаживали 5 х10 6 клеток костного мозга в течение 3 последовательных дней. Через 4 недели после ТКМ была обнаружена доля донорских клеток в периферической крови и сердце. (приблизительно 5%) (Рисунок 2C).

Чтобы проиллюстрировать, как приемная модель ТКМ может быть применена к изучению модели CH, CD45.2+ донорские клетки костного мозга(WT или Tet2-/-) были пересажены мышам-реципиентам CD45.1+. Реципиентам без кондиционирования пересаживали 5х 10 6 клеток костного мозга каждый день в течение 3 последовательных дней (в общей сложности 1,5 х10 7,n = 5-6 на группу). Проточный цитометрический анализ периферической крови проводили через 4, 8, 12 и 16 недель после трансплантации. Донорские клетки с дефицитом Tet2 дают конкурентное преимущество и постепенно расширяются с течением времени; WBC, моноциты, Ly6Chi моноциты, нейтрофилы, Т-клетки и В-клетки значительно увеличивались с течением времени. По сравнению с Tet2-дефицитными донорскими клетками, привитыми к мышам-реципиенцию, мыши-реципиенты, привитые донорскими клетками WT, показали менее значительное клональное расширение донорских клеток(рисунок 3). В соответствии с клинической парадигмой клонального кроветворения, расширение клеток с дефицитом Tet2 не влияет на абсолютное количество различных типов клеток крови9 (данные не показаны).

Figure 2
Рисунок 2: Проточный цитометрический анализ крови и сердца с использованием различных методов предварительного кондиционирования. Проточный цитометрический анализ периферической крови и сердца проводили через 1 месяц после трансплантации костного мозга. Чтобы отличить донорские клетки от клеток реципиентов, мышам-реципиентам CD45.1+ трансплантировали CD45.2+ донорские клетки костного мозга. (A)5 x 106 клеток костного мозга пересаживали после двух фракций общего облучения тела (2 x 5,5 Гр, интервал 4 ч, n = 3). (B)5 x 106 клеток костного мозга были пересажены после двух фракций общего облучения тела с защитой грудной клетки (2 x 5,5 Гр, интервал 4 ч, n = 10). Реципиенты без кондиционирования пересаживались с 5 x10 6 клетками костного мозга в течение 3 дней подряд (в общей сложности 1,5 x 107, n = 4). Данные выражаются как среднее ± SEM. Общее количество WBC определяется как CD45+; Нейтрофилы какLy6G+; Ly6Chi моноциты как CD115+,Ly6G-, так и Ly6C+; Ly6Cло моноциты в виде CD115+, Ly6G-, и Ly6C-; В-клетки какCD45R+; CD4+ Т-клетки как CD3e+ и CD4+; CD8+ Т-клетки как CD3e+ и CD8+; и макрофаги как CD64+,Ly6G-, и Ly6C-. (Лейкоциты: лейкоциты, Neut: нейтрофилы, Mono: моноциты, Mac: макрофаги). Рисунок 2A,C был изменен по сравнению с Wang et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Клональное расширение клеток с дефицитом Tet2 с использованием приемной ТКМ к неусловленным мышам. CD45.2+ донорские клетки костного мозга(WT или Tet2-/-) были пересажены мышам-реципиентам CD45.1+. Реципиентам без кондиционирования пересаживали 5х 10 6 клеток костного мозга каждый день в течение 3 дней подряд (в общей сложности 1,5 х 107,n = 5-6 на группу). Проточный цитометрический анализ периферической крови проводили через 4, 8, 12 и 16 недель после трансплантации. Показана доля CD45.2+ донорских клеток в каждой популяции. (A) WBC (B) Моно (C) Ly6Chi mono (D) В клетки (E) Т-клетки. Данные выражаются как среднее ± SEM. WBC определяются как CD45+; Нейтрофилы какLy6G+; Ly6Chi моноциты как CD115+,Ly6G-, так и Ly6C+; Ly6Cло моноциты в виде CD115+, Ly6G-, и Ly6C-; В-клетки какCD45R+; CD4+ Т-клетки как CD3e+ (WT: дикий тип, WBC: белые кровяные клетки, Mono: моноциты) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для исследований клонального кроветворения мы описали три метода ТКМ: ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с облучением с частичным экранированием и менее часто используемый метод ТКМ, который не включает предварительное кондиционирование (адмтивное ТКМ). Эти методы были использованы для оценки влияния клонального кроветворения на сердечно-сосудистые заболевания. Исследователи могут модифицировать эти методы соответствующим образом в соответствии с конкретной целью своего исследования.

Модели клонального кроветворения
Клональный кроветворение – это явление, при котором мутантные кроветворные клетки конкурируют с клетками дикого типа и со временем приобретают клональное доминирование. Для создания модели этого соревнования мышам можно вводить костный мозг, который состоит из смеси генетически разных клеток. Как правило, эта смесь будет включать мутантные и дикие клетки, которые были помечены флуоресцентной меткой или различными маркерами панклейкоцитов (т.е. CD45.1 и CD45.2). Например, при создании моделей, имитирующих Tet2-опосредованный CH, мы выполняем конкурентоспособную трансплантацию костного мозга летально облученным реципиенцистам, которая обычно включает смешивание 90% клеток, которые происходят от CD45.1 Tet2+/+ доноров и 10% клеток, которые происходят из CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- или контрольных Tet2+/+ доноров8. Обнаружение проточной цитометрией вариантов CD45 с использованием специфических моноклональных антител позволяет отличить донорские клетки (CD45.1-/CD45.2+) от клеток-конкурентов (CD45.1+/CD45.2-) в крови и оценить клональную динамику тестовых клеток с течением времени. Таким образом, мы смогли наблюдать постепенное увеличение донорского химеризма клеток с дефицитом Tet2, в то время как процент клеток дикого типа остается примерно на уровне 10%. Эта экспериментальная установка имитирует человеческий сценарий людей, несущих соматическую мутацию TET2, поскольку эти мутации первоначально переносятся небольшим количеством HSPC, которые будут постепенно расширяться с течением времени. Использование этого подхода в моделях сердечно-сосудистых заболеваний атеросклероза и сердечной недостаточности привело к документированию потенциальной причинно-следственной связи между Tet2-опосредоченной CH и CVD 8,9,10.

При использовании этих подходов исследователи должны учитывать возможные смешанные эффекты, создаваемые ЧМТ. Хотя ЧМТ до трансплантации обеспечивает высокую степень приживления HSPC, это предварительное кондиционирование приведет к нескольким нежелательным эффектам за пределами кроветворной системы. Было задокументировано, что ЧМТ может привести к воспалению, травме и фиброзу в нескольких системах органов, включая кожу, печень, почки, легкие, костный мозг, сердце, мозг и т. Д.18,19,20. Эти побочные эффекты могут негативно влиять на исследуемые сердечно-сосудистые органы, а также изменяют патогенез заболевания21,22. Примечательным примером является влияние облучения на резидентные макрофаги в сердце. Облучение грудной клетки приводит к заметной замене кардио-резидентных макрофагов циркулирующими макрофагами, полученными из моноцитов. Исследования показали, что кардио-резидентные макрофаги демонстрируют различные характеристики относительно циркулирующих макрофагов, полученных из моноцитов, которые будут приживляться в сердце после радиационного повреждения. Считается, что в условиях заболевания кардио-резидентные макрофаги играют кардиопротекторную роль, тогда как инфильтрирующие макрофаги, передающиеся через кровь, как сообщается, способствуют травмам и воспалению23. Поэтому вполне возможно, что замена резидентных сердечных иммунных клеток клетками, передаемыми кровью, изменит исследуемые патологические процессы, которые способствуют сердечно-сосудистым заболеваниям24,25,26. Аналогичным образом, в головном мозге ЧМТ приводит к истощению резидентной микроглии и замещению периферически полученными макрофагами27,28. В то время как периферически полученные макрофаги могут вести себя как клетки микроглии, они сохраняют уникальную функциональную и транскрипционную идентичность по сравнению с микроглией, полученной из моноцитов28. Поэтому возможно, что последствия заболевания могут быть изменены, особенно при изучении таких заболеваний, как ишемические инсульты. Чтобы избежать этих смешанных эффектов, может быть рекомендовано экранирование грудной клетки и головы. Это выгодно, потому что обеспечивает защиту сердца и мозга соответственно; и он также поддерживает их резидентные иммунные клетки нетронутыми, лучше повторяя состояние СН человека. Однако, как отмечалось ранее, экранирование приводит к более низкому уровне химеризма по сравнению с предварительным кондиционированием ЧМТ, что по существу устраняет все кроветворные клетки хозяина.

Другим важным препятствием в предварительном кондиционировании является его вредное воздействие на нишу костного мозга. Хотя вызванное облучением повреждение ниши БМ может быть восстановлено в неоптимальной степени, неясно, восстанавливается ли наивное кроветворение в этих поврежденных микросредах. Кроме того, трансплантация смешанных HSPC в пустой BM инициирует гонку за пролиферацию между клонами, а не простую «конкуренцию» за нишу, которую занимает HSPC дикого типа, что, по-видимому, и происходит в CH. Таким образом, потенциально предпочтительным подходом к изучению СН может быть приемный метод ТКМ, при котором клетки БМ переносятся мышам-реципиенции без предварительного кондиционирования. Этот приемный метод ТКМ без предварительного кондиционирования минимально влияет на продолжающееся наивное кроветворение, наиболее точно повторяя СН, наблюдаемый у людей29. На рисунке 2С показан уровень химеризма через 1 месяц после трансплантации без предварительного кондиционирования. В то время как донорский химеризм низок в этот ранний момент времени, мы находим постепенно растущую долю клонов с дефицитом Tet2 с течением времени, как показано на рисунке 3. Следует отметить, что эта модель наиболее полезна, когда мутантные клетки имеют конкурентное преимущество перед клетками дикого типа в условиях гомеостатических условий, таких как клетки с дефицитом Tet2. Когда Tet2-дефицитные клетки приживляются, наблюдается заметное расширение в различных популяциях лейкоцитов, таких как нейтрофилы, моноциты, NK-клетки и В-клетки. Более медленное расширение было отмечено в Т-клетках, предположительно из-за более длительного срока полураспада этой популяции.

Расширение Tet2-дефицитных клеток наблюдалось не только в периферической крови, но и в ряде других тканей, включая костный мозг, печень и почки, с различной динамикой восстановления кроветворных клеток9. Например, в предыдущей опубликованной статье нашей лаборатории описывался химеризм клеток костного мозга WT и Tet2-дефицитных донорских клеток, привитых мышам-реципиенщикам CD45.1 через 8 месяцев после принятия BMT9. Донорские клетки с дефицитом Tet2, пересаженные мышам-реципиентам CD45.1, показали конкурентное преимущество перед незрелой линией-клетками Sca1+c-Kit+ (LSK), краткосрочными и долгосрочными клетками HSC и мультипотентными прагениторами (MMP) по сравнению с клетками доноров WT, трансплантированных мышам-реципиентам CD45.1. Кроме того, поскольку Tet2-deficient донорская клетка приживленная мышами-реципиентами, они развивают возрастной фенотип кардиомиопатии без экзогенных факторов, вызывающих сердечную дисфункцию, тем самым повторяя эффект клонального кроветворения таким же образом, как у стареющих людей. Это наблюдение сопровождалось повышенной степенью химеризма в сердечных нейтрофилах и моноцитах Ly6Chi. В совокупности этот приемный режим ТКМ может быть применен к будущим исследованиям, которые могут расширить наше понимание связи между развитием сердечно-сосудистых заболеваний и клональным кроветворением на более продвинутом уровне.

Таким образом, мы описали три метода BMT и обсудили их применение при создании моделей CH. СН связан с более плохими прогнозами при сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как атеросклероз и сердечная недостаточность. Хотя был достигнут значительный прогресс, изучение причинно-следственных связей между СН и ССЗ все еще находится в зачаточном состоянии, и необходимы дальнейшие исследования с использованием оптимизированных моделей животных. Мы надеемся, что эти протоколы позволят исследователям выбрать более физиологически подходящий метод ТКМ, который минимизирует потенциальное смешивающее воздействие на сердечно-сосудистую систему, в конечном итоге давая исследования, которые расширяют наше понимание того, как СН способствует сердечно-сосудистым заболеваниям.

Конструкция свинцового экранирования
Толщина свинцового щита будет определяться типом облучения, используемого для индуцирования миелоабляции. Рентгеновские или гамма-типы излучения часто используются для экспериментальной миелоабляции, но различаются с точки зрения их частоты, длины волны и энергии фотонов. Когда дело доходит до экранирования, энергия фотона, которая описывает энергию или скорость, с которой движутся лучи, является наиболее важным параметром. Как правило, источник излучения рентгеновских лучей имеет энергию 160 кВп, тогда как источники цезия-137, которые испускают гамма-лучи, имеют энергию 662 КэВ. Энергия, излучаемая этими источниками излучения, приравнивается к их проникающей силе, причем более высокие энергии имеют большую силу проникновения. Поэтому при использовании облучателей на основе цезия требуется большая толщина свинцового экрана по сравнению с использованием рентгеновских облучателей. Рентгеновское облучение, которое мы используем при выполнении защиты грудной клетки и брюшной полости, требует свинцового щита толщиной 7 мм для обеспечения достаточной защиты. Однако для источников цезия 137, которые мы используем при защите головы, свинцовые щиты должны быть толщиной не менее 1 дюйма, чтобы обеспечить достаточную защиту.

Свинцовые щиты для использования в рентгеновских облучателях можно приобрести у коммерческих поставщиков. В качестве альтернативы, свинцовые листы могут быть разрезаны по размеру, чтобы они либо помещались вокруг тела животного, либо вокруг ограничителя (см. Рисунок 1). При использовании облучателя на основе цезия следует использовать свинцовые кирпичи, которые значительно толще и могут быть изготовлены на заказ компаниями, которые специализируются на изготовлении этих типов щитов. Например, для головного козырька мы специально разработали свинцовый кирпич для хранения 50 мл конического трубчатого ограничителя (см. Рисунок 1F). Животное способно поместиться внутри ограничителя, который затем прорезывается в отверстие, сделанное в кирпиче, чтобы обеспечить 1,5 дюйма защиты от облучения. Важно отметить, что все свинцовые щиты должны быть покрыты либо краской, либо лентой, чтобы предотвратить воздействие свинцовой пыли, которая может быть токсичной.

Основываясь на оборудовании и его параметрах, исследователи могут спроектировать свои собственные свинцовые щиты для интересующих их объектов. Здесь мы ввели защиту грудной клетки, брюшной полости и головы; однако другие участки, такие как конечность или бок, также могут быть рассмотрены для экранирования. Кроме того, в то время как оба источника излучения (цезий-137 и рентген) пригодны для абляции костного мозга и успешного приживления, между источниками облучения цезия-137 ирентгеновского облучения наблюдалась вариабельность в восстановлении популяций лимфоидных и миелоидных клеток. Таким образом, исследователи должны учитывать разрозненные физиологические реакции на источник излучения для использования в исследованиях.

Интервалы дозирования
Дозировка и интервалы дозирования могут влиять на эффективность приживления донорских клеток и выживаемость. У пациентов с высокими дозами облучение может вызвать идиопатическую интерстициальную пневмонию, повреждение желудочно-кишечного тракта и образование катаракты. В мышиных моделях однократное облучение в высоких дозах с последующей трансплантацией костного мозга может дать аналогичные результаты, а также может повлиять на выживаемость31. Поэтому фракционированное облучение настоятельно рекомендуется для исследований ТКМ на мышах. Кроме того, интервалы дозирования фракций могут влиять на выживаемость мышей и скорость восстановления, что приводит к различным фракциям химеризма донорских клеток в гематологических органах, а также в других тканях31. Таким образом, исследователи должны быть осторожны при разработке графика дозирования фракционированного облучения для исследований ТКМ.

В контексте выживаемости и восстановления иммунных клеток наше небольшое исследование показало, что группа мышей, получавших общее облучение тела смертельной дозой облучения 11 Гр в двух фракциях 5,5 Гр, разделенных группой интервала 24 ч, не имела существенно отличающихся результатов, чем группа, которая получала ту же дозу ЧМТ с интервалом в 4 ч (см. Таблицу 1). Однако при ТКМ, защищающей грудную клетку, группа интервала 24 ч, по-видимому, показала меньшую эффективность химеризма донорских клеток по сравнению с 4-хотной интервальной группой. Возможное объяснение этого результата заключается в том, что облучение с интервалом 24 ч, возможно, было недостаточным для удаления иммунокомпетентных клеток реципиента, потому что длительные интервалы давали мышам-реципиенциев достаточно времени для восстановления поврежденных клеток. Кроме того, защита грудной клетки защищает частичные кости позвоночника, которые также содержат ГСК реципиента. Таким образом, оставшиеся и восстановленные иммунокомпетентные клетки-реципиенты, возможно, атаковали донорские клетки и индуцировали результат, который показал более низкую эффективность приживения.

   

WBC (%) В-клетка (%) Т-ячейка (%) Моно (%) Ly6Cпривет моно (%) Ly6Clo mono (%) Нейтрофил (%)
ЧМТ-БМТ Интервал 4 ч 97.4 ± 1.0 100 ± 0 59.1 ± 18.7 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
Интервал 24ч 97.2 ± 2.2 100 ± 0 79.0 ± 8.1 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
ТКМ, защищающий грудную клетку Интервал 4 ч 56.2 ± 4.0 54.2 ± 6.2 0.5 ± 0.1 66.7 ± 6.1 63,8 ± 6,3 70.8 ± 5.7 82.0 ± 3.8
Интервал 24ч 34.4 ± 3.1 34.8 ± 3.1 2.9 ± 1.7 45.0 ± 3.2 34.2 ± 3.6 56,2 ± 4,9 56 ± 10.0

Таблица 1: Эффективность приживления донорских клеток с использованием различных интервалов дозирования. Проточный цитометрический анализ периферической крови проводили через 1 месяц после трансплантации костного мозга. ВТ CD45.2+ донорские клетки костного мозга были пересажены в CD45.1+ мышей-реципиентов. 5 x 106 клеток костного мозга трансплантировали после двух фракций общего облучения тела (2 x 5,5 Гр) с экранированием грудной клетки или без него, разделенных интервалом 4 ч или интервалом 24 ч. (n = 3–4 на группу).

Уход за животными
Для успеха этого эксперимента требуется несколько шагов с участием мышей. Таким образом, дополнительное внимание требуется в следующих моментах: во-первых, доставка жизнеспособных донорских клеток имеет решающее значение для успешного приживляния. Следует правильно обучаться сбору интактных БМ-клеток и их инъекции мышам-реципиенцию. Последствия плохой доставки клеток включают неспособность донорских HSPC восстановить костный мозг реципиента, что приводит к смертности. Во-вторых, необходимо соблюдать осторожность после трансплантации, чтобы избежать инфекции, особенно после миелоаблативной терапии. Контакт с патогенами может быть смертельным, так как мыши становятся временно иммунодефицитными после облучения. Как указано выше, добавление питьевой воды антибиотиками может снизить риск смертельной инфекции. Кроме того, обеспечение животных-реципиентов питательным / гидратационным гелем может свести к минимуму обезвоживание и дефицит питательных веществ, которые могут возникнуть после облучения, поскольку облучение может нарушить эпителий кишечника, что приведет к диарее32. Клетки также должны часто заменяться, чтобы снизить риск заражения фекальными бактериями, животные должны обрабатываться на правильной станции переноса животных, а мыши-реципиенты должны тщательно контролироваться на предмет потери веса и любых признаков дистресса или боли.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США К. Уолшу (HL131006, HL138014 и HL132564), С. Сано (HL152174), грантом Американской кардиологической ассоциации М. А. Эвансу (20POST35210098) и грантом Японского фонда сердца Х. Огава.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-121 general supply
1.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-129 general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
Absolute Ethanol (200 prfof) Fisher chemical 200559 general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle Becton Dickinson 309626 general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) Becton Dickinson 395195 general supply
Cesium-137 Irradiator J. L. Shepherd  Mark IV equipment
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10 general supply
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09 general supply
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Ketamine Zoetis 043-304 injection
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimtech Science KCC34155 general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim TEVA 0703-9526-01 injection
Xylazine Akorn 139-236 injection
X-ray irradiator Rad source RS-2000 equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
  2. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
  4. Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
  5. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  6. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  7. Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
  8. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
  9. Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
  10. Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
  11. Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
  12. Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
  13. Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
  14. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
  15. Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
  16. Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
  17. Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
  18. Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
  19. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  20. Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
  21. Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
  22. Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
  23. Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
  24. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  25. Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
  26. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  27. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  28. Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
  29. Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
  30. Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
  31. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  32. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 171 клональный кроветворение миелоаблативное предварительное кондиционирование немиелоаблативное кондиционирование восстановление кроветворных клеток трансплантация костного мозга перенос
Процедуры трансплантации костного мозга у мышей для изучения клонального кроветворения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, E., Evans, M. A., Doviak, H.,More

Park, E., Evans, M. A., Doviak, H., Horitani, K., Ogawa, H., Yura, Y., Wang, Y., Sano, S., Walsh, K. Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (171), e61875, doi:10.3791/61875 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter