Her beskriver vi en brugervenlig metode til at generere 3D-selvmonterede hjertemikrotissue-arrays sammensat af prædifferentierede humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Denne brugervenlige og lavcellekrævende teknik til at generere hjertemikrotiser kan implementeres til sygdomsmodellering og tidlige stadier af lægemiddeludvikling.
Generering af humane kardiomyocytter (PM’er), hjertefibroblaster (CF’er) og endotelceller (EC’er) fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) har givet en unik mulighed for at studere det komplekse samspil mellem forskellige kardiovaskulære celletyper, der driver vævsudvikling og sygdom. Inden for hjertevævsmodeller bruger flere sofistikerede tredimensionelle (3D) tilgange inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (iPSC-PM’er) til at efterligne fysiologisk relevans og indfødt vævsmiljø med en kombination af ekstracellulære matricer og tværbindinger. Disse systemer er imidlertid komplekse at fremstille uden mikrofabrikationsekspertise og kræver flere uger at samle sig selv. Vigtigst af alt mangler mange af disse systemer vaskulære celler og hjertefibroblaster, der udgør over 60% af nonmyocytterne i det menneskelige hjerte. Her beskriver vi afledningen af alle tre hjertecelletyper fra iPSC’er til fremstilling af hjertemikrotiser. Denne lette replikastøbningsteknik tillader hjertemikrotissuekultur i standard multi-brøndcellekulturplader i flere uger. Platformen tillader brugerdefineret kontrol over mikrovævsstørrelser baseret på indledende såningstæthed og kræver mindre end 3 dage for selvmontering for at opnå observerbare hjertemikrovævskontraktioner. Desuden kan hjertemikrovævene let fordøjes, samtidig med at der opretholdes høj cellelevedygtighed til enkeltcelleforhør ved anvendelse af flowcytometri og enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq). Vi forestiller os, at denne in vitro-model af hjertemikrotiser vil hjælpe med at fremskynde valideringsstudier inden for lægemiddelopdagelse og sygdomsmodellering.
Lægemiddelopdagelse og sygdomsmodellering inden for kardiovaskulær forskning står over for flere udfordringer på grund af mangel på klinisk relevante prøver og utilstrækkelige translationelle værktøjer1. Meget komplekse prækliniske modeller eller overforenklede in vitro-enkeltcellemodeller udviser ikke patofysiologiske tilstande på en reproducerbar måde. Derfor har flere miniaturiserede vævskonstruerede platforme udviklet sig til at hjælpe med at bygge bro over kløften med det formål at opnå en balance mellem brugervenlighed på en måde med høj gennemstrømning og trofast rekapitulation af vævsfunktion2,3. Med fremkomsten af induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) kan vævstekniske værktøjer anvendes på patientspecifikke celler med eller uden underliggende kardiovaskulær sygdomstilstand for at besvare forskningsspørgsmål4,5,6. Sådanne vævskonstruerede modeller med cellulær sammensætning svarende til hjertevævet kunne anvendes i lægemiddeludviklingsindsatsen for at teste for kardiotoksicitet og dysfunktion induceret af patologiske ændringer i adfærd hos en eller flere celletyper.
Selvsamlede mikrovæv eller organoider afledt af humane iPSC’er er tredimensionelle (3D) strukturer, der er miniaturevævslignende samlinger, der udviser funktionelle ligheder med deres in vivo-modstykker . Der er flere forskellige tilgange, der tillader dannelse af organoider in situ via rettet differentiering af iPSC’er eller gennem dannelse af embryoide kroppe4. De resulterende organoider er et uundværligt redskab til at studere morfogenetiske processer, der driver organogenese. Tilstedeværelsen af en række cellepopulationer og forskelle i selvorganisering kan imidlertid føre til variation i resultaterne mellem forskellige organoider5. Alternativt er prædifferentierede celler, der er selvsamlet til mikrovævssuer med vævsspecifikke celletyper for at studere lokale celle-celleinteraktioner, fremragende modeller, hvor det er muligt at isolere de selvmonterede komponenter. Især inden for human hjerteforskning har udviklingen af 3D-hjertemikrovæv med flercellede komponenter vist sig at være udfordrende, når celler stammer fra forskellige patientlinjer eller kommercielle kilder.
For at forbedre vores mekanistiske forståelse af celleadfærd i en fysiologisk relevant, personlig in vitro-model bør ideelt set alle komponentcelletyper udledes af den samme patientlinje. I forbindelse med et menneskeligt hjerte ville en virkelig repræsentativ hjerte-in vitro-model fange krydstalen blandt fremherskende celletyper, nemlig kardiomyocytter (CM’er), endotelceller (EF’er) og hjertefibroblaster (CF’er) 6,7. Den trofaste rekapitulation af et myokardium kræver ikke kun biofysisk strækning og elektrofysiologisk stimulering, men også cellecellesignalering, der stammer fra understøttende celletyper som ECs og CFs8. GF’er er involveret i syntesen af ekstracellulær matrix og opretholdelse af vævsstruktur; og i en patologisk tilstand kan CF’er fremkalde fibrose og ændre elektrisk ledning i CMs9. På samme måde kan EU’er regulere kontraktile egenskaber ved PM’er gennem parakrin signalering og levering af vitale metaboliske krav10. Derfor er der behov for humane hjertemikrovæv, der består af alle tre hovedcelletyper, for at gøre det muligt at udføre fysiologisk relevante eksperimenter med høj kapacitet.
Her beskriver vi en bottom-up-tilgang til fremstilling af hjertemikrovæv ved afledning af humane iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM’er), iPSC-afledte endotelceller (iPSC-EC’er) og iPSC-afledte hjertefibroblaster (iPSC-CF’er) og deres 3D-kultur i ensartede hjertemikrotissue-arrays. Denne letkøbte metode til at generere spontant slående hjertemikrovæv kan bruges til sygdomsmodellering og hurtig test af lægemidler til funktionel og mekanistisk forståelse af hjertefysiologi. Desuden kan sådanne multicellulære hjertemikrotissueplatforme udnyttes med genomredigeringsteknikker til at efterligne hjertesygdomsprogression over tid under kroniske eller akutte dyrkningsforhold.
For at generere hjertemikrotiser fra prædifferentierede iPSC-PM’er, iPSC-EC’er og iPSC-CF’er er det vigtigt at opnå en meget ren kultur for bedre kontrol af cellenumre efter kontakthæmmet cellekomprimering inden for hjertemikrovævene. For nylig, Giacomelli et. al.18 har demonstreret fremstilling af hjertemikrotiser ved hjælp af iPSC-CM’er, iPSC-EC’er og iPSC-GF’er. Hjertemikroproblemer genereret ved hjælp af den beskrevne metode består af ~ 5.000 celler (70% iPSC-CM’er, 15% iPSC-EC’er og 15…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Amanda Chase for hendes nyttige feedback på manuskriptet. Finansieringsstøtte blev ydet af Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) fra University of California, T29FT0380 (D.T.) og 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) og 17MERIT33610009 (J.C.W.); og National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 og NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |