Summary
Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).
Abstract
Klonal hematopoez, hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC) somatik mutasyonların birikmesinden kaynaklanan yaygın bir yaşla ilişkili durumdur. Sürücü genlerindeki mutasyonlar, hücresel zindelik sağlayan, somatik mutasyonu barındıran progeny lökositlere giderek daha fazla yol açan genişleyen HSPC klonlarının gelişmesine yol açabilir. Klonal hematopoez kalp hastalığı, inme ve mortalite ile ilişkili olduğundan, bu süreçleri modelleyen deneysel sistemlerin geliştirilmesi, bu yeni risk faktörünün altında yer alan mekanizmaları anlamanın anahtarıdır. Toplam vücut ışınlama (TBI) gibi farelerde miyeloablatif koşullandırmayı içeren kemik iliği nakli prosedürleri, bağışıklık hücrelerinin kardiyovasküler hastalıklardaki rolünü incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kemik iliği nişine ve kalp ve beyin gibi diğer ilgi alanlarına eşzamanlı hasar, bu prosedürlerle kaçınılmazdır. Bu nedenle laboratuvarımız TBI'ın neden olduğu olası yan etkileri en aza indirmek veya önlemek için iki alternatif yöntem geliştirmiştir: 1) ışınlama kalkanı ile kemik iliği nakli ve 2) koşulsuz farelere benimseyen BMT. Korumalı organlarda, lokal çevre korunarak klonal hematopoez analizine izin verirken, yerleşik bağışıklık hücrelerinin işlevi bozulmamıştır. Buna karşılık, koşullanmamış farelere benimseyen BMT, hem organların yerel ortamlarının hem de hematopoetik nişinin korunması ek avantaja sahiptir. Burada, üç farklı hematopoetik hücre rekonstrüt yaklaşımını karşılaştırıyoruz ve kardiyovasküler hastalıkta klonal hematopoez çalışmaları için güçlü yönlerini ve sınırlamalarını tartışıyoruz.
Introduction
Klonal hematopoez (CH), yaşlı bireylerde sıklıkla gözlenen ve genetik mutasyon taşıyan genişletilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) klonunun bir sonucu olarak ortaya çıkan bir durumdur1. 50 yaşına kadar, çoğu bireyin her HSPC2'deortalama beş eksonik mutasyon elde etmiş olacağı ileri sürülmektedir , ancak bu mutasyonların çoğu birey için çok az fenotipik sonuçlara neden olacaktır. Bununla birlikte, bu mutasyonlardan biri HSPC'ye rekabet avantajı sağlıyorsa (örneğin, çoğalmasını, kendini yenilemesini, hayatta kalmasını veya bunların bir kombinasyonunu teşvik ederek), bu mutant klonun diğer HSPC'lere göre tercihli genişlemesine yol açabilir. Sonuç olarak, mutasyona uğramış HSPC olgun kan hücrelerine yol açtıkça mutasyon hematopoetik sisteme giderek daha fazla yayılacak ve periferik kan içinde mutasyona uğramış hücrelerin farklı bir popülasyonuna yol açacaktır. Onlarca farklı aday sürücü genlerindeki mutasyonlar hematopoetik sistem içindeki klonal olaylarla ilişkili olsa da, bunlar arasında DNA metiltransferaz 3 alfa (DNMT3A) ve on bir translokasyon 2 (TET2) mutasyonları en yaygın3 'tür. Çeşitli epidemiyolojik çalışmalar, bu genetik mutasyonları taşıyan bireylerin kardiyovasküler hastalık (CVD), inme ve tüm nedensel mortalite3, 4 ,5,6,7riskinin önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulmuştur. Bu çalışmalar CH ile CVD ve inme insidansının artması arasında bir ilişki olduğunu tespit etmekle birlikte, bu ilişkinin nedensel mi yoksa yaşlanma süreci ile paylaşılan bir epifenomenon mu olduğunu bilmiyoruz. Bu ilişkinin daha iyi anlaşılması için, CH'nin insan durumunu doğru bir şekilde özetleyen uygun hayvan modelleri gereklidir.
Zebra balığı, fare ve insan dışı primatlar 8 , 9 , 10 , 11,12,13,14kullanılarak grubumuz ve diğerleri tarafından çeşitli CH hayvan modelleri kurulmuştur. Bu modeller genellikle genetiği değiştirilmiş hücrelerin nakliyle, bazen Cre-lox rekombinasyonunu veya CRISPR sistemini kullanarak hematopoetik rekonsyon yöntemlerini kullanır. Bu yaklaşım, hematopoetik hücrelerdeki belirli bir gen mutasyonunun hastalık gelişimine nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için analizini sağlar. Ek olarak, bu modeller genellikle mutant hücrelerin etkilerini normal veya vahşi tip hücrelerden ayırt etmek için konjenik veya muhabir hücreler kullanır. Çoğu durumda, donör hematopoetik kök hücreleri başarılı bir şekilde engrafe etmek için bir ön koşullandırma rejimi gereklidir.
Şu anda, kemik iliğinin alıcı farelere nakli iki ana kategoriye ayrılabilir: 1) miyeloablatif şartlandırma ve 2) koşulsuz transplantasyon. Miyeloablatif koşullandırma, toplam vücut ışınlama (TBI) veya kemoterapi15olmak üzere iki yöntemden biriyle elde edilebilir. TBI, alıcıyı ölümcül bir gama veya X-ışını ışınlama dozuna tabi tutularak, hızla bölünen hücrelerde DNA kırılmaları veya çapraz bağlantılar üreterek, onarılamaz hale getirerekgerçekleştirilir 16. Busulfan ve siklofosfamide, hematopoetik nişi bozan ve benzer şekilde hızla bölünen hücrelere DNA hasarı veren iki yaygın olarak kullanılan kemoterapi ilacıdır. Miyeloablatif önkoşulların net sonucu, alıcının hematopoetik sistemini yok eden hematopoetik hücrelerin apoptozudur. Bu strateji sadece donör HSPC'lerin başarılı bir şekilde yerleştirilmesine izin verir, aynı zamanda alıcının bağışıklık sistemini baskılayarak greft reddini de önleyebilir. Bununla birlikte, miyeloablatif önkoşul, doku ve organlara ve yerleşik bağışıklık hücrelerine zarar vermenin yanı sıra yerli kemik iliği nişinin tahrip edilmesi gibi ciddi yan etkilere sahiptir17. Bu nedenle, özellikle ilgi organlarının zarar görmesi açısından, bu istenmeyen yan etkilerin üstesinden gelmek için alternatif yöntemler önerilmiştir. Bu yöntemler, alıcı farelerin korumalı ışınlanması ve koşulsuz farelere benimseyen BMT9,17. Bir kurşun bariyerlerin yerleştirilmesiyle toraks, karın boşluğu, kafa veya diğer bölgeleri ışınlamadan korumak, ilgi çekici dokuları ışınlamanın zarar verici etkilerinden korur ve yerleşik bağışıklık hücresi popülasyonlarını korur. Öte yandan, HSPC'lerin koşullanmamış farelere benimseyen BMT'si, doğal hematopoetik niş koruduğu için ek bir avantaja sahiptir. Bu yazıda, farelerde birkaç transplantasyon rejiminden sonra HSPC engraftasyonunun protokollerini ve sonuçlarını, özellikle HSPC'nin TBI farelerine, ışınlamadan kısmen korunan farelere ve koşulsuz farelere teslimini açıklıyoruz. Genel amaç, araştırmacıların her yöntemin farklı fizyolojik etkilerini ve CH ve kardiyovasküler hastalıkların ayarlanmasındaki deneysel sonuçları nasıl etkilediklerini anlamalarına yardımcı olmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan konularını içeren tüm prosedürler Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Ön koşuldan önce
- Alıcı fareleri ışınlamadan önce antibiyotik takviyeli suya (5 mM sülfamethoxazole, 0.86 mM trimethoprim) ~24 saat yerleştirin. Bu, enfeksiyonu önlemek için gereklidir, çünkü bağışıklık sistemi ışınlamadan sonra baskılanacak ve ışınlamadan sonra 2 hafta boyunca korunacaktır. Bu noktada, beslenmeyi teşvik etmek ve ışınlamadan sonra kilo kaybını ve dehidratasyonu önlemek için fareleri bir beslenme / hidrasyon jeli ile destekleyin.
Şekil 1: Çeşitli önkoşul kurulumlarını gösteren görüntüler. (A) Gama ışını (Sezyum-137) kullanılarak pasta kafes toplam vücut ışınlama kurulumu: Radyasyon ışını ışınlayıcının arkasından y ekseni yönünde (yatay radyasyon) gelir. (B) X-ışını kullanılarak fare kafesi toplam vücut ışınlama kurulumu: Fare kafesi yansıtıcı odaya yerleştirilir. Radyasyon ışını ışınlayıcının tepesinden koni şeklinde (dikey radyasyon) gelir. Radyasyon kaynağından kafese olan mesafe 530 mm'dir. (C) X-ışını ışınlayıcısında ayarlanabilir tepsi: Bu kurulum X-ışını kullanılarak kısmen korumalı ışınlama için kullanılır. Radyasyon ışını ışınlayıcının tepesinden koni şeklinde (dikey radyasyon) gelir. Radyasyon kaynağından tepsiye olan mesafe 373 mm ve yarıçapı 250 mm'dir. (D) Toraks koruyucu: Anestezik fareler bir tepsiye yerleştirilir. Fareler, kollar ve bacaklar tamamen uzatılmış olarak supine pozisyonlarında birbirine ters yerleştirilir. Kurşun kalkanın alt ucu xiphisternum kemiği ve üst ucu timus ile hizalanır. (E) Karın koruyucu: Anesteziye uğramış fareler, anüsle hizalanmış kurşun kalkanının alt ucu ve diyaframın altındaki üst uç ile toraks koruyucu düzeneğindeki gibi yerleştirilir. (F) Gama ışını (Sezyum-137) kullanılarak baş koruyucu ışınlama kurulumu: Uyuşturulmuş farenin ataları bantlanır ve fare konik bir kısıtlayıcıya yerleştirilir. Siyah kurşun kalkan (işaretli) farenin başını ve kulaklarını kaplar. Radyasyon ışını ışınlayıcının arkasından Y ekseni yönünde (yatay radyasyon) gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Alıcı farelerin önkoşullanması (isteğe bağlı)
- Toplam vücut ışınlama
- Alıcı fareleri aynı ışınlama dozunu almak için eşit dilimlenmiş bir pasta kafese veya hesaplanan yarıçap içindeki yansıtıcı hazneye bir fare kafesine yerleştirin; bununla birlikte, düzgün ışınlama sağlamak için pasta kafesi başına en fazla 8 fare ve fare kafesi başına 5 fare önerilir (Şekil 1A,B).
- Tam miyeloablasyon elde etmek için, alıcı farelerin 4-24 saat arayla ayrılmış iki 5,5 Gy fraksiyonunda toplam 11 Gy radyasyon dozu aldığından emin olun.
NOT: Kesirler arasında 4 h aralığı uygulanarak en uygun engraftment elde edilebilirken, bu, işçilik ve/veya ışınlayıcı kullanılamadığında yararlı olabilecek 24 saat aralığına kadar uzatılabilir.
- Kısmen korumalı ışınlama
- Alıcı fareleri ketamin (80–100 mg/kg) ve ksilazin (5–10 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Fare hareketinin kısıtlanması, koruma işlemi sırasında hedefleme organlarının düzgün ışınlanması ve etkili bir şekilde korunmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir.
- Toraks ve karın koruyucu için, X-ışını ışınlayıcısının radyasyon ışınını dikey olarak fareye yönlendirin (Şekil 1C).
- Uyuşturulduğu fareleri, radyasyon kaynağını yukarıdan ortalayarak düz bir tabağa yerleştirin. Birbirine ters çevrilmiş fareleri kollar ve bacaklar tamamen uzatılmış bir şekilde bir geri zeka pozisyonuna yerleştirin (Şekil 1D,E).
NOT: X-ışını ışınlayıcı tesisi, bu deney için, aynı anda iki farenin tek tip ışınlama sağlayan etkili yarıçap içinde konumlandırılabilmesini sağlar. Etkili yarıçap radyasyon kaynağı ve tepsi arasındaki mesafeye göre hesaplanırken, aynı anda ışınlanabilen hayvan sayısı belirli ışınlayıcıya bağlı olacaktır. - Farelerin ışınlama prosedürü sırasında hareketsiz hale getirilmesini sağlamak için farelerin pençelerini bant kullanarak tabağa sabitleyin. Kurşun kalkanını koruma gerektiren bölgeleri kapsayacak şekilde yerleştirin.
- Toraks kalkanı için, farenin xiphisternum kemiğinden timusa kadar olan uzunluğu ölçerek ve ışınlama kaynağından yeterli koruma sağlayacak kalınlığı hesaplayarak kurşun kalkanı hazırlayın. Kurşun kalkanı, alt ucu xiphisternum kemiğine hiza olacak şekilde yerleştirin. Kurşun bariyerin üst ucu timusa yakın olacaktır (Şekil 1D).
- Karın kalkanı için, farenin anüsünden diyaframa kadar olan uzunluğu ölçerek ve ışınlama kaynağından yeterli koruma sağlayacak kalınlığı hesaplayarak kurşun kalkanı hazırlayın. Kurşun kalkanı, alt ucun anüsle hizalaması için yerleştirin. Kurşun kalkanın üst ucu diyaframın altına sığar (Şekil 1E).
NOT: Kurşun kalkanın kohortlar arasında tutarlı olacak şekilde yerelleştirilmesi, farelerin büyüklüğüne göre bazı varyasyonları azaltabilir.
- Uyuşturulduğu fareleri, radyasyon kaynağını yukarıdan ortalayarak düz bir tabağa yerleştirin. Birbirine ters çevrilmiş fareleri kollar ve bacaklar tamamen uzatılmış bir şekilde bir geri zeka pozisyonuna yerleştirin (Şekil 1D,E).
- Baş koruyucu için, Sezyum ışınlayıcının radyasyon ışınını yatay olarak fareye yönlendirin.
- Uyuşturulmuş bir farenin önceden testerelerini dikkatlice karın bölgesine bantleyin. Bu, kolların tam doz ışınlama almasını ve kalkan tarafından kapsanmamasını sağlar.
- Baş koruması için, fareyi bir kurşun kalkanın içine sığan konik bir kısıtlayıcıya yerleştirin. Fare konik kısıtlayıcının içine girdikten sonra, kısıtlayıcıyı kurşun kalkan içindeki yuvaya kaydırın (Şekil 1F). Kurşun kalkan, farenin başını ve kulaklarını tamamen örtmelidir (~3,2 cm), farenin vücudunun geri kalanını ışınlama için açıkta bırakmalıdır. Koruyucunun kalkanın içindeki konumu, kalkanın içinde veya dışında daha fazla kaydırarak farklı büyüklükteki hayvanlara uyacak şekilde ayarlanabilir.
- Fareleri ışınlama için kaynağa dik olarak ışınlayıcının içine yerleştirin.
- Fareleri 4-24 saat arayla ayrılmış iki 5,5 Gy ışınlama fraksiyonuna (toplam 11 Gy dozu) maruz kalın.
- Her ışınlama fraksiyonundan sonra, hipotermiyi önlemek ve anesteziden iyileşmeye yardımcı olmak için anestezili farelerin olduğu kafesleri ısıtılmış paspaslara veya kırmızı ısı lambalarının altına yerleştirin.
NOT: Sıcaktan kaçamadıkları için lamba kullanırken uyuşturulmış fareyi aşırı ısıtmamak için dikkatli olunmalıdır. Yukarıda açıklandığı gibi, hayvanların konumlandırılması ve kurşun kalkanın kalınlığı, ışınlayıcının özel özelliklerine (radyasyon tipi / ışın yönü vb.) dayanan çalışmalar arasında farklılık gösterebilir. Araştırmacıların deneylerini buna göre ayarlamaları gerekecektir.
3. Kemik izolasyonu
NOT: İdeal olarak, donör fareler ve alıcı fareler yaş olarak ve 8-12 hafta içinde benzer olmalıdır. Heterojenliği en aza indirmek için (aynı genotipe sahip fareler kullanırken bile) donör olarak en az 3 fare kullanmak (tek donör yerine) tercih edilir. Tek bir farenin altı kemiğinden (iki uyluk kemiği, iki kaval kemiği ve iki humeri) yaklaşık 40 milyon kırılmamış kemik iliği hücresi elde edilebilir. Her alıcı fareye 5 milyon kemik iliği hücresi nakli tipik olarak engraftasyon sağlayacaktır.
- Donör fareleri anestezi olmadan servikal çıkık ile ötenazi (hücrelerin kimyasal kirlenmesini önlemek için tercih edilen yöntem) ve her fareyi emici bir ped üzerine yerleştirin.
- % 70 etanol spreyi kullanarak cildi dezenfekte edin.
- Göğüs kafesinin altındaki deride küçük bir enine kesim yapın ve cildi kesiğin her iki tarafında sıkıca tutun, baş ve ayaklara doğru ters yönde yırtın. Cildi tüm uzuvlardan soyun.
- Omuzları ve dirsek eklemlerini kesin ve humeri elde etmek için bir Kimwipe yardımıyla bağlı kasları ve bağ dokularını çıkarın.
- Uyluk kemiği ve kalça kemikleri arasındaki kalça eklemlerini dikkatlice yerinden sökün. Uyluk kemiği başı boyunca kesmek ve bacakları ayırmak için künt makas kullanın. Uyluk kemiği ve kaval kemiğini ayırmak için diz eklemini kesin ve uyluk kemiği ve kaval kemiğini hasat etmek için bir Kimwipe yardımıyla bağlı kasları ve bağ dokularını dikkatlice çıkarın.
NOT: Bu adım sırasında kemik epifizini sağlam tutmak için özellikle dikkat edin. Sterilite kaybı nedeniyle kırık kemikleri atın. Kalça kemikleri ve omurga kemikleri uyluk kemiği, kaval kemiği ve humerusa ek olarak toplanabilir. Omurga kemiklerini toplamak için, kemikleri parçalara ayırmak ve kemik iliği hücrelerini toplamak için bir harç ve bir pestle kullanılabilir. - İzole edilmiş kemikleri aynı genotipteki farelerden 20 mL buz gibi steril PBS içeren 50 mL konik tüpe yerleştirin ve daha fazla kullanıma kadar buzda tutun. Kemikleri uygun genotiplere sahip tüplere doğru şekilde yerleştirmeye özellikle dikkat edin.
- Her fare arasında eldiven değiştiren her donör hayvan için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Ayrıca, her fare arasında% 70 etanol ile temiz makas ve diğer aletler.
4. Kemik iliği hücre izolasyonu
NOT: Biyogüvenlik sınıfı II kabinde aşağıdaki adımları uygulayın.
- Tüp setlerinin hazırlanması: 18 G iğne kullanarak steril 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünün dibinde küçük bir delik açın ve altta 100 μL buz gibi steril PBS içeren steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne sadece altı kemik sığabileceği için, tüm kemikleri aynı anda işlemek için yeterli tüp setleri hazırlanması önerilir. - PBS'yi aspire edin ve izole edilmiş kemikleri steril 100 mm hücre kültürü kabına aktarın. Her kemiği ince epoplar kullanarak tutarak, bir otoklavda sterilize edilmiş küçük makas kullanarak epifizleri dikkatlice kesin. Kesilen kemikleri hazırlanan tüp setlerine yerleştirin.
- Tüpleri 4 °C'de 35 s için 10.000 x g'da santrifüj edin.
- Santrifüjlemeden sonra, kemik iliğinin kemiklerden başarıyla çıkarıldığını onaylayın. Kemikler, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün dibinde nispeten büyük bir kırmızı pelet ile beyaz ve yarı saydam görünmelidir. 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünü atın.
NOT: Görsel muayenede 1,5 mL'lik tüpün altındaki kemik iliği tespit edilemezse, kemiği tekrar kesin ve 4.3 adımını tekrarlayın. - Kemik iliğini 1 mL buz gibi PBS'de yeniden depolayın, ardından hücre süspansiyonu aynı genotipten eşleşen 50 mL konik tüpe aktarın.
- Hücreleri 10 kez 10 mL şırınga ile 18 G iğneden geçirerek ayrıştırın.
- Tek hücreli süspansiyonları 70 μm hücre süzgeçten filtreleyin. 10 mL'lik son hacme ilave buz gibi PBS ekleyin ve pipet yardımının nazik kullanımıyla hücreleri yeniden kullanın.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 310 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı epire edin ve hücre peletini 10 mL serumsuz RPMI ortamı ile yeniden diriltin. Hücre sayımı için bu malzemeden 30 μL ayırın.
- Hücre konsantrasyonu bir hücre sayacı ile belirleyin ve transplantasyon için gerekli hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. %100 BMT örneği için, her alıcı fare için 5 x10 6 kemik iliği hücresi gereklidir.
NOT: Rekabetçi bir BMT için, donör hücrelerin (örneğin, CD45.2+) ve rakip hücrelerin (örneğin, CD45.1 + ) bir karışımınıiçeren toplam 5 x 106 kemik iliği hücresi hazırlayın. Ekstra kemik iliği hücrelerinin hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. Örneğin, deneysel grup başına 10 alıcı fare varsa, genellikle 12 alıcı fare için yeterli hücre hazırlarız. - Hesaplanan hücre süspansiyon hacmini yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 310 x g'da santrifüj.
- Uygun hücre yoğunluğunu ve hacmini elde etmek için serumsuz RPMI ortamının hesaplanan miktarını kullanarak süpernatantı aspire edin ve hücreleri yeniden biriktirin. Tipik olarak, 200 μL retro yörünge enjeksiyonu için en uygun hacimdir.
5. Kemik iliği hücrelerinin ışınlanmış farelere nakli
- Alıcı fareleri% 5 izofluran ile uyuşturun.
- Fareler uyuşturulurken, insülin şırıngalı 28-30 G'lik bir iğne kullanarak retro-orbital damara yavaşça 200 μL kemik iliği hücresi enjekte edin.
- Alternatif olarak, donör hücrelerin teslimini kuyruk damarı intravenöz enjeksiyonu ve femoral intramedüller enjeksiyon ile, sırasıyla maksimum 0,2 mL ve 25 μL hacimde gerçekleştirin.
- Hücreler enjekte edildikten sonra, ağrı kesici için gözün yüzeyine bir damla proparakain içeren göz damlası yerleştirin. Hayvanın daha sonra bilincini geri kazanmasına izin verilebilir.
6. Kemik iliği hücrelerinin koşullu olmayan farelere nakli
- Alıcı fareleri% 5 izofluran soluyarak uyuşturun.
- 28-30 G insülin şırındingli ışınlanmamış alıcı farelere retro-yörüngesel olarak genotipten 5 x 106 kırılmamış kemik iliği hücresi enjekte edin.
- 6.1 ve 6.2 adımlarını art arda 3 gün boyunca tekrarlayın, böylece alıcı fareler toplam 1.5 x 107 kemik iliği hücresi ile nakledilecektir.
NOT: Ön koşullandırma işlemi yapılmadan evlat edinilen BMT 3 gün üst üste kemik iliği nakli gerektirdiğinden, her enjeksiyon için göz değiştirme girişiminde bulunulmalıdır. - Enjeksiyondan sonra, etkilenen göze bir damla proparakanin içeren göz damlası sürün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üç BMT/pre-conditioning yönteminin donör hücre engraftmenti üzerindeki etkisini karşılaştırmak için, donör hücrelerin periferik kan ve kalp dokusundaki fraksiyonları BMT sonrası 1 aylık akış sitometrisi ile analiz edildi. İzole hücreler, lökositlerin farklı alt kümelerini tanımlamak için spesifik lökosit belirteçleri için lekelendi. Bu deneylerde WT B6'ya yabani tip(WT) C57BL/6 (CD45.2) donör kemik iliği hücreleri teslim edildi. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) alıcı fareler donör hücreleri alıcının hücrelerinden ayırt etmek için. Kullanılan akış sitometrisi gating stratejileri daha önce Ek Şekil 1'deWang ve ark.9 tarafından açıklanmıştır.
Toplam vücut ışınlama (TBI) tedavi grubu, 4 saat arayla ayrılmış iki5,5 Gy fraksiyonunda 11 Gy toplam ölümcül radyasyon dozunu takiben 5 x 10 6 kemik iliği hücresi aldı. Alıcı farelerin periferik kanında monositler, nötrofiller ve B hücreleri büyük ölçüde ablatlandı ve donör kemik iliği türevi hücrelerin soyu ile değiştirildi. Ek olarak, alıcı farelerin kalplerindeki yerleşik kardiyak monosit ve nötrofil popülasyonu neredeyse tamamen donör türevi hücrelerle değiştirildi (Şekil 2A).
Kısmen korumalı ışınlama grubunda, alıcı fareler bir toraks kalkanı ile ışınlandı ve 4 saat arayla ayrılmış iki5.5 Gy fraksiyonunda toplam 11 Gy radyasyon dozunu takiben 5 x 10 6 kemik iliği hücresi ile nakledildi. TBI grubunun aksine, donör türevi hücrelerin kardiyak bağışıklık hücrelerine katkısı mütevazıydı, bu da muhtemelen alıcı farelerin kalplerindeki yerel bağışıklık hücrelerini korumanın ve kemik iliği türevi donör hücrelerin periferik kandan fizyolojik olarak yeniden depolandığının kombine etkilerini yansıtıyordu. Korumalı bölgelerdeki alıcı fare kemik iliği hücrelerinin de periferik kan rekonsyona katkıda bulunma olasılığı yüksektir, bu da periferik kandaki donör türetilmiş hücrelerin yüzdesini TBI tedavi grubuna kıyasla azaltır (Şekil 2B).
BMT ön koşullandırması olmayan grupta (evlat edinen BMT), alıcı farelere art arda 3 gün boyunca 5 x10 6 kemik iliği hücresi nakledildi. BMT sonrası 4 haftada, donör türevi hücrelerin periferik kan ve kalpteki kısmı tespit edilebilirdi. (yaklaşık %5) (Şekil 2C).
Benimsenen BMT modelinin CH modelinin çalışmasına nasıl uygulanabileceğini göstermek için CD45.2+ donör kemik iliği hücreleri (WT veya Tet2-/-) CD45.1+ alıcı farelere nakledildi. Koşullandırması olmayan alıcılara her gün 3 ardışık gün boyunca 5 x10 6 kemik iliği hücresi nakledildi (grup başına toplam 1,5 x10 7, n = 5-6). Periferik kanın akış sitometrik analizi transplantasyon sonrası 4, 8, 12 ve 16 hafta yapıldı. Tet2 eksikliği olan donör hücreleri rekabet avantajı sağladı ve zamanla kademeli olarak genişledi; WBC'ler, monositler, Ly6Chi monositler, nötrofiller, T hücreleri ve B hücreleri zamanla önemli ölçüde artmıştır. Alıcı farelere kazınan Tet2 eksikliği olan donör hücreleri ile karşılaştırıldığında, WT donör hücreleri ile kaplanmış alıcı fareler donör hücrelerinin daha az önemli klonal genişlemesini göstermiştir (Şekil 3). Klonal hematopoez klinik paradigması ile tutarlı olarak, Tet2 eksikliği olan hücrelerin genişlemesi, çeşitli kan hücresi tipleri9'un mutlak sayılarını etkilemez (veriler gösterilmez).
Şekil 2: Farklı önkoşul yöntemleri kullanılarak kan ve kalbin akış sitometrik analizi. Kemik iliği naklinden 1 ay sonra periferik kan ve kalbin akış sitometrik analizi yapıldı. Donör hücreleri alıcıların hücrelerinden ayırmak için CD45.1+ alıcı farelere CD45.2+ donör kemik iliği hücreleri nakledildi. (A) Toplam vücut ışınlamanın iki fraksiyonunu takiben 5 x10 6 kemik iliği hücresi nakledildi (2 x 5.5 Gy, 4 h aralık, n = 3). (B) toraks koruyucu ile toplam vücut ışınlamanın iki fraksiyonunu takiben 5 x10 6 kemik iliği hücresi nakledildi (2 x 5.5 Gy, 4 saat aralık, n = 10). (C) Koşullandırması olmayan alıcılara 3 gün üst üste 5 x10 6 kemik iliği hücresi nakledildi (toplam 1,5 x 107, n = 4 için). Veriler SEM ± ortalama olarak ifade edilir. Toplam WBC'ler CD45+olarak tanımlanır; Nötrofiller Ly6G+olarak; CD115+, Ly6G - ve Ly6C+olarakLy6Chi monositler; CD115+, Ly6G-ve Ly6C olarak Ly6Clo monositler-; B hücreleri CD45R+olarak; CD4+ T hücreleri CD3e+ ve CD4+olarak ; CD3e+ veCD8+ olarak CD8+ T hücreleri ; ve CD64+, Ly6G-ve Ly6C- olarak Makrofajlar . (WBC'ler: beyaz kan hücreleri, Nötrodu: nötrofiller, Mono: monositler, Mac: makrofajlar). Şekil 2A,C, Wang ve ark.9'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tet2 eksikliği olan hücrelerin, benimsenen BMT kullanılarak koşullu olmayan farelere klonal genişlemesi. CD45.2+ donör kemik iliği hücreleri (WT veya Tet2-/-) CD45.1+ alıcı farelere nakledildi. Koşullandırması olmayan alıcılara 3 gün üst üste her gün 5 x10 6 kemik iliği hücresi nakledildi (grup başına toplam 1,5 x10 7, n = 5-6). Periferik kanın akış sitometrik analizi transplantasyon sonrası 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra yapıldı. Her popülasyondaki CD45.2+ donör hücrelerin fraksiyonu gösterilmiştir. (A) WBC'ler (B) Mono (C) Ly6Chi mono (D) B hücreleri (E) T hücreleri. Veriler ortalama olarak ifade edilir ± SEM. WBC'ler CD45+olarak tanımlanır; Nötrofiller Ly6G+olarak; CD115+, Ly6G - ve Ly6C+olarakLy6Chi monositler; CD115+, Ly6G-ve Ly6C olarak Ly6Clo monositler-; B hücreleri CD45R+olarak; CD4+ T hücreleri CD3e+ (WT: vahşi tip, WBC'ler: beyaz kan hücreleri, Mono: monositler) Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klonal hematopoez çalışmaları için üç BMT yöntemi tanımladık: total vücut ışınlamalı BMT, kısmi kalkanlı ışınlamalı BMT ve ön koşullandırma içermeyen daha az yaygın olarak kullanılan bir BMT yöntemi (benimsenen BMT). Bu yöntemler klonal hematopoezin kardiyovasküler hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır. Araştırmacılar bu yöntemleri çalışmalarının özel amacına uyacak şekilde değiştirebilirler.
Klonal hematopoez modelleri
Klonal hematopoez, mutant hematopoetik hücrelerin vahşi tip hücrelerle rekabet ettiği ve zamanla klonal hakimiyet elde ettiği fenomendir. Bu yarışmanın bir modelini oluşturmak için, farelere genetik olarak farklı hücrelerin bir karışımından oluşan kemik iliği uygulanabilir. Genellikle, bu karışım floresan etiketi veya farklı pan-lökosit belirteçleri (cd45.1 ve CD45.2) ile etiketlenmiş mutant ve vahşi tip hücreleri içerecektir. Örneğin, Tet2 aracılı CH'yi taklit eden modeller oluştururken, genellikle CD45.1 Tet2+/+ donörlerinden kaynaklanan hücrelerin% 90'ını ve CD45.2 Tet2 -/- ,Tet2 +/-veya kontrol Tet2 +/+donörlerinden kaynaklanan hücrelerin% 8'ini karıştırmayı içeren ölümcül ışınlanmış alıcılara rekabetçi bir kemik iliği nakli gerçekleştiriyoruz. Belirli monoklonal antikorlar kullanılarak CD45 varyantlarının akış sitometrisi tespiti, donör hücreleri (CD45.1-/CD45.2+) kan içindeki rakip hücrelerden (CD45.1+/ CD45.2-) ayırt etmeyi ve test hücrelerinin klon dinamiklerini zaman içinde değerlendirmeyi sağlar. Bunu yaparak, Tet2 eksikliği olan hücrelerin donör kimerminde kademeli bir artış gözlemleyebildik, vahşi tip hücrelerin yüzdesi ise yaklaşık% 10'da kaldı. Bu deneysel ayar, TET2 somatik mutasyon taşıyan bireylerin insan senaryosunu taklit eder, çünkü bu mutasyonlar başlangıçta zaman içinde yavaş yavaş genişleyecek az sayıda HSPC tarafından taşınır. Bu yaklaşımın ateroskleroz ve kalp yetmezliği kardiyovasküler hastalık modellerinde ederek Tet2aracılı CH ve CVD 8,9,10arasında potansiyel bir nedensel bağlantının belgelenmesine yol açmıştır.
Bu yaklaşımları kullanırken, araştırmacılar TBI tarafından oluşturulan olası kafa karıştırıcı etkileri dikkate almalıdır. Transplantasyondan önce TBI yüksek derecede HSPC engraftmenti sağlasa da, bu ön koşullandırma hematopoetik sistemin dışında istenmeyen birkaç etkiye yol açacaktır. TBI'ın cilt, karaciğer, böbrekler, akciğerler, kemik iliği, kalp, beyinvb. Bu yan etkiler, incelenmekte olan kardiyovasküler organları olumsuz yönde etkileyebilir ve ayrıca hastalık patogenezinideğiştirirler 21,22. Önemli bir örnek, ışınlamanın kalpteki yerleşik makrofajlar üzerindeki etkisidir. Toraksın ışınlanması, kardiyak yerleşik makrofajların dolaşımdaki monosit türevli makrofajlarla belirgin bir şekilde değiştirilmesine neden olur. Çalışmalar, kardiyak yerleşik makrofajların, radyasyon hasarının ardından kalbe kazınacak monosit türevli makrofajların dolaşımına göre farklı özellikler gösterdiğini göstermiştir. Hastalık ortamlarında, kardiyak yerleşik makrofajların kardiyoprotektif bir rol oynadığı düşünülmektedir, oysa kan yoluyla bulaşan makrofajların yaralanma ve iltihabı teşvik ettiği bildirilmiştir23. Bu nedenle, yerleşik kardiyak bağışıklık hücrelerinin kan kaynaklı hücrelerle değiştirilmesinin, kardiyovasküler hastalığa katkıda bulunan patolojik süreçleri değiştireceği düşünülebilir24,25,26. Benzer şekilde, beyinde, TBI yerleşik mikroglianın tükenmesi ve periferik olarak türetilmiş makrofajlar ile değiştirilmesi ile sonuçlanır27,28. Periferik olarak türetilmiş makrofajlar mikroglial hücreler gibi davranabilirken, monosit türevli mikroglia28'ekıyasla benzersiz bir işlevsel ve transkripsiyonel kimlik korurlar. Bu nedenle, özellikle iskemik inmeler gibi hastalıkları incelerken, hastalığın sekellerinin değiştirilmesi mümkündür. Bu şaşırtıcı etkilerden kaçınmak için toraks ve başın korunması önerilebilir. Bu avantajlıdır, çünkü sırasıyla kalbe ve beyne koruma sağlar; ve ayrıca yerleşik bağışıklık hücrelerini sağlam tutar, CH'nin insan durumunu daha iyi yeniden sağlar. Bununla birlikte, daha önce de belirtildiği gibi, kalkanlama, TBI ön koşullandırmasına kıyasla daha düşük bir kimerizm oranına neden olur ve bu da esasen konağın tüm hematopoetik hücrelerini ortadan kaldırır.
Ön koşullandırmada bir diğer önemli engel kemik iliği nişi üzerindeki zararlı etkisidir. BM nişinin ışınlama kaynaklı hasarı suboptimal ölçüde geri yüklenebilmesine rağmen, bu hasarlı mikroçevrimlerde naif hematopoezisin bulunup bulunmadığı belirsizdir. Buna ek olarak, karışık HSPC'lerin boş BM'ye nakli, muhtemelen CH'de meydana gelen vahşi tip bir HSPC tarafından işgal edilen bir niş için basit bir "rekabet" yerine klonlar arasında çoğalma yarışı başlatır. Bu nedenle, CH'yi incelemek için potansiyel olarak tercih edilebilir bir yaklaşım, BM hücrelerinin ön koşullandırma olmadan alıcı farelere aktarıldığı benimsenen BMT yöntemi olabilir. Ön koşullandırma yöntemi olmayan bu benimseyen BMT, insanlarda gözlenen en sadık şekilde yeniden bulunan CH29. Şekil 2C, ön koşullandırma olmadan 1 aylık transplantasyon sonrası kimerizm seviyesini göstermektedir. Donör kimerizmi bu erken zaman noktasında düşük olsa da, Şekil 3'tesunulduğu gibi, zaman içinde Tet2 eksikliği olan klonların giderek artan bir kısmını buluyoruz. Bu modelin en çok mutant hücrelerin Tet2 eksikliği olan hücreler gibi homeostatik koşullar altında vahşi tip hücrelere karşı rekabet avantajına sahip olduğunda yararlı olduğu belirtilmelidir. Tet2 eksikliği olan hücreler engrafted zaman, nötrofiller, monositler, NK hücreleri ve B hücreleri gibi çeşitli lökosit popülasyonlarında belirgin bir genişleme vardır. T hücrelerinde, muhtemelen bu popülasyonun daha uzun yarı ömrü nedeniyle daha yavaş bir genişleme kaydedildi.
Tet2 eksikliği olan hücrelerin genişlemesi sadece periferik kanda değil, kemik iliği, karaciğer ve böbrek de dahil olmak üzere diğer birçok dokuda da gözlenmiştir, hematopoetik hücre rekonsupsiyonunun farklı dinamikleriile 9. Örneğin, laboratuvarımızın önceki yayınlanmış makalesi, evlat edinen BMT 9'dan8 ay sonra CD45.1 alıcı farelere kazınmış WT ve Tet2 eksikliği olan donör hücrelerin kemik iliği hücre kimerizmini tanımladı. CD45.1 alıcı farelere nakledilen tet2 eksikliği olan donör hücreler, olgunlaşmamışsoylara görerekabet avantajı göstermiştir - Sca1+c-Kit+ (LSK) hücreleri, kısa ve uzun süreli HSC hücreleri ve çok güçlü progenitörler (MPP'ler) CD45.1 alıcı farelere nakledilen WT donör hücrelerine kıyasla. Ek olarak, Tet2-eksikt donör hücre engrafted alıcı fareler olarak, onlar kardiyak disfonksiyona neden eksojen faktörler olmadan yaşa bağlı kardiyomiyopati fenotip geliştirir, böylece klonal hematopoezisin etkisini yaşlanan insanlarınkine benzer bir şekilde yeniden alırlar. Bu gözleme kardiyak nötrofillerde ve Ly6Chi monositlerinde artan chimerism derecesi eşlik etti. Toplu olarak, bu benimseyen BMT rejimi, kardiyovasküler hastalık gelişimi ve klonal hematopoez arasındaki ilişkiyi daha ileri düzeyde genişletebilecek gelecekteki çalışmalara uygulanabilir.
Özetle, üç BMT yöntemini tanımladık ve CH modellerini oluştururken uygulamalarını tartıştık. CH, ateroskleroz ve kalp yetmezliği gibi kardiyovasküler hastalıklarda daha zayıf prognozlarla ilişkilidir. Önemli ilerlemeler kaydedilmiş olmasına rağmen, CH ve CVD arasındaki nedensel bağlantıların incelenmesi henüz başlangıç aşamasındadır ve optimize edilmiş hayvan modellerinin kullanımı yoluyla daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Bu protokollerin araştırmacıların kardiyovasküler sistem üzerindeki potansiyel kafa karıştırıcı etkileri en az düzeye indiren ve sonuçta CH'nin kardiyovasküler hastalığa nasıl katkıda bulunduğuna dair anlayışımızı genişleten çalışmalar sağlayan daha fizyolojik olarak uygun bir BMT yöntemi seçmelerine izin vermesini umuyoruz.
Kurşun koruyucu tasarımı
Kurşun kalkanın kalınlığı, miyeloablasyonu teşvik etmek için kullanılan ışınlama türüne göre dikte edilecektir. X-ışını veya gama ışını radyasyon türleri deneysel miyeloablasyon için sıklıkla kullanılır, ancak frekansları, dalga boyları ve foton enerjileri açısından farklılık gösterir. Koruma söz konusu olduğunda, ışınların hareket ettiği enerjiyi veya hızı tanımlayan foton enerjisi en önemli parametredir. Tipik olarak, radyasyon kaynağı X ışınları 160 kVp enerjiye sahipken, gama ışınları yayan sezyum-137 kaynakları 662 KeV enerjiye sahiptir. Bu radyasyon kaynaklarının yaydığı enerji, daha yüksek enerjilerin daha fazla penetrasyon gücüne sahip olmasıyla, penetrasyon güçlerine eşittir. Bu nedenle, X-ışını tabanlı ışınlayıcıların kullanılmasına kıyasla sezyum kaynak tabanlı ışınlayıcılar kullanırken daha fazla kurşun kalkanı kalınlığı gerekir. Toraks ve karın koruyucu yaparken kullandığımız X-ışını bazlı ışınlama, yeterli koruma sağlamak için 7 mm kalınlığında bir kurşun kalkan gerektirir. Bununla birlikte, baş koruyucu yaparken kullandığımız sezyum 137 kaynakları için, yeterli koruma sağlamak için kurşun kalkanların en az 1 inç kalınlığında olması gerekir.
X-ray ışınlayıcılarda kullanılmak üzere kurşun kalkanlar ticari satıcılardan satın alınabilir. Alternatif olarak, kurşun levhalar hayvanın vücuduna uyacak veya bir kısıtlayıcının etrafına sığacak şekilde kesilebilir (bkz. Şekil 1). Sezyum bazlı bir ışınlayıcı kullanırken, oldukça kalın olan kurşun tuğlalar kullanılmalıdır ve bu tür kalkanları yapma konusunda uzmanlaşmış şirketler tarafından özel olarak yapılabilir. Örneğin, başörgü için, 50 mL konik tüp kısıtlayıcıyı tutmak için özel olarak bir kurşun tuğla tasarladık (bkz. Şekil 1F). Hayvan, ışınlamadan 1,5 inç koruma sağlamak için tuğlada yapılmış bir deliğe oluklu olan kısıtlayıcının içine sığabilir. Daha da önemlisi, tüm kurşun kalkanlar, toksik olabilen kurşun tozlarına maruz kalmayı önlemek için boya veya bantla kaplanmalıdır.
Ekipmana ve parametrelerine dayanarak, araştırmacılar ilgi alanları için kendi kurşun kalkanlarını tasarlayabilirler. Burada toraks, karın ve baş koruyucu tanıttık; bununla birlikte, uzuv veya kanat gibi diğer siteler de kalkan için düşünülebilir. Ayrıca, her iki radyasyon kaynağı (Sezyum-137 ve X-ışını) kemik iliği ablasyonu ve başarılı engraftasyon için uygunken, Sezyum-137 ve X-ışını ışınlama kaynakları arasında lenfoid ve miyeloid hücre popülasyonlarının yeniden uzlaştırılmasında değişkenlik gözlenmiştir30. Bu nedenle, araştırmacılar çalışmalarda kullanılmak üzere radyasyon kaynağına verilen farklı fizyolojik yanıtları dikkate almalıdır.
Dosing aralıkları
Dozaj ve dozaj aralıkları donör hücre gravür ve sağkalım oranlarının verimliliğini etkileyebilir. İnsan hastalarda, yüksek doz ışınlama idiyopatik interstisyel pnömoniye, gastrointestinal yaralanmaya ve katarakt oluşumuna neden olabilir. Fare modellerinde, kemik iliği naklinin ardından gelen tek yüksek doz ışınlama benzer sonuçlar üretebilir ve hayatta kalma oranlarını da etkileyebilir31. Bu nedenle, kesirli ışınlama fare BMT çalışmaları için şiddetle tavsiye edilir. Ek olarak, fraksiyonların dosing aralıkları fare sağkalım oranını ve rekonsups oranını etkileyebilir, hematolojik organlarda ve diğer dokularda donör hücre kimerizminin farklı fraksiyonlarına yol açabilir31. Bu nedenle, araştırmacılar BMT çalışmaları için kesirli bir ışınlama dosing programı tasarlamada dikkatli olmalıdır.
Sağkalım oranı ve immün hücre rekonsesi bağlamında, küçük çalışmamız, 24 saatlik bir aralık grubu ile ayrılmış iki 5,5 Gy fraksiyonunda 11 Gy ölümcül radyasyon dozu ile toplam vücut ışınlanması alan bir grup farenin, 4 saat aralıklarla aynı TBI dozajını alan gruptan önemli ölçüde farklı sonuçlar elde ettiğini göstermiştir (bkz. Tablo 1). Bununla birlikte, toraks koruyucu BMT ile, 24 h aralıklı grup, 4 h aralık grubuna kıyasla donör hücre kimerizminin daha az verimliliğini göstermiştir. Bu sonucun olası bir açıklaması, 24 saat aralıklı ışınlamanın alıcının immün yetmez hücrelerini çıkarmak için yeterli olmayabileceğidir, çünkü uzun aralıklar alıcı farelere hasarlı hücreleri onarmak için yeterli zaman vermiştir. Ek olarak, toraks koruyucu, alıcının HSC'lerini de içeren kısmi omurga kemiklerini korur. Bu nedenle, kalan ve kurtarılan immün yetmeci alıcı hücreler donör türevi hücrelere saldırmış ve daha düşük engraftment verimliliği gösteren bir sonuç doğurmuş olabilir.
| WBC (%) | B hücresi (%) | T hücresi (%) | Mono (%) | Ly6Chi mono (%) | Ly6Clo mono (%) | Nötrofil (%) | ||
| TBI-BMT | 4 saat aralığı | 97.4 ± 1.0 | 100 ± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| 24 saat aralığı | 97,2 ± 2,2 | 100 ± 0 | 79.0 ± 8.1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| toraks koruyucu BMT | 4 saat aralığı | 56.2 ± 4.0 | 54.2 ± 6.2 | 0,5 ± 0,1 | 66,7 ± 6,1 | 63,8 ± 6,3 | 70.8 ± 5.7 | 82.0 ± 3.8 |
| 24 saat aralığı | 34.4 ± 3.1 | 34.8 ± 3.1 | 2.9 ± 1.7 | 45.0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56,2 ± 4,9 | 56 ± 10.0 | |
Tablo 1: Farklı dosing aralıkları kullanılarak donör hücre gravürlerinin verimliliği. Kemik iliği naklinden 1 ay sonra periferik kanın akış sitometrik analizi yapıldı. WT CD45.2+ donör kemik iliği hücreleri CD45.1+ alıcı farelere nakledildi. 5 x 106 kemik iliği hücresi, toplam vücut ışınlamanın iki fraksiyonunu (2 x 5.5 Gy) 4 saat aralık veya 24 saat aralıkla ayrılmış toraks kalkanı ile veya olmadan nakledildi. (n = grup başına 3–4).
Hayvan bakımı
Bu deneyin başarısı için fareleri içeren birden fazla adım gereklidir. Bu nedenle, aşağıdaki noktalarda ekstra dikkat gerekir: İlk olarak, canlı donör hücrelerin teslimi başarılı bir şekilde engraftment için çok önemlidir. Sağlam BM hücrelerinin toplanması ve alıcı farelere enjeksiyonları konusunda uygun şekilde eğitilmelidir. Hücrelerin kötü verilmesinin sonuçları arasında donör HSPC'lerin mortaliteye yol açan alıcı kemik iliğini yeniden inşa edememeleri saydır. İkincisi, özellikle miyeloablatif tedaviyi takiben enfeksiyondan kaçınmak için transplantasyondan sonra dikkatli olunmalıdır. Fareler ışınlamadan sonra geçici olarak immün yetmez hale geldiği için patojenlerle temas ölümcül olabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, içme suyunu antibiyotiklerle takviye etmek ölümcül enfeksiyon riskini azaltabilir. Ayrıca, alıcı hayvanlara beslenme / hidrasyon jeli sağlamak, ışınlama ishale yol açan bağırsak epitelini bozabileceğinden, ışınlamadan sonra oluşabilecek dehidratasyonu ve beslenme eksikliklerini en aza indirebilir32. Dışkı bakterilerinin bulaşma riskini azaltmak için kafesler de sık sık değiştirilmeli, hayvanlar uygun bir hayvan transfer istasyonunda ele alınmalı ve alıcı fareler kilo kaybı ve herhangi bir sıkıntı veya ağrı belirtisi açısından dikkatle izlenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından K. Walsh'a (HL131006, HL138014 ve HL132564), S. Sano'ya (HL152174), M. A. Evans'a Amerikan Kalp Derneği hibesi (20POST35210098) ve H. Ogawa'ya Japonya Kalp Vakfı hibesi ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
